Αφηρημένο

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η δεύτερη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με το θάνατο στις ανεπτυγμένες χώρες. Η έγκαιρη ανίχνευση της CRC οδηγεί σε μειωμένη θνησιμότητα CRC. Μια δοκιμή CRC ελέγχου με βάση το αίμα είναι ιδιαίτερα επιθυμητή λόγω της περιορισμένης εισβολής και υψηλό ποσοστό αποδοχής μεταξύ των ασθενών σε σύγκριση με το που χρησιμοποιούνται σήμερα κοπράνων εξέταση αίματος και κολονοσκόπηση. Εδώ περιγράφουμε την ανακάλυψη και την επικύρωση ενός πάνελ 29-γονιδίου σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) για την ανίχνευση CRC και αδενωματώδεις πολύποδες (AP). δείγματα αίματος προοπτικά συλλέγονται από μια πολυκεντρική, περίπτωση ελέγχου κλινική μελέτη. Πρώτον, προφίλ 93 δείγματα με 667 υποψήφιες και 3 αναφορά γονιδίων με υψηλής απόδοσης PCR πραγματικού χρόνου (OpenArray σύστημα). Μετά την ανάλυση, 160 γονίδια είχαν διατηρηθεί και να δοκιμαστεί ξανά σε 51 επιπλέον δείγματα. Χαμηλή εκφράζονται και ασταθής γονίδια απορρίφθηκαν καταλήγοντας σε ένα τελικό σύνολο δεδομένων 144 δειγμάτων μορφοποιημένης με 140 γονίδια. Για να ορίσετε ποια γονίδια, μόνα τους ή σε συνδυασμούς είχε την υψηλότερη δυνατότητα να διακρίνουν AP ή /και CRC από τους ελέγχους, τα δεδομένα αναλύθηκαν από ένα συνδυασμό μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική μεθόδους. Ο κατάλογος των 29 δυνητικά διακρίνουσα γονίδια συντάχθηκε και να αξιολογηθούν για προγνωστική ακρίβεια της από τιμωρούνται λογιστικής παλινδρόμησης και εκκίνησης. Αυτή η μέθοδος διακρίσεις AP & gt? 1 εκατοστό και CRC από τους ελέγχους με ευαισθησία 59% και 75%, αντίστοιχα, με 91% ειδικότητα. Η συμπεριφορά του πάνελ 29 γονιδίων επικυρώθηκε με LightCycler 480 πραγματικού χρόνου PCR πλατφόρμα, συνήθως εγκρίθηκε από κλινικά εργαστήρια. Στην παρούσα εργασία εντοπίστηκαν μια ομάδα 29 γονιδίων που εκφράζονται σε PBMC που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανάπτυξη ενός νέου ελάχιστα επεμβατική δοκιμή για την ακριβή ανίχνευση της ΑΡ και CRC χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο σε πραγματικό χρόνο πλατφόρμα PCR

Παράθεση:. Ciarloni L, Hosseinian S, Monnier-Benoit S, Imaizumi Ν, Dorta G, Ruegg C, et al. (2015) Ανακάλυψη ενός 29-Gene Panel σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος για τη διάγνωση του καρκίνου του παχέος εντέρου και αδενώματα Χρησιμοποιώντας Υψηλής Απόδοσης Real-Time PCR. PLoS ONE 10 (4): e0123904. doi: 10.1371 /journal.pone.0123904

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Antonio Moschetta, IRCCS Istituto Oncologico Giovanni Paolo II, Ιταλία

Ελήφθη: 8 Δεκεμβρίου 2014? Αποδεκτές: 27 Φεβ, 2015? Δημοσιεύθηκε: 13, Απρ 2015

Copyright: © 2015 Ciarloni et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από Diagnoplex ΑΕ. Ο χρηματοδότης παρέχεται στήριξη με τη μορφή των μισθών για τους συγγραφείς LC, NI, SMB, SH, αλλά δεν έχει καμία επιπλέον ρόλο στη συλλογή και ανάλυση δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Οι συγκεκριμένοι ρόλοι αυτών των συγγραφέων αρθρωτά στο τμήμα του συγγραφέα εισφορών »

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. LC SH SMB NI ήταν υπάλληλοι της Diagnoplex ΑΕ κατά το χρόνο της μελέτης. Επίσης, κατέχουν δικαιώματα προαίρεσης αγοράς μετοχών σε Diagnoplex ΑΕ. CR είναι συνιδρυτής, συμβουλευτικό μέλος του διοικητικού συμβουλίου και κατέχει μετοχές της Diagnoplex ΑΕ. GD έχει υπηρετήσει ως ομιλητής, σύμβουλος και συμβουλευτικό μέλος του διοικητικού συμβουλίου για Diagnoplex Α.Ε., και έχει λάβει τη χρηματοδότηση της έρευνας από Diagnoplex ΑΕ. Αυτό δεν αλλάζει προσήλωση μας στην PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη πιο κοινή μορφή καρκίνου και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται μεταξύ ανδρών και γυναικών στην Ευρώπη [1]. Είναι σημαντικό, CRC είναι συχνά ιάσιμη, όταν διαγνωσθεί σε πρώιμα στάδια. Επιπλέον, η ανίχνευση και απομάκρυνση των αδενωματώδεις πολύποδες (AP) αποτρέπει το σχηματισμό CRC και μειώνει τη θνησιμότητα λόγω της CRC. Αρκετές χώρες έχουν ήδη υιοθετήσει τρόπους ελέγχου για CRC και κατευθυντήριες οδηγίες κλινικής πρακτικής συστήσει ότι τα άτομα μέσου όρου κίνδυνο να ξεκινήσει ο τακτικός έλεγχος σε ηλικία των 50 ετών [2, 3]

Η κολονοσκόπηση είναι ο «χρυσός κανόνας» για AP και CRC διάγνωση, ωστόσο, δεν είναι η προτιμώμενη μέθοδος για τη μαζική διαλογή λόγω του κόστους, η εισβολή, χαμηλή συμμόρφωση του και περιορισμένη δυνατότητα πρόσβασης. Επί του παρόντος, συνιστάται μη επεμβατικές μέθοδοι για τον έλεγχο μάζας περιλαμβάνουν ανοσοχημική και guaiac κοπράνων εξέταση αίματος (iFOBT, gFOBT). Ωστόσο, η συμμόρφωση με κοπράνων δοκιμές εξακολουθεί να είναι μη ικανοποιητικός σε χώρες με ένα πρόγραμμα προσυμπτωματικού ελέγχου FOBT [4, 5, 6]. Ως εκ τούτου, υπάρχει ακόμη μια μεγάλη ανικανοποίητη ανάγκη έκκληση για μη ή ελάχιστα επεμβατική, συμβατό, οικονομικά αποδοτική και ακριβή δοκιμή ελέγχου για την ανίχνευση ΑΡ και CRC σε πρώιμο στάδιο. Μια δοκιμασία διαλογής με βάση το αίμα είναι ιδιαίτερα ελκυστική λόγω της ελάχιστης εισβολής του και την υψηλή αποδοχή από τους ασθενείς. Ειδικότερα εμείς και άλλοι έχουν αναφέρει υπογραφές που προέρχονται από μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος προφίλ (PBMC) έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με το πεπτικό [7, 8, 9, 10], του μαστού [11], η νεφρική [12, 13], πνευμονικής [14] και καρκίνοι της ουροδόχου κύστης [15]. Οι δοκιμές αυτές είναι εννοιολογικά διαφορετική από τις κλασικές δοκιμές βιοδεικτών όγκου, καθώς βασίζονται στην ανίχνευση της απόκρισης ξενιστή σε σήματα που προέρχονται από όγκους [16, 17] και όχι σε δείκτες που προέρχονται από τον ίδιο τον όγκο.

Κατά την αναζήτηση για τις διαφορές στην έκφραση γονιδίων και την ταυτοποίηση των μεταγραφών RNA για να χρησιμοποιηθεί στη συνέχεια ως δυνητικός βιοδείκτες, που χρησιμοποιούνται συνήθως μέθοδοι περιλαμβάνουν microarray πλατφόρμες υβριδισμού DNA ή τεχνικές προσδιορισμού αλληλουχίας RNA που βασίζεται σε [18, 19]. Αν και ισχυρό, αυτές οι μέθοδοι είναι πολύπλοκες, χρονοβόρες και δαπανηρές, και παράγουν μεγάλο όγκο δεδομένων που απαιτεί εξειδικευμένα εργαλεία βιοπληροφορικής και οι αρμοδιότητες για την ανάλυσή τους. Επιπλέον, εντοπίστηκαν γονίδια ενδιαφέροντος απαιτούν περαιτέρω επικύρωση από πιο ακριβείς και ευαίσθητες μεθόδους, όπως σε πραγματικό χρόνο qPCR, πριν να μπορούν να μεταφραστούν σε κλινικά χρήσιμη δοκιμές [20]. Σε εναλλακτική λύση σε αυτές τις τεχνικές, υψηλής απόδοσης σε πραγματικό χρόνο qPCR πλατφόρμες απέδειξαν να αποδίδουν καλά όταν επιλογή υποψήφιο γονίδιο προήλθε από στερεά επιστημονικές αποδείξεις, παρά το γεγονός ότι επιτρέπουν την ανάλυση μόνο ένα κλάσμα του μεταγραφικό [21]. Σημαντικά, οι ανακαλύψεις βασίζονται σε βιοδείκτη qPCR πλατφόρμες έχουν το μεγάλο πλεονέκτημα ότι μια περαιτέρω βαθμίδα επικύρωσης εν όψει της κλινική χρήση τους δεν είναι απαραίτητη. Επιπλέον, είναι ουσιαστικά λιγότερο ακριβό από ολόκληρο το γονιδίωμα προσεγγίσεις, επιτρέποντας την ανάλυση ενός μεγαλύτερου σετ δείγματος και αυξάνοντας έτσι την στατιστική ισχύ της μελέτης.

Εδώ αναφέρουμε την ανακάλυψη και τον χαρακτηρισμό ενός πάνελ 29-γονιδίου σε PBMC για την ανίχνευση ορθοκολικού αδενώματος και καρκινώματος χρησιμοποιώντας μια νανολίτρου υψηλής απόδοσης πλατφόρμα qPCR (OpenArray) [22]. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε δείγματα προοπτικά συλλέγονται από μια πολυκεντρική, μελέτη ασθενών-μαρτύρων στην οποία οι ασθενείς παραπέμφθηκαν για κολονοσκόπηση ή προγραμματισμένη για τη χειρουργική επέμβαση για την αφαίρεση CRC. Δείξαμε επίσης ότι ο πίνακας γονίδιο θα μπορούσε εύκολα να μεταφερθούν και να εφαρμοστούν σε ένα ιατρικό εργαστήριο φιλική δοκιμασία, η οποία αποτελεί βασικό βήμα για την ανάπτυξη μιας νέας οικονομικά αποδοτικό, απλό τεστ προσυμπτωματικού ελέγχου του καρκίνου του παχέος εντέρου με βάση το αίμα.

Υλικό και Μέθοδοι

ασθενείς

Μια μελέτη ασθενών-μαρτύρων (DGNP-COL-0310), μεταξύ των οποίων τρεις Νότιας Κορέας και έξι ελβετικά κέντρα που συμμετείχαν 1665 άτομα άνω των 50 ετών που προβλέπεται για την κολονοσκόπηση από το γενικό γιατρό ή είχαν προγραμματιστεί για τη χειρουργική επέμβαση, διεξήχθη τον Ιούνιο του 2010 έως τον Απρίλιο του 2013. Η μελέτη ειδικά μελετηθεί και σχεδιαστεί για την ανάπτυξη και επικύρωση μιας νέας δοκιμασίας για CRC έλεγχο. Η φάση βιοδεικτών ανακάλυψη έλαβε χώρα κατά τη διάρκεια του πρώτου εξαμήνου του πρόσληψης του ασθενούς. Για το σκοπό αυτό, ένα υποσύνολο των 144 ατόμων, που διατίθενται για τον έλεγχο, CRC και ΑΡ ομάδες (Πίνακας 1), επελέγη τυχαία, και χρησιμοποιούνται για την δημιουργία προφίλ γονιδιακής έκφρασης με υψηλής απόδοσης qPCR.

Η

άτομα δεν είχαν καμία πρώτου βαθμού οικογενειακό ιστορικό CRC ή ένα γνωστό προδιάθεση CRC, προηγούμενο ιστορικό πολυπόδων ή καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου CRC, χωρίς ηπατοχολική, ουροποιογεννητικού, αυτοάνοσων και φλεγμονωδών διαταραχών, συμπεριλαμβανομένων των φλεγμονωδών νόσων του εντέρου, μολυσματικές ασθένειες και πυρετό εντός 4 εβδομάδων πριν από την κολονοσκόπηση. Οι χρόνιες ασθένειες κοινές στην παλιά πληθυσμού, όπως ο διαβήτης, η υπέρταση, υπερχοληστερολαιμία, καρδιακή ανεπάρκεια, δεν θεωρήθηκαν ως κριτήρια αποκλεισμού. Ένα θέμα ελέγχου ορίστηκε ως ένα άτομο χωρίς παρελθόν και το παρόν ιστορικό ορθοκολικού βλαβών ή ασθενειών (π.χ. μικρά αδενώματα, υπερπλαστικούς πολύποδες, καρκίνος). Η ομάδα AP περιλαμβάνονται άτομα διαγνώστηκαν με αδένωμα μεγαλύτερο από 1 cm, με βάση την ενδοσκοπική μέτρησης. Η ομάδα CRC περιελάμβανε ασθενείς με καρκίνωμα σε όλα τα τέσσερα στάδια ΤΝΜ. Τελική διάγνωση βασίστηκε σε κολονοσκόπηση και ιστοπαθολογική αξιολόγηση.

Ηθικά

έγκρισης

Το πρωτόκολλο της μελέτης (DGNP-COL-0310) εγκρίθηκε από τις αρμόδιες συμβούλια επανεξέταση επιτροπές δεοντολογίας και για την έρευνα σε ανθρώπινα υποκείμενα των καντόνι της Βέρνης, Ελβετία (Kantonale Etikkommission Βέρνης, Όχι ΚΕΚ 139/10), Canton St. Gallen, Ελβετία (Ethikkommission des Kantons Σεν Γκάλεν, Νο EKSG 10/091 /1Β), καντονιού Vaud, Ελβετία (Επιτροπή Cantonale d’éthique de la recherche sur l’être ανθρώπινη, Νο VD 77/10), Canton Βασιλεία, Ελβετία (Ethikkommission beider Βασιλείας, Νο EKBB 242/10), της αποχώρησης Νοσοκομείο, Yonsei University College of Medicine, η Νότια Κορέα (Νο 4-2010-0128) και από το θεσμικό Διοικητικό συμβούλιο Βιοηθικής αναθεώρηση του Εθνικού Πανεπιστημίου της Σεούλ Νοσοκομείο, Νότια Κορέα (IRB Νο H-1004-020-315). Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες στη μελέτη ακολουθώντας τις τοπικές ηθικές κατευθυντήριες γραμμές.

συλλογή και επεξεργασία αίματος

περιφερικού αίματος από όλα τα άτομα συντάχθηκε είτε μέχρι 30 ημέρες πριν ή έως και 12 εβδομάδων μετά την κολονοσκόπηση και πριν από κάθε πολύποδα ή καρκίνου εκτομή ή προεγχειρητική χημειοθεραπεία. Τα δείγματα αίματος συλλέχθηκαν σε σωλήνες 4×4 ml BD Vacutainer CPT (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Γεμιστά σωλήνες CPT διατηρήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου και ο διαχωρισμός PBMC εκτελέστηκε μέσα σε 6 ώρες σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. PBMC σφαιρίδια επανααιωρήθηκαν σε RNA

αργότερα

Solution (Life Technologies, Carlsbad, CA) και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C.

RNA παρασκευή

Αυτοματοποιημένη καθαρισμό του συνολικού RNA ήταν πραγματοποιείται σε QIAcube από RNeasy Mini kit (Qiagen, Venlo, Κάτω Χώρες) και περιελάμβανε θεραπεία ϋΝάσης. Η συγκέντρωση του RNA μετρήθηκε με φασματοφωτόμετρο Nanodrop (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ) και η ακεραιότητα του RNA αναλύθηκε με Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Δείγματα με RIN & lt? 7 θεωρήθηκαν κακής ποιότητας και απορρίπτεται. Κατά μέσο όρο RNA έδειξε RIN 9 ± 0,5. Απομονωμένα ολικό RNA δειγματίστηκε και φυλάχθηκε στους -80 ° C. Προκειμένου να ανταποκριθεί στην υψηλή συγκέντρωση του RNA που απαιτείται από το πρωτόκολλο του RT, δείγματα RNA συστηματικά καταβυθίζεται μετά από μια τυπική /3Μ μέθοδο οξικού νατρίου 100% αιθανόλη.

σχεδιασμός διαλογής και σύνολο δεδομένων γενιά

Για να βρουν σχετικές βιοδεικτών στο αίμα για CRC, πραγματοποιήσαμε γονίδιο διαλογή έκφρασης σε 144 δείγματα που προέρχονται από ασθενείς με AP ή CRC και θέματα ελέγχου. Η διαλογή επινοήθηκε σε 2 φάσεις (Σχήμα 1). Πρώτον, προφίλ 93 δείγματα με ένα μεγάλο πάνελ γονίδιο. Ο πίνακας περιελάμβανε 667 υποψήφια, εκ των οποίων 42 βιοδεικτών προηγουμένως εντοπιστεί από το εργαστήριο μας [8] και 625 νέες υποψήφιος που θα επιλεγεί από τη βιβλιογραφία (S1 πίνακα). Επίσης προστέθηκαν Τρία γονίδια αναφοράς επί qPCR κανονικοποίηση των δεδομένων. Η βιβλιογραφική έρευνα επικεντρώθηκε σε γονίδια, μοριακών οδών και βιολογικών διεργασιών που θεωρούνται σχετικές με την ανταπόκριση του όγκου-ξενιστή, όπως φλεγμονή και ανοσολογική απόκριση, εισβολή και μετάσταση όγκου, αιμοποίηση, μονοπάτια μεταγωγής σήματος (στην συγκεκριμένη οδό NF-kB), χημειοκινών και κυτοκίνες (ιδιαίτερα IL-1, IL-2), πρωτεΐνες εξωκυτταρικής μήτρας, μόρια προσκόλλησης και δείκτες κυτταρικής επιφάνειας. Για κάθε υποψήφιο γονίδιο, μία δοκιμασία TaqMan επιλέχθηκε από μια εμπορική αποθήκη (τεχνολογίες Life, Carlsbad, CA) (S1 Πίνακας) και διανέμεται σε τρία 224-δοκιμασία Open πλάκες Array, το καθένα έχει διάσταση 12 δείγματα παράλληλα. Ως εκ τούτου, για την πλήρη προφίλ 12 δείγματα, τρεις πλάκες 224-δοκιμασίας, θερμοκυκλοποιημένα παράλληλα, χρησιμοποιήθηκαν. Για να ελέγξετε για ενδο-πλάκα μεταβλητότητα και η επαναληψιμότητα, το γονίδιο αναφοράς RPLP0 αναλύθηκε για κάθε δείγμα σε όλες τις 3 πλάκες. RPLP0 ανάλυση τυπική απόκλιση (SD) των 3 επαναλήψεων του δείγματος παρουσίασαν μέση SD 0,21 Ct, με ενδοτεταρτημοριακό εύρος των 0,14 – 0,34, υποδεικνύοντας ότι η μέτρηση του δείγματος ήταν ακριβής και εξαιρετικά επαναλήψιμη σε όλη τη σειρά 3-πλάκα. Σε αυτή τη φάση θα επικεντρωθεί στην πιάσει την ευρύτερη θέμα βιολογική μεταβλητότητα και όχι την ελαχιστοποίηση της τεχνικής μία, ως εκ τούτου συστηματικές επαναλήψεις δείγματος δεν πραγματοποιήθηκαν, για να καταστεί δυνατή η σκιαγράφηση ενός μέγιστου αριθμού δειγμάτων.

Σε ένα πρώτο στάδιο του ελέγχου που εκτελούνται στο OpenArray σύστημα, 670 γονίδια είχαν προφίλ σε 93 δείγματα. Από αυτές, επιλέχθηκαν 163 γονίδια και περαιτέρω δοκιμαστεί σε φάση 2 σε επιπλέον 51 δείγματα. Το τελικό σύνολο δεδομένων που περιλαμβάνονται 144 δείγματα προφίλ με 163 γονίδια. Μια ομάδα 29 γονιδίων συντάχθηκε με βάση την υψηλότερη δύναμη να διακρίνει ΑΡ /CRC από ελέγχους από μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση. Τέλος, ο πίνακας 29-γονίδιο είχε επικυρωθεί με μια πλατφόρμα LightCycler480, που χρησιμοποιούνται συνήθως σε κλινικά εργαστήρια.

Η

Από 670 γονίδια που αναλύθηκαν, 133 δεν έδειξε καμία έκφραση ή κακή ενίσχυση PCR. Τα υπόλοιπα 534 υποψήφια γονίδια και 3 γονίδια αναφοράς συνολική και εκφράζεται με διάμεση τιμή Ct 22,94 (ενδοτεταρτημοριακό εύρος: 21,28 – 25,24) και ένα μέσο SD 0,7 (ενδοτεταρτημοριακό εύρος: 0,59 – 1,04) (S2 Πίνακας). προφίλ Gene πέρασε μέσω ενός ελαφρύ βήμα φιλτραρίσματος κατά την οποία έπρεπε να πληρούν τουλάχιστον ένα από τα ακόλουθα κριτήρια για τουλάχιστον μία από την ανάλυση διάκρισης (

i

.

e

. έλεγχος έναντι CRC ή ελέγχου έναντι AP): ρ-τιμή μικρότερη από 0,1 ή πτυσσόμενο αλλαγή μεγαλύτερη από 1,5 (γραμμική κλίμακα). Επιπλέον, βιοδείκτες έχουν καθοριστεί προηγουμένως στο εργαστήριο μας [8] διατηρήθηκαν σε αυτή τη φάση, ανεξάρτητα p-αξία τους ή να πάει πάσο αλλαγή, προκειμένου να αξιολογηθεί σε ένα μεγαλύτερο σύνολο του δείγματος και χρησιμοποιώντας μια πολυμεταβλητή στατιστική προσέγγιση. Συνολικά, επελέγησαν 160 γονίδια, μαζί με τα τρία γονίδια αναφοράς, για τη δεύτερη φάση της εξέτασης. Αυτή τη φορά τα 163 γονίδια, που μετράται από 168 δοκιμασίες (5 γονίδια με πολύ χαμηλή έκφραση είχε μια δεύτερη δοκιμασία για την επικύρωση του μέτρου που λαμβάνεται), διατέθηκαν σε μια ενιαία πλάκα (S3 Πίνακας). Πρόσθετες 51 δείγματα προφίλ εις διπλούν, με αυτό το μειωμένο πίνακα γονίδιο για την αύξηση του μεγέθους του δείγματος και η στατιστική ισχύς στις επόμενες αναλύσεις. Επίσης, 40 δείγματα ήδη διαμορφωμένο στη φάση 1, επανα-αναλύθηκαν για να εξασφαλιστεί η επαναληψιμότητα των μετρήσεων σε όλη την φάση 1 και φάση 2 και το διαφορετική μορφή πλάκας (224-

vs

. Format 168-δοκιμασίας). Τα επίπεδα έκφρασης που λαμβάνονται και στις δύο φάσεις για αυτά τα 40 δείγματα υψηλή συσχέτιση (R

2 = 0,993) (S1 σχήμα), προτρέποντας μας να συνδυάσουμε τις 93 και 51 δείγματα, προφίλ για τα 163 γονίδια, σε ένα ενιαίο τελικό σύνολο δεδομένων ( Εικ. 1). Για την κατάρτιση του συνόλου δεδομένων, χρησιμοποιήθηκαν οι μέσες τιμές των 40 δείγματα μετρήθηκαν εις διπλούν.

νανολίτρου υψηλής απόδοσης qPCR

Εννιακόσια ng ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε όγκο 20 μl χρησιμοποιώντας την υψηλής Ικανότητα cDNA Reverse Transcription kit (Life Technologies, Carlsbad, CA) με τυχαία εναύσματα, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

προφίλ γονιδιακής έκφρασης εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα OpenArray [22] (Life Technologies, Carlsbad, CA) , ένα νανολίτρου υψηλής απόδοσης πλατφόρμα PCR σε πραγματικό χρόνο, επιτρέποντας 3072 αντιδράσεις σε μια ενιαία πλάκα. Οι αντιδράσεις PCR διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο πλάκες σε πραγματικό χρόνο TaqMan OpenArray. Εν συντομία, τα μίγματα αντίδρασης PCR που περιέχει 2.5 μλ GeneAmp Fast PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA), 1 μΐ TaqMan OpenArray Remix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA), 0,3 μΙ RNase-free νερό, και 1,2 μΐ cDNA, φορτώθηκαν αυτόματα σε μονές ή διπλές αντίδρασης στις OpenArray πλάκες χρησιμοποιώντας ένα όργανο OpenArray AccuFill σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Το πρωτόκολλο θερμική κυκλοποίηση αποτελούνταν από 40 κύκλους στους 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 1 λεπτό. Στο τέλος κάθε γύρου, οι εικόνες, τα οποία συλλέγονται πριν και κατά τη διάρκεια της εκτέλεση PCR, ελέγχθηκαν οπτικά για να ελέγξει για misloading ή πλάκες διαβάζοντας τα προβλήματα του δείγματος. Οι τιμές Ct υπολογίστηκαν από το λογισμικό OpenArray ανάλυση με τη χρήση αυτόματων κατωφλίου με την ελάχιστη δέσμη σήματος εμπιστοσύνης ct σε 300. Οι τιμές κάτω από την ελάχιστη ρύθμιση του σήματος έδειξε μια αποτυχημένη αντίδραση ή καθόλου ενίσχυση και τις τιμές που λείπουν εμφανίστηκε στα εξαγόμενα δεδομένα. Τις περισσότερες φορές μια αποτυχημένη αντίδραση οφειλόταν σε επίπεδα έκφρασης πέρα ​​από το όριο ανίχνευσης. Δεδομένου ότι η μέγιστη τιμή Ct ανιχνεύθηκε ήταν κατώτερη από 36, οι τιμές αυτές αντικαταστάθηκαν από την αυθαίρετη τιμή Ct των 36. Λείπει αξίες κρίνεται ότι προκαλείται από τεχνικούς λόγους αντικαταστάθηκαν από τις μέσες τιμές Ct του συγκεκριμένου γονιδίου σε όλα τα δείγματα. Α RNA αναφοράς (Ref Xpress Human καθολική ολικό RNA) (Qiagen, Venlo, Κάτω Χώρες) ήταν παρούσα ως θετικός έλεγχος τουλάχιστον μία φορά σε κάθε εκτέλεση PCR, προκειμένου να διασφαλιστεί η διαδικασία και η σταθερότητα του αντιδραστηρίου καθώς και αναπαραγωγιμότητα πάνω τρέχει διαφορετικές PCR. Οι αρνητικοί έλεγχοι που περιέχουν νερό αντί cDNA χρησιμοποιήθηκαν για να αποκλείσει πιθανή μόλυνση του DNA.

επί 384 φρεατίων σε πραγματικό χρόνο qPCR

Διακόσια ng του συνολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας SuperScript Vilo cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

σε πραγματικό χρόνο έτοιμο δοκιμασίες Προσαρμοσμένη RT-qPCR (Roche, Βασιλεία, Ελβετία) με βάση την Οικουμενική ProbeLibrary (UPL) τεχνολογία (S4 πίνακα), ήταν προ-φορτωμένο σε πλάκες 384-φρεατίων από τον κατασκευαστή. Real-time PCR ανάλυση σε πλάκες 384-φρεατίων διεξήχθη στο όργανο Lightcycler 480 (Roche, Βασιλεία, Ελβετία) σε 144 δείγματα. Οι αντιδράσεις PCR διεξήχθησαν εις διπλούν σε πλάκες των 384-φρεατίων σε συνολικό όγκο 10 μΙ. Κάθε καλά φορτώθηκε από ένα αυτοματοποιημένο πιπέτα (Microlab Starlet, Hamilton Ρομποτικής, Reno, NV) με 5 μλ πραγματικό χρόνο Έτοιμο ανιχνευτές DNA Master Mix (Roche, Βασιλεία, Ελβετία) και το cDNA ισοδύναμο του 2,5 ng ολικού RNA. Το πρόγραμμα qPCR αποτελείτο από 2 δευτερόλεπτα σε 95 ° C και 30 δευτερόλεπτα στους 60 ° C για 40 κύκλους. Θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες δημιουργήθηκαν με κάθε παρτίδα ανάδρομης μεταγραφής και συμπεριλήφθηκαν σε κάθε εκτέλεση qPCR για κάθε δοκιμασία στόχο. Ο αρνητικός μάρτυρας δεν περιείχαν ούτε RNA ούτε cDNA για να επιβεβαιώσετε σημειώθηκε καμία μόλυνση. Ο θετικός έλεγχος έγινε με μία τυποποιημένη ποσότητα των Ανθρωπίνων Οικουμενική RNA αναφοράς (Clontech, Mountain View, CA) δειγματίστηκε και φυλάχθηκε στους -80 ° C. Για qPCR τρέξει την επικύρωση, ο αρνητικός μάρτυρας απέδωσε καμία ενίσχυση ή ένα σημείο διέλευσης αξίας (Cp) προς τα πάνω ή ίσο με 35, και το θετικό μάρτυρα μια τιμή Cp, για κάθε γονίδιο στόχο, που έπεσε μέσα σε ένα προκαθορισμένο εύρος. τιμές Cp ήταν υπολογίζονται αυτόματα με το λογισμικό ανάλυσης LightCycler 480 σύμφωνα με την

ου παράγωγο μέγιστη μέθοδος 2 [23].

Η στατιστική ανάλυση

δεδομένα PCR που προέρχονται από το OpenArray και τις πλατφόρμες LC480 ομαλοποιήθηκαν με τη μέθοδο ΔΟΙ χρησιμοποιώντας το μέσο όρο των τριών γονιδίων καθαριότητας RPLP0, NACA και TPT1. Επελέγησαν Αυτά τα γονίδια επειδή ήταν η πιο σταθερή σε 3 PBMC που σχετίζονται με το σύνολο δεδομένων μικροσυστοιχιών διαθέσιμη από τη βάση δεδομένων GEO [24] και επίσης σε ανάλυση qPCR εκτελείται από εμάς (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

αλλαγή Gene φορές έκφρασης, ορίστηκε ως με, όπου είναι τα κανονικοποιημένα δεδομένα.

Wilcoxon rank test [25] εφαρμόστηκε στα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης κανονικοποιούνται, προκειμένου να καθοριστούν τα γονίδια σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενο μεταξύ των ομάδων. Επιπλέον, στη φάση 2 ελέγχου, δοκιμών κατάταξης Wilcoxon εφαρμόστηκε σε 500 τυχαία επιλεγμένα σύνολα δεδομένων (bootstrap) και σημαντικότητας ορίστηκε σε γονίδια που εμφανίζεται σημαντική (p-value & lt? 0,05) σε τουλάχιστον 250 δολώματά από 500.

Η πολυπαραγοντική ανάλυση που χρησιμοποιείται για την επιλογή χαρακτηριστικών στη φάση 2 διαλογής περιλάμβανε τις ακόλουθες μεθόδους:. K-top pair βαθμολόγησης, μια παράμετρο-free, ο αλγόριθμος επιλογής χαρακτηριστικών [26], και τιμωρείται η μέθοδος λογιστικής παλινδρόμησης με διαφορετικούς αλγόριθμους [27, 28]

για να αξιολογηθεί η προγνωστική ακρίβεια του πίνακα 29-γονιδίου, τιμωρείται μοντέλα λογιστικής παλινδρόμησης τοποθετηθεί στο σύνολο δεδομένων και επικυρώνεται από μη επικαλυπτόμενα bootstrap μέθοδο [29]. Πεντακόσια τυχαία σύνολα δεδομένων συντάχθηκαν με την αντικατάσταση από το σύνολο δεδομένων? κάθε bootstrap είχαν το ίδιο μέγεθος με το σύνολο εκπαίδευσης. Το μοντέλο είχε τοποθετηθεί εκ νέου σε κάθε εκκίνησης και πιστοποιηθεί σε δείγματα out-of-τσάντα. Οι ειδικότητα και ευαισθησία μέσες τιμές πάνω από 500 δολώματά υπολογίστηκαν και δέκτη Λειτουργικά Χαρακτηριστικά (ROC) καμπύλες με γραφική παράσταση της ευαισθησίας έναντι του ψευδώς θετικό ποσοστό (1-ειδικότητα). Περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) υπολογίστηκε.

Ο συντελεστής συσχέτισης Pearson χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει γραμμική συσχέτιση μεταξύ των μετρήσεων γονίδια »από δύο μέσων.

Το περιβάλλον στατιστικές Ε χρησιμοποιήθηκε για στατιστικές αναλύσεις.

Αποτελέσματα

Ορισμός ενός πάνελ 29 γονιδίων για καρκίνο του παχέος εντέρου και αδένωμα

ανίχνευσης

Το σύνολο των δεδομένων που προκύπτουν από τη φάση 2 διαλογής (163 γονίδια και 144 δείγματα) αναλύθηκε και φιλτράρεται για χαμηλή έκφραση και ασταθής γονιδίων μεταξύ των δύο φάσεων, και 20 γονίδια περαιτέρω απορρίπτονται, μειώνοντας τον αριθμό των υποψηφίων γονιδίων για 140. τα δεδομένα διερευνηθούν προκειμένου να καθορίσει ποια γονίδια, μόνα τους ή σε συνδυασμούς, είχε την υψηλότερη δύναμη να διακρίνει CRC , ΑΡ και AP μαζί με την πρώιμη CRC στάδιο (ΑΡ + CRC I-II) από την ομάδα ελέγχου (S3 πίνακα). Επιπλέον, η ομάδα CRC συγκρίθηκε με ομάδα AP, για τον εντοπισμό συγκεκριμένων γονιδίων σε θέση να διαφοροποιήσει μεταξύ CRC και AP. Σε γενικές γραμμές, τα περισσότερα από τα γονίδια φάνηκε να τα πάνω ρυθμισμένα στις ομάδες CRC και ΑΡ σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Η παρατηρούμενη γονιδιακή έκφραση φορές οι αλλαγές ήταν σχετικά μέτρια, δεν υπερβαίνει το ένα συντελεστή 2,3 (log2 = 1,22) (Σχήμα 2). Όταν ένα φίλτρο που βασίζεται σε μια ομάδα FC & gt? 1.3 και τιμή-p & lt? 0,05 εφαρμόστηκε σε όλες τις συγκρίσεις ομάδας (CRC /Con, AP /Con, AP + CRCI-II /Con, CRC /AP), βρήκαμε 28 γονίδια που ικανοποίησε και τα δύο κριτήρια (S3 Πίνακας). Ανάμεσα σε αυτούς, 14 διακρίσεις CRC και 8 AP από την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 2), δύο εκ των οποίων ήταν κοινά και στις δύο συνθήκες (CES1 και IL1B). Επτά ήταν ειδικά μόνο για το διαχωρισμό AP από την CRC και 1 για τη διάκριση AP + CRC Ι-ΙΙ. Γονίδια επιβεβαιώθηκε ότι είναι σημαντικό όταν στατιστική δοκιμή εφαρμόστηκε σε 500 τυχαία σύνολα δεδομένων (bootstrap, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Τα οικόπεδα ηφαίστειο συνοψίζουν τη γονιδιακή έκφραση πολλαπλών μεταβολών (FC) (

x-άξονα

) και οι ρ-τιμές (

γ-άξονα

) για τις συγκρίσεις: A, CRC έναντι ελέγχου ή, Β, ΑΡ έναντι του ελέγχου. P-τιμή αποκοπής ορίστηκε σε 0,05 (οριζόντια γραμμή) και διπλώστε την αλλαγή του κατώτατου ορίου στο ± 0,38 (ισοδύναμο με ± 1.3 σε γραμμική κλίμακα, κάθετη γραμμή). Μια FC ίση με 1 σημαίνει ότι το γονίδιο εκφράζεται στην ομάδα των τόκων, κατά μέσο όρο, διπλάσια από ό, τι στην ομάδα ελέγχου.

Η

Η πολυπαραγοντική ανάλυση εφαρμόστηκε στο σύνολο δεδομένων για διακρίσεις CRC, AP , AP + CRC από την ομάδα ελέγχου. Περιελάμβανε KTS ζεύγους [26] και πέντε διαφορετικούς αλγορίθμους που βασίζονται σε κυρώσεις μέθοδο λογιστικής παλινδρόμησης [27, 28, 30] για τη μεταβλητή επιλογές και την τοποθέτηση μοντέλο. Γονίδια κατατάσσονται ανάλογα με τη συχνότητα της επιλογής από τη μέθοδο που χρησιμοποιείται, που συνοψίζεται από την πολυμεταβλητή βαθμολογίας. Τριάντα οκτώ γονίδια με βαθμολογία τουλάχιστον δύο κρατήθηκαν για να καταρτίσει τον τελικό κατάλογο γονίδιο (S3 Πίνακας).

Η μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική γονίδιο λίστες ήταν τότε συγχωνευθεί, καταλήγοντας σε ένα τελικό κατάλογο των 29 γονιδίων (Πίνακας 2). Είναι ενδιαφέρον ότι, οι περισσότεροι από τους μονομεταβλητών top-σκοράροντας γονίδια φάνηκε να είναι, επίσης, τα top-σκοράροντας γονιδίων στην πολυπαραγοντική ανάλυση. Τέσσερα γονίδια (MAP2K3, MAPK6, CD63, ITGB5), εξαιρούνται από το φίλτρο της μονοπαραγοντική ανάλυση επειδή FC & lt? 1.3 αλλά στατιστικά σημαντική (p αξία & lt? 0.05), ήταν «γλίτωσαν» από την πολυπαραγοντική ανάλυση. Από τις υπόλοιπες 10 γονίδια δεν είναι στατιστικά σημαντική και ενσωματωθεί στις τελικές λίστες χάρη στην πολυμεταβλητή προσέγγιση (GATA2, LTF, ΜΜΡ9, CXCL10, MSL1, RHOC, FXYD5), οι τρεις πρώτοι παρουσίασαν FC & gt?. 1.3

Λειτουργική ανάλυση που πραγματοποιήθηκε με το πακέτο Ingenuity Διαδρομή ανάλυση (ΜΠΒ? www.qiagen.com/ingenuity), αποκάλυψε ότι η ομάδα εμπλουτίστηκε με γονίδια που εμπλέκονται στην λευκοκύτταρα μετανάστευση και χημειοταξία (CCR1, CXCL10, CXCL11, CXCR3, IL1B, IL8, ITGA2, ΜΜΡ9, S100A8) (Πίνακας 3). Αυτές οι κυτταρικές λειτουργίες είναι στενά που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό διακίνηση των κυττάρων και φλεγμονή. Εξαιρετικά εκπροσωπούνται ήταν επίσης γονίδια που εμπλέκονται στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση (BCl3, CD63, EGR1, GATA2, ΙΟΥΝ, LTF, MAPK6, ΜΜΡ 11, NME1, PPARG, TNFSF13B), αντανακλώντας έναν πιθανό ρόλο στην αιμοποίηση.

Η

Επικύρωση της 29-γονιδίου πίνακα

για να αξιολογηθεί η κλινική σημασία του πίνακα 29-γονιδίων μας, ιδίως της προγνωστική ακρίβεια, τιμωρείται λογιστικής παλινδρόμησης εφαρμόστηκε στο σύνολο δεδομένων και εντοιχισμένες μοντέλα επικυρώθηκαν από μη-επικαλυπτόμενες εκκίνησης μέθοδος. Μοντέλα μπορούσε διακρίσεις CRC ή AP & gt? 1 εκατοστό από ελέγχους με μέσο όρο ευαισθησία 75% και 59%, αντίστοιχα. Η μέση εξειδίκευση, που ορίζεται ως ο αριθμός των ελέγχων ταξινομείται ορθώς επί του συνολικού αριθμού των ελέγχων, ήταν 91%. ανάλυση ROC προσδιορίζεται μια AUC 0,88 (0,83-0,92, 95% CI) και 0,85 (0,78 – 0,91, 95% CI) για CRC ή ανίχνευση ΑΡ, αντίστοιχα (Σχήμα 3). Όταν η ίδια προσέγγιση εφαρμόστηκε στα 15 κορυφαία γονίδια για CRC ή AP διακρίσεις από μονοπαραγοντική ανάλυση μόνο (Πίνακας 2), προγνωστική ακρίβεια μειώθηκαν δραστικά. Όταν η ειδικότητα ορίστηκε σε 91%, CRC ανιχνεύθηκαν με ευαισθησία 65% και AP με ευαισθησία 37%, με μια AUC 0,86 (0,77-0,84, 95% CI) και 0,77 (0,70 – 0,82, 95% CI ), αντίστοιχα. Το αποτέλεσμα αυτό υποστηρίζεται η επιλογή μας για την ενσωμάτωση μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική προσέγγιση για την επιλογή γονιδίων: γονίδια που διαφορετικά θα είχαν απορριφθεί, διότι δεν πληρούν τη σταθερή τιμή p και τα κριτήρια FC, ήταν πράγματι πολύτιμη για CRC και AP ανίχνευσης, όπως κρίνεται από την πολυμεταβλητή μεθόδους

Α. Περίληψη των ψευδών και αληθινή θετικά ποσοστά του πίνακα 29-γονίδιο με τον χαρακτηρισμό υποθέσεων CRC. B. Περίληψη των ψευδών και αληθινή θετικά ποσοστά του πίνακα 29-γονίδιο με τον χαρακτηρισμό υποθέσεων AP. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση 500 επικυρώσεις εκκίνησης. Οι Boxplots αντιπροσωπεύουν την κατανομή των 500 δολώματά. Η μαύρη γραμμή αντιπροσωπεύει τις μέσες τιμές πάνω από 500 δολώματά για κλινική ειδικότητα και ευαισθησία.

Η

Δοκιμασία μετανάστευσης σε 384 φρεατίων πλατφόρμα qPCR

Η OpenArray πλατφόρμα αποδειχθεί ότι είναι πολύτιμο για την υψηλή throughput προφίλ γονιδιακής έκφρασης και ανακάλυψης βιοδεικτών. Ωστόσο, αυτή η πλατφόρμα δεν είναι κατάλληλο σε συνήθεις εργαστηριακές ρύθμιση κλινικές, στις οποίες ευκολία χρήσης, την ευελιξία και χαμηλό κόστος προτιμώνται. Με σκοπό την ανάπτυξη του πίνακα 29-γονιδίου σε μια ευρέως χρησιμοποιούμενη δοκιμασία ελέγχου CRC, αξιολογήσαμε τη συμπεριφορά του πίνακα σε μια πλατφόρμα qPCR που συνήθως υιοθετηθεί από κλινικά εργαστήρια. Τα 144 δείγματα προφίλ με τον πίνακα 29-γονίδιο χρησιμοποιώντας ένα LightCycler 480 (LC480) όργανο και μια σειρά από εμπορικά διαθέσιμες δοκιμασίες probe-based (Universal ProbeLibrary, Roche), προεγκατεστημένο σε πλάκες 384-καλά.

Συσχέτιση και η ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης έδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου που μετράται στα δύο πλατφόρμες ήταν πολύ συγκρίσιμες (συντελεστής συσχέτισης: 0.933) (Εικ 4Α). Σε γενικές γραμμές, η έκφραση του γονιδίου έδειξαν παρόμοια διακύμανση μεταξύ των δειγμάτων (Σχήμα 4Β). Ωστόσο, μια ομάδα ταπεινός εκφρασμένων γονιδίων που εμφανίζονται μετρήσεις με μικρότερες τυπικές αποκλίσεις πάνω στην πλατφόρμα LC480 ό, τι στο OpenArray ένα, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι δοκιμασίες στο όργανο LC480 είναι πιο ακριβή. Όταν επαναλαμβάνεται η ανάλυση γονιδιακής έκφρασης απόκλιση μεταξύ των ελέγχων και CRC ομάδων με το σύνολο δεδομένων LC480, βρήκαμε ότι σχετική αφθονία και η στατιστική σημαντικότητα για τα 29 γονίδια ήταν παρόμοια ή με την παρόμοια τάση σε ό, τι παρατηρήθηκε στην OpenArray σύνολο δεδομένων (Εικόνα 4C και 4D) . Ωστόσο, για πέντε γονίδια (PTGES, ΜΜΡ 11, IL8, CCR1, S100A8) στατιστική σημαντικότητα χάθηκε όταν μετριέται στο LC480.

οικόπεδα διασποράς σύγκριση αναλύσεις για κάθε γονίδιο για τα σύνολα δεδομένων που δημιουργούνται στην LC480 και OpenArray πλατφόρμες . Οι ακόλουθες μεταβλητές χρησιμοποιήθηκαν: A. Οι μέσες κανονικοποιημένες τιμές έκφρασης (ΔCp και ΔΟΙ) (R

2: 0.933), Β Μέση τυπικές αποκλίσεις (SD) σε σχέση με κάθε γονιδίου στόχου μετράται, έκφραση Γ Gene φορές αλλαγές μεταξύ το CRC και την ομάδα ελέγχου (γραμμική απόλυτες τιμές), Δ ρ-τιμές από τις στατιστικές δοκιμές μεταξύ του CRC και την ομάδα ελέγχου (log μεταμορφωθεί). Γραμμές αντιπροσωπεύουν μια τιμή p & lt? 0,05. έχουν ονόματα γονίδιο έχουν επικαλύπτονται με τις γραφικές παραστάσεις

Η

Συζήτηση και Συμπεράσματα

Στην παρούσα εργασία έχουμε εντοπίσει μια ομάδα 29 γονιδίων που εκφράζονται σε PBMC, ικανό να διακρίνει τα άτομα με AP & gt.? 1 εκατοστό ή CRC από υγιή άτομα. Τιμωρίες ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης που ταξινομούνται σωστά το 75%, 59% (ευαισθησία) και 91% (ειδικότητα) του CRC, AP και τους ελέγχους, αντίστοιχα.

Η προσέγγιση που χρησιμοποιείται είναι διαφορετική σε σύγκριση με τις υπάρχουσες εξετάσεις προσυμπτωματικού ελέγχου για CRC, όπως βασίζεται σε προφίλ γονίδια έκφρασης PBMC. Αυτή αξιοποιεί την καθιερωμένη έννοια της αλληλεπίδρασης όγκου-ξενιστή και τη συμβολή των κυττάρων που προέρχονται από μυελό των οστών εξέλιξης του όγκου [16, 17]. Είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι η AP, θεωρούνται προκαρκινικές αλλοιώσεις, ανιχνεύονται επίσης, αν και με χαμηλότερη ευαισθησία, από την ομάδα 29-γονιδίου. Πράγματι, η φλεγμονή σχετίζεται με νεοπλασματικές του παχέος σχηματισμό πολυπόδων [31] και φλεγμονώδεις παθήσεις του εντέρου, ιδιαίτερα ελκώδη κολίτιδα, είναι ένας παράγοντας κινδύνου για CRC [32]. Σημαντικά, μη-στεροειδή αντι-φλεγμονώδη φάρμακα προστασία έναντι ανάπτυξης CRC [33], πρόληψη σχηματισμού αδενώματος σε πειραματικά μοντέλα με οικογενή αδενωματώδη πολυποδίαση coli [34] και την αναστροφή μεταβολών γονιδιακή έκφραση στον φυσιολογικό κόλον σε αλληλουχία αδενώματος [35]. Αυτό ενισχύει την άποψη ότι θα μπορούσε να αναπτυχθεί η προτεινόμενη προσέγγιση για την ΑΡ και την έγκαιρη ανίχνευση CRC ως πιο αποτελεσματική εναλλακτική λύση για κοπράνων λανθάνουσας αιμορραγίας που βασίζονται σε δοκιμές. Η πισίνα 670 υποψήφια γονίδια που χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο πολλών γονιδίων που περιλαμβάνονται ξενιστή και οδών που εμπλέκονται στη φλεγμονή, ανοσοαπόκριση και την εξέλιξη του όγκου. Είναι σημαντικό, αυτά τα γονίδια δεν επελέγησαν με βάση μια προηγούμενη οθόνη γονιδίωμα-ευρεία, αλλά με βάση τις υπάρχουσες γνώσεις (δηλαδή τη λογοτεχνία και τα δικά του δεδομένα) και υποθέσεις (δηλαδή ο ρόλος της φλεγμονής στην εξέλιξη του καρκίνου). Η πλειοψηφία αυτών των 29 γονιδίων του πίνακα είναι μεσολαβητές /ρυθμιστές της φλεγμονής, κυτταρικής κινητικότητας, κυτταρική επιβίωση, κυτταρική σηματοδότηση και τον πολλαπλασιασμό (Πίνακας 2 και 3). Αυτό είναι συνεπές με την έννοια ότι με όγκο κινητοποιηθούν μυελό οστών κυκλοφορούντα myelomoncytic κύτταρα είναι σε κατάσταση ενεργοποίησης σε απόκριση σε παράγοντες όγκο που απελευθερώνεται.