Αφηρημένο

MITOSTATIN

, ένα μυθιστόρημα υποθετικό ογκοκατασταλτικό γονίδιο που προκαλείται από ντεκορίνη υπερέκφραση, εκφράζεται σε πιο φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς, αλλά είναι σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε προχωρημένα στάδια του μαστού και της ουροδόχου κύστης καρκινωμάτων . Mitostatin επηρεάζει αρνητικά την ανάπτυξη των κυττάρων, επάγει κυτταρικό θάνατο και ρυθμίζει τα επίπεδα έκφρασης και την ενεργοποίηση του Hsp27. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι η έκτοπη έκφραση της Mitostatin σε PC3, DU145, και LNCaP καρκίνου του προστάτη κύτταρα όχι μόνο προκάλεσε μια σημαντική μείωση στην ανάπτυξη των κυττάρων, αλλά επίσης παρεμπόδισε τη μετανάστευση και την εισβολή. Επιπλέον, Mitostatin ανέστειλε το σχηματισμό αποικίας σε μαλακό άγαρ των PC3 και LNCaP κυττάρων, καθώς και ογκογονικότητα των κυττάρων LNCaP σε γυμνούς ποντικούς. Αντιστρόφως, η στόχευση της ενδογενούς Mitostatin με siRNA και στρατηγικές αντι-νόημα σε PC3 και DU145 κύτταρα καρκίνου του προστάτη ενίσχυσε την κακοήθη φαινότυπο σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Σε συμφωνία αυτών των αντι-ογκογόνο ρόλους, ανακαλύψαμε ότι Mitostatin απουσίαζε από -35% (

n

= 124) των δειγμάτων του όγκου του προστάτη και μείωση της συνολικής του συνδέθηκε με προχωρημένα στάδια του καρκίνου. Συλλογικά, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι

MITOSTATIN

μπορεί να δρα ως ογκοκατασταλτικό γονίδιο στον καρκίνο του προστάτη και παρέχει μια νέα κυτταρικό και μοριακό μηχανισμό που πρέπει να αξιοποιηθούν περαιτέρω και να αποκρυπτογραφηθεί στην κατανόηση της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη.

Παράθεση: Fassan Μ, D’Arca D, Letko J, Vecchione Α, Gardiman MP, McCue P, et al. (2011) Mitostatin ρυθμίζεται προς τα κάτω στη ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη και καταστέλλει την Επεμβατική Φαινότυπος κύτταρα καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 6 (5): e19771. doi: 10.1371 /journal.pone.0019771

Επιμέλεια: Hava Karsenty Avraham, Beth Israel Deaconess Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 31 του Ιανουαρίου 2011? Αποδεκτές: 4 Απρ, 2011? Δημοσιεύθηκε: May 6, 2011

Copyright: © 2011 Fassan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο ήταν εν μέρει υποστηρίζεται από το Ίδρυμα Sidney Kimmel για την Έρευνα του Καρκίνου, τον Benjamin Perkins ουροδόχου κύστης Ταμείου Καρκίνου και του Ταμείου Martin Greitzer (σε RB), τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας χορηγεί RO1 CA39481, RO1 CA47282 και RO1 CA120975 (σε RVI), RO1 DK068419 (με ΑΜ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με το θάνατο στους άνδρες, στις περισσότερες ανεπτυγμένες χώρες, και η πιο κοινή κακοήθεια στην αμερικανική άνδρες. Στις Ηνωμένες Πολιτείες, το ένα πάνω από οκτώ άνδρες θα αναπτύξει καρκίνο του προστάτη κατά τη διάρκεια της ζωής του και πάνω από 27.360 άτομα αναμένεται να πεθάνουν από τη νόσο του τρέχοντος έτους [1].

Μοριακή γενετική μελέτες του καρκίνου του προστάτη έχουν εντοπίσει μεταλλάξεις, διαγραφές , ή απώλεια του όγκου έκφραση γονιδίων καταστολής σε υποομάδες ασθενών με καρκίνο του προστάτη [2]. Ωστόσο, λόγω της ετερογένειας της ίδιας και η εστιακή φύση του γονιδίου μεταβολές καταστολέα ογκογονίδιο /όγκου του καρκίνου του προστάτη, ο ρόλος αυτών των γονιδίων σε εμφάνιση καρκίνου του προστάτη και η διαγνωστική ή /και προγνωστική αξία τέτοιων γονιδίων μεταβολών παραμένει αβέβαιη [2].

η απώλεια ετεροζυγωτίας (ΑΕ) επισημαίνει την παρουσία των κατασταλτικών γονιδίων σε συγκεκριμένες χρωμοσωμικές περιοχές σε όγκους. Αρκετές μελέτες allelotyping αναφερθεί το τμήμα τελομερών του χρωμοσώματος 12 για να διαγραφεί σε μία ποικιλία στερεών όγκων [3] – [11]., Συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη [12]

MITOSTATIN

είναι μία νέα υποθετικό ογκοκατασταλτικό γονίδιο εντοπίζεται στο 12q24.1 [13] – [15] η οποία χαρακτηρίζεται πρόσφατα στο εργαστήριο μας [13]. Έχουμε αποδείξει προηγουμένως ότι αυτή η ντεκορίνη επαγόμενη πρωτεΐνη 62-kDa εκφράζεται στους περισσότερους ανθρώπινους ιστούς? επηρεάζει την ανάπτυξη των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη και του κυτταρικού θανάτου με τη ρύθμιση του επιπέδου και ενεργοποίηση Hsp27 [13]. Έχουμε επίσης αναλύθηκαν με ανοσοϊστοχημεία της έκφρασης Mitostatin σε μια σειρά πρωτογενών ουροδόχου κύστης και του μαστού όγκους και παρατηρείται μια μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης Mitostatin σε προχωρημένα στάδια του όγκου. Επιπλέον, Kim και συνεργάτες εντόπισαν πρόσφατα μια μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου του

MITOSTATIN

γονιδίου σε ένα γαστρικό καρκίνωμα με αστάθεια μικροδορυφόρου [14].

Αν και η βιολογική λειτουργία των Mitostatin σε καρκίνους του προστάτη δεν είναι ακόμη χαρακτηρισμένο, η σχέση της με ντεκορίνη και Hsp27 υποδηλώνει ένα ρόλο για Mitostatin στην ανάπτυξη καρκίνου. Για να μελετηθεί η λειτουργία καταστολέα όγκου του Mitostatin στον καρκίνο του προστάτη, θα υπερ-εκφράζεται και εξαντλημένο ενδογενή πρωτεΐνη Mitostatin με στρατηγικές antisense και siRNA σε καρκίνο του προστάτη που προέρχονται από κυτταρικές σειρές.

Σε αυτή τη μελέτη, παρέχουμε τα πρώτα στοιχεία για ένας ρόλος του Mitostatin στην αναστολή μετανάστευσης κυττάρων, εισβολή και ογκογονικότητα των κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Επιπλέον, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι Mitostatin ρυθμίζεται προς τα κάτω σε προχωρημένο στάδιο καρκίνους ανθρώπινου προστάτη. Έτσι, Mitostatin μπορούσε να λειτουργήσει ως ένα κλασικό ογκοκατασταλτικό γονίδιο και ανάλυση της έκφρασης του μπορεί να αποδειχθεί ένα χρήσιμο κλινικό δείκτη για τη διάγνωση και την πρόγνωση σε αυτή την κοινή ανθρώπινη καρκίνο.

Αποτελέσματα

Mitostatin Υπερ-έκφραση σε κύτταρα του προστάτη Καρκίνος Αναστέλλει Colony Σχηματισμός

Ως αρχική προσέγγιση για τη θέσπιση έκφραση Mitostatin στον προστάτη που χρησιμοποιούνται κυτταρικά εκχυλίσματα από δεκατέσσερις διαφορετικές προστάτη που προέρχονται από τα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων τόσο των φυσιολογικών και κακοήθων κυττάρων του προστάτη. Χρησιμοποιώντας ανοσοκηλίδωση με Mitostatin-ειδικό αντίσωμα [13], ανακαλύψαμε ότι όλοι οι κυτταρικές σειρές που αναλύθηκαν, αλλά ένας (

δηλ

:. 1542CP

3TX), εκφραζόμενη πρωτεΐνη Mitostatin σε διάφορα επίπεδα (Σχήμα 1Α). Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα κύτταρα LNCaP παρουσίασαν την υψηλότερη έκφραση και 1532CP

2TX έδειξε ένα μόλις ανιχνεύσιμα επίπεδα ενδογενούς Mitostatin (Σχήμα 1Α). Αξίζει να σημειωθεί ότι, 1542NPTX κύτταρα, τα οποία εκφράζουν Mitostatin, είναι οι «κανονικές» των ομολόγων των Mitostatin αρνητικών κακοήθη 1542CP

κύτταρα 3TX

Α:. Ανάλυση κηλίδος Western: Mitostatin εκφράζεται διαφορικά σε καρκινικό κύτταρο ανθρώπινου προστάτη γραμμές. Πρωτεΐνη φόρτωση επιβεβαιώθηκε με της ανιχνεύσεως της μεμβράνης με αντίσωμα προς β-ακτίνη. Β: Western blots που δείχνει την έκφραση του Mitostatin σε PC3, κυτταρικές γραμμές DU145 και LNCaP που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη

Η

Στη συνέχεια, εστιάσαμε στη διερεύνηση της βιολογικής λειτουργίας του Mitostatin σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη με σταθερή μορφομετατροπή PC3. και τα κύτταρα LNCaP με ένα κατασκεύασμα έκφρασης cDNA Mitostatin V5-tagged και PC3 και DU145 κυττάρων με κατασκεύασμα cDNA αντι-νόημα. Τοποθετήσαμε επίσης την αλληλουχία που κωδικοποιεί Mitostatin σε μια αυτο-αδρανοποίηση ρετροϊικό φορέα υπό τον έλεγχο ενός επαγόμενου υποκινητή της Drosophila HPS70 να μολύνει κύτταρα DU145. Έχουμε λάβει πέντε κλώνοι σταθερώς υπερ-εκφράζουν Mitostatin (PC3 Β2, DU145 Mitostatin, LNCaP Β1Α, LNCaP B3a και LNCaP A3a) και δύο κλώνοι οι οποίοι έδειξαν μειωμένα επίπεδα του ενδογενούς πρωτεΐνης Mitostatin (PC3 Μ2 και DU145 Μ2) (Σχήμα 1Β). Σε τρεις ανεξάρτητες δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας, όλες οι κυτταρικές σειρές Mitostatin υπερεκφράζουν έδειξε μία μείωση στον αριθμό και το μέγεθος των αποικιών μετά από 15 ημέρες (Σχήμα 2 Α-Γ) σε σύγκριση με είτε το γονικό είτε το V5-επιμολυσμένα κύτταρα. DU145 Mitostatin, η οποία είναι επίσης ο κλώνος με την υψηλότερη έκφραση του Mitostatin σε σύγκριση με την έκφραση της γονικής κυτταρικής (4,2 φορές αύξηση, cfr Σχήμα 1Β), έδειξε την υψηλότερη αναστολή σχηματισμού αποικιών (Σχήμα 2 Β). Ενδιαφέρον, κύτταρα που εκφράζουν ένα αντιπληροφοριακό κατασκεύασμα Mitostatin παρουσίασαν είτε έναν αριθμό παρόμοιο (DU145 Μ2, Σχήμα 2 Β) ή υψηλότερη (PC3 Μ2, Σχήμα 2Α) αποικιών σε σύγκριση με τα πατρικά ή ψευδο-διαμολυσμένα κύτταρα.

Mitostatin υπερέκφραση στον καρκίνο προέρχεται κυτταρικές σειρές προστάτη [PC3, Α? DU145, Β? και LNCaP, Γ] μείωσε την ικανότητα να σχηματίζουν αποικίες μετά από 15 ημέρες, ενώ τα κύτταρα με εξάντληση της ενδογενούς πρωτεΐνης Mitostatin έδειξε παρόμοια (DU145 Μ2) ή υψηλότερη (PC3 Μ2) αριθμού αποικιών σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα. Στήλες, κατά μέσο όρο ανά πιάτο από πειράματα εις τριπλούν?

μπαρ

, SEM. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt?. 0.01

Η

Mitostatin υπερέκφραση Αναστέλλει μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη

Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η ντεκορίνη και Hsp27 εμπλέκονται στο κελί μετανάστευση. Ο πρώην έχει αποδειχθεί ότι ασκεί μια αντί-μεταναστευτική επίδραση σε διάφορες κυτταρικές σειρές που περιλαμβάνουν διαφορετικές οδούς σηματοδότησης [16] – [19], ενώ ο τελευταίος εμπλέκεται στην αναδιοργάνωση ακτίνης όταν τα κύτταρα σχηματίζουν ελασματοπόδια [20]. Δεδομένου ότι έχουμε ανακαλύψει προηγουμένως Mitostatin σε κύτταρα ντεκορίνης-υπερεκφράζουν και απέδειξαν ότι Mitostatin αναστέλλει την έκφραση και φωσφορυλίωση Hsp27 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη [13], επιδιώξαμε να καθοριστεί αν Mitostatin μπορεί να ρυθμίζει τη μετανάστευση των κυττάρων σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Κατά συνέπεια, πραγματοποιήσαμε

in vitro

δοκιμές μετανάστευσης χρησιμοποιώντας τα διάφορα Mitostatin υπερεκφράζουν ή Mitostatin-εξαντληθεί τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Σε όλα τα κυτταρική γραμμή που δοκιμάστηκαν, Mitostatin υπερέκφραση ανέστειλε την ικανότητα των κυττάρων να μεταναστεύουν (Σχήμα 3Α) υποδεικνύοντας ότι Mitostatin ρυθμίζει αρνητικά τη μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Σε Mitostatin-υπερεκφράζουν LNCaP κλώνοι το ανασταλτικό αποτέλεσμα Mitostatin για τη μετανάστευση συσχετίζεται άμεσα με την ποσότητα της πρωτεΐνης (

δηλ

:. LNCaP A3a κλώνος με την υψηλότερη έκφραση Mitostatin ήταν ο πιο αργός στην δοκιμασία μετανάστευσης). Αντίστροφα, ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα στα οποία ενδογενείς Mitostatin ήταν ρυθμισμένη προς τα κάτω είτε με στρατηγική αντινοηματικών (PC3 Μ2 και DU145 Μ2) ή Mitostatin siRNA (κύτταρα PC3) έδειξε αυξημένη κινητικότητα κυττάρου (Σχήματα 3Α).

A

και

Β: Mitostatin υπερεκφράζουν κλώνους επέδειξαν μειωμένη μεταναστευτικές ιδιότητες σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα. Η μετανάστευση εκτιμήθηκε μέσω της μετανάστευσης (Α) και τις δοκιμασίες επούλωσης πληγών (Β). Κύτταρα με προς τα κάτω ρύθμιση της ενδογενούς πρωτεΐνης Mitostatin (PC3 Μ2, PC3 Mitostatin shRNA, και DU145 Μ2) έδειξε αυξημένο κακοήθη συμπεριφορά. Τα δεδομένα εκφράζονται ως ποσοστό της μετανάστευσης

έναντι

γονικών κυττάρων.

Στήλες

, εκπρόσωπος εικόνες του τριπλούν από τρία ανεξάρτητα πειράματα?

μπαρ

, SEM. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt?. 0.01

Η

Στη συνέχεια, προσδιορίζεται η ικανότητα των Mitostatin να αναστέλλει τη μετανάστευση των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη χρησιμοποιώντας ένα

in vitro

«τυλίγεται ομαλά σε ρολό επούλωση «δοκιμασία κινητικότητα [21]. Σε αντίθεση με τα γονικά κύτταρα και κύτταρα ελέγχου PC3 V5 (τα δεδομένα δεν φαίνονται), τα κύτταρα PC3 B2 υπερεκφράζουν Mitostatin παρουσίασαν σημαντική μείωση στην μετανάστευση στην απογυμνωμένη περιοχή, τόσο σε 4 και 8 ώρες μετά τον τραυματισμό (Σχήμα 3Β). Πραγματοποιήσαμε το ίδιο πείραμα σε LNCaP και DU145 κύτταρα και παρατήρησε ότι σε όλες τις κυτταρικές σειρές. Ουσιαστικά, Mitostatin υπερ-έκφραση προκάλεσε μια μείωση στην κυτταρική κινητικότητα σε σύγκριση με τη γονική ή ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Mitostatin Υπερ-έκφραση Αναστέλλει Invasion and Cell Adhesion

Η απόκτηση από καρκινικά κύτταρα ενός επεμβατικού φαινοτύπου είναι ένα κρίσιμο βήμα για την εξέλιξη του όγκου. φίλτρα Matrigel επικαλυμμένα χρησιμοποιούνται ευρέως για την εξέταση επεμβατική μετανάστευσης μέσω ενός τρισδιάστατου εξωκυττάριας μήτρας [21]. Κατά συνέπεια, πραγματοποιήσαμε

in vitro δοκιμασίες

εισβολή αξιολογώντας την ικανότητα των κυττάρων καρκίνου του προστάτη να εισβάλλουν μέσω Matrigel σε 5% μέσο που περιέχει ορό. Mitostatin υπερέκφραση ανέστειλε την κυτταρική εισβολή σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (Σχήμα 4Α). Σε LNCaP υπερ-κλώνους έκφρασης το ανασταλτικό αποτέλεσμα της πρωτεΐνης για τη μετανάστευση συσχετίζεται άμεσα με την ποσότητα της πρωτεΐνης (LNCaP A3a είχε τη χαμηλότερη ικανότητα να εισβάλει). Επιπλέον, παρατηρήσαμε αυξημένη σε κύτταρο εισβολή σε PC3 Μ2 και DU145 Μ2 αντινόημα κλώνους, και τα κύτταρα PC3 Mitostatin siRNA

Α:. Mitostatin αναστέλλει επεμβατική ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Κύτταρα με προς τα κάτω ρύθμιση της ενδογενούς πρωτεΐνης Mitostatin (PC3 Μ2, PC3 Mitostatin shRNA, και DU145 Μ2) έδειξε αυξημένο κακοήθη συμπεριφορά. Β: Mitostatin υπερ-έκφραση επηρεάζει την ικανότητα των κυττάρων να αποδίδουν λαμινίνη. Τα δεδομένα εκφράζονται ως ποσοστό της μετανάστευσης

έναντι

γονικών κυττάρων.

Στήλες

, εκπρόσωπος εικόνες του τριπλούν από τρία ανεξάρτητα πειράματα?

μπαρ

, SEM. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt?. 0.01

Η

Η τήρηση εξωκυττάρια μήτρα είναι ένα εγγενές χαρακτηριστικό της επεμβατικής και μεταστατικό φαινότυπο και μεταναστεύουν κύτταρα σχηματίζουν παροδική συνημμένα στην εξωκυττάρια μήτρα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η λαμινίνη-1 είναι το κύριο συστατικό του Matrigel. Ως εκ τούτου, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς πρόσφυσης και απλώθηκαν τα διάφορα Mitostatin υπερεκφράζουν ή Mitostatin-εξαντλημένο προστάτη καρκινικά κύτταρα σε τρυβλία λαμινίνη-επικαλυμμένα. Τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν στη λαμινίνη για 2 ώρες και ο αριθμός των συνδεδεμένων κυττάρων στη συνέχεια υπολογίστηκε. Ο αριθμός των κυττάρων που προσκολλώνται σε λαμινίνη ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε κύτταρα που υπερεκφράζουν Mitostatin συγκριτικά με γονικά κύτταρα σε DU145 και PC3 κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4Β), δεικνύοντας ότι Mitostatin αναστέλλει την προσκόλληση των κυττάρων στην λαμινίνη. Σε συμφωνία με αυτό το συμπέρασμα, Mitostatin εξαντλημένο κύτταρα PC3 έδειξαν αυξημένη ικανότητα να συμμορφώνονται με λαμινίνη (Σχήμα 4Β). Από την άλλη πλευρά, η έλλειψη σημαντικών διαφορών στην κυτταρική πρόσφυση στη λαμινίνη παρατηρήθηκε στα κύτταρα LNCaP μπορούσε εν μέρει να εξηγηθεί από τεκμηριωμένες χαμηλή κολλητική ικανότητα τους

in vitro

[22], [23].

Συλλογικά, τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότι Mitostatin όχι μόνο αναστέλλει τη μεταναστευτική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων του προστάτη, αλλά επίσης την ικανότητα να εισβάλλουν ένα περίπλοκο τρισδιάστατο μήτρα, όπως Matrigel, και να συμμορφώνονται με λαμινίνη υποστρώματα.

Mitostatin Υπερ-έκφραση Αναστέλλει Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη και την ογκογονικότητα

Για να διερευνηθεί περαιτέρω η υπόθεση ότι Mitostatin μπορεί να διαδραματίσει έναν άμεσο ρόλο στην καρκινογένεση του προστάτη, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις ανάπτυξη αγκυροβόλιο ανεξάρτητη και

in vivo

ογκογενετικότητας δοκιμασίες σε γυμνούς ποντικούς. PC3 Β2 κυττάρων με υψηλή έκφραση Mitostatin δεν σχηματίζουν αποικίες, ενώ PC3 Μ2 με χαμηλό επίπεδο Mitostatin έδειξε αυξημένο αριθμό των αποικιών (Σχήμα 5Α). Επιπλέον, η πλειονότητα των αποικιών στις 3-PC Μ2 κύτταρα ήταν μεγαλύτερα από εκείνα σε κύτταρα ελέγχου (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Σε κύτταρα LNCaP (Σχήμα 5Α-Β), η μείωση του αριθμού και της διαστάσεως των αποικιών συσχετίζονται απευθείας με τα επίπεδα έκφρασης Mitostatin

Α:. Τα δεδομένα από τριπλές καλλιέργειες της γονικής PC3 και LNCaP και PC3 κλώνοι V5, PC3 Β2, PC3 Μ2, LNCaP V5, LNCaP Β1Α, LNCaP B3a, και LNCaP A3a καλλιεργήθηκαν σε μαλακό άγαρ δημιουργώντας αποικίες μεγαλύτερες από 0,2 mm σε διάμετρο. Οι κλώνοι που υπερεκφράζουν Mitostatin έδειξε μία μειωμένη ικανότητα να σχηματίσουν αποικίες, ενώ ο Mitostatin ρυθμισμένα προς τα κάτω κλώνος, PC3 Μ2, έδειξε μια αύξηση του αριθμού των αποικιών σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα. Οι αποικίες μετρήθηκαν μετά από 21 ημέρες. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01 Β:. Εκπρόσωπος αποικίες των γονικών κυττάρων LNCaP (αριστερά), LNCaP Β1Α (μέση), και LNCaP A3a (δεξιά) εμφανίζονται μετά από 21 ημέρες (μεγέθυνση χ 200)

In vivo

πειράματα έδειξαν ότι τα ξενομοσχεύματα που προέρχονται από Mitostatin-υπερεκφράζουν LNCaP κύτταρα ήταν σημαντικά μικρότερες από εκείνες που προκαλούνται από γονικά κύτταρα LNCaP και κυττάρων ελέγχου LNCaP V5 (Σχήμα 6Α-Β). Οι όγκοι που προέρχονται από LNCaP Β1Α και LNCaP B3a ανήλθε κατά μέσο όρο όγκου 50% και 25% μικρότερο από τους όγκους που προέρχονται από γονικά κύτταρα. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση των όγκων εγκλεισμένους σε παραφίνη και αναλύσεις ανοσοστυπώματος κατεψυγμένων ξενομοσχευμάτων όγκου (Σχήμα 6C-D) έδειξε υψηλή έκφραση Mitostatin σε LNCaP Β1Α και LNCaP ξενομοσχεύματα B3a, σε σύγκριση με το βασικό επίπεδο της έκφρασης Mitostatin φαίνεται στο γονικά κύτταρα. Mitostatin έκφραση σε επιμολυσμένα κύτταρα επιπροσθέτως επιβεβαιώθηκε με ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις χρησιμοποιώντας το αντίσωμα αντι-tag V5 (Σχήμα 6C)

Α:. Ξενομοσχεύματα συστάθηκε με υπο δερματική ένεση LNCaP, LNCaP V5, LNCaP Β1Α και τα κύτταρα LNCaP B3a σε αθυμικοί (BALB /c

ηυ /ηυ

) αναπτύχθηκαν για 65 ημέρες. Β: Το μέγεθος του όγκου σε ζώα που ενέθηκαν με κύτταρα που υπερεκφράζουν Mitostatin αξιοσημείωτα μειωμένη σε σχέση με τους όγκους σε ζώα που ενέθηκαν με κύτταρα ελέγχου. Το γράφημα απεικονίζει την κατανομή του μεγέθους των όγκων που σχηματίζονται σε BALB /c

nu /nu

ποντίκια μέσω 65 ημέρες. *:

P

& lt? 0,05. C, D: Ανοσοϊστοχημική και ανοσοκηλίδα ανάλυση της έκφρασης Mitostatin σε LNCaP και παράγωγα ξενομοσχεύματα όγκου. Η ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας τόσο αντι-V5 (άνω πάνελ) και αντι-Mitostatin (κάτω πάνελ) αντισώματα. μπαρ κλίμακα:. 50 μm

Η

Συλλογικά, τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι Mitostatin εμπλέκεται άμεσα σε μια δοσο-εξαρτώμενο τρόπο στον έλεγχο ενός από τα πιο ισχυρά

in vitro

ιδιότητες των κακοήθων κυττάρων , όπως αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη, καθώς και

in vivo

ογκογονικότητας. Έτσι, Mitostatin είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής κλειδί του μετασχηματισμένου φαινοτύπου σε καρκίνο του προστάτη.

Mitostatin Έκφραση μειώνεται στο Advanced Προστάτη καρκινώματα

Δείξαμε πρόσφατα ότι Mitostatin εκφράζεται παντού σε φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς, αλλά τα επίπεδα της είναι αισθητά εξασθενημένα σε προχωρημένα στάδια καρκίνου του μαστού και της ουροδόχου κύστης καρκίνους [13]. Για να διερευνήσουν την έκφραση Mitostatin σε καρκίνους του προστάτη, θα αξιολογούνται από qRT-PCR ανάλυση 10 αντίστοιχα δείγματα φυσιολογικού καρκίνου και με ανοσοϊστοχημεία (IHC) τρεις μικροσυστοιχίες ιστού που αποτελείται από 293 δείγματα, συμπεριλαμβανομένων 124 καρκίνοι του προστάτη και 43 φυσιολογικά αντίστοιχα. επίπεδα Mitostatin mRNA ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται στο καρκινικό ομόλογό (Εικόνα 7Α?

P

= 0,029). Τα δεδομένα αυτά επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από την IHC. Mitostatin εκφράστηκε κυρίως στο κυτταρόπλασμα της βασικής κυτταρικής στοιβάδας του κανονικού προστατικού επιθηλίου (Εικόνα 7Β) και μια ισχυρή θετικότητα παρατηρήθηκε στη λεγόμενη ατροφία του προστάτη αδένα (Σχήμα 7C). Όλες οι προ-νεοπλασματικές αλλοιώσεις (

δηλαδή

: PIN) έδειξαν μια ήπια έως μέτρια Mitostatin ανοσοχρώση (Σχήμα 7D), ενώ το μεγαλύτερο μέρος του αδενοκαρκινώματος έδειξε είτε εστιακή χρώση (Σχήμα 7Ε, F) ή καθόλου χρώση σε όλα ( Σχήμα 7G). Όπως ήταν αναμενόμενο, τα μυϊκά κύτταρα και ενδοθηλίου των αιμοφόρων αγγείων », έδειξε ένα Mitostatin μέτρια θετικότητα. Ενδιαφέροντος, πέντε νεοπλασματικές περιπτώσεις είχαν αποκλειστικά την πυρηνική θετικότητα. Συνολικά, 44 από τα δείγματα όγκου 124 ήταν εντελώς αρνητική (-35%), 65 εμφάνισαν ήπια έως μέτρια θετικότητα (52,4%) και μόνο 15 δείγματα έδειξαν έντονη θετικότητα Mitostatin (12,1%). Στην μονοπαραγοντική ανάλυση, μειωμένη Mitostatin ανοσοϊστοχημικές όρος συσχετίζεται με τα στάδια όγκου (

P

= 0,046), αύξηση Pt (

P

= 0.040), και ο όγκος του όγκου (

P =

0.045). Δεν υπάρχουν κλινικά-παθολογικών παραμέτρων οδήγησε ανεξάρτητα στατιστικά σημαντική σχετίζονται με Mitostatin έκφραση στην πολυπαραγοντική ανάλυση. . Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώνουν περαιτέρω την ιδέα ότι η απώλεια της Mitostatin μέσω μεταλλάξεων ή υποβάθμισης της πρωτεΐνης θα μπορούσε να συμβάλει στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη, εφόσον τα δείγματα καρκίνου του προστάτη αξιολογήθηκαν ανωτέρω προέρχονται από ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του προστάτη

Α: Σχετική φορές των επιπέδων mRNA Mitostatin σε φυσιολογικά δείγματα προστατικού ιστού (Ν, μαύρο), και Gleason 7 προστάτη δείγματα καρκίνου (Κ, φωτεινά γκρι). Mitostatin έδειξε μια συνεπή ρύθμιση προς τα κάτω σε ιστούς του καρκίνου (

P

= 0,029). Στήλες, εκπρόσωπος εικόνες των τριπλών? μπαρ, SD. B-G: ανοσοϊστοχημική ανίχνευση της Mitostatin σε ανθρώπινο προστάτη. Mitostatin πρωτεΐνη εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα των φυσιολογικών (Β) και ατροφική (C) του προστάτη αδένες. Υψηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης Mitostatin παρατηρήθηκαν σε αλλοιώσεις PIN (D) και σε μερικούς όγκους (Ε). ΣΤ: Εκτός από ένα ασθενή χρώση, Mitostatin ανιχνεύθηκε επίσης στους πυρήνες σε λίγες περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος. G: έκφραση Mitostatin είναι παρόν σε μία ατροφική αδένα (μαύρο βέλος), σε αντίθεση με τα γύρω αρνητικές νεοπλασματικών αδένες. Ράβδος κλίμακας: 50 μm

Η

Συζήτηση

Αν και ο καρκίνος του προστάτη είναι ένας από τους πιο κοινούς κακοήθειες, πολύ λίγα είναι γνωστά σχετικά με τους μοριακούς μηχανισμούς που καθορίζουν κακοήθη μετασχηματισμό του επιθηλίου του προστάτη.. Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη, τα καρκινικά κύτταρα γίνονται πιο κινητικά και να αποκτήσουν επεμβατική ικανότητα. Οι περισσότεροι θάνατοι από καρκίνο του προστάτη δεν οφείλονται στην πρωτογενή όγκο, αλλά μάλλον να δευτερογενείς μεταστάσεις σε απομακρυσμένα όργανα. Για το λόγο αυτό είναι θεμελιώδους σημασίας για τη μελέτη των μηχανισμών που οδηγούν προστάτη εισβολή και μεταστάσεις καρκίνου. Η 12q χρωμοσωμική περιοχή έχει αποδειχθεί να διαγραφεί σε μια μεγάλη ποικιλία στερεών προηγμένων όγκων [3] – [12], ως εκ τούτου, γεγονός που υποδηλώνει την παρουσία, στην περιοχή αυτή, από ένα ή περισσότερα ογκοκατασταλτικών γονιδίων που εμπλέκονται στη διαδικασία της εξέλιξης του καρκίνου.

Έχουμε προσδιορίσει προηγουμένως το γονίδιο Mitostatin, εντοπισμένη στο 12q24.1, κατά τη διαδικασία της διαλογής για τα γονίδια της ανάπτυξης συνελήφθη επάγεται από την πλούσια σε λευκίνη πρωτεογλυκανών ντεκορίνης [13]. Ντεκορίνη είναι ένα μέλος της οικογένειας μικρών πρωτεογλυκανών γονίδιο πλούσιες σε λευκίνη που έχει γίνει πρόσφατα μια εστίαση σε διάφορους τομείς της έρευνας για τον καρκίνο [20]. Αυτή η διαλυτή πρωτεΐνη εμπλέκεται σε έναν αριθμό κυτταρικών διαδικασιών, συμπεριλαμβανομένης της συναρμολόγησης μήτρας, ινιδιογένεσης, και τον έλεγχο του πολλαπλασιασμού των κυττάρων [18], [24] – [33]. Decorin έχει δειχθεί ότι αναστέλλει τη μετανάστευση [16] – [19], [34], εισβολή [18], και ογκογονικότητα [19], [29], [33], [35], [36] μιας ευρείας ποικιλίας μετασχηματισμένα κύτταρα. Επιπλέον, ντεκορίνη προκαλεί απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης της κασπάσης-3 [36], [37]. Ως εκ τούτου, είναι εύλογο ότι η ντεκορίνη που προκαλείται από πρωτεΐνες θα μπορούσαν να είναι τελεστές της δράσης κατασταλτικής του όγκου αυτής της πρωτεογλυκάνης.

Έχουμε προηγουμένως δείξει ότι Mitostatin εκφράζεται παντού σε φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς. Ωστόσο, τα επίπεδα πρωτεΐνης του είναι αξιοσημείωτα εξασθενημένα σε προχωρημένα στάδια της πρωτογενούς μαστικών και ουροθηλίου νεοπλάσματα [13]. Δείξαμε επίσης ότι Mitostatin υπερ-έκφραση επηρεάζει αρνητικά την ανάπτυξη των κυττάρων και επάγει κυτταρικό θάνατο σε κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης [13], υποδηλώνοντας ότι θα μπορούσε να συμπεριφερθεί Mitostatin ως κλασικός ογκοκατασταλτικό γονίδιο σε άλλες μορφές κακοήθειας. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήσαμε τρία ευρέως χρησιμοποιούμενο κύτταρο καρκινώματος προστάτη γραμμές, δηλαδή, PC3 και DU145 ευνουχισμός ανθεκτικά κύτταρα και LNCaP κύτταρα εξαρτώμενων από ανδρογόνα, και χρησιμοποιούνται διαγονιδιακά και ανοσολογικές στρατηγική για να εντοπίσει την λειτουργία του Mitostatin σε αυτά τα κύτταρα. Τα αποτελέσματα μας επιβεβαίωσαν την πρόβλεψη μας Mitostatin που ανήκουν στην οικογένεια γονιδίων καταστολής του όγκου, εφόσον η υπερέκφραση του σχηματισμού αποικίας ανέστειλε Mitostatin, ενώ η καταστολή της ενδογενούς Mitostatin προκάλεσε τα αντίθετα αποτελέσματα.

μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή αποτελούν θεμελιώδη συστατικά των κυττάρων του όγκου μεταστάσεων . Καθώς η αυξημένη κυτταρική μετανάστευση και εισβολή είναι το σήμα κατατεθέν του μεταστατικού φαινοτύπου, και έτσι ένα μέτρο της επιθετικότητας, η τρέχουσα μελέτη παρέχει αποτελέσματα που εμπλέκουν Mitostatin ως σημαντικό πρωτεΐνη για τον προσδιορισμό μιας επιθετικής κυτταρικό φαινότυπο. Πράγματι, Mitostatin υπερεκφράζουν κλώνους έδειξαν μια σημαντική μείωση στην κινητικότητα, και

αντίστροφα

από τα κάτω ρύθμιση της ενδογενούς Mitostatin είτε με αντίθετης φοράς ή στρατηγικές siRNA που προκάλεσε το αντίθετο αποτέλεσμα. Ένα άμεσο ρόλο της Mitostatin στην προώθηση κυτταρική μετανάστευση είναι επίσης εμφανής από την επούλωση της πληγής μελέτες μας, επιβεβαιώνεται σε όλες τις κυτταρικές σειρές που αναλύθηκαν.

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι Mitostatin ρυθμίζει τόσο την κυτταρική κινητικότητα και την ικανότητα των κυττάρων καρκίνου του προστάτη να εισβάλουν μέσω ενός 3D μήτρα μέσω ενός μηχανισμού που πρόκειται να διαλευκανθεί. Mitostatin αλλάξει τις ιδιότητες προσκόλλησης κυττάρου σε λαμινίνη, η οποία είναι το πρώτο απαραίτητο βήμα για να εισβάλουν της μεμβράνης Matrigel. Αυτό το εύρημα είναι σύμφωνο με το ρόλο που διαδραματίζει ντεκορίνη ως αρνητικός ρυθμιστής της κυτταρικής προσκόλλησης στη λαμινίνη [19]. Άλλες ογκοκατασταλτικά γονίδια έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζουν πολλαπλές χαρακτηριστικά καρκινικά κύτταρα (μετανάστευση, εισβολή, την ανάπτυξη, την προδιάθεση να αποπτωτικά ερεθίσματα) που ενεργεί για σημαντικές κυτταρικές σύμπλοκα πρωτεΐνης [38] – [40]. Έτσι, το μέλλον των προσπαθειών μας θα πρέπει να επικεντρωθεί στον εντοπισμό των εταίρων πρωτεΐνης Mitostatin και στη μελέτη των πιθανών σημάτων καταρράκτη που εμπλέκονται στην Mitostatin βιολογία.

Για να διερευνήσουν μια πιθανή άμεσο ρόλο για Mitostatin στα κύτταρα του προστάτη μετασχηματισμό πραγματοποιήσαμε αγκύρωση-ανεξάρτητες δοκιμασίες ανάπτυξης και

in vivo

ογκογένεσης με γυμνά ποντίκια. Και οι δύο μελέτες επιβεβαίωσαν το ρόλο του Mitostatin ως αρνητικός ρυθμιστής του μετασχηματισμού. Και στα δύο πειράματα Mitostatin έκφραση συσχετίζεται καλά με την επιθετικότητα των καρκινικών κυττάρων.

Σε αυτή τη μελέτη παρατηρήθηκε μείωση στην έκφραση Mitostatin σε δύο λαμβάνεται από καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές (1542CP

3TX και 1532CP

2TX ? 16,7% των καρκινικών κυττάρων που προέρχονται από γραμμές) και σε -35% από μια σειρά 124 καρκίνοι του προστάτη. Ενδιαφέρον, σε φυσιολογικά δείγματα, το ανώτερο στρώμα επιθηλιακών προστάτη ήταν σταθερά αρνητικά για επιτόπια Mitostatin, ενώ το κάτω στρώμα έδειξε μια ισχυρή θετικότητα, που υποδηλώνει την παρουσία ενός διαφορετικού κυτταρικής δέσμευση στην έκφραση Mitostatin. Μια ισχυρή θετικότητα ήταν πάντα παρατηρήθηκε στη λεγόμενη ατροφία του προστάτη αδένα (μια κοινή διαδικασία τυπικά αλλά δεν βρέθηκε αποκλειστικά σε ηλικιωμένους ασθενείς), ενώ ένα μέτριο θετικότητα παρατηρήθηκε σε όλες τις προ-νεοπλαστικές αλλοιώσεις, με μια μείωση στο πιο προχωρημένο καρκίνο του προστάτη στάδια. Σε πρωτογενείς όγκους του προστάτη, Mitostatin ρύθμιση προς τα κάτω ήταν στατιστικώς σχετίζεται με προχωρημένα στάδια όγκου και αυξημένο μέγεθος (ή άμεση βαθμό) του πρωτογενούς όγκου σε παθολογική εξέταση (

δηλαδή

: PT), επιβεβαιώνοντας την προηγούμενη παρατήρηση μας του μαστού και καρκίνο της ουροδόχου κύστης [13]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα κάτω ρύθμιση Mitostatin κατά τα τελευταία στάδια της ογκογένεσης του προστάτη θα μπορούσε να προωθήσει την πρόοδο του καρκίνου. Εμείς δεν βρήκε καμία συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης Mitostatin και άλλες κλινικές παραμέτρους που χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση του καρκίνου του προστάτη κακή πρόγνωση, όπως είναι ο βαθμός Gleason, αν και αυτό το σημείο μένει να διερευνηθεί σε μεγαλύτερο σειρά περιπτώσεων.

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη παρέχει την πρώτη απόδειξη ότι Mitostatin θα μπορούσαν να διαδραματίσουν ένα σημαντικό ρόλο ως καταστολέας όγκων στην ανάπτυξη του όγκου του προστάτη και την εξέλιξη μέσα από ανασταλτικές επιδράσεις του στην κυτταρική μετανάστευση, εισβολή, ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη, και

in vivo

ογκογένεση. Επιπλέον, το επίπεδο Mitostatin μειώνεται σε προχωρημένα στάδια των πρωτοπαθών καρκίνων του προστάτη. Στο σύνολό τους, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν περαιτέρω την υπόθεση ότι Mitostatin ενεργεί ως

καλόπιστους

ογκοκατασταλτικό και δείχνουν ότι απαιτούνται περαιτέρω έρευνες Mitostatin ως ένα χρήσιμο κλινικό δείκτη για τη διάγνωση και την πρόγνωση σε όγκους του προστάτη δικαιολογημένη.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και δημιουργία σταθερών κλώνων

Καρκίνος του προστάτη προέρχονται κυτταρικές σειρές 2220, 2221, 11609, 11610, 11611, TSUP, 1532CP

2Tx, 1535CP

1TX, 1542CP

3Tx, LNCaP, DU145, PC3 και και του προστάτη αθανατοποιημένων κανονική κυτταρικές γραμμές που παράγονται 1535NPTX, και 1542NPTX ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) και διατηρήθηκαν όπως συνιστάται. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13], [41] (Data S1), και επιλέγονται σε μέσο συμπληρωμένο με είτε G418 (400 μg /ml) ή πουρομυκίνη (0,75 μg /ml) για 3 εβδομάδες.

Mitostatin γονιδιακή σίγηση

η γονιδιακή αποσιώπηση της ανθρώπινης Mitostatin επιτεύχθηκε με στρατηγικές siRNA τη χρήση επικυρωμένων SureSilencing Mitostatin siRNA και ελέγχου πλασμίδια (SuperArray Bioscience Corp, Frederick, MD). Κύτταρα PC3 διαμολύνθηκαν με όχημα (DEPC-επεξεργασμένο νερό), τον έλεγχο siRNA (κωδικοποιημένο), ή siRNA που κατευθύνεται έναντι Mitostatin (100 pmol /L) με τη χρήση αντιδραστηρίου Oligofectamine ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) ακολουθώντας τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα PC3 στερήθηκαν τροφής εντός μέσου χωρίς ορό (SFM) για 12 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και αναλύθηκαν για τη μετανάστευση και την εισβολή, όπως περιγράφεται παρακάτω. Η έκφραση του Mitostatin πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε με ανάλυση ανοσοστύπωσης (Σχήμα S1).

Σχηματισμού Αποικίας και Μετανάστευσης Οι δοκιμασίες

Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 400 κύτταρα /100 mm δίσκου. Την ημέρα 15, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη [100% φορμαλδεΰδη είναι 37%, έτσι 3,7% είναι 10% φορμαλίνη,

δηλαδή

: PBS-φορμαλδεΰδη] και χρωματίζονται με κρυσταλλικό ιώδες για μέτρηση των αποικιών [21] . Τα κύτταρα στερήθηκαν ορού για 24 ώρες. Τα κύτταρα (2.5 × 10

4 σε 200 μλ) στη συνέχεια εμβολιάζονται σε θαλάμους Boyden (άνω βουλή) (BD Biocoat, Bedford, ΜΑ). Κάτω θάλαμοι περιείχαν 500 μι είτε SFM ή 1% ή 5% ορό. Μετά από 10 ώρες, μετανάστευσαν κύτταρα μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο μετά από μονιμοποίηση και χρώση με μπλε Coomassie όπως περιγράφεται [42], [43].

Η μετανάστευση, εισβολή και πρόσφυση Αναλύσεις

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 35-mm εντός μέσου που περιέχει ορό μέχρι υπο-συρροή και στη συνέχεια μεταφέρονται σε SFM. Μετά από 24 ώρες, οι πλάκες χαραχθεί με ένα λεπτό αναλώσιμο άκρο για να δημιουργήσει ένα τραύμα στο κύτταρο μονοστιβάδα [42]. Τα κύτταρα επωάστηκαν για επιπλέον 72 ώρες σε 1% ή 5% μέσο που περιέχει ορό και αναλύθηκαν και φωτογραφήθηκαν με ένα Zeiss Axiovert 200 Μ κυττάρων ζώντων μικροσκόπιο (Carl Zeiss Inc., Thornwood, ΝΥ) χρησιμοποιώντας το Metamorph Image Acquisition και λογισμικό ανάλυσης (Universal απεικόνισης, Downingtown, PA) στη διευκόλυνση Kimmel Cancer Center Ομοεστιακή Μικροσκοπίας Core. Κυττάρων εισβολή μέσω μιας τρισδιάστατης εξωκυττάριας μήτρας αξιολογήθηκε με δοκιμασία εισβολή Matrigel χρησιμοποιώντας BD εισβολής σε Matrigel Chambers (BD Biocoat) με μεμβράνες φίλτρο 8,0 μm-όπως περιγράφηκε προηγουμένως [42], [43]. Για δοκιμασίες συγκόλλησης, πλάκες 96-φρεατίων, επικαλυμμένες με λαμινίνη ποντικού (BD Biocoat), επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα με λευκωματίνη 1% βόειου ορού (BSA) (Sigma, St. Louis, ΜΟ), για να εμποδίσει μη ειδική σύνδεση. 100.000 κύτταρα /φρεάτιο σπάρθηκαν εις τριπλούν και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 2 ώρες στους 37 ° C και τα μη προσκολλημένα κύτταρα στη συνέχεια απομακρύνθηκαν με δύο πλύσεις. Τα προσκολλημένα κύτταρα βάφτηκαν με CyQUANT NF Κυττάρων Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού κιτ (Invitrogen) και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm. επίπεδα Υπόβαθρο της κυτταρικής πρόσφυσης σε φρεάτια επικαλυμμένα με BSA μόνη αφαιρέθηκαν από τις τιμές που ελήφθησαν για τη λαμινίνη.

Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη και Ογκογονικότητα Δοκιμασίες

Για δοκιμασία μαλακού άγαρ, τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε 0,2% αγαρόζη σε DMEM 10% FBS μέσου, απλώθηκαν σε μια πυκνότητα από 10

3 κύτταρα σε τρυβλίο 60-mm επικαλυμμένα προηγουμένως με 0,4% αγαρόζη, και διατηρήθηκε στους 37 ° C °. Την ημέρα 21, οι αποικίες & gt? 0,2 mm σε διάμετρο μετρήθηκαν και αναλύθηκαν [21]. δοκιμασίες Ογκογονικότητα διεξήχθησαν ουσιαστικά όπως περιγράφεται [44], υπό πρωτόκολλα έχουν εγκριθεί από τη Φροντίδα των Ζώων και Χρήση επιτροπή Thomas Jefferson. Ανοσοανεπάρκεια, αθυμικά γυμνά (BALB /c

ηυ /ηυ

) ποντικούς εγχύθηκαν υποδορίως σε οπίσθια πλευρίζει με 2 × 10

6 κύτταρα σε 200 μΙ μήτρας βασικής μεμβράνης Matrigel (BD Biosciences). Η ανάπτυξη των όγκων παρακολουθούνταν καθημερινά για 65 ημέρες.

Ηθική δηλώσεις

Όλοι οι ασθενείς που συμμετείχαν στη μελέτη qRT-PCR έδωσε γραπτή συγκατάθεση τους.