Αφηρημένο

Το νευροβλάστωμα (ΝΒ) παθογένεια έχει αναφερθεί να σχετίζεται στενά με πολυάριθμες γενετικές αλλοιώσεις. Ωστόσο, ο βασικός προτύπων μεθυλίωσης του DNA δεν έχουν εκτεταμένα μελετηθεί σε αυτό το αναπτυξιακό κακοήθεια. Εδώ, θα παράγεται βάσει μικροδιάταξης προφίλ μεθυλίωσης του DNA των πρωτογενών νευροβλαστικών όγκων. Οι αναλύσεις Αυστηρές εποπτευόμενη απόκλιση μεθυλίωση μας επέτρεψε να προσδιοριστούν επιγενετικές μεταβολές χαρακτηριστικές για όγκους ΝΒ, καθώς και για κλινική και βιολογική υποτύπους ΝΒ. Παρατηρήσαμε ότι το γονίδιο-ειδική απώλεια της μεθυλίωσης του DNA είναι πιο διαδεδομένη από υπερμεθυλίωση προαγωγού. Αξίζει να σημειωθεί ότι, όπως υπομεθυλίωση επηρεάζονται καρκίνου που σχετίζονται με τις βιολογικές λειτουργίες και τα γονίδια που σχετίζονται με ΝΒ παθογένεση όπως

CCND1

,

SPRR3

,

BTC

,

EGF

και

FGF6

. Ειδικότερα, η διαφορική μεθυλίωση σε

CCND1

επηρεάζεται κυρίως μια εξελικτική διατηρημένη λειτουργικά σχετικές 3 ‘αμετάφραστη περιοχή, γεγονός που υποδηλώνει ότι η υπομεθυλίωση εκτός των περιοχών του υποκινητή μπορεί να διαδραματίσει ένα ρόλο στην παθογένεση ΝΒ. Υπερμεθυλίωση στοχευμένες γονίδια που εμπλέκονται στην κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό, όπως

RASSF1A

,

POU2F2

ή

HOXD3

, μεταξύ άλλων. Τα αποτελέσματα που προκύπτουν από τη μελέτη αυτή παρέχει νέες βιοδεικτών υποψήφια επιγενετικές που σχετίζονται με NB, καθώς και γνώσεις σχετικά με την μοριακή παθογένεση αυτού του όγκου, η οποία περιλαμβάνει μια σημαντική ειδική γονιδιακή υπομεθυλίωση

Παράθεση:. Mayol G, Martin-Subero JI , Ρίος J, Queiros Α, Kulis Μ, SUNOL M, et al. (2012) DNA υπομεθυλίωση Επηρεάζει σχετιζόμενη με τον καρκίνο Βιολογικές Λειτουργίες και Γονίδια σχετικές με νευροβλάστωμα Παθογένεια. PLoS ONE 7 (11): e48401. doi: 10.1371 /journal.pone.0048401

Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 7 του Αυγούστου 2012? Δεκτές: 1 Οκτ του 2012? Δημοσιεύθηκε: 7 του Νοέμβρη 2012

Copyright: © 2012 Mayol et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το ισπανικό Υπουργείο Υγείας (Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigación Sanitaria, 2007? PI070286) και Ισπανική Εταιρεία κατά του Καρκίνου (Asociación Española Contra el καρκίνος, 2007). Ο.Μ. υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση του νοσοκομείου Sant Joan de Déu της Βαρκελώνης (Grant BR201102), S.G. από μια δωρεά από την Ένωση NEN και J.I.M-S. Οι μελέτες σχετικά με epigenomics υποστηρίζεται από το ισπανικό Υπουργείο Επιστημών και Καινοτομίας (σύμβαση Ryc και SAF2009-08663)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το νευροβλάστωμα (ΝΒ), η πιο κοινή εξωκράνια όγκων της παιδικής ηλικίας, είναι μια σύνθετη αναπτυξιακή κακοήθεια που χαρακτηρίζεται από πολλές βιολογικά σημαντικές γενετικές αλλοιώσεις που συνδέονται στενά με την κλινική έκβαση των ασθενών [1]. Εκτός από τις γενετικές αλλαγές, το σύμπλοκο και ετερογενής κλινική εξέλιξη του ΝΒ εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την ηλικία του ασθενούς κατά τη διάγνωση, όπως επίσης και το στάδιο και ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά κλινική του όγκου [1].

Altered προτύπων μεθυλίωσης του DNA έχουν ευρέως φέρεται να είναι ένας κρίσιμος παράγοντας στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του καρκίνου. Ειδικότερα, υπερμεθυλίωση περιφερειακό DNA (hyperM) των CpG νησίδων σε περιοχές υποκινητή των ογκοκατασταλτικών γονιδίων καθώς και την παγκόσμια υπομεθυλίωσης (hypoM) που επηρεάζουν επαναλήψεων DNA θεωρείται ότι είναι οι πιο συχνές καρκίνου που σχετίζονται με επιγενετικές αλλαγές [2], [3]. Μέχρι στιγμής, οι περισσότερες μελέτες έχουν εστιάσει την προσοχή τους σχετικά με το ρόλο και τους μηχανισμούς του υποκινητή hyperM, δεδομένου ότι η απώλεια της παγκόσμιας μεθυλίωσης του DNA πιστεύεται ότι επηρεάζουν επαναλήψεων DNA και να ασχολείται κυρίως με διαρθρωτικές πυρηνικές λειτουργίες, όπως η χρωμοσωμική αστάθεια [2].

Αν και η γονιδιωματική προφίλ του ΝΒ είναι καλά χαρακτηρισμένα, αλλαγές μεθυλίωσης του DNA δεν έχουν εκτεταμένα μελετηθεί σε αυτούς τους όγκους. Διάφορα γονίδια έχουν αναφερθεί ως μεθυλιωμένο σε NB [4] – [9], παρ ‘όλα αυτά το γονιδίωμα κλίμακα πρότυπο μεθυλίωσης του DNA του ΝΒ είναι ακόμη σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί ο τρόπος διεξαγωγής των επιγενετικών αλλαγών στο NB σε επίπεδο γονιδιώματος-ευρεία χρήση μεθυλίωσης του DNA ειδικά μικροσυστοιχίες. Εκτός από τον εντοπισμό των μεταβολών σε παγκόσμιο επίπεδο που συνδέεται με NB, χαρακτηρίσαμε προτύπων μεθυλίωσης του DNA που σχετίζονται με διακριτές κλινικές και βιολογικές υποκατηγορίες της νόσου. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε ότι το γονίδιο-ειδική απώλεια της μεθυλίωσης του DNA είναι πιο διαδεδομένη από hyperM υποκινητή. Τέτοια hypoM επηρεάζονται καρκίνου που σχετίζονται με τις βιολογικές λειτουργίες και τα γονίδια που σχετίζονται με ΝΒ παθογένεση όπως

CCND1

[10].

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και δείγματα

Ένα σύνολο των 25 πρωτογενείς όγκους νευροβλαστικών (ΝΤ), συμπεριλαμβανομένων των 22 ΚΟ, 2 ganglioneuromas (GN) και 1 γαγγλιονευροβλάστωμα (GNB) χρησιμοποιήθηκαν για την ευρεία ανάλυση μεθυλίωσης του γονιδιώματος. Επιπλέον, μια ανεξάρτητη ομάδα των 13 ΚΟ και 2 GN χρησιμοποιήθηκε για διθειώδες Pyrosequencing, mRNA έκφραση γονιδίων και τον αριθμό αντιγράφων του DNA παραλλαγή αναλύσεις (Πίνακας 1 και Πίνακας S1 Α). GN και GNB καθώς και κανονική ανθρώπινο εμβρυϊκό εγκέφαλο (FB) και επινεφριδίων (AG) ιστοί χρησιμοποιήθηκαν ως δείγματα αναφοράς. αξιολόγηση του κινδύνου Σημείωση ορίστηκε από το Διεθνές Σύστημα Νευροβλάστωμα στάσης (INSS) [11]. δείγματα όγκων αξιολογήθηκαν από έναν παθολόγο (M.S.), οι όγκοι μόνο με & gt? 70% περιεκτικότητα σε κύτταρο βιώσιμο όγκο συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη. DNA απομονώθηκε από snap-κατεψυγμένα δείγματα με τη χρήση κυττάρων Λύσης (Promega, USA) και πρωτεϊνάση Κ (Sigma, USA) ακολουθώντας τα πρωτόκολλα των κατασκευαστών

δήλωση

Ηθική:. Η μελέτη εγκρίθηκε από το Θεσμικό Έρευνας Επιτροπή ηθικής και Δεοντολογίας (Comité Ético de Investigación Clínica, Fundación Sant Joan de DEU – CEIC-FSJD). Οι ασθενείς /γονείς /κηδεμόνες υπέγραψαν μια ενημερωμένη συγκατάθεση πριν από τη συλλογή των δειγμάτων.

Γονιδίωμα-ευρύ μεθυλίωσης του DNA profiling

μεθυλίωσης του DNA profiling πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Infinium HumanMethylation27 BeadChip (Illumina, USA). Γονιδιωματικής μετατροπή όξινο θειώδες DNA και την υβριδοποίηση στην πλατφόρμα διεξήχθη στο Γονοτυπικές Μονάδα Ανθρωπίνων στο Ισπανικό Εθνικό Κέντρο Καρκίνου (CEGEN-CNIO, Μαδρίτη, Ισπανία), όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό BeadStudio (version 3, Illumina Inc, USA) [12], [13]. Για κάθε θέση CpG υπολογίσαμε το βήτα-τιμή (βvalue), το οποίο είναι ένα ποσοτικό μέτρο των επιπέδων μεθυλίωσης του DNA που κυμαίνονται από 0 ° Ο για εντελώς μη μεθυλιωμένα έως 1 για πλήρως μεθυλιωμένα κυτοσίνες. Πιθανές πηγές των βιολογικών και τεχνικών προκαταλήψεις που θα μπορούσαν να επηρεάσουν τα αποτελέσματά μας, όπως CpGs το φύλο και χαμηλής ποιότητας αποκλείστηκαν από τη μελέτη [14] – [16]. έχουν τα δεδομένα μεθυλίωση μικροσυστοιχιών έχουν κατατεθεί στο Gene Expression Omnibus αποθετήριο δεδομένων (GSE39626).

μεθυλίωση του DNA Διαφορική ανάλυση

Δεδομένου ότι δεν υπάρχει στρατηγική συναίνεση για διαφορική ανάλυση μεθυλίωσης, χρησιμοποιήσαμε τρεις διαφορετικές προσεγγίσεις. Πρώτον, CpG θέσεις ταξινομήθηκαν ως hyperM όταν βvalues ​​ήταν & lt? 0.25 στα δείγματα αναφοράς και & gt? 0,75 σε τουλάχιστον 10% των δειγμάτων ΝΒ, και hypoM όταν βvalues ​​ήταν & gt? 0.75 στα δείγματα αναφοράς και & lt? 0,25 σε τουλάχιστον 10% των δειγμάτων ΝΒ. Δεύτερον, η διαφορική μεθυλίωση ορίστηκε ως μέση βvalues ​​μεταξύ ΝΒ και δείγματα αναφοράς που δείχνει μια απόλυτη διαφορά μεγαλύτερη από 0,25 [17]. Τέλος, ένα αταίριαστο t-test εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας παραιτηθεί μεταθέσεων (SDP) [18] και False Discovery Rate (FDR) αναλύσεις [19]. Διαγράμματα Venn χρησιμοποιήθηκαν για να συγκρίνουν τους καταλόγους των διαφορικά μεθυλιώνονται CpGs (https://www.pangloss.com/seidel/Protocols/venn.cgi) και μόνο αυτά ταυτόχρονα προσδιορίζονται από τα τρία κριτήρια ταξινόμησης ορίστηκαν ως διαφορικά μετουσιωμένο.

ιεραρχική ομαδοποίηση και κύριο συστατικό ανάλυση

Ανεξέλεγκτη και εποπτεύεται agglomerative ιεραρχική ομαδοποίηση πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το εργαλείο ανάλυσης Cluster από Στεφάνη Studio (έκδοση 3, Illumina Inc, USA). Ανάλυση Κύριων Συνιστωσών (PCA) πραγματοποιήθηκε με R (www.r-project.org) χρησιμοποιώντας το πακέτο FactoMineR διατίθενται μέσω Bioconductor.

Bisulfite Pyrosequencing

Για την επικύρωση των δεδομένων της μεθυλίωσης του DNA, όξινο θειώδες Pyrosequencing ( BPS ανάλυση) πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Εν συντομία, γενωμικό DNA ήταν όξινο θειώδες μετατρέπεται χρησιμοποιώντας EpiTect Plus μετατροπή διθειώδους Kit (Qiagen, Hilden, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μια επακόλουθη PCR ενίσχυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση βιοτινυλιωμένων εκκινητών (Πίνακας S1B). Pyrosequencing και η ανάλυση των δεδομένων έγιναν με τον αναλυτή pyrosequencer PyroMark Q96 (Qiagen, Hilden, Γερμανία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Η γονιδιακή έκφραση ανάλυση

Για την εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης των διαφορικά μεθυλιωμένων γονιδίων, δημοσίως διαθέσιμα σύνολα δεδομένων μικροσυστοιχιών έκφραση [21] – [23] με αναλύθηκαν αντιπροσωπευτικά φάσματα όγκου ΣΗΜ. Ανεπεξέργαστα δεδομένα ομαλοποιήθηκε σε ένα μετασχηματισμό z-score. Αταίριαστο ανάλυση t-test ρυθμίζεται από το SDP και FDR έγινε. Γονίδια με στατιστικά σημαντική διαφορική έκφραση (

σ

& lt? 0.01), z-score & gt? 1 & gt? 50% των δειγμάτων, θεωρήθηκαν διαφορικά εκφρασμένων

Για υποψήφια γονίδια, συνολικά. RNA απομόνωση και ποσοτικοποίηση έκφρασης γονιδίου πραγματοποιήθηκε για 10 περιπτώσεις που περιλαμβάνονται στη συστοιχία μεθυλίωση και ένα ανεξάρτητο σύνολο 13 δειγμάτων ΝΒ χρησιμοποιώντας ποσοτική πραγματικού χρόνου αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR qRT-) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22] (Πίνακας S1B).

Bioinformatic σχολιασμό των διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια

Η βάση δεδομένων για το σχολιασμό, την απεικόνιση και την Ολοκληρωμένη Discovery (David) v6.7 (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) χρησιμοποιήθηκε για γονιδιακή-σχολιασμό εμπλουτισμού ανάλυση και βιολογικής οδού χαρτογράφηση [24]. Πιθανότητα (διόρθωση Benjamini-Hochberg) μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια ταξινομούνται σύμφωνα με χρωμοσωμικές τους εντόπιση. ανάλυση της κατανομής πιθανότητας διεξήχθη για να προσδιοριστεί η πιθανότητα εμπλουτισμού των χρωμοσωμάτων.

P

-τιμή & lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Ανάδοχος κατάταξη των διαφορικά μεθυλιωμένων γονιδίων σε υποστηρικτές με υψηλή (HCP), ενδιάμεσο (ICP), χαμηλή (LCP) και μεικτό περιεχόμενο CpG, καθώς και ο προσδιορισμός των Polycomb (PCG) γονιδίων στόχων διεξήχθη όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [14]

Υπεργεωμετρική ανάλυση κατανομής πιθανότητας με πιθανότητα αποκοπής & lt?. 0.05, διεξήχθη για να προσδιοριστεί hyperM ή hypoM εμπλουτισμό χρωμόσωμα και να καθορίσει τον τύπο υποστηρικτής και ο εμπλουτισμός PCG-σήμα διαφορικά μεθυλιωμένο γονίδια. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό SPSS έκδοση 15.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL).

Αποτελέσματα

μεθυλίωσης του DNA προφίλ και την ταυτοποίηση των διαφορικά μεθυλιωμένων γονιδίων σε NB

Για να διερευνήσει το πρότυπο της μεθυλίωσης του DNA στο NB, αναλύσαμε 22 πρωτογενείς όγκους Σημείωση χρησιμοποιώντας το μικροσυστοιχιών Infinium HumanMethylation27 BeadChip. Δύο GN, 1 GNB, καθώς και, φυσιολογικά ανθρώπινα FB και AG ιστοί που χρησιμοποιούνται ως δείγματα αναφοράς για τον προσδιορισμό διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια ειδικά για ΣΗΜ.

Αρχικά πραγματοποιείται μια έλεγχο της ποιότητας των δεδομένων που λαμβάνονται από την ανάλυση μικροσυστοιχιών και αποκλείεται 3337 CpGs το φύλο και χαμηλής ποιότητας. Επιπλέον, ένα δείγμα NB (NT18, Πίνακας S1 Α) αποκλείστηκε λόγω της κακής ανίχνευσης

σ

-τιμές.

Ανεξέλεγκτη Principal Component Analysis (PCA) πραγματοποιείται σε όλα τα δείγματα που περιλαμβάνονται στη μελέτη, έδειξε ότι NBs εμφανίσει μια σαφώς διακριτή προφίλ μεθυλίωσης του DNA, σε σύγκριση με κανονικά δείγματα αναφοράς (FB και AG) και την κλινική λιγότερο επιθετική GNB και καλοήθεις GN (Σχήμα 1Α), που είναι μεταξύ των δύο φορέων επιγενετικώς χωρίς να ξεχωρίζουν από φυσιολογικά δείγματα αναφοράς. Προκειμένου να εντοπιστούν διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια σε NB, εποπτευόμενο αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ανεξάρτητα τρία διαφορετικά δείγματα αναφοράς (FB, AG και 2 GN με 1 GNB). Με τη σύγκριση των καταλόγων γονίδιο που παράγεται από αυτές τις αναλύσεις ήμασταν σε θέση να προσδιορίσει ένα κοινό σύνολο 351 γονιδίων, είναι 23 hyperM και 328 hypoM, στην ΝΒ (Εικόνα 1Β, Πίνακας S2A). Αυτό το σύνολο των γονιδίων που θα αναφέρεται στο εξής ως NB-ειδικών γονιδίων. Στη συνέχεια πραγματοποιείται μια εποπτευόμενη ιεραρχική συμπλέγματος και ένα PCA χρησιμοποιώντας το hyperM και hypoM γονίδιο ρυθμίζει ξεχωριστά. Αξίζει να σημειωθεί ότι, το πρότυπο μεθυλίωσης του DNA των γονιδίων hyperM μας επέτρεψε να διαφοροποιηθούν ΚΟ, με ποικίλα

καθεστώς ενίσχυσης MYCN

. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα γονίδια hypoM διαχωρίζονται ΚΟ ανάλογα με την ηλικία τους κατά τη διάγνωση, ομαδοποίηση άτομα με 5 ή περισσότερα χρόνια χωριστά από τους νεότερους ασθενείς (Εικόνα 1Γ και 1Δ)

Α:. Ανεξέλεγκτη Ανάλυση Κύριων Συνιστωσών (PCA) του πίνακα με βάση το DNA δεδομένων μεθυλίωση σε 21 νευροβλάστωμα (ΝΒ) (που ταξινομούνται σύμφωνα με το INSS Στάδιο), 2 γαγγλιονεύρωμα (GN), 1 γαγγλιονευροβλάστωμα (GNB)? και φυσιολογικά δείγματα αναφοράς: εμβρυϊκού εγκεφάλου (FB) και επινεφριδίων (AG). Β: διάγραμμα Venn δείχνει τη στρατηγική που χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό NB-ειδικά γονίδια. Υπερμεθυλίωση και μεθυλιωμένος γονίδια σε NB προσδιορίστηκαν με τη χρήση τριών διαφορετικών εποπτευόμενους αναλύει με διακριτά δείγματα αναφοράς (FB, AG και GN /GNB). C: Με επίβλεψη ιεραρχική ανάλυση συστάδων δεδομένων μεθυλίωσης του DNA από NB-ειδικά γονίδια σε 21 δείγματα NB, ​​2 GN, 1 GNB? και 2 φυσιολογικά δείγματα αναφοράς: FB και AG. D: Εποπτευόμενοι Principal Component Analysis (PCA) σε 21 δείγματα NB, ​​2 GN, 1 GNB? και φυσιολογικά δείγματα αναφοράς:. FB και AG για NB-ειδικών γονιδίων

Η

Οι ΝΒ-ειδικά γονίδια κατατάχθηκαν σύμφωνα με το ποσοστό των δειγμάτων που βρέθηκαν διαφορικά μετουσιωμένο και το επίπεδο των βvalue αλλαγές. Οι πιο ξεκάθαρα τα γονίδια hyperM στη σειρά ήταν

EMP1

,

RASSF1A

,

ΚΑΣ

,

GNG12

,

HOXD3

,

PAMR1

,

IL17RC

,

CARD11

,

POU2F2

και

P2RY6

(Πίνακας S2B). Μεταξύ αυτών,

RASSF1A

και

POU2F2

έχουν περιγραφεί προηγουμένως μεθυλιωμένης σε όγκους ΝΒ και κυτταρικές σειρές. Εδώ, τα δύο γονίδια έδειξαν σαφώς αυξημένα επίπεδα μεθυλίωσης σε ≥80% των δειγμάτων NB, το οποίο είναι σύμφωνο με προηγούμενες αναφορές [5], [7], [25]. Εκτός αυτού, με τις γνώσεις μας μόνο

HOXD3

έχει περιγραφεί προηγουμένως hyperM στον καρκίνο, ειδικά στο καρκίνωμα του προστάτη [26], [27].

Εφαρμόζοντας την ίδια στρατηγική, 69 γονίδια ήταν σαφώς hypoM σε NB (Πίνακας S2B). Αξίζει να σημειωθεί ότι, μεταξύ αυτών που προσδιορίζονται

CCND1

. Αυτό το γονίδιο έχει αναφερθεί ότι εκφράζεται έντονα σε ένα σημαντικό τμήμα (& gt? 75%) των όγκων ΝΒ και κυτταρικές γραμμές [10], [28]. Τα 17 CpGs αναλύονται σε όλο το μήκος του

CCND1

locus αποκάλυψε ένα πολύπλοκο μοτίβο επιγενετικό σε περιπτώσεις ΝΒ και τα δείγματα αναφοράς (Σχήμα 2Α). Στην NB, παρατηρήσαμε μια μείωση των επιπέδων μεθυλίωσης του DNA σε 12 από 17 περιοχές CpG και μια σημαντική υπομεθυλίωση, χρησιμοποιώντας αυστηρά κριτήρια, μόνο σε δύο CpGs (Target αναγνωριστικά cg04717045 και cg02723533). Απροσδόκητα, απώλεια μεθυλίωσης του DNA, παρατηρήθηκε έξω από την περιοχή 5 ‘του

CCND1

, η οποία ήταν μη μεθυλιωμένες σε περιπτώσεις ΝΒ και δείγματα ελέγχου. Υπομεθυλίωση εντός του γονιδίου-σώμα δεν θεωρήθηκε σημαντική λόγω επιγενετικών ετερογένειας στα δείγματα αναφοράς (Σχήμα 2Α). Η 3 ‘αμετάφραστη περιοχή (3’-UTR), σε αντίθεση, μεθυλιώθηκε με συνέπεια σε δείγματα αναφοράς και υπο-μεθυλιώνεται σε ένα μεγάλο κλάσμα του ΚΟ. Στις δύο περιοχές σημαντικά hypoM, 17 από 21 Σημ χάσουν μεθυλίωση σε σύγκριση με όλα τα δείγματα αναφοράς (βvalue & gt? 0.90), είναι 11 από αυτούς αισθητά hypoM (Εικόνα 2Α)

Α: Γραφική απεικόνιση του. επίπεδα μεθυλίωσης του DNA των 17 CpGs μετριέται σε όλη την

CCND1

μήκος. Ο θερμικός χάρτης δείχνει τα δεδομένα από 21 νευροβλάστωμα (ΝΒ) και των δειγμάτων αναφοράς (2 GN, 1 GNB? 1 FB και 1 AG). Κάτω από το θερμικός χάρτης δείχνουμε κάποια γενωμική χαρακτηριστικά του

CCND1

τόπου (UCSC γονιδίωμα Browser, τα δεδομένα από το hg19 προσαρμοσμένο στο hg18) συμπεριλαμβανομένων των χώρων μεταγραφικού παράγοντα δέσμευσης (TFBS), εξελικτικά συντηρημένη υπερευαισθησία τομέα DNAseI (cluster ϋΝΑάσης Ι) και σπονδυλωτών Multiz Ευθυγράμμιση, PhastCons διατήρησης (θηλαστικών Διατήρηση) και θέσεις-στόχους των miRNAs (TS). Β: Η μεθυλίωση του DNA ειδικά πυρογραμμάτων για

CCND1

. Το παραπάνω πυρόγραμμα αντιστοιχεί σε ένα δείγμα νευροβλάστωμα ενώ κάτω από την πυρόγραμμα αντιστοιχεί σε ένα δείγμα αναφοράς (FB). Grey σκίαση δείχνει το ποσοστό της μεθυλίωσης παρατηρείται για τις CpGs αναλύθηκαν. C: Box-οικόπεδο για τα δεδομένα της μεθυλίωσης του DNA των

CCND1

λαμβάνεται με όξινο θειώδες Pyrosequencing σε μια ανεξάρτητη ομάδα των 13 ΝΒ και 2 GN δειγμάτων και των δειγμάτων αναφοράς. Α: Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της

CCND1

αναλύονται από qRT-PCR σε δύο ανεξάρτητες ομάδες Σημ

Η

αλλαγές μεθυλίωσης του DNA σε κλινικά και βιολογικά σχετικές υποομάδες Σημ

Α. εποπτευόμενη προσέγγιση χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση διαφορικών προφίλ μεθυλίωσης του DNA μεταξύ των κλινικών και βιολογικά σχετικές υποομάδες Σημ.

υψηλού κινδύνου (HR) NBS (n = 9), που ορίζεται ως το στάδιο 4 και

MYCN

ενισχυμένο (

MYCN

Α) όγκων, συγκρίθηκαν με χαμηλού κινδύνου (LR) NBS (n = 8), η οποία περιλαμβάνει το στάδιο 1-3

MYCN

μη ενισχυμένο (

MYCN

NA) όγκους. Εντοπίστηκαν συνολικά 19 καθαρά διαφορικά μεθυλιωμένο γονίδια. Πέντε γονίδια ήταν hyperM στο HR σε σχέση με την LR ΝΒ και δείγματα αναφοράς, ενώ δεν παρατηρήθηκε γονίδιο hypoM σε αυτή την κλινική υποομάδα. Σε αντίθεση, hyperM δεν παρατηρήθηκε σε LR ΚΟ, ενώ 14 γονίδια που παρουσίασαν

de novo

απώλεια της μεθυλίωσης σε αυτό το κλινικά ευνοϊκή υποομάδα (Πίνακας S2C).

Είμαστε δίπλα σε σύγκριση με τα δύο κλινικά σχετική μεταστατικό NB υποομάδες, δηλαδή το στάδιο 4 (n = 6) και το στάδιο 4S (n = 4) ΚΟ. Εμείς εντόπισε συνολικά 9 διαφορετικά μεθυλιωμένο γονίδια. Από αυτά, τα 2 γονίδια ήταν hyperM σε τουλάχιστον 3 από τα 4 στάδια 4S ΚΟ και δεν hyperM ανιχνεύθηκε στο στάδιο 4 ΚΟ. Όσον αφορά την hypoM, 5 και 2 γονίδια παρατηρήθηκαν σε 4S στάδιο και 4 ΚΟ, αντίστοιχα (Πίνακας S2C).

Συγκρίνοντας

MYCN

Α (n = 5) και ΝΑ (n = 15 ) όγκους, εντοπίσαμε 23 διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια (7 hyperM και 16 hypoM) στο

MYCN

ενισχύεται σε σχέση με μη ενισχυμένο όγκοι και τα δείγματα αναφοράς (Πίνακας S2C).

Τέλος, συγκρίναμε ΚΟ με βάση την ηλικία του ασθενούς στην διάγνωση, χρησιμοποιώντας την κλινικά καθιερωμένη 18 μήνες ηλικία cut-off, δηλαδή & lt? 18 μήνες (n = 11) και ≥18 μήνες (n = 10). Σύμφωνα με τα κριτήρια επιλογής μας, καμία συνέπεια διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια ταυτοποιήθηκαν, πιθανότατα λόγω της υψηλής ετερογένειας στις δύο υποομάδες. Με βάση την εποπτευόμενη ανάλυση PCA που φαίνεται στο Σχήμα 1Δ, παρατηρήσαμε ότι οι ασθενείς με 5 ή περισσότερα χρόνια της ηλικίας διαχωρίζονται ξεχωριστά από τους νεότερους ασθενείς, προτείνοντας διαφορετικά υποκείμενα μοτίβα μεθυλίωσης. Μια εποπτευόμενη ανάλυση έτσι πραγματοποιήθηκε με τη χρήση δύο ηλικιακές cut-offs, 18 μηνών και 5 ετών (δηλαδή το 0 έως το & lt? 18 μήνες (n = 12), ≥18months να & lt? 5 έτη (n = 4), ≥5 έτη (n = 5)). Παρατηρήθηκαν διαφορές μεταξύ των προτύπων μεθυλίωσης των τριών υποομάδων ηλικίας. Ωστόσο, η μεθυλίωση ήταν ετερογενή σε ασθενείς ηλικίας κάτω των 5 ετών, αλλά σαφώς διακριτές από τις παλαιότερες ασθενείς Σημείωση (Πίνακας S2C). Εφαρμόζοντας μόνο πέντε χρόνια ηλικία cut-off (& lt? 5 ετών, n = 16 και ≥5 ετών, n = 5), εντοπίσαμε ένα σαφές πρότυπο μεθυλίωσης του DNA χαρακτηρίζεται από ένα σύνολο γονιδίων με συνεπή απώλεια της μεθυλίωσης του DNA σε ασθενείς μικρότερα των 5 ετών σε σχέση με τους ηλικιωμένους ασθενείς, η τελευταία είναι παρόμοια με τα δείγματα αναφοράς (Πίνακας S2C).

Τεχνική και κλινική επικύρωση των υποψηφίων γονιδίων από Pyrosequencing

όξινο θειώδες DNA Pyrosequencing 3 NB-ειδική υποψήφια γονίδια (

EMP1

,

GNG12

και

CCND1

), καθώς και του

EPSTI1

, η οποία είναι διαφορικά μεθυλιώνεται σε κλινικά σχετικές NB υποομάδες, πραγματοποιήθηκε για την επικύρωση των δεδομένων συστοιχίας μεθυλίωσης του DNA. Δύο NB όγκων περιλαμβάνονται στην μικροσυστοιχία καθώς και μια ανεξάρτητη ομάδα των 13 ΝΒ και 2 GN δείγματα χρησιμοποιήθηκαν για το σκοπό αυτό. Κατ ‘αρχάς, ο βαθμός συσχέτισης μεταξύ μεθυλίωσης μικροσυστοιχιών DNA και δεδομένων BPS ελέγχθηκε και βρέθηκε να είναι σημαντικά υψηλός (r = 0,958,

σ

& lt? 0.001) (Σχήμα S1)

Σύμφωνα με. τα αποτελέσματα πίνακα,

EMP1

και

GNG12

NB-ειδικών γονιδίων έδειξε υψηλά επίπεδα μεθυλίωσης σε σύγκριση με δείγματα αναφοράς σε όλες τις περιπτώσεις ΣΗΜ του συνόλου επικύρωσης (n = 13) (Σχήμα S2B και S2C ).

CCND1

έδειξε μια σαφή απώλεια της μεθυλίωσης σε 10 από τους 13 ανεξάρτητους ΚΟ δοκιμαστεί, η οποία είναι σύμφωνη με το ποσοστό των περιπτώσεων hypoM προσδιορίζονται από τη συστοιχία μεθυλίωση (Εικόνα 2Α, 2Β και 2Γ, Εικόνα S2A).

EPSTI1

ανάλυση μεθυλίωσης στη σειρά επικύρωση επιβεβαίωσε επίσης τα στοιχεία array (Σχήμα S2D).

Σύνδεσης μεταξύ της μεθυλίωσης του DNA και της έκφρασης του γονιδίου

Για να διερευνήσουν κατά πόσον η διαφορετική μεθυλίωση του DNA σε NB συνδέεται με την έκφραση του γονιδίου, αναλύσαμε τα δημοσιευμένα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης των ανεξάρτητων και αντιπροσωπευτικών συνόλων όγκου NB [21] – [23]. δεδομένα έκφραση ήταν διαθέσιμα για 13 από 23 hyperM και 136 328 hypoM NB-ειδικά γονίδια (Πίνακας S3A). Πέντε από τα δεκατρία (38,4%) γονίδια hyperM έδειξαν χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης σε σύγκριση με τα δείγματα αναφοράς. Σε αντίθεση, 10 από 136 γονίδια (7,3%) με χαμηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης ήταν άκρως εκφρασμένη σε ΝΒ σε σύγκριση με τα δείγματα αναφοράς. Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες που ανέφεραν ότι μόνο ένα κλάσμα των γονιδίων με υπομεθυλίωσης υποκινητή δείχνουν μια σημαντική αύξηση στην έκφραση γονιδίων, που, πιθανώς, ρυθμισμένο σε συγκεκριμένες ενεργοποίησης [29] – [30].

Για την επικύρωση εάν απόκλιση μεθυλίωση του DNA σε ΝΒ συνδέεται με αλλαγές γονιδιακή έκφραση, αναλύσαμε 5 υποψήφια γονίδια από qRT-PCR σε 23 ΚΟ με διαθέσιμα RNA (10 περιπτώσεις που περιλαμβάνονται στη συστοιχία μεθυλίωση και ένα ανεξάρτητο σύνολο 13 δειγμάτων ΝΒ). Σε γενικές γραμμές, τα γονίδια hyperM έδειξαν χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης σε δείγματα ΝΒ σε σύγκριση με τα δείγματα αναφοράς. Παρομοίως, τα περισσότερα γονίδια hypoM έδειξε υψηλότερα επίπεδα έκφρασης στους όγκους ΝΒ σε σχέση με τα δείγματα αναφοράς, επιβεβαιώνοντας τα δεδομένα μικροσυστοιχιών (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

CCND1

βρέθηκε ότι εκφράζεται υψηλά σε όλα τα δείγματα ΝΒ, σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [10], [31] (Εικόνα 2D).

Βιολογικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά του διαφορικά μεθυλιωμένων γονιδίων σε NB

διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια λειτουργικά χαρακτηρίζεται χρησιμοποιώντας βιοπληροφορικής προσεγγίσεις. Μια ανάλυση του γονιδίου οντολογία (GO) γονιδίων hypoM στην NB επέτρεψε την ταυτοποίηση των εμπλουτίζεται σημαντικά (

σ

& lt? 0,05) λειτουργίες, όπως η αντίδραση της άμυνας, ανοσολογική αντίδραση, το ανοσοποιητικό σύστημα διαδικασίας, η ανταπόκριση σε ερεθίσματα και την επιδερμίδα ανάπτυξης ( Πίνακας S3b). Λόγω του μικρού μεγέθους του δείγματος, σετ γονιδίων που προέρχονται από άλλες συγκρίσεις δεν οδηγούν σε κανένα σημαντικά εμπλουτισμένη όρος GO.

Οι περισσότερες μελέτες σε ενήλικες όγκοι έχουν αναφερθεί ότι τα γονίδια hyperM εμπλουτισμένο σε προωθητές με υψηλή περιεκτικότητα σε CpG (HCP) και γονιδίων στόχων PRC2 σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (ΟΚΕ) [17]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, σε σειρά μας, η ομάδα των γονιδίων hyperM έδειξε μια απώλεια για τους υπευθύνους HCP (21,7%

vs.

53,5% στο παρασκήνιο,

σ

= 0,072) και ένας εμπλουτισμός για τους φορείς ICP (34,78%

vs.

11,68% στο παρασκήνιο,

σ

= 0.012). Καμία σημαντική εμπλουτισμού για τους στόχους PRC2 παρατηρήθηκε (13%

vs.

9,6% στο παρασκήνιο,

σ

= 0,49). Σε αντίθεση, τα γονίδια hypoM έδειξε το προηγουμένως αναφερθεί πρότυπο [17], δηλαδή είχαν συσχετισθεί με αύξηση για χαμηλή περιεκτικότητα υποκινητές CpG (LCP) (68,3%

vs.

22,6% στο παρασκήνιο,

p

& lt?. 0.001) και μείωση των στόχων PRC2 (3,3%

vs

9,6% στο παρασκήνιο,

σ

& lt?. 0.001) (Πίνακας S3C)

Για να προσδιορίσετε αν διαφορική μεθυλίωση σε NB συμβαίνει ομοιογενώς σε όλο το γονιδίωμα, η κατανομή των χρωμοσωμάτων του NB-ειδικών γονιδίων αναλύθηκε. Δεδομένου του μικρού αριθμού των γονιδίων hyperM καμία σημαντική πλουτισμό ή ομαδοποιούνται τάση παρατηρήθηκε (Πίνακας S3D). Αντιστρόφως, ένα σημαντικό μέρος των γονιδίων hypoM χαρτογραφηθούν σε χρωμοσώματα 1 (48 γονίδια), 17 (25 γονίδια), 19 (58 γονίδια) και 21 (9 γονίδια) (

ρ

& lt? 0,05 για όλους) και έδειξε χρωμόσωμα συγκεκριμένη εντόπιση. Τα γονίδια αυτά αντιστοιχίζονται σε συγκεκριμένες χρωμοσωμικές περιοχές 1ρ36 (20%) και 1q21 (25%), το χρωμόσωμα 17p13 και 17q21 (και οι δύο 27%), ενώ η πλειοψηφία των γονιδίων που εντοπίζονται στο χρωμόσωμα 19 περιορίστηκαν σε θέση 19p13 (& gt? 70%? 43 58), και όλα τα χρωμόσωμα 21 γονίδια hypoM αντιστοιχίζεται με 21q22 (9/9).

Dicussion

στην παρούσα μελέτη, αναλύσαμε το μοτίβο της διαφορικής μεθυλίωσης σε δείγματα πρωτογενούς NB χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες -με βάση την ανάλυση μεθυλίωσης του DNA. Ανεξέλεγκτη PCA έδειξε ότι τα προφίλ μεθυλίωσης του DNA σε ΝΒ είναι σαφώς διαφορετικές από εκείνες του κλινικά λιγότερο επιθετική GNB και καλοήθεις GN και τα κανονικά δείγματα αναφοράς που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη (Σχήμα 1Α). Διαφορική ανάλυση μεθυλίωσης του DNA με τη χρήση αυστηρών κριτηρίων μας επέτρεψε να εντοπιστούν μεθυλίωσης του DNA αλλάζει χαρακτηριστικό των όγκων ΝΒ. Είναι ενδιαφέρον ότι, η εξέλιξη του hyperM και hypoM βρέθηκε να σχετίζεται με κλινική-βιολογικώς σχετικό υποομάδες των όγκων ΝΒ. Συγκεκριμένα, το πρότυπο μεθυλίωσης του DNA των γονιδίων hyperM μας επέτρεψε να διαφοροποιηθούν ΚΟ, με ποικίλα

καθεστώς ενίσχυσης MYCN

. γονίδια HypoM διαχωρίζονται περιπτώσεις ανάλογα με την ηλικία κατά τη διάγνωση, ομαδοποίηση άτομα με 5 ή περισσότερα χρόνια χωριστά από τους νεότερους ασθενείς (Σχήμα 1D). Εποπτευόμενοι ανάλυση μεθυλίωσης του DNA συγκρίνοντας γνωστές κλινικές υποομάδες Σημείωση επιβεβαιωθεί η ύπαρξη διαφορικά μεθυλιωμένων γονιδίων μεταξύ όγκων υψηλού και χαμηλού κινδύνου,

MYCN

Ένα από NA όγκων, καθώς και το στάδιο 4 από το στάδιο 4S ΝΒ. Προηγούμενες εκθέσεις ανάλυση συγκεκριμένων υποψήφια γονίδια έχουν εντοπιστεί υπερμεθυλίωση γονίδια που σχετίζονται με το

MYCN

καθεστώς ενίσχυσης σε κυτταρικές σειρές NB και όγκους [4], επιβεβαιώνοντας έτσι την ύπαρξη της υποομάδας-συγκεκριμένα μοτίβα μεθυλίωσης του DNA στο ΝΒ. Ωστόσο, δεν διαφορών μεθυλίωσης DNA συνεπής ταυτοποιήθηκαν κατά τη σύγκριση υποομάδων χρησιμοποιώντας την κλινικά εγκατεστημένος προγνωστική ηλικία αποκοπής 18 μηνών. Αντίθετα, σύμφωνα με την ανάλυση που φαίνεται στο Σχήμα 1ϋ, μια συνεπής απώλεια της μεθυλίωσης του DNA παρατηρήθηκε σε ασθενείς ηλικίας μικρότερης των 5 ετών σε σύγκριση με ηλικιωμένους ασθενείς και τα δείγματα αναφοράς (Πίνακας S2C). Στην ΝΒ, η ηλικία κατά τη διάγνωση είναι μια ισχυρή δείκτης της συμπεριφοράς του όγκου, και έτσι είναι κρίσιμης σημασίας στην προγνωστική αξιολόγηση αυτής της αναπτυξιακής κακοήθειας [32]. Παραδοσιακά, η ηλικία του ασθενούς έχει αναλυθεί ως δυαδική λειτουργία, με σημείο αποκοπής αρχικά καθοριστεί σε 12 μήνες και πρόσφατα σε μια πιο βέλτιστη προγνωστική ηλικία cut-off των 18 μηνών [32]. Ωστόσο, η Διεθνής Ταξινόμηση Νευροβλάστωμα Παθολογία (το σύστημα Shimada) αξιολογεί την προγνωστική επίπτωση των ιστολογικά χαρακτηριστικά του όγκου εξετάζει δύο ηλικία cut-offs κατά τη στιγμή της διάγνωσης: 18 μήνες και 5 ετών [33]. Είναι ενδιαφέρον, αν και παρατηρήσαμε την ηλικία που σχετίζονται με μοτίβα μεθυλίωσης του DNA υπενθυμίζοντας αυτές τις δύο ηλικιακές cut-offs, ήταν πιο συνεπείς χρησιμοποιώντας τα 5 χρόνια cut-off.

Σε γενικές γραμμές, παρατηρήθηκε ότι η απώλεια της μεθυλίωσης του DNA είναι πιο διαδεδομένη από ό, τι hyperM υποκινητή σε ΝΒ. Αυτό είναι σύμφωνο με τη γνωστή παγκόσμια υπομεθυλίωση του καρκινικού κυττάρου DNA, γενικά πιστεύεται ότι επηρεάζουν επαναληπτικές αλληλουχίες και δορυφορικά DNA και να συμβάλει στην παραγωγή του χρωμοσωμικής αστάθειας [2]. Ως εκ τούτου, ειδικά για το γονίδιο υπομεθυλίωσης δεν έχει μελετηθεί εκτενώς. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε ότι hypoM επηρεάζονται τα γονίδια που σχετίζονται με ΝΒ παθογένεση όπως

CCND1

. Η κυκλίνη D1 είναι ένας ρυθμιστής υπομονάδα της εξαρτώμενης από κυκλίνη κινάσες που απαιτούνται για G1 του κυτταρικού κύκλου /S μετάβαση που έχει περιγραφεί εντόνως εκφρασμένο σε διάφορους τύπους συμπαγών όγκων, καθώς και σε περισσότερες από 75% των ΚΟ. Η αιτία του

CCND1

υπερέκφραση σε αυτούς τους όγκους είναι πολύ άγνωστη. ενισχύσεις υψηλού επιπέδου

CCND1

έχουν αναφερθεί μόνο σε ένα μικρό ποσοστό (2%) του NB όγκων [10]. Ως εκ τούτου, τους μηχανισμούς πλην γονιδιακή ενίσχυση φαίνονται να είναι υπεύθυνη για την αυξημένη

CCND1

έκφραση [34]. Πρόσφατα,

GATA3

, ένας παράγοντας μεταγραφής υπερεκφράζεται σε NB, έχει αναφερθεί ότι εμπλέκεται σε

CCND1

υπερέκφραση [35]. Σε αυτή τη μελέτη, παρατηρήσαμε απώλεια του

CCND1

γονίδιο μεθυλίωσης σε περισσότερες από 70% των όγκων ΝΒ αναλύθηκαν, συνδέεται με την υψηλή

CCND1

επίπεδα έκφρασης και απουσία γονιδιακής ενίσχυσης (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα) . Διαφορικά μεθυλιωμένα CpGs δεν εντοπίστηκαν στην περιοχή του υποκινητή αλλά στην 3 ‘αμετάφραστη περιοχή (Εικόνα 2Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, με βάση τα διαθέσιμα στοιχεία στο πρόγραμμα περιήγησης UCSC γονιδίωμα (GRCh37 /hg19), η 3’-UTR του

CCND1

είναι μια εξελικτική διατηρημένη DNAseI υπερευαίσθητο τομέα υψηλού εμπλουτισμού για θέσεις στόχους microRNA και θέσεις πρόσδεσης μεταγραφικού παράγοντα, συμπεριλαμβανομένων των

GATA3

,

MYC

,

FOXA1 /2

και

JunD

, μεταξύ άλλων. Πειραματικά δεδομένα υποστηρίζουν το λειτουργικό ρόλο της περιοχής 3′-UTR στην έκφραση του

CCND1

έχουν αναφερθεί σε κύτταρα του μανδύα λεμφώματα (MCL), όπου εκτός από τη σύντηξη του

CCND1

γονίδιο στο χρωμόσωμα 11 έως ενισχυτή βαριάς αλυσίδας ανοσοσφαιρίνης, η απώλεια της 3′-UTR έχει συνδεθεί με υπερ-πολλαπλασιαστική MCL [36]. Ωστόσο,

CCND1

ανακατατάξεις που οδηγούν σε απώλεια της 3′-UTR έχουν παρατηρηθεί μόνο σε ένα πολύ μικρό ποσοστό της ΚΟ [10]. Αξίζει να σημειωθεί, στη σειρά μας

CCND1

hypoM συμβαίνει με την παρουσία του

RASSF1A

υποστηρικτής hyperM. Επιλεκτική επιγενετική αποσιώπηση του

RASSF1A

είναι ένα κοινό συμβάν στον ανθρώπινο καρκίνο, συμπεριλαμβανομένης ΝΒ όπου έχει αναφερθεί υπερμεθυλίωση σε & gt? 75% των όγκων [5], [25]. Ras συνδέσμου οικογένεια περιοχή 1 ισομορφή Α είναι ένας καταστολέας όγκου που ρυθμίζει αρνητικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω αναστολής της κυκλίνης D1 συσσώρευση πρωτεΐνης μέσω μετα-μεταγραφικό μηχανισμών [37].

RASSF1A

hyperM έχει ήδη αντίστροφα σχετίζεται με την έκφραση της κυκλίνης D1 και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [38]. Είναι ως εκ τούτου δελεαστικό να υποθέσουμε ότι η απώλεια του

CCND1

γονίδιο μεθυλίωσης στην ρυθμιστική περιοχή 3′-UTR και ταυτόχρονη υπερμεθυλίωση του

RASSF1A

θα μπορούσε να αποτελέσει ένα δυναμικό μηχανισμό που διέπουν

CCND1

γονίδιο υπερέκφραση σε ΝΒ.

απώλεια της μεθυλίωσης επηρεάζονται επίσης γονιδίων με σχετιζόμενη με τον καρκίνο των βιολογικών λειτουργιών, δηλαδή

SPRR3

, έχει ήδη αναφερθεί ως υπο-μεθυλιωμένα στον καρκίνο, ειδικά σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [39]. Η υπερέκφραση του

SPRR3

έχει αναφερθεί για την προώθηση του πολλαπλασιασμού του μαστού και καρκίνου του παχέος εντέρου μέσω της ενίσχυσης της αποικοδόμησης της ρ53 μέσω του

ΑΚΤ

και

ΜΑΡΚ

οδών [40], [41]. HypoM επηρεάζεται επίσης γονίδια που αναφέρθηκαν ότι διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, δηλαδή

BTC

,

EGF

και

FGF6

. Betacellulin, μέλος της οικογένειας EGF, έχει πρόσφατα αναφερθεί ότι επάγουν τον πολλαπλασιασμό των νευρικών βλαστικών κυττάρων και την πρόληψη της αυθόρμητης διαφοροποίησης σε κυτταρική καλλιέργεια μέσω τόσο τον υποδοχέα EGF (

EGFR

) που βρίσκεται στο NSCs και

ErbB4

σχετικά με νευροβλάστες [42]. Ο επιδερμικός αυξητικός παράγοντας δρα επίσης μέσω του EGFR να διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και νεοπλασματικό μετασχηματισμό.