Abstract

Ο lamellipodium, ένα ουσιαστικό δομή για τη μετανάστευση των κυττάρων, παίζει σημαντικό ρόλο στην εισβολή και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων. Αν και Rac1 αναγνωρίζεται ως βασικός παράγοντας στη διαμόρφωση της ελασματοπόδια, οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν lamellipodial κινητικότητα δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Optogenetic τεχνολογία μας επέτρεψε να ελέγχουν spatiotemporally τη δραστηριότητα της μέσω φωτός Rac1 (PA-Rac1) σε ζωντανά κύτταρα. Χρησιμοποιώντας αυτό το σύστημα, έχουμε αποκάλυψε το ρόλο της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) σε Rac1 εξαρτώμενη lamellipodial κινητικότητας σε PC-3 καρκίνου του προστάτη κύτταρα. Μέσα από τις τοπικές μπλε ακτινοβολία λέιζερ του PA-Rac1-κύτταρα που εκφράζουν, lamellipodial κινητικότητα ήταν αναστρέψιμα που προκαλείται. Πρώτον, παρατηρήθηκε προς τα έξω επέκταση ενός lamellipodium παράλληλα προς το υπόστρωμα. Η εκτεταμένη lamellipodium συνέχεια έδειξε ruffling δραστηριότητας στην περιφέρεια. Αξίζει να σημειωθεί ότι, PI (3,4,5) P

3 και WAVE2 εντοπίστηκαν στην επέκταση lamellipodium σε PI3K-εξαρτώμενο τρόπο. Επιβεβαιώσαμε ότι η αναστολή της δράσης της ΡΙ3Κ κατέστειλε σημαντικά lamellipodial επέκταση, ενώ η δραστηριότητα ruffling επηρεάστηκε λιγότερο. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Rac1 που προκαλείται lamellipodial κινητικότητα αποτελείται από δύο ξεχωριστές δραστηριότητες, PI3K-εξαρτώμενο προς τα έξω την επέκταση και PI3K-ανεξάρτητο Ruffling

Παράθεση:. Κάτω Τ, Kawai Κ, Egami Υ, Kakehi Υ, Araki Ν (2014 ) Rac1-Dependent Lamellipodial κινητικότητας σε καρκίνο του προστάτη PC-3 κύτταρα αποκαλυφθε’ντα από Optogenetic Ελέγχου της Rac1 δραστηριότητας. PLoS ONE 9 (5): e97749. doi: 10.1371 /journal.pone.0097749

Επιμέλεια: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8 Ιαν 2014? Αποδεκτές: 24, Απρ 2014? Δημοσιεύθηκε: May 21, 2014

Copyright: © 2014 Kato et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης (JSPs) KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/index.html) 25.861.427 σε ΤΚ? 24659087 και 23390039 έως NA? 26860136 και 24890154 στην ΚΚ? 25860142 έως YE? 24390369 στο YK. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η μετανάστευση των κυττάρων παίζει σημαντικό ρόλο στην εμβρυϊκή οργανογένεση? επούλωση τραυμάτων και ανοσολογικές αποκρίσεις? και η παθογένεση πολλών ασθενειών, συμπεριλαμβανομένων εισβολή καρκίνου και μετάσταση [1], [2]. Ως εκ τούτου, η κατανόηση των μοριακών μηχανισμών υποκείμενη κυτταρική μετανάστευση είναι σημαντική για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών για την πρόληψη διείσδυση και μετάσταση όγκων. Η μετανάστευση κυττάρων περιλαμβάνει τις διαδικασίες του πολωμένου κυτταρικής προεξοχή και προσκόλληση στην κατεύθυνση της κίνησης, τη συστολή κυττάρων, αποσυναρμολόγηση κόλλας εστιών, και συστολής στην περιφέρεια του άκρου ρυμούλκησης του κυττάρου [1]. Κατά τη διάρκεια της μετανάστευσης των κυττάρων του όγκου που σχετίζεται με μετάσταση και εισβολή καρκίνου, μεταστατικά κύτταρα εμφανίζουν δραστικές αλλαγές στο σχήμα. Αυτή η παραμόρφωση που προκαλείται από ακτίνη αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού, η οποία ρυθμίζεται από την οικογένεια Rho ΘΤΡάσες όπως Cdc42 και Rac1. Rho οικογένεια ΘΤΡάσες συμπεριφέρονται ως μοριακοί διακόπτες, ποδηλασία μεταξύ ενεργών μορφών GTP-δεσμεύεται και ανενεργές μορφές ΑΕΠ-δεσμεύεται. Οι Rho οικογένεια ΘΤΡάσες ενεργοποιούνται από παράγοντες ανταλλαγής νουκλεοτιδίου γουανίνης (GEFs) και αδρανοποιείται με ΟΤΡάσης ενεργοποίησης πρωτεΐνες (διάκενα) [3]. Rac1, μέλος της οικογένειας GTPases Rho, οδηγεί στην παραγωγή των φύλλων που μοιάζουν με προεξοχές που αναφέρεται ως ελασματοπόδια ή μεμβράνη βολάν, ενώ Cdc42, ένα άλλο μέλος της οικογένειας Rho, δημιουργεί ακίδα-όπως προεξοχές που ονομάζεται τΊΙοροάίβ [3]. Rac1 είναι υπερδραστηριοποιημένο στα μεταστατικά καρκινικά κύτταρα προστάτη [4]. Επιπλέον, η αναστολή της δραστικότητας μπλοκ Rac1 η μετανάστευση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων του προστάτη [5]. Αυτές οι μελέτες προτείνουν ότι Rac1 μεσολάβηση σχηματισμός lamellipodial παίζει σημαντικό ρόλο στη μετάσταση του καρκίνου του προστάτη.

Μέχρι σήμερα, η έκφραση των μεταλλακτών Rac1 όπως η ουσιαστικά δραστική (CA) Rac1Q61L και το κυρίαρχο αρνητικό (DN) Rac1T17N έχει έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για τη διερεύνηση της εμπλοκής των Rac1 σε σχηματισμό lamellipodial και ruffling [6]. Ωστόσο, τα στοιχεία του φαινοτύπου των κυττάρων που λαμβάνονται χρησιμοποιώντας μεταλλάξεις Rac1 πρέπει να ερμηνεύονται με προσοχή. Λόγω των επιπτώσεων της μη αναστρέψιμη, μόνιμη και παγκόσμια έκφραση στα κύτταρα, είναι δύσκολο να πούμε ότι οι φαινότυποι των κυττάρων που εκφράζουν μεταλλαγμένα Rac1 αντανακλούν ακριβώς δράση της πρωτεΐνης ως μοριακός διακόπτης. Για να διευκρινιστεί ο ακριβής ρόλος της χωροχρονικής ενεργοποίηση της Rac1, Wu et al. [7], [8] ανέπτυξε πρόσφατα ένα Rac1 φωτο-ενεργοποιήσιμο σύστημα (PA-Rac1) με σύντηξη ενός φως-οξυγόνου-τάσης (LOV) περιοχή και μια καρβοξυ-τερματική ελικοειδή προέκταση (ϋα) αλληλουχία στο αμινο άκρο ενός ιδιοσυστατικά ενεργό Rac1. ΛΤ είναι μια πρωτεΐνη περιοχή ελαφριάς διακόπτη του

Avena sativa

phototropin 1. Στο σκοτάδι, η φλαβίνη-πεδίο σύνδεσης ΛΤ αλληλεπιδρά με ϋα και εμποδίζει τη θέση πρόσδεσης τελεστή του ΡΑ-Rac1 διαμορφώνοντας σε κλειστή διαμόρφωση. Ακτινοβόληση με φως στα 400-500 nm φως προκαλεί την αποσύνδεση της LOV τομέα και ϋα έλικα, και οδηγεί στην ενεργοποίηση Rac1. Αυτή η ενεργοποίηση φωτο-επαγόμενη είναι αναστρέψιμη. Χρησιμοποιώντας αυτό το σύστημα, εντοπισμένη ενεργοποίηση Rac1 δείχθηκε να είναι επαρκής για να επάγει κυτταρική κινητικότητα και καθορίζουν την κατεύθυνση της κίνησης των κυττάρων [7], [8].

Η σχέση μεταξύ Rac1 και φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ3Κ) σε ο σχηματισμός των ελασματοπόδια περιπλέκεται επειδή λειτουργεί PI3K ανάντη και κατάντη της Rac1 [9]. Οι φωσφατιδυλινοσιτολο 3,4,5-τριφωσφορική (ΡΙ (3,4,5) Ρ

3) είναι γνωστό ότι δεσμεύει Rac GEFs και στη συνέχεια να επιταχύνει τον πολυμερισμό της ακτίνης μέσω της ενεργοποίησης Rac1 [10]. Επιπλέον, μια θετική βρόχος ανάδρασης έχει αναφερθεί μεταξύ PI (3,4,5) P

3 και Rac για την κυτταρική πολικότητα κατά τη διάρκεια ευκαρυωτικό χημειοταξία [11], [12]. Ωστόσο, στη ρύθμιση της κυτταρικής προεξοχής και πολικότητας, οι αναφορές σχετικά με τη λειτουργία του ΡΙ3Κ κατάντη της Rac1 αναμιγνύονται [13], [14]. Έτσι, ο ακριβής ρόλος της PI3K κατάντη της Rac1 παραμένει ένα αμφιλεγόμενο ζήτημα.

Για να διευκρινιστεί η σημασία της PI3K για να Rac1 εξαρτώμενη lamellipodial κινητικότητα, θα εφαρμοστεί το σύστημα PA-Rac1 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Photomanipulation δραστηριότητας PA-Rac1 χρησιμοποιώντας ένα μπλε λέιζερ μας επέτρεψε να διακρίνουμε δύο lamellipodial κινητικών διεργασιών στα ζωντανά κύτταρα: lamellipodial επέκταση και περιφερειακών Ruffling. Συγκεκριμένα, βρήκαμε ότι οι αναστολείς της ΡΙ3Κ κατέστειλε την έναρξη lamellipodial επέκταση αλλά είχε μικρή επίδραση στην περιφερική ruffling. Η παρούσα μελέτη αποκάλυψε ότι Rac1 εξαρτώμενη lamellipodial κινητικά διαδικασίες αποτελούνται από δύο διαχωριστούν δραστηριότητες:. PI3K-εξαρτώμενη lamellipodial προς τα έξω την επέκταση και PI3K-ανεξάρτητη περιφερειακή Ruffling

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και cDNA μορφώματα

ορός εμβρύου μόσχου (FBS) και RPMI-1640 ελήφθησαν από την Sigma Chemical Co. (St. Louis, ΜΟ). Το αντιδραστήριο επιμόλυνσης HP DNA X-tremeGENE αποκτήθηκε από τη Roche Diagnostic Systems (Basel, Ελβετία). Τα άλλα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από την Wako Pure Chemicals (Osaka, Japan) ή Nacalai Tesque (Κιότο, Ιαπωνία), εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

pTriEx /mCherry-PA-Rac1Q61L (πλασμίδιο # 22027) και pTriEx /mCherry- ΡΑ-Rac1 T17N (πλασμίδιο # 22029) ελήφθησαν από την Addgene (Cambridge, ΜΑ). Ο Δρ Joel A. Swanson (University of Michigan) υπό την προϋπόθεση ευγενικά την pmCitrine-AKT-πλεκστρίνης περιοχή ομολογίας (PH) και pmCitrine-Rac1Q61L. Τα κατασκευάσματα ρΕΟΡΡ-Ν1-WAVE2 ήταν πλούσια δώρα του Δρ Tadaomi Takenawa (Πανεπιστήμιο Kobe).

Cell Culture και διαμόλυνση

PC-3 ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη κύτταρα αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Rockville, MD) και διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI που περιέχει 10% θερμο-απενεργοποιημένο FBS, 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Για την απεικόνιση ζωντανών κυττάρων, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε καλυπτρίδες 25 mm σε πιάτα 35 mm σε πυκνότητα 2,0 × 10

4 κύτταρα /τρυβλίο και επωάστηκαν για μια νύχτα πριν από την επιμόλυνση.

Το X-tremeGENE HP αντιδραστήριο επιμόλυνσης DNA χρησιμοποιήθηκε για επιμόλυνση πλασμιδίου σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. pTriEx /mCherry-ΡΑ-Rac1Q61L προστέθηκε στα πιάτα 35 mm. Στις θεραπείες συν-επιμόλυνση, 0,01-0,5 μα τα κατάλληλα πλασμίδια προστέθηκε στα δίσκους 35 χλστ μαζί με 0.3 μ§ του πλασμιδίου PA-Rac1.

φαρμακευτικές αγωγές

Για να προσδιοριστεί η ρόλος της ΡΙ3Κ σε Rac1 επαγόμενη κυτταρική κινητικότητα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αναστολείς ΡΙ3Κ κατά την ακτινοβόληση. Χρησιμοποιήσαμε 50 μΜ LY294002 (Sigma), 100 ηΜ wortmannin (Sigma), και 1 μΜ ZSTK474 (Active Biochemicals) ως αναστολείς της ΡΙ3Κ. LY294002 και wortmannin, τα οποία είναι παν-ΡΙ3Κ αναστολείς, χρησιμοποιούνται ευρέως ως εργαλεία για τη διερεύνηση ποικίλες διεργασίες μεταγωγής σήματος περιλαμβάνουν ΡΙ3Κ. ZSTK474 αναστέλλει επίσης και τις τέσσερις ισομορφές ΡΙ3Κ αλλά δεν αναστέλλει τις κινάσες ΡΙ3Κ σχετίζονται όπως mTOR και DNA-εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση. Αυτοί οι αναστολείς διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), φυλαγμένο στους -20 ° C, και εφαρμόστηκε στα κύτταρα στις υποδεικνυόμενες τελικές συγκεντρώσεις. Αυτοί οι αναστολείς προστέθηκαν συχνά στα κύτταρα 30 λεπτά πριν από την φωτοενεργοποίηση, αλλά σε μερικά πειράματα, προστέθηκαν κατά τη διάρκεια της φωτοενεργοποίησης. Για τις θεραπείες ελέγχου, 0,1% DMSO εφαρμόσθηκε στα κύτταρα.

φωτοενεργοποίηση και του Live-κυττάρων Imaging

Σε 12-24 ώρες μετά την επιμόλυνση, το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα Ringer (RB ) που αποτελείται από 155 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM ΟαΟ

2, 1 mM MgCl

2, 2 mM Na

2HPO

4, 10 mM γλυκόζη, 10 mM HEPES ρΗ 7.2, και 0,5 mg /ml βόεια λευκωματίνη ορού. Οι καλυπτρίδες 25 χιλιοστά τοποθετήθηκαν σε έναν θάλαμο RB-συμπληρώθηκε με C θερμο-ελεγχόμενη φάση 37 ° (Tokai Hit INU-ONI, Shizuoka, Ιαπωνία). Η φωτοενεργοποίηση του ΡΑ-Rac1 και απεικόνισης ζωντανών κυττάρων πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός Axio Παρατηρητής Ζ1 ανεστραμμένο μικροσκόπιο εφοδιασμένο με μία μονάδα σάρωσης με λέιζερ (LSM700, Zeiss), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Για φωτοενεργοποίηση PA-Rac1, την υποδεικνυόμενη περιοχή των κυττάρων καρκίνου του προστάτη που εκφράζουν mCherry-ΡΑ-Rac1 επανειλημμένα ακτινοβολήθηκαν χρησιμοποιώντας nm λέιζερ 5 mW 445 σε 0,2% της ισχύος για τις υποδεικνυόμενες περιόδους σε κατάσταση φωτολεύκανση. εικόνες live-κυττάρων αποκτήθηκαν μέσω μιας 63x Plan-Αχρωματικός /N. Α 1.4 φακό κάθε 15 δευτερόλεπτα χρησιμοποιώντας ένα 10 mW λέιζερ 555 nm σε 0.5% -2.0% εξουσίας να αποκτούν mCherry φθορισμού και φωτεινού πεδίου φάσης-αντίθεσης εικόνες. Για την οπτικοποίηση ΡΙ (3,4,5) Ρ

3 ή WAVE2, τα κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν με pmCherry-ΡΑ-Rac1 και του τομέα pmCitrine-ΑΚΤ-ΡΗ ή pEGFP-WAVE2, αντίστοιχα. EGFP ή mCitrine εικόνες φθορισμού αποκτήθηκαν μόνο στην πρώτη και τελευταία χρονικά σημεία για την αποφυγή ακούσιας φωτοενεργοποίησης από το λέιζερ 488 nm, καθώς αυτό το μήκος κύματος διέγερσης επικαλύπτει ελαφρώς με το φάσμα φωτοενεργοποίησης [8]. Έχουμε προσαρμοστεί η ισχύς των 488 nm laser όσο το δυνατόν χαμηλότερα, έτσι ώστε η απόκτηση του πρώτου καρέ από το λέιζερ δεν θα επηρεάσει δραστηριότητα PA-Rac1.

εικόνες Time-lapse χρησιμοποιώντας μικροσκοπία αντίθεσης φάσης και φθορισμού ήταν λαμβάνονται σε διαστήματα 15 sec και συναρμολογούνται σε ταινίες QuickTime χρησιμοποιώντας Zen λογισμικού 2009 (Carl Zeiss). αναλύσεις κυματογράφο διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας λογισμικό απεικόνισης MetaMorph (Molecular Devices). Τα δεδομένα εικόνας που παρουσιάζονται εδώ είναι αντιπροσωπευτικά των αποτελεσμάτων από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Ποσοτική ανάλυση εικόνας

Για την ποσοτική ανάλυση της εικόνας της lamellipodial επέκτασης οφείλεται σε PA-Rac1 φωτοενεργοποίηση με την απουσία ή παρουσία αναστολέων PI3K, πήραμε μετρήσεις των αυξήσεων περιοχή των κυττάρων, αφαιρώντας τις περιοχές των κυττάρων πριν φωτοενεργοποίησης από αυτά μετά φωτοαντιδράσεις χρησιμοποιώντας το λογισμικό απεικόνισης MetaMorph.

Για την ποσοτική ανάλυση των mCitrine-ΑΚΤ-PH και ΕΟΡΡ- WAVW2 προσλήψεις με φωτο-περιοχές, οι εντάσεις φθορισμού των περιοχών ενδιαφέροντος μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό απεικόνισης MetaMorph. Οι εντάσεις φθορισμού των mCitrine και EGFP μετά από 5 λεπτά της φωτοενεργοποίησης συγκρίθηκαν με τις εντάσεις φθορισμού στην αντίστοιχη περιοχή πριν φωτοαντιδράσεις χρησιμοποιώντας τουλάχιστον 16 κελιά.

Για την ποσοτικοποίηση των επιδράσεων των αναστολέων ΡΙ3Κ σε επεκταθεί ελασματοπόδια και ruffling δραστηριότητα mCitrine-Rac1Q61L-εκφράζοντα κύτταρα, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη σε 30 λεπτά μετά την προσθήκη των αναστολέων ΡΙ3Κ (50 μΜ LY294002, 100 ηΜ wortmannin, ή 1 μΜ ZSTK474) ή το όχημα μόνο (0,1% DMSO). Χρησιμοποιώντας το σύστημα απεικόνισης MetaMorph, οι μέγιστες διάμετροι των κυττάρων που εκφράζουν Rac1Q61L μετρήθηκαν πριν και μετά τις φαρμακευτικές αγωγές για να αξιολογηθεί η επίδραση της αναστολής της ΡΙ3Κ στην εκτεταμένη lamellipodial. Ομοίως, οι περιφερειακές βολάν ανά κύτταρο μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού για να αξιολογήσει τον αντίκτυπο της αναστολής PI3K για ruffling δραστηριότητα. Τριάντα κύτταρα σε κάθε ομάδα υποβλήθηκαν σε ποσοτική ανάλυση εικόνας.

Δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± τυπικό σφάλμα (SE) για τον αριθμό των κυττάρων που αναφέρονται στο κείμενο. Η στατιστική ανάλυση έγινε χρησιμοποιώντας τη λειτουργία t-τεστ Wilcoxon του Excel 2012. Οι διαφορές μεταξύ των δειγμάτων που αναλύθηκαν θεωρήθηκαν σημαντικές σε ρ & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Τοπική ενεργοποίηση των ΡΑ-Rac1 Προκαλεί αντιστρεπτά Lamellipodial παράταση και ruffling

Για να διευκρινιστεί η σχέση μεταξύ της ενεργοποίησης Rac1 και lamellipodial δυναμική, παρουσιάσαμε mCherry-λιωμένο PA-Rac1 σε κύτταρα PC-3. Μετά την επιβεβαίωση της έκφρασης του mCherry-ΡΑ-Rac1 με βάση το σήμα mCherry, έχουμε ακτινοβολημένα μία περιφερειακή περιοχή των κυττάρων χρησιμοποιώντας ένα λέιζερ 445 nm κατά τη διάρκεια των διαστημάτων της απόκτησης εικόνας και απέκτησε εικόνες αντίθεσης φάσης των ζωντανών κυττάρων κάθε 15 sec με συνεστιακή μικροσκοπία. Τυπικά, μετά 1-4 λεπτά ακτινοβόλησης με το λέιζερ nm 445, ένα λεπτό φύλλο που μοιάζει με προεξοχή (δηλαδή, ένα lamellipodium) που εκτείνεται παράλληλα προς το υπόστρωμα παρατηρήθηκε στο περιφερειακό χώρο κυψελών που ακτινοβολήθηκε από το λέιζερ 445 nm. Η lamellipodium φτάσει στο μέγιστο μήκος του μετά από 5-6 λεπτά της ενεργοποίησης PA-Rac1. Εκείνη την εποχή, μετά την προς τα έξω επέκταση, το πλήρως εκτεταμένο lamellipodium κουλουριαστεί αιχμή του για να δείξει μια περιφερειακή κίνηση Ruffling. Οι ruffling κινήσεις συνεχίστηκε για όλη τη διάρκεια της ακτινοβόλησης. Μετά την ακτινοβόληση σταμάτησε, τόσο η lamellipodial επέκταση και η περιφερειακή αναστάτωση υποχώρησε αμέσως (Εικ. 1 και Movie S1). Σε προηγούμενη μελέτη μας, ραχιαία Ruffling προκλήθηκε σε RAW 264 μακροφάγα με ενεργοποίηση PA-Rac1 [15], [16], αλλά ραχιαίο ruffling δεν ήταν εμφανής σε κύτταρα PC-3.

PC-3 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με pTriEx /mCherry-PA-Rac1 και υποβάλλεται σε τοπικό φωτοενεργοποίηση του PA-Rac1 (ορθογώνια περιοχή που περιγράφεται από μπλε κουκκίδες). εικόνες time-lapse ενός PC-3 κυττάρων που εκφράζουν mCherry-PA-Rac1 αποκτήθηκαν κατά τη διάρκεια της μέσω φωτός με χρήση ακτινοβολίας laser 445-nm. Τα ανώτερα και μεσαία πίνακες δείχνουν τις εικόνες αντίθεσης φάσης και φθορισμού mCherry, αντίστοιχα. Οι παρέλθει φορές μετά την έναρξη της φωτοενεργοποίησης εμφανίζεται στο πάνω μέρος. Στον κάτω πίνακα, οι καμπύλες του σχήματος του κυττάρου στους υποδεικνυόμενους χρόνους παρέλθει αναρροφάται μπλε (0 min, πρωτότυπο), κίτρινο (3,5 min, φάση επέκτασης), και το κόκκινο (6 λεπτά, ruffling φάση). Τα μαύρα προφίλ δείχνουν τα βολάν μεμβράνη. μπαρ κλίμακα, 10 μm.

Η

Όταν ακτινοβολείται μια διαφορετική περιοχή του ίδιου κυττάρου, ένα lamellipodial επέκταση δημιουργήθηκε στο πρόσφατα ακτινοβοληθεί περιοχή, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα φαινόμενα εξαρτώνται από την τοπική ενεργοποίηση PA-Rac1 από φως ακτινοβολία (Εικ. 2). Η υπερέκφραση ενός ΑΕΠ δεσμευμένου (κυρίαρχη αρνητική) μετάλλαξη του ΡΑ-Rac1 (ΡΑ-Rac1 T17N) δεν διεγείρουν είτε lamellipodial επέκταση ή περιφερική ruffling μετά την ακτινοβολία λέιζερ 445-nm (δεν φαίνεται). Το εύρημα αυτό έδειξε ότι οι μορφολογικές αλλαγές που προκαλούνται από την ακτινοβολία λέιζερ 445 nm που εξαρτώνται από GTP-φορτωμένο Rac1.

Time-lapse εικόνες ενός PC-3 κυττάρων που εκφράζουν mCherry-PA-Rac1 αποκτήθηκαν κατά τη διάρκεια της PA-Rac1 photo-χειραγώγηση από την τοπική ακτινοβολία λέιζερ των διαφόρων περιοχών. Επιλεγμένα αντίθεσης φάσης και οι εικόνες φθορισμού mCherry φαίνονται. Πρώτον, την περιοχή 1 ακτινοβολήθηκε για 10 λεπτά. Η ακτινοβόληση στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε περιοχή 2. Μετά 25 λεπτά, το ακτινοβόληση ήταν απενεργοποιημένο. Τα επιλεγμένα time-lapse εικόνες αντίθεσης φάσης και φθορισμού mCherry εμφανίζονται. Η επέκταση και ανάσυρση ελασματοπόδια περιγράφονται σε κόκκινο και κίτρινο, αντίστοιχα. μπαρ κλίμακα, 10 μm.

Η

PA-Rac1 που προκαλείται Lamellipodial Παράταση εξαρτάται από την PI3K

Για να εξεταστεί η επίδραση της αναστολής της δραστικότητας PI3K για PA-Rac1 που προκαλείται lamellipodial κινητικότητα, εμείς μεταχειρισμένα LY294002, ένας συνθετικός αναστολέας της ΡΙ3Κ. Επιβεβαιώσαμε καταρχάς ότι τα κύτταρα που εκφράζουν PA-Rac1 εκτίθενται lamellipodial επέκταση και ruffling λόγω φωτοενεργοποίηση. Μετά την παύση φωτοενεργοποίηση, προσθέσαμε 50 μΜ LY294002 στα ίδια κύτταρα. Όταν ακτινοβολείται τις ίδιες περιοχές των κυττάρων 30 λεπτά μετά την προσθήκη του LY294002, lamellipodial επέκταση κατεστάλη σημαντικά από τον αναστολέα ΡΙ3Κ (Σχ. 3Α και ταινία S2). Πραγματοποιήσαμε τις ίδιες πειράματα χρησιμοποιώντας 22 PC-3 κύτταρα και ποσοτικά σε σχέση με την αύξηση περιοχή λόγω της ενεργοποίησης ΡΑ-Rac1 σε κάθε κύτταρο πριν και μετά τη θεραπεία με Ι Υ294002 (Σχ. 3Β). Η ποσοτική ανάλυση εικόνας έδειξε ότι η αύξηση του τομέα κυττάρων λόγω της ΡΑ-Rac1 επαγόμενη lamellipodial επέκταση κατεστάλη σημαντικά με LY294002 (ρ & lt?. 0.01, η = 22, Σχήμα 3Β).

(Α) PC- 3 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με pTriEx /mCherry-ΡΑ-Rac1. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επανειλημμένες φωτοενεργοποίηση απουσία (έλεγχος) ή παρουσία 50 μΜ LY294002. Η προπορευόμενη ακμή της εκτεινόμενη lamellipodium σκιαγραφείται στο κόκκινο. μπαρ κλίμακα, 10 μm. (Β) Η αυξημένη περιοχή κυττάρων λόγω lamellipodial παράταση ποσοτικοποιήθηκε αφαιρώντας την περιοχή του κυττάρου πριν φωτοενεργοποίησης από την περιοχή του κυττάρου 7 λεπτά μετά την έναρξη της ενεργοποίησης ΡΑ-Rac1. Η αύξηση αυτή επαληθεύεται σε 22 PC-3 κύτταρα. Το οικόπεδο στοιχεία δείχνουν την αυξημένη περιοχή λόγω lamellipodial επέκτασης που προκλήθηκε από PA-Rac1 φωτοενεργοποίηση απουσία [LY (-)] ή παρουσία LY294002 [LY (+)]. Η σημασία των διαφορών μεταξύ LY (-) και LY (+) επιβεβαιώθηκε με t-τεστ Wilcoxon (δεξιά). Η αύξηση της lamellipodial περιοχή με την παρουσία του LY294002 ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη των κυττάρων ελέγχου (ρ & lt? 0,01). ανάλυση (C) κυμογραφικά διεξήχθη σε δύο βέλος τοποθετείται σε όλη την lamellipodium ενός PC-3 κυττάρων που εκφράζουν mCherry-ΡΑ-Rac1 πριν και μετά την προσθήκη του LY294002. Η περιοχή με λέιζερ-ακτινοβολημένα υποδεικνύεται με ένα μπλε παραλληλόγραμμο. Η λευκή γραμμή περιγράφει το εκτεινόμενο lamellipodium, και η διακεκομμένη γραμμή περιγράφει το αρχικό σχήμα των κυττάρων. Το κάτω πίνακας παρουσιάζει την κυματογράφο ενός lamellipodium υποβάλλονται σε αλλαγές στο μήκος. Η κυματογράφο καταδεικνύει την επέκταση και ανάσυρση ενός lamellipodium κατά την ενεργοποίηση PA-Rac1 (μπλε 1) και απενεργοποίησης (μαύρο 1), αντίστοιχα. Το πράσινο βέλος δείχνει την προσθήκη της LY294002. Ο αναστολέας ΡΙ3Κ είχε λιγότερο από ένα ανασταλτικό αποτέλεσμα επί lamellipodial επέκταση και αναστάτωση (μπλε 2). Ωστόσο, η έναρξη της lamellipodial επέκταση δραστικά αναστέλλεται (μαύρο 2-μπλε 3). Κλίμακα μπαρ, 10 μm.

Η

Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε κυμογραφικά ανάλυση για να προσδιορίσει τις μεταβολές στο μήκος του ελασματοπόδια. Μετά την επιβεβαίωση της PA-Rac1 που προκαλείται lamellipodial επέκταση και ruffling λόγω PA-Rac1 μέσω φωτός, προσθέσαμε LY294002 στα κύτταρα κατά τη διάρκεια PA-Rac1 μέσω φωτός. Αν και τα μήκη του ελασματοπόδια άλλαξαν λόγω περιφερικής ruffling, η ανασταλτική δράση του LY294002 επί lamellipodial παράταση ήταν μικρή. Περιφερική ruffling παρέμεινε για όλη τη διάρκεια της ακτινοβόλησης. Αμέσως μετά φωτοενεργοποίησης έπαυσε, τόσο lamellipodial επέκταση και περιφερειακών Ruffling υποχωρήσει εντελώς. Όταν ξανά ακτινοβοληθεί την ίδια περιοχή, τα κύτταρα δεν έδειξαν lamellipodial προέκταση (Σχ. 3C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο σχηματισμός ενός lamellipodium είναι πιο ευαίσθητο σε αναστολείς ΡΙ3Κ ό, τι είναι η διατήρηση της επεκτάθηκε ελασματοπόδια και περιφερικού ruffling.

Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με τη χρήση 100 ηΜ wortmannin ή 1 μΜ ZSTK474 ως αναστολείς ΡΙ3Κ (Σχ. S1). Ως μάρτυρας, τα ίδια πειράματα ενεργοποίησης PA-Rac1 διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας κύτταρα επεξεργασμένα με 0.1% DMSO, το όχημα των αναστολέων. σχηματισμό PA-Rac1 που προκαλείται lamellipodial δεν αναστέλλεται από DMSO (Εικ. S2).

PA-Rac1 Φωτοενεργοποίηση μπορεί Τοπικά Ενεργοποίησε PI3K και Recruit WAVE2

Επειδή PA-Rac1 που προκαλείται lamellipodial επέκταση ήταν αναστέλλεται από τους αναστολείς ΡΙ3Κ, επιχειρήσαμε να διευκρινιστεί ότι η ενεργοποίηση PA-Rac1 οδήγησε σε ενεργοποίηση ΡΙ3Κ. Για την παρακολούθηση της παραγωγής των PI (3,4,5) P

3 ανά δραστηριότητα PI3K, τα κύτταρα PC-3 συνεπιμολύνθηκαν με pmCitrine-ΑΚΤ-PH και pTriEx /mCherry-PA-Rac1Q61L και παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Zeiss LSM700 (Εικ . 4). Η ένταση φθορισμού των mCitrine-ΑΚΤ-PH στο lamellipodial αιχμή μετά από 5 λεπτά από ΡΑ-Rac1photoactivation μετρήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό απεικόνισης MetaMorph και ποσοτικά σε σχέση με εκείνη της ίδιας περιοχής πριν φωτοενεργοποίηση. Μετά από 5 λεπτά από τοπική ενεργοποίηση του ΡΑ-Rac1, η ένταση φθορισμού του mCitrine-ΑΚΤ-PH έδειξε 125,4% ± 22,3% αύξηση (n = 16) σε σύγκριση με εκείνη που μετρήθηκε πριν από την φωτοενεργοποίηση, υποδηλώνοντας ότι τα επίπεδα του ΡΙ (3,4 , 5) P

3 στα επέκταση ελασματοπόδια αυξήθηκαν σημαντικά από την τοπική φωτοενεργοποίηση του PA-Rac1. Με την παρουσία του LY294002, χωρίς κύτταρα παρουσίασαν αύξηση στην ένταση φθορισμού του mCitrine-ΑΚΤ-PH μετά την ακτινοβόληση. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι η Rac1 μέσω φωτός ενεργοποιεί PI3K να παράγουν PI (3,4,5) P

3 από PI (4,5) P

2 στη μεμβράνη του εκτείνεται ελασματοπόδια.

PC -3 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με pTriEx /mCherry-ΡΑ-Rac1 και mCitrine-ΑΚΤ-PH. Αντίθεσης φάσης, mCherry-PA-Rac1 (ερυθρός φθορισμός), και mCitrine-ΑΚΤ-PH (κίτρινο φθορισμό) εικόνες αποκτήθηκαν πριν και μετά PA-Rac1 μέσω φωτός. PA-Rac1 φωτοενεργοποίηση επαναλήφθηκε στην ίδια περιοχή κύτταρο απουσία (έλεγχος) ή παρουσία 50 μΜ LY294002. Τα επίπεδα των PI (3,4,5) P

3 αυξήθηκαν στην επέκταση lamellipodium με φωτοενεργοποίηση (βέλη). Με την παρουσία του LY294002, ΡΙ (3,4,5) Ρ

3 δεν αυξήθηκαν στην περιοχή όπου PA-Rac1 ήταν φωτο-ενεργοποιηθεί. Το μπλε-διακεκομμένη ορθογώνιο δείχνει την περιοχή μέσω φωτός. Η επέκταση lamellipodium είναι με κόκκινο περίγραμμα. Ράβδοι κλίμακας, 10 μm.

Η

Επιπλέον, εξετάσαμε τη δυναμική του WAVE2 κατά τη διαδικασία ελασματοπόδια ροών, επειδή WAVE2 παίζει σημαντικό ρόλο στην επαγόμενη από Rac1 αναδιοργάνωση ακτίνης σε συνδυασμό με PI (3,4 , 5) P

3 [17] – [19]. Μετά από 5 λεπτά ακτινοβόλησης με φως 445-nm, EGFP-WAVE2 εντοπισμένο ως διακεκομμένη γραμμή στην αιχμή της εκτείνεται lamellipodial (Εικ. 5). Η ένταση φθορισμού EGFP-WAVE2 μετά φωτοαντιδράσεις έδειξε 315,1% ± 54,4% αύξηση (n = 17) που βρίσκονται στην αιχμή της εκτείνεται ελασματοπόδια. Μετά την προσθήκη του LY294002, ούτε ΕΟΡΡ- WAVE2 πρόσληψη ούτε lamellipodial επέκταση προκλήθηκε με ΡΑ-Rac1photoactivation (Εικ. 5). Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι WAVE2 στρατολογείται από ΡΙ (3,4,5) P

3 και συμβάλλει στην Rac1-εξαρτώμενη lamellipodial επέκταση μέσω πολυμερισμού της ακτίνης.

PC-3 κύτταρα συν-επιμολυσμένα με pTriEx /mCherry-PA-Rac1 και ρΕΟΡΡ-Ν1-WAVE2. Αντίθεσης φάσης, mCherry-PA-Rac1 (ερυθρός φθορισμός), και EGFP-WAVE2 (πράσινο φθορισμό) εικόνες αποκτήθηκαν πριν και μετά PA-Rac1 μέσω φωτός. PA-Rac1 φωτοενεργοποίηση επαναλήφθηκε στην ίδια περιοχή κύτταρο απουσία (έλεγχος) ή παρουσία 50 μΜ LY294002. Τα κίτρινα βέλη δείχνουν ότι WAVE2 προσελήφθη στην αιχμή της εκτείνεται lamellipodium. Με την παρουσία του LY294002, WAVE2 δεν προσελήφθη στην περιφέρεια των κυττάρων όπου φωτοενεργοποιηθεί PA-Rac1. Το μπλε-διακεκομμένη ορθογώνιο δείχνει την περιοχή μέσω φωτός. μπαρ κλίμακα, 10 μm.

Η

αναστολείς PI3K δεν επηρεάζουν Επέκταση ελασματοπόδια αλλά κάνει Ενισχύστε Περιφερική Ruffling

Για να διευκρινιστεί η επίδραση της αναστολής της PI3K για τη διατήρηση της επεκτάθηκε ελασματοπόδια, εφαρμόσαμε LY294002 σε κύτταρα PC-3 που εκφράζουν mCitrine-Rac1Q61L, ένα ιδιοσυστατικά ενεργό Rac1 μεταλλαγμένο. Οι mCitrine-Rac1Q61L εκφράζουν κύτταρα είχαν καλά εξαπλωθεί ελασματοπόδια γύρω από ολόκληρο περιφέρειες τους. Όταν προσθέσαμε 50 μΜ LY294002 σε αυτά τα κύτταρα, το επεκτάθηκε ελασματοπόδια συρρικνώθηκε μόνο ελαφρώς, ακόμη και μετά από 30 λεπτά. Παραδόξως, περιφερική δράση ruffling ήταν αξιοσημείωτα αυξημένη από την αναστολή της ΡΙ3Κ στα Rac1Q61L εκφράζουν κύτταρα (Σχ. 6 και Ταινία S3). Ποσοτική ανάλυση των μεταβολών στην μέγιστη διάμετρο των κυττάρων έδειξε ότι ο παράγων αυτός δεν επηρεάστηκε σημαντικά από οποιαδήποτε αναστολέα ΡΙ3Κ, ενώ ο αριθμός των περιφερικών βολάν αυξήθηκε σημαντικά μετά από 30 λεπτά της αναστολής της ΡΙ3Κ (Πίνακας 1).

PC- 3 κύτταρα επιμολύνθηκαν με pmCitrine-Rac1Q61L. Οι εικόνες time-lapse της αντίθεσης φάσης και φθορισμού mCitrine-Rac1Q61L συνελήφθησαν πριν (αριστερά) και μετά (δεξιά) την προσθήκη του LY294002. Kymographs δημιουργήθηκαν για να δείχνουν τις αλλαγές στο μήκος ενός lamellipodium στη θέση του δικέφαλο γραμμή. Το κύτταρο mCitrine-Rac1Q61L εκφράζουν είχε ένα εκτεταμένο lamellipodium γύρω από ολόκληρη την περιφέρεια του. Μετά την προσθήκη 50 μΜ LY294002, το διευρυμένο lamellipodium είχε συρρικνωθεί μόνο ελαφρά, αλλά η περιφερειακή ruffling εκδόθηκε. Οι kymographs δείχνουν δυναμικές αλλαγές στο μήκος λόγω της ενισχυμένης ruffling μετά την προσθήκη του LY294002. Κλίμακα μπαρ, 10 μm

Η

Συζήτηση

ελασματοπόδια μπορούν να ταξινομηθούν σε τρεις κατηγορίες:. Η λεπτή αιχμή ενός κυττάρου που επεκτείνει τη μεμβράνη κατά μήκος του υποστρώματος, η περιφερειακή βολάν που σχηματίζεται από την προς τα άνω κάμψη του πρόσθιου άκρου, και οι κατακόρυφες βολάν ραχιαία που εμφανίζονται πίσω από την προπορευόμενη ακμή επί της ραχιαίας επιφάνειας του κυττάρου [9], [20]. Ωστόσο, οι διάφοροι μηχανισμοί που ρυθμίζουν αυτές τις lamellipodial κινητικό διαδικασίες δεν έχουν διευκρινιστεί. PC-3 κύτταρα και άλλα κύτταρα καρκίνου του προστάτη δεν εμφανίζουν ράχης ruffling, η οποία παρατηρείται σε RAW264 μακροφάγα μετά από ενεργοποίηση PA-Rac1 [15]. Η διαφορά αυτή οφείλεται πιθανότατα με τις διαφορές μεταξύ αυτών των τύπων κυττάρων. PC-3 κύτταρα έδειξαν αξιοσημείωτη lamellipodial επέκταση και περιφερικό ruffling με την ενεργοποίηση PA-Rac1. Η παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε για να χαρακτηρίσει lamellipodial δυναμική και η ρύθμισή τους σε PC-3 καρκινικά κύτταρα, όπως lamellipodial κινητικότητα διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην εισβολή και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη.

Προηγούμενες αναφορές έχουν σημειωθεί ότι η αναστολή της δραστικότητα ΡΙ3Κ παρεμποδίζει όλες παράγοντα ανάπτυξης που προέρχεται από αιμοπετάλια (PDGF) προκληθείσα lamellipodial κινητικών διεργασιών σε ινοβλάστες, συμπεριλαμβανομένης της παράτασης, περιφερική ruffling, και το σχηματισμό της ραχιαίας σούφρα [19]. Επειδή ΡΙ3Κ εμπλέκεται στο πρώιμο στάδιο της μεταγωγής σήματος από τον υποδοχέα PDGF σε ινοβλάστες [21], όλες οι απαντήσεις να PDGF θα μπορούσαν να υποκλαπούν με αναστολή ΡΙ3Κ. Ωστόσο, δράση ΡΙ3Κ φέρεται να είναι περιττό για M-CSF-επαγόμενη ruffling και EGF-επαγόμενη ραχιαίο ruffling σε Α431 κύτταρα [22], [23]. Έτσι, σηματοδότηση από διακεκριμένους υποδοχείς οδηγεί στο σχηματισμό σούφρα σε διάφορους τύπους κυττάρων. Στα πειράματά μας χρησιμοποιώντας την optogenetic έλεγχο της δραστηριότητας Rac1, που προκαλείται από απευθείας Rac1 μεσολάβηση lamellipodial δραστηριότητα χωρίς ανάντη σηματοδότηση από τους υποδοχείς. Επειδή θα μπορούσε επομένως να αγνοηθεί η συμμετοχή των ΡΙ3Κ στις αρχές μεταγωγή σήματος από διαφορετικούς τύπους υποδοχέων, θα μπορούσαμε να διαλευκανθεί ο ρόλος της ΡΙ3Κ σε lamellipodial κινητικότητα κατάντη του Rac1. Χρησιμοποιώντας live-κυττάρων απεικόνισης σε συνδυασμό με PA-Rac1 photomanipulation, θα μπορούσε να αποδείξει σαφώς ότι η lamellipodium πρώτη εκτείνεται προς τα έξω παράλληλα με το υπόστρωμα, και ότι το πλήρως εκτεταμένο lamellipodium τότε δείχνει ruffling δραστηριότητα από κέρλινγκ την αιχμή. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η lamellipodial επέκταση που προκαλείται από ενεργοποίηση PA-Rac1 ήταν σοβαρά διαταραγμένο από αναστολείς ΡΙ3Κ ενώ περιφερικό ruffling δεν ανεστάλη. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι δύο τύποι lamellipodial κινητικότητας, επέκταση και ruffling, διαφορικά ρυθμίζεται από μονοπάτια PI3K-εξαρτώμενη και PI3K-ανεξάρτητο σηματοδότησης.

Wiskott-Aldrich πρωτεΐνη σύνδρομο (WASP) και WASP-οικογένεια verprolin-ομόλογη πρωτεΐνη (WAVE) οικογένεια πρωτεϊνών είναι ενεργοποιητές της /3-εξαρτώμενο ARP2 πολυμερισμού [17]. Τα οικογενειακά WAVE πρωτεϊνών που σχετίζονται με το σχηματισμό lamellipodial μέσω του μονοπατιού σηματοδότησης Rac1. Για να αποφευχθεί ο πολυμερισμός της ακτίνης διαταραγμένη, η οικογένεια πρωτεϊνών WAVE υπάρχουν ως ετεροπενταμερείς πρωτεϊνικών συμπλόκων που εμποδίζουν τη δική τους ενεργή sites. Αν και τα κύματα είναι λειτουργικά ενεργοποιούνται από GTP-δεσμεύεται Rac1 όταν αρχίζει τον πολυμερισμό της ακτίνης, τα κύματα δεν μπορεί να συνδεθεί άμεσα με GTP-δεσμεύεται Rac1. Αντ ‘αυτού, IRSp53 (υποδοχέα ινσουλίνης τυροσινικής κινάσης ρ53 υπόστρωμα) λειτουργεί ως συνδετικό μόριο για σύνδεση Rac1 και το WAVE συγκρότημα [18]. GTP-δεσμεύεται Rac1 προκαλεί μια αλλαγή αλλοστερική στο συγκρότημα κύμα που εκθέτει δραστική θέση του? WAVE2 τότε ενεργοποιεί το συγκρότημα ARP2 /3, το οποίο καθίσταται πυρήνας για τον πολυμερισμό της ακτίνης στην αιχμή της lamellipodium [24] – [26].

Σε πειράματα PA-Rac1 ενεργοποίησης μας, WAVE2 εντοπίστηκε στο οι κορυφαίες άκρες της επέκτασης ελασματοπόδια. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε ούτε WAVE2 προσλήψεις ούτε lamellipodial επέκταση όταν δραστηριότητας PI3K ανεστάλη. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η PI (3,4,5) P

3 απαιτείται για την πρόσληψη WAVE2 και για lamellipodial επέκταση. Επειδή WAVE2 έχει ένα ΡΙ (3,4,5) P

3-αλληλουχία δέσμευσης [19], PI (3,4,5) P

3 μπορεί να προσλάβει WAVE2 στην αιχμή. Σουετσούγκου et al. [18] ανέφεραν ότι η δραστικότητα του συμπλόκου WAVE2 βελτιστοποιήθηκε με IRSp53 σε συνδυασμό με ενεργοποιημένο Rac1 και ΡΙ (3,4,5) Ρ

3. Επιπλέον, οι ταυτόχρονη σύνδεση του GTP-δεσμευμένη Rac και όξινα φωσφολιπίδια όπως ΡΙ (3,4,5) Ρ

3 έως WAVE2 απαιτείται για την αποτελεσματική πρόσληψη και ενεργοποίηση WAVE2 [17]. Αυτές οι προηγούμενες εκθέσεις ενισχύσει τον ισχυρισμό μας ότι η αναστολή των lamellipodial επέκταση από τους αναστολείς PI3K αποτελέσματα από την διαταραχή της πρόσληψης WAVE2.

Σε αυτή τη μελέτη, η ενεργοποίηση των ΡΑ-Rac1 που προκαλείται από την παραγωγή των PI (3,4,5 ) P

3 και η πρόσληψη των WAVE2 όταν ξεκίνησε lamellipodial επέκταση. Επιπλέον, οι αναστολείς PI3K εμπόδισε την πρόσληψη WAVE2 και PI (3,4,5) P

3 και κατέστειλε lamellipodial επέκταση. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η PI3K διαδραματίζει ουσιαστικό ρόλο στην έναρξη lamellipodial επέκταση. Επιπλέον, χρησιμοποιούνται συστατικώς δραστικά κύτταρα που εκφράζουν Rac1Q61L να παρατηρήσει την απόκριση του εκτεταμένου ελασματοπόδια στην αναστολή της δραστικότητας ΡΙ3Κ. Σε κύτταρα που εκφράζουν Rac1Q61L, η εκτεταμένη ελασματοπόδια ήταν σχετικά ανθεκτικά στους αναστολείς PI3K.