Abstract

Η γενιστεΐνη έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει καρκίνους τόσο in vitro όσο και in vivo, με μεταβολή της έκφρασης αρκετών microRNAs (miRNAs). Σε αυτή τη μελέτη, επικεντρωθήκαμε σε όγκο miRNAs καταπιεστής ρυθμίζονται από genistein και να διερευνηθεί η λειτουργία τους στον καρκίνο του προστάτη (PCA) και μονοπάτια στόχο. Χρησιμοποιώντας την ανάλυση μικροσυστοιχιών miRNA και σε πραγματικό χρόνο RT-PCR παρατηρήσαμε ότι το miR-574-3p ήταν σημαντικά up-ρυθμίζονται σε κύτταρα προστάτη αντιμετωπίζονται με γενιστεΐνη σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος. Η έκφραση του miR-574-3p ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε κυτταρικές σειρές προστάτη και την κλινική τους ιστούς του προστάτη σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα του προστάτη (RWPE-1) και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών. Χαμηλό επίπεδο έκφρασης του miR-574-3p συσχετίστηκε με προχωρημένο στάδιο του όγκου και μεγαλύτερο σκορ Gleason σε δείγματα προστάτη. Re-έκφραση του miR-574-3p σε κύτταρα προστάτη ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη μετανάστευση και την εισβολή in vitro και in vivo. αποκατάσταση miR-574-3p απόπτωση που επάγεται μέσω της μείωσης των Bcl-xL και ενεργοποίηση της κασπάσης-9 και κασπάσης-3. Χρησιμοποιώντας GeneCodis ανάλυση λογισμικού, πολλά μονοπάτια που επηρεάζονται από miR-574-3p εντοπίστηκαν, όπως «Μονοπάτια του καρκίνου», «σηματοδοτικό μονοπάτι JAK-STAT», και «Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι». Δοκιμασίες λουσιφεράσης ανταποκριτή απέδειξαν ότι miR-574-3p συνδέεται άμεσα με την 3 ‘UTR αρκετών γονιδίων-στόχων (όπως RAC1, EGFR και EP300), που είναι συστατικά της «Pathways στον καρκίνο». Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου και Western ανάλυση έδειξε ότι τα επίπεδα του mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης των τριών γονιδίων στόχων σε κύτταρα προστάτη ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται με miR-574-3p. Μελέτες απώλειας λειτουργίας κατέδειξε ότι οι τρεις γονίδια στόχους επηρεάζουν σημαντικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή σε κυτταρικές γραμμές PCa. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η genistein up-ρυθμίζει ογκοκατασταλτικό miR-574-3p έκφραση στόχευση διαφόρων κυτταρικών μονοπατιών σηματοδότησης. Τα ευρήματα αυτά ενισχύουν την κατανόηση του πώς genistein ρυθμίζει με miRNA στον προστάτη

Παράθεση:. Chiyomaru Τ, Yamamura S, Fukuhara S, Hidaka Η, Majid S, Saini S, et al. (2013) Γενιστεΐνη Up-Ρυθμίζει Ογκοκατασταλτικής microRNA-574-3p στον καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 8 (3): e58929. doi: 10.1371 /journal.pone.0058929

Επιμέλεια: Burton Β Yang, του Πανεπιστημίου του Τορόντο, Καναδά

Ελήφθη: 16 Οκτ του 2012? Αποδεκτές: 8η Φεβρουαρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 12, Μάρ 2013

Copyright: © 2013 Chiyomaru et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Κέντρο Έρευνας Πόρων των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας μέσω αριθμών Grant R01CA160079, R01CA138642, T32DK007790 και VA κριτική Αξιών και VA Έργου του Προγράμματος. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Συν-συγγραφέας Rajvir Dahiya είναι μια Συντακτική μέλος του Διοικητικού Συμβουλίου PLoS ONE. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η πιο συχνά διαγιγνώσκεται τύπος καρκίνου μεταξύ των ανδρών το 2012 είναι ο καρκίνος του προστάτη (PCA) που αναμένεται να αντιπροσωπεύουν το 29% (241.740) όλων των νέων περιπτώσεων καρκίνου. Προστάτη κατατάσσεται δεύτερη στην καρκίνο του πνεύμονα σε θανάτους από καρκίνο σχετίζονται και αναμένεται να αντιπροσωπεύουν το 9% (28.170) του συνόλου των αρσενικών θανάτων από καρκίνο το 2012 [1]. Μεταστατικό προστάτη δεν είναι ιάσιμη και συνεχίζει να είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο [2]. Ο κατευνασμός μπορεί να επιτευχθεί με ορμονοθεραπεία στέρησης ωστόσο μετά από μια εξαιρετική αρχική ανταπόκριση, σε περίπου 2 με 3 χρόνια οι περισσότερες από αυτές ΣΕΣΣ θα υποτροπιάζουν στην ανθεκτική ευνουχισμό μορφή της νόσου [3] με το θάνατο συνήθως συμβαίνει μέσα σε αρκετές [4] χρόνια. Δεν υπάρχουν επιτυχημένες θεραπείες για ανεξάρτητου από ανδρογόνο PCa. Η καλύτερη κατανόηση των βιολογικών μηχανισμών των ανδρογόνων-ανεξάρτητο προστάτη μπορεί να οδηγήσει σε νέες προσεγγίσεις για τη θεραπεία του προστάτη που δεν ανταποκρίνεται με μεγαλύτερη επιτυχία.

Ανάπτυξη των χημειοθεραπευτικών παραγόντων με χαμηλή τοξικότητα ασθενής εξετάζεται επί του παρόντος από πολλούς επιστήμονες. Πολλοί από αυτούς τους παράγοντες που προέρχονται από φυσικά φυτικά προϊόντα. Η γενιστεΐνη είναι ένα phytoestrogenic ισοφλαβονοειδές που έχει πλειοτροπικές βιολογικές επιδράσεις σε μια ευρεία ποικιλία καρκίνων, χωρίς καμία εμφανή τοξικότητα σε φυσιολογικά κύτταρα [5]. Η genistein είναι ένας αναστολέας της πρωτεϊνικής κινάσης της τυροσίνης και επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση, αγγειογένεση όγκου, μετάσταση και εξασθενεί την αντίσταση σε πολλά φάρμακα που περιλαμβάνουν βασικά συστατικά οδών μεταγωγής σήματος [6], [7], [8].

microRNAs (miRNAs ) είναι μικρά μη-κωδικοποίησης RNAs (21-23 νουκλεοτίδια) που κατά κύριο λόγο συνδέονται ατελώς στην 3 ‘αμετάφραστη περιοχή (UTR) του mRNA που στόχου και ρυθμίζουν αρνητικά την έκφραση του γονιδίου μετα-μεταγραφικά από μεταφραστικά καταστολή και την υποβάθμιση του στόχου mRNA [9], [ ,,,0],10]. Από τον προσδιορισμό των miRNAs το 1993 πάνω από 1500 ανθρώπινη miRNAs έχουν καταχωρηθεί στη βάση δεδομένων miRBase (https://microrna.sanger.ac.uk/). Βιοπληροφορική δείχνουν ότι πάνω από το 60% των γονιδίων που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη μπορεί να στοχεύονται από miRNAs [11]. miRNAs παίζουν σημαντικό ρόλο σε πολλές βιολογικές διεργασίες, όπως η ανάπτυξη, η διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση, την αγγειογένεση και το μεταβολισμό. Επιπλέον, είναι ρυθμιστές κλειδιά στη θεραπεία πολλών ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [12] και miRNAs μπορούν να λειτουργήσουν ως ογκογονίδια ή γονίδια καταστολής όγκου [13], [14]. Οι επιδράσεις της γενιστεΐνης στην ρύθμιση αρκετών miRNAs έχουν αναφερθεί [15], [16], [17]. Το εργαστήριο μας έχει δείξει ότι η γενιστεΐνη αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων που στοχεύουν ογκογόνο miRNAs όπως miR-21, miR-151, miR-221 και miR-222. Σε αυτή τη μελέτη, εστιάσαμε στην ογκοκατασταλτικό miR-574-3p που ρυθμίζεται από genistein και να διερευνηθεί η λειτουργία της σε προστάτη και στόχος μονοπάτια.

Αποτελέσματα

Γενιστεΐνη θεραπεία αυξάνει miR-574-3p η έκφραση που ρυθμίζεται προς τα κάτω σε PCa

Για τον προσδιορισμό των σχετικών επιπέδων έκφρασης miR-574-3p σε κύτταρα προστάτη, πραγματοποιήσαμε ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας κυτταρικές γραμμές DU145 PC3 και και σε σύγκριση τους με φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη (RWPE-1). Παρατηρήσαμε ότι miR-574-3p έκφραση ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω σε κυτταρικές σειρές προστάτη συγκριτικά με κύτταρα RWPE-1 (PC3 0,68 φορές, DU145 0,65 φορές) (Εικ. 1Α).

(Α) Η έκφραση του miR-574-3p σε κυτταρικές σειρές προστάτη (DU145 και PC3) και φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα προστάτη (RWPE-1). Real-time PCR έδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης του miR-574-3p ήταν κάτω-ρυθμίζονται σε κυτταρικές σειρές προστάτη (DU145 και PC3). miR-574-3p έκφραση ομαλοποιήθηκε σε RNU48. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE. *, P & lt? 0,05. (Β) Τα επίπεδα έκφρασης του miR-574-3p μετά από θεραπεία με γενιστεΐνη (25 μΜ και 50 μΜ). miR-574-3p έκφραση αυξήθηκε κατά 30-50% σε κύτταρα κατεργασμένα genistein σε σύγκριση με τους μάρτυρες. *, P & lt? 0,05. (C) miR-574-3p έκφραση σε κλινικά δείγματα (παρακείμενο φυσιολογικό ιστό, η = 48? PCa, n = 48). miR-574-3p έκφραση προσδιορίστηκε με PCR πραγματικού χρόνου και ομαλοποιήθηκε ως προς RNU48. P & lt? 0,0001. (D) σε πραγματικό χρόνο PCR που δείχνουν συσχέτιση των κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά με miR-574-3p έκφρασης.

Η

Για τον προσδιορισμό miRNAs ρυθμίζεται από genistein, πραγματοποιήσαμε μια μικροσυστοιχιών miRNA χρησιμοποιώντας κύτταρα PC3 μετά genistein θεραπεία (Πίνακας 1 ). Η έκφραση των miRNAs 33 ήταν σημαντικά up-ρυθμίζεται χρησιμοποιώντας δύο συγκεντρώσεις genistein (25 μΜ και 50 μΜ) με miR-574-3p είναι η πιο πληγείσα. Προηγούμενες μελέτες έκφρασης των miRNAs από το εργαστήριο μας έδειξαν επίσης ότι το miR-574-3p ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε δείγματα προστάτη σε σύγκριση με τους μη-καρκινικούς ιστούς του προστάτη [18]. Για να επιβεβαιώσετε την έκφραση του miR-574-3p, πραγματοποιήσαμε TaqMan ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση και παρατήρησε ότι miR-574-3p έκφραση ήταν σημαντικά up-ρυθμίζονται με θεραπεία genistein (1,31 – 1,50 φορές) (Εικ. 1Β).

miR-574-3p είναι σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε προστάτη ιστών Δείγματα

Εμείς αξιολογήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης του miR-574-3p σε ανθρώπινους ιστούς προστάτη (n = 48) και των παρακείμενων μη -cancerous ιστούς (n = 48). Το επίπεδο έκφρασης του miR-574-3p ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε σύγκριση με PCa φυσιολογικούς ιστούς (Ρ & lt? 0,0001? Εικ. 1 C). Για να προσδιορίσετε αν τα επίπεδα των miR-574-3p σε ιστούς όγκων συσχετίζεται με κλινική-παθολογική παράγοντες, αναλύσαμε miR-574-3p επίπεδα έκφρασης σε ανθρώπινα δείγματα όγκων. Οι κλινικές δημογραφικά στοιχεία της κοόρτης της μελέτης συνοψίζονται στον Πίνακα 2. Συσχέτιση 574-3p έκφρασης με κλινικοπαθολογοανατομικές μεταβλητές, όπως η παθολογική στάδιο (PT) και το σκορ Gleason φαίνεται στο σχήμα. 1D. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι περιπτώσεις με χαμηλή αύξηση της έκφρασης του miR-574-3p από χαμηλής ποιότητας, χαμηλής παθολογικές στάδιο για υψηλής ποιότητας και υψηλής παθολογική στάδιο. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-574-3p είναι σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε προστάτη και μπορεί να είναι ένα υποθετικό ογκοκατασταλτικό στη ΣΕΣΣ.

Η

Επίδραση του miR-574-3p Υπερ-έκφραση επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, Μετανάστευση και εισβολή σε προστάτη γραμμές κυττάρων in vitro και in vivo

Για να εξετάσει τις λειτουργικές τους ρόλους του miR-574-3p, πραγματοποιήσαμε μελέτες κέρδος-of-λειτουργία χρησιμοποιώντας ένα προ-miR-574-3p miRNA πρόδρομοορ επιμολυσμένα σε PC3 και DU145 κύτταρα. Η έκφραση του miR-574-3p ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε προ-miR miRNA πρόδρομος επιμολύνσεων (Σχήμα 2Α?. PC3 316,8 φορές, DU145 307,5 ​​φορές). δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων (MTS) και δοκιμασία επούλωσης τραυμάτων έδειξε σημαντική αναστολή σε miR-574-3p μορφομετατροπείς σε αμφότερα τα κύτταρα PC3 και DU145 σε σύγκριση με τους μορφομετατροπείς αναφοράς (Σχ. 2Β και 2C). δοκιμασία Εισβολή (Matrigel) έδειξαν επίσης ότι ο αριθμός των κυττάρων που εισβάλλουν μειώθηκε σημαντικά σε miR-574-3p μορφομετατροπείς σε σύγκριση με τους ομολόγους τους (Σχ. 2D). Για να επιβεβαιώσετε το αποτέλεσμα του miR-574-3p για ογκογονικότητα in vivo, miR-574-3p και miR-ελέγχου-επιμολυσμένα κύτταρα DU145 υποδόρια ένεση σε γυμνά ποντίκια. Παρατηρήσαμε ότι miR-574-3p υπερέκφραση ανέστειλε το σχηματισμό των καρκινικών κυττάρων DU145 ίη νίνο (Σχ. 2Ε). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι miR-574-3p παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του κυτταρικού όγκου.

(Α) miR-574-3p επίπεδα έκφρασης σε κυτταρικές σειρές προστάτη (PC3 και DU145) προσδιορίσθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR στις 72 ώρες μετά την επιμόλυνση του προδρόμου προ-miR miRNA. miR-574-3p έκφραση ομαλοποιήθηκε σε RNU48. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE. (Β) Η υπερέκφραση του miR-574-3p αναστέλλει σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αναλύθηκε με την δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων MTS 1, 2 και 4 ημέρες μετά την παροδική επιμόλυνση. *, P & lt? 0,05. (Γ) Η υπερέκφραση του miR-574-3p αναστέλλει σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων. Μετά την επιμόλυνση (48 ώρες), ένα τραύμα σχηματίστηκε με απόξεση και να μετρηθεί μετά από 6, 12 και 24 ώρες. Αντιπροσωπευτικά εικόνες των πληγών δοκιμασία επούλωσης παρουσιάζεται στο 200 × μεγέθυνση. ** P & lt? 0,0001. *, P & lt? 0.005. (D) Η υπερέκφραση του miR-574-3p μειώθηκαν σημαντικά την κυτταρική διείσδυση. Αντιπροσωπευτικά εικόνες της ανάλυσης εισβολής εμφανίζεται στο 200 × μεγέθυνση. *, P & lt? 0.005. (Ε) Αντιπροσωπευτικές εικόνες των όγκων σε γυμνά ποντίκια 5 εβδομάδες μετά την υποδόρια ένεση των επιμολυσμένων miR-574-3p κυτταρικές γραμμές DU145 ή κυτταρικές γραμμές ελέγχου και χρονική πορεία της ανάπτυξης του όγκου.

Η

miR-574-3p επιρροές κυτταρική απόπτωση στα κύτταρα του προστάτη

Από το miR-574-3p αποκατάσταση ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κυτταρικές σειρές προστάτη, υποθέσαμε ότι η αποκατάσταση της μπορεί να προκαλέσει απόπτωση. Σύκο. 3Α και 3Β έδειξε ότι οι αποπτωτικών και πρώιμων αποπτωτικών κλάσματα (πάνω δεξιά και κάτω δεξιά στο τεταρτημόριο εικόνες, αντίστοιχα) ήταν υψηλότερες σε miR-574-3p μορφομετατροπείς σε σύγκριση με το μάρτυρα. Αυτό οδηγεί σε μια προ-αποπτωτικό ρόλο για miR-574-3p και προτείνει ότι επηρεάζει αποπτωτικά μονοπάτια και ρυθμίζει την γένεσιν όγκων. Συνεπώς εξετάσαμε την έκφραση διαφόρων αποπτωτικών πρωτεϊνών με ανάλυση κηλίδος Western και διαπίστωσε ότι miR-574-3p επανέκφραση προκαλεί Bcl-xL κάτω ρύθμιση (Σχ. 3C). Επίσης, διασπάται κασπάσες-9 και -3 ήταν πάνω ρυθμισμένα (Σχ. 3C), υποστηρίζοντας περαιτέρω το γεγονός ότι το miR-574-3p είναι ένα προ-αποπτωτικό miRNA.

(Α) Προσδιορισμός απόπτωσης χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής . Αντιπροσωπευτικά στοιχεία τεταρτημόριο του miR-ελέγχου και miR-574-3p επιμολύνσεων σε PC3 (άνω) και DU145 (κάτω) κύτταρα. (Β) Το ραβδόγραμμα δείχνει την αναλογία των κλασμάτων αποπτωτικών κυττάρων (πρώιμων αποπτωτικών συν αποπτωτικών κυττάρων) σε miR-574-3p επιμολύνσεις σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Τα δεδομένα για τα αποπτωτικά κυτταρικά κλάσματα εκφράζεται ως η σχετική τιμή για τη μέση έκφραση του μορφομετατροπέα miR-ελέγχου. *, P & lt? 0,05. (C) ανοσοστυπώματα ανάλυσης για αποπτωτικών δεικτών στο miR-ελέγχου και miR-574-3p επιμολυσμένα κύτταρα DU145. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

Αναζήτηση για miR-574-3p γονίδια-στόχους από in silico ανάλυση

Για να αναζητήσετε υποθετική γονιδίων στόχων του miR-574-3p, εμείς που χρησιμοποιούνται στη βάση δεδομένων TargetScan. Το πρόγραμμα αυτό έδειξε ότι το miR-574-3p έχει 437 προβλέψει γονιδίων στόχων. Χρησιμοποιήσαμε in silico ανάλυση για τον προσδιορισμό των βιολογικών διεργασιών ή πορείες δυνητικά ρυθμίζονται από miR-574-3p. Τα γονίδια στόχοι υποψήφιος είχαν ανατεθεί σε μονοπάτια χρησιμοποιώντας ανάλυση GeneCodis λογισμικού (https://genecodis.cnb.csic.es) [19], [20], [21], καθώς και στατιστικά εμπλουτισμένο οδοί αναγνωρίσθηκαν όπως «Μονοπάτια του καρκίνου» «μονοπάτι JAK-STAT σηματοδότηση», και «Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι» (Ρ & lt? 0,05, Πίνακας 3). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ανάλυση γονιδιακής έκφρασης για όλα τα υποψήφια γονίδια-στόχους που εμπλέκονται σε καθεμιά από τις 9 μονοπάτια χρησιμοποιώντας δεδομένα έκφρασης μικροσυστοιχιών, οι οποίες εγκρίθηκαν από το Gene Expression Omnibus (GEO) και επικεντρώθηκε στα «Μονοπάτια του καρκίνου». Από την ανάλυση αυτή, εντοπίστηκαν αρκετά σημαντικά στόχους γονίδιο, συμπεριλαμβανομένων tropomyosin 3 (TPM3), χωρίς φτερά τύπου MMTV οικογενειακή ιστοσελίδα ολοκλήρωσης, μέλος 5Α (WNT5A), ras σχετίζονται C3 botulinum υπόστρωμα τοξίνη 1 (rho οικογένειας, πρωτεΐνη που δεσμεύεται με μικρή GTP Rac1) (RAC1), υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), υποδοχέα ρετινοειδών Χ, άλφα (ΚΧΚα), v-ΑΚΤ ποντικού thymoma ογκογονίδιο ιού ομόλογο 2 (ΑΚΤ2), και Ε1Α δεσμευτική πρωτεΐνη p300 (EP300).

Η

λουσιφεράσης αναλύσεις που χρησιμοποιούν διανύσματα περιέχουν 3’UTR τοποθεσίες των γονιδίων Υποθετικά δέσμευσης στόχου

για να επιβεβαιώσετε τη σύνδεση του miR-574-3p στο 3 ‘UTR αυτών των 7 γονιδίων στόχων, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς λουσιφεράσης. Κάθε στόχος έχει μία προβλεπόμενη θέση δέσμευσης για miR-574-3p (Σχ. 4Α). Εμείς κλωνοποιημένα οι υποθετικές miR-574-3p 3’UTRs στοχεύουν σε μια λουσιφεράσης φορέα δοκιμασία ρεπόρτερ. δοκιμασίες λουσιφεράσης έδειξαν ότι το miR-574-3p μείωσε τις σχετικές δραστηριότητες της λουσιφεράσης της RAC1, EGFR και EP300 (Εικ. 4Β) εκτός των άλλων τεσσάρων γονιδίων. Μετάλλαξη του υποθετικές θέσεις σε αυτές τις 3’UTRs δεσμευτική miR-574-3p μείωσε την απάντηση miR-574-3p υποδεικνύοντας ότι το miR-574-3p συνδέεται άμεσα με τις 3’UTRs της RAC1, EGFR και EP300.

(Α) Υποθετικά miR-574-3p δέσμευσης και μεταλλαγμένες θέσεις στην 3’UTR των γονιδίων στόχων. δοκιμασίες (Β) λουσιφεράσης ανταποκριτή χρησιμοποιώντας φορείς που κωδικοποιούν υποθετικές θέσεις πρόσδεσης 3’UTR. PC3 και DU145 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με πρόδρομο Pre-miR miRNA ή αρνητικό μάρτυρα, που ακολουθείται από παροδική επιμόλυνση με βασικό φορέα ή άγριου-τύπου πλασμίδια 3’UTR αναφοράς ή μεταλλαγμένες πλασμίδια 3’UTR για 24 ώρες. δραστηριότητα ανταποκριτή 3’UTR μετρήθηκε με λουσιφεράσης δοκιμασία και ομαλοποιήθηκε ως προς τη δραστικότητα της λουσιφεράσης της Renilla. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE. *, P & lt? 0,05. (ΝΤΟ). Τα επίπεδα mRNA των τριών γονιδίων στόχων του miR-574-3p προσδιορίστηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR αναλύσεις μετά από επιμόλυνση με miR-574-3p μιμείται και αρνητικού μάρτυρα σε κυτταρικές σειρές προστάτη (PC3 και DU145). *, P & lt? 0,05. (Δ) Ανάλυση ανοσοκηλίδας για τα γονίδια-στόχους σε miR-ελέγχου και miR-574-3p επιμολυσμένα κύτταρα PC3. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

Κανονισμός του συστήματος Target Gene Expression σε προστάτη κυτταρικές γραμμές με miR-574-3p

Ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση έδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης του mRNA των τριών γονιδίων στόχων σε PC3 και DU145 κατεστάλησαν στο ΜΙΚ-574-3p μορφομετατροπείς σε σύγκριση με τους ελέγχους (Σχ. 4C). Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης από τα τρία γονίδια στόχους μειώθηκαν επίσης στο ΜΙΚ-574-3p μορφομετατροπείς σε σύγκριση με τους ελέγχους (Σχ. 4D).

Επίδραση του γονιδίου στόχου siRNA Knockdown επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, μετανάστευση, και εισβολή δραστηριότητα στο προστάτη κυτταρικές γραμμές

Για να εξετάσει το λειτουργικό ρόλο των γονιδίων στόχων, πραγματοποιήσαμε μελέτες απώλειας λειτουργίας χρησιμοποιώντας si-RNA νοκ ντάουν με PC3 και DU145 κύτταρα. Η έκφραση mRNA και πρωτεΐνης του RAC1, EGFR και EP300 ήταν σημαντικά κατασταλεί σε si-RNA μορφομετατροπείς σύγκριση με τους ελέγχους (Σχ. 5Α και 5Β). δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων (MTS) και πληγή δοκιμασία επούλωσης έδειξαν σημαντική αναστολή σε si-RAC1, si-EGFR και επιμολύνσεις si-EP300 και στα δύο κύτταρα PC3 και DU145 σε σύγκριση με τις επιμολύνσεις ελέγχου (Εικ. 5C και 5D). δοκιμασία εισβολής (Matrigel) έδειξε επίσης ότι ο αριθμός των εισβάλλοντας κυττάρων μειώθηκε σημαντικά σε si-RAC1, si-EGFR και si-EP300 επιμολύνσεις σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχ. 5Ε).

(Α) Target τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης σε κυτταρικές σειρές προστάτη (PC3 και DU145) καθορίστηκαν με PCR πραγματικού χρόνου σε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση του siRNA. έκφραση του γονιδίου-στόχου κανονικοποιήθηκε προς GAPDH. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE. *, P & lt? 0,05. (Β) έκφραση του γονιδίου-στόχου σε κυτταρικές σειρές PC3 προσδιορίστηκαν με ανάλυση ανοσοαποτύπωσης σε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση του siRNA. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Γ) εξόντωση RAC1, EGFR και EP300 αναστέλλει σημαντικά την κυτταρική βιωσιμότητα. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αναλύθηκε με την δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων MTS 1, 2 και 4 ημέρες μετά την παροδική επιμόλυνση. (D) Νοκ ντάουν της RAC1, EGFR και EP300 αναστέλλει σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων. Μετά την επιμόλυνση (48 ώρες), ένα τραύμα σχηματίστηκε με απόξεση και να μετρηθεί μετά από 6, 12 και 24 ώρες. Αντιπροσωπευτικά εικόνες των πληγών δοκιμασία επούλωσης παρουσιάζεται στο 200 × μεγέθυνση. (Ε) εξόντωση RAC1, EGFR και EP300 μειώθηκαν σημαντικά την κυτταρική διείσδυση. Αντιπροσωπευτικά εικόνες της ανάλυσης εισβολής εμφανίζεται στο 200 × μεγέθυνση. ** P & lt?. 0.0001

Η

Συζήτηση

Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι η genistein ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, την εισβολή, την αγγειογένεση και μετάσταση στοχεύοντας διάφορα γονίδια και σηματοδότηση μονοπατιών [6], [7], [22]. Για παράδειγμα genistein ανέστειλε κύτταρο εισβολή μειώνοντας την έκφραση του ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 σε ανθρώπινα επιθηλιακά προστάτη και μεταστατικά κύτταρα όπου εξέλιξης του όγκου συσχετίζεται θετικά με την έκφραση της ΜΜΡ [23], [24], [25]. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι η genistein κάτω ρυθμισμένη η έκφραση του MCM2 αυξάνοντας miR-1296 έκφραση σε κύτταρα προστάτη [26]. Έχουμε επίσης αναφερθεί ότι η genistein κάτω ρυθμισμένα miR-221/222 έκφραση σε κύτταρα προστάτη με αποτέλεσμα την αυξημένη έκφραση του γονιδίου καταστολής όγκων ΑΡΧΗ οποίο είναι στόχος της miR-221/222 [16]. Η genistein έχει επίσης αναφερθεί ότι αναστέλλει την αγγειογένεση προστάτη με καταστολή των οδών αυτοκρινείς και παρακρινείς σηματοδότηση VEGF με μεσολάβηση μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων [27]. Το γονίδιο EP300 έχει ταυτοποιηθεί ως συν-ενεργοποιητής της HIF1A και παίζει ένα ρόλο στην διέγερση των γονιδίων που προκαλείται από υποξία όπως VEGF [28]. RAC1 είναι επίσης ένας σημαντικός ρυθμιστής του VEGF με μεσολάβηση αγγειογένεσης [29] και miR-151 έχει ένα ογκογόνο λειτουργία ρύθμισης ενεργοποίηση RAC1 με τη στόχευση ARHGDIA [30]. Μπορούμε επίσης αποδειχθεί πρόσφατα ότι η genistein ανέστειλε τη μετανάστευση προστάτη των κυττάρων και up-ρυθμιζόμενη πολλά ογκοκατασταλτικά γονίδια, συμπεριλαμβανομένων ARHGDIA στόχαστρο miR-151. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι genistein up-ρυθμίζεται miR-574-3p έκφραση στα κύτταρα του προστάτη. In silico ανάλυση και δοκιμασίες λουσιφεράσης έδειξαν ότι RAC1 και EP300 ήταν υποτιθέμενο γονιδίων στόχων για miR-574-3p. Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου και Western ανάλυση έδειξε ότι τα επίπεδα του mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης του RAC1 και EP300 σε κύτταρα προστάτη ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω με miR-574-3p. Ως εκ τούτου, genistein μπορεί να μειορυθμίζουν RAC1 και EP300 έως ρύθμισης miR-574-3p.

Υπερ-έκφραση της Notch 1 οδηγεί στην επαγωγή του φαινοτύπου ΕΜΤ και αυξημένη έκφραση του miR-21 [31]. Η γενιστεΐνη έχει αποδειχθεί ότι αδρανοποιούν τα Notch και hedgehog σηματοδότηση [31], [32] και έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ότι η genistein ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου με μείωση miR-21 έκφραση σε νεφροκυτταρικό καρκίνωμα [15]. Έτσι έχει genistein μια λειτουργία καταστολής όγκου, ρύθμιση «σηματοδότηση Notch» από κάτω ρύθμιση των miR-21. Genistein μπορεί επίσης να μειώσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων με τη ρύθμιση «Wnt σηματοδότηση» [33], [34], [35] μέσω του miR-574-3p στον καρκίνο. Σε αυτό το EGFR μελέτη, ένα υποθετικό γονίδιο στόχος για miR-574-3p, ήταν ρυθμισμένη σε προστάτη και αυξάνεται σε προχωρημένο καρκίνο [36], [37]. έκφραση EGFR συσχετίστηκε με υψηλό σκορ Gleason, υποτροπή της νόσου και ορμονοάντοχου κατάστασης [37], [38]. Οι ερευνητές ανέφεραν ότι EGFR ρυθμίζεται από διάφορους miRNAs όπως miR-7, miR-128b, miR-133, miR-145, miR146a, miR-146b-5P, miR-331-3p, miR-542-5p [39] – [47]. Η γενιστεΐνη επάνω ρυθμισμένη έκφραση miR-146a σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα και λειτουργεί ως καταστολέας όγκων σε ευνουχισμό ανθεκτικά προστάτη [44], [45]. Genistein ίσως κάτω-ρυθμίζονται τα επίπεδα EGFR από up-ρύθμιση miR-574-3p.

genistein επάγει την απόπτωση με τη ρύθμιση ενδογενών και εξωγενών οδών σηματοδότησης. Pro- και αντι-αποπτωτικών Bcl-2 οικογένεια πρωτεϊνών διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της μιτοχονδριακής αποπτωτικό μονοπάτι [48] και τα κάτω ρύθμιση των Bcl-xL με genistein επάγει απόπτωση σε κύτταρα προστάτη [49]. Σε αυτή την οδό ενεργοποιημένης κασπάσης-9 επιταχύνει την ενεργοποίηση της κασπάσης δήμιος, συμπεριλαμβανομένης της κασπάσης-3, και τα μόρια διαδοχικά διασπά σηματοδότησης και κυτταρικών πρωτεϊνών [49], [50]. Στη μελέτη μας, miR-574-3p επαγόμενη απόπτωση και οργανωμένη έκφραση των Bcl-XL, κασπάσης-9 και της κασπάσης-3. Ως εκ τούτου, η παρούσα μελέτη δείχνει ότι η genistein επαγόμενη απόπτωση στα κύτταρα του προστάτη εμφανίζεται με αυξημένη miR-574-3p έκφρασης.

Σε αυτή τη μελέτη, εστιάσαμε στην miR-574-3p που ρυθμίζεται προς τα πάνω από genistein και ήταν σημαντικά ρυθμισμένα προς τα κάτω miRNA ειδική προς PCA στο προφίλ miRNA [18]. προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι το miR-574-3p θα μπορούσε να είναι ένα ογκοκατασταλτικό miRNA στον προστάτη και καρκίνου της ουροδόχου κύστης [18], [51], [52]. miR-574-3p βρίσκεται στο χρωμόσωμα 4p14, ένα συχνά διαγράφονται χρωμοσωμική περιοχή σε PCa και κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως [51], [53]. Su et al ανέφεραν ότι η έκφραση του miR-574-3p μειώθηκε σε γαστρικό καρκίνο και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή ήταν σημαντικά ανέστειλε σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα miR-574-3p επιμολυσμένα [54]. Βρήκαν το γονίδιο CUL2 να είναι ένας στόχος του miR-574-3p χρήση από υπολογιστική πρόβλεψη και πειραματική επαλήθευση. προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι miR-574-3p έχει λειτουργία καταστολής όγκου και ότι το ογκογόνο γονίδιο MESDC1 στοχεύεται από miR-574-3p στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης [52]. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε αποδείξει ότι το miR-574-3p ρυθμίζεται προς τα κάτω σε κλινικά δείγματα προστάτη και ανδρογόνο-ανεξάρτητες κυτταρικές σειρές προστάτη (PC3 και DU145). Κάτω ρύθμιση του miR-574-3p έκφραση σε όγκους σχετίζεται με υψηλό στάδιο του όγκου και το σκορ Gleason υποδεικνύοντας ότι το miR-574-3p μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως βιολογικός δείκτης για την εξέλιξη του όγκου σε ΣΕΣΣ.

Εν κατακλείδι, μας τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η genistein up-ρυθμίζει miR-574-3p έκφραση η οποία στοχεύει σε διάφορες κυτταρικές σηματοδότηση μονοπατιών. Αυτά τα ευρήματα ενισχύσουν την κατανόησή μας για το πώς genistein ρυθμίζει την έκφραση των miRNAs στην ΣΕΣΣ.

Υλικά και Μέθοδοι

Κλινική του προστάτη δείγματα

Όλα τα slides ιστού εξετάστηκαν από μια σκάφους επικυρωμένο παθολόγο για το ταυτοποίηση του προστάτη εστίες, καθώς και παρακείμενο φυσιολογικό αδενικό επιθήλιο. Όλες οι ασθενείς με καρκίνο είχαν αυξημένα επίπεδα του ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) και είχαν υποβληθεί σε ριζική προστατεκτομή, από το 1998 έως το 2004. Τα δημογραφικά στοιχεία του ασθενούς »παρουσιάζονται στον Πίνακα 2. Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς και η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή UCSF για τα Ανθρώπινα Ερευνών (αριθμός έγκρισης: H9058-35751-01).

Cell Culture

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου προστάτη, PC3 και DU145 και ένα μη κακοήθη επιθηλιακά κυτταρική σειρά του προστάτη, RWPE-1, αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). κυτταρικές σειρές προστάτη καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO2 και 95% αέρα στους 37 ° C. κύτταρα RWPE-1 καλλιεργήθηκαν σε μέσο ανάπτυξης κερατινοκυττάρων συμπληρωμένο με 5 ng /ml ανθρώπινου ανασυνδυασμένου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα και 0.05 mg /mL εκχύλισμα βόειας υπόφυσης (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). κύτταρα Υποσυρρέουσες (60% -70% συρροή) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με γενιστεΐνη (25 μmol /L και 50 μmol /L? Sigma, St Louis, ΜΟ, USA) διαλυμένη σε διμεθυλοσουλφοξείδιο και τα κύτταρα σε αγωγή με φορέα (διμεθυλοσουλφοξείδιο) χρησίμευσαν ως μάρτυρες. Μέσα και γενιστεΐνη αλλάχθηκαν κάθε μέρα και τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 4 ημέρες.

RNA Extraction

RNA εκχυλίστηκε από FFPE ανθρώπινα δείγματα χρησιμοποιώντας ένα miRNeasy σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εμπεδωθεί με παραφίνη κιτ (Qiagen, Valencia , CA, USA) μετά από μικροδιατομή. Για να αφομοιώσουν το DNA, χρησιμοποιήθηκε το Qiagen RNase-free kit DNase. Ολικό RNA εκχυλίστηκε επίσης από κυτταρικές σειρές του προστάτη και μη κακοηθών κυτταρική σειρά επιθηλιακών προστάτη χρησιμοποιώντας ένα κιτ miRNeasy mini (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

microRNA Microarray

Για miRNA μικροσυστοιχιών, ολικού RNA εξήχθη από κύτταρα PC3 σε επεξεργασία με τη χρήση ενός genistein miRNeasy Mini Kit. Η ανάλυση μικροσυστοιχιών miRNA πραγματοποιήθηκε και αναλύονται από μια εμπορική εταιρεία (Φάλαγγα Biotech, Belmont, CA, USA) χρησιμοποιώντας το ανθρώπινο v3 πλατφόρμα miRNA OneArray που έχει σχεδιαστεί για να περιέχει το 100% των miRBase Sequence Database Release 17.0.

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Εκχυλίσματα ολικού RNA μεταγράφηκε ανάστροφα σε μονόκλωνο cDNA χρησιμοποιώντας ένα κιτ σύνθεσης cDNA iScript (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) και έναν TaqMan microRNA αντίστροφη Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Ποσοτική ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR διεξήχθη με ένα Applied Biosystems Prism7500 Fast Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας, χρησιμοποιώντας TaqMan καθολικής PCR μάστερ μιξ σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Applied Biosystems). Τα επίπεδα έκφρασης του RNA προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το 7500 γρήγορο σύστημα SDS έκδοση λογισμικού 1.3.1 (Applied Biosystems). παράμετροι της PCR για το ποδήλατο ήταν ως ακολούθως: 95 ° C για 20 δευτερόλεπτα, 40 κύκλοι PCR στους 95 ° C για 3 δευτερόλεπτα, και 60 ° C για 30 δευτερόλεπτα. Όλες οι αντιδράσεις έγιναν σε ένα 10-μι όγκος αντίδρασης εις τριπλούν. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη δέλτα-δέλτα μέθοδος Ct για τον υπολογισμό της πολλαπλής μεταβολής. ανιχνευτές TaqMan και εναύσματα για RAC1 (ID δοκιμασία: Hs01902432_s1), EGFR (ID δοκιμασία: Hs01076078_m1), EP300 (ID δοκιμασία: Hs00914223_m1), GAPDH (ID δοκιμασία: Hs02758991_g1), miR-574-3p (ID δοκιμασία: 002349), RNU48 (Δοκιμασία ID: 001006) ελήφθησαν από την Applied Biosystems. GAPDH και RNU48 χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι.

Ανάλυση Western

Στις 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (Pierce, Brebieres, Γαλλία) που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης (Sigma). Πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση έγινε χρησιμοποιώντας ένα κιτ BCA προσδιορισμού πρωτεϊνών (Pierce). Protein λύμα (30 μg) διαχωρίστηκε επί 4% έως πηκτές SDS πολυακρυλαμιδίου 20% και μεταφέρθηκε σε μεμβράνη PVDF. Αντισώματα προς EP300 και Bcl-xL αγοράστηκαν από την Invitrogen και Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Αντισώματα έναντι RAC1, EGFR και GAPDH αγοράστηκαν από GeneTex (Irvine, CA, USA), αντίστοιχα. Αντισώματα προς διασπασμένη κασπάση 3, -9 και κασπάσης-3, -9 αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ, USA). Μετά την επώαση με πρωτογενές αντίσωμα η μεμβράνη πλύθηκε και κατόπιν επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα σε υπεροξειδάση (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ, USA). Ειδικά σύμπλοκα κατέστησαν ορατά με το σύστημα ανίχνευσης echochemiluminescence (ECL) (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Η μεμβράνη αφαιρέθηκε χρησιμοποιώντας ReBlot Plus Strong Antibody διάλυμα απογύμνωσης (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA). Το επίπεδο έκφρασης των γονιδίων στη συνέχεια αξιολογήθηκε με τη χρήση του λογισμικού ImageJ (ver 1,43?. https://rsbweb.nih.gov/ij/index.html).

Η επιμόλυνση

Pre-miR πρόδρομος miRNA και αρνητικού ελέγχου (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα κέρδος-of-λειτουργίας. RAC1, EGFR και EP300 siRNA (Sigma) και αρνητικού ελέγχου siRNA (D-001810 – 10? Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ, USA) χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα απώλειας λειτουργίας. PC3 και DU145 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (Invitrogen), σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή.

Κυττάρων πολλαπλασιασμός, μετανάστευση, και εισβολή Δοκιμασίες

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα CellTiter 96 υδατική Λύση Κυττάρου Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού (MTS) (Promega, Madison, WI, USA) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με μετρήσεις απορρόφησης στα 490 nm χρησιμοποιώντας SpectraMAX 190 (Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, USA). δραστικότητα μετανάστευσης των κυττάρων αξιολογήθηκε με δοκιμασία επούλωση της πληγής. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία έξι φρεατίων, και οι κυτταρικές μονοστοιβάδες αποξέστηκαν χρησιμοποιώντας ένα άκρο μικροπιπέτας Ρ-20. Το πλάτος της αρχικής διάκενο (0 h) και το υπολειμματικό κενό 6, 12 και 24 ώρες μετά τον τραυματισμό υπολογίστηκαν από μικροφωτογραφίες. Μια δοκιμασία κυττάρων εισβολή διεξήχθη χρησιμοποιώντας τροποποιημένο Boyden τμημάτων που αποτελούνται από transwell-προεπικαλυμμένα Matrigel ένθετα φίλτρο μεμβράνης με πόρους οκτώ micron σε πλάκες ιστοκαλλιέργειας 24 φρεατίων (Βϋ Biosciences, Bedford, ΜΑ, USA). Ελάχιστο βασικό μέσο που περιέχει 10% FBS στον κατώτερο θάλαμο χρησίμευσε ως χημειοελκυστικό, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [55]. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

In vivo όγκου Ανάπτυξης

Όλα φροντίδα των ζώων έγινε σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές του Ιατρικού Κέντρου του Σαν Φρανσίσκο Υποθέσεων Βετεράνων και η μελέτη εγκρίθηκε από το Σαν Φρανσίσκο VA (αριθμός πρωτοκόλλου: 11-008-01) IACUC. χρήστες ζώων έχουν ολοκληρώσει προγράμματα κατάρτισης για να χειριστεί και να συνεργαστεί με τα ποντίκια μέσω AALAS (Αμερικανική Ένωση για Εργαστήριο Επιστήμης Ζωικής Παραγωγής) πριν από τα πειράματα σε ζώα. Για την υποδόρια μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού, κύτταρα DU145 (2.5 × 10

6) που διαμολύνθηκαν παροδικά με miR-574-3p ή miR-ελέγχου αιωρήθηκαν σε 50 μι RPMI 1640 και εγχύθηκαν υποδορίως σε θηλυκούς γυμνούς ποντικούς (στέλεχος BALB /c ηυ /ηυ? Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, ΜΑ, USA, ηλικίας 5 εβδομάδων). Ένα σύνολο 8 γυμνών ποντικών (4-miR-574-3p, 4-miR-ελέγχου) χρησιμοποιήθηκαν και η ανάπτυξη του όγκου εξετάστηκε κατά τη διάρκεια των 35 ημερών. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε με βάση πλάτους (x) και μήκος (y):. x

2y /2, όπου x & lt? y

Η απόπτωση Δοκιμασίες

φθορισμού που ενεργοποιείται σε κύτταρα (FACS) ανάλυση για απόπτωση έγινε 96 ώρες μετά την επιμόλυνση, χρησιμοποιώντας αννεξίνη V-FITC /7-AAD Kit (Beckman Coulter, Brea, CA, USA), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Βιτρώ κύτταρα αναλύθηκαν αμέσως με ένα κυτταρόμετρο ροής (Cell Lab Quanta SC? Beckman Coulter).

Αναγνώριση του miR-574-3p ρυθμιζόμενα γονίδια-στόχοι και βιοπληροφορική ανάλυση

Για να αναζητήσετε τα γονίδια που ρυθμίζονται από miR-574-3p, χρησιμοποιήσαμε TargetScan αλγόριθμος (αφήστε 6.2, https://www.targetscan.org/). Για τον προσδιορισμό των βιολογικών διεργασιών ή πορείες δυνητικά ρυθμίζονται από miR-574-3p, πραγματοποιήσαμε ανάλυση GeneCodis (https://genecodis.dacya.ucm.es/) χρησιμοποιώντας όλα τα υποψήφια γονίδια.