Αφηρημένο

πρωτεϊνικής κινάσης τυροσίνης 6 (PTK6) είναι ένας μη-υποδοχέα κινάσης τυροσίνης τύπου που μπορεί να εμπλέκονται σε ορισμένες μορφές καρκίνου. Ωστόσο, ο βιολογικός ρόλος και η έκφραση κατάσταση του PTK6 σε καρκίνο του παγκρέατος είναι άγνωστη. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε το λειτουργικό ρόλο της PTK6 επί του παγκρέατος εισβολή καρκίνου. Πέντε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές εξέφρασαν PTK6 σε διάφορα επίπεδα. έκφραση PTK6 παρατηρήθηκε επίσης σε ανθρώπινο παγκρεατικό αδενοκαρκινώματα. PTK6 καταστολή από siRNA μείωσε σημαντικά τόσο την κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή (0,59 /0,49 φορές για BxPC3, 0.61 /0.62 για PANC1, 0.42 /0.39 για MIAPaCa2, αντίστοιχα,

p & lt? 0,05

για το καθένα). Αντίθετα, αναγκάστηκε υπερέκφραση PTK6 με επιμόλυνση ενός φορέα έκφρασης PTK6 στα κύτταρα PANC1 και MIAPaCa2 αυξημένη κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή (1.57 /1.67 φορές για PANC1, 1.44 /1.57 για MIAPaCa2, αντίστοιχα,

p & lt? 0,05

) . Φίμωση PTK6 μειωμένο 2 ενεργοποίηση /ERK1, αλλά δεν ΑΚΤ ή ενεργοποίηση STAT3, ενώ PTK6 υπερέκφραση αυξημένη ενεργοποίηση ERK1 /2. U0126, ένας ειδικός αναστολέας της ERK1 /2, κατάργησε πλήρως την επίδραση της υπερέκφρασης PTK6 στην κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι PTK6 ρυθμίζει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε καρκίνο του παγκρέατος μέσω σηματοδότησης ERK. PTK6 μπορεί να είναι ένα μυθιστόρημα θεραπευτικό στόχο για τον καρκίνο του παγκρέατος

Παράθεση:. Ono Η Basson MD, Ito Η (2014) PTK6 Προωθεί Καρκίνος Μετανάστευση και την εισβολή στον Καρκίνο του παγκρέατος κύτταρα ανάλογα με ERK σηματοδότησης. PLoS ONE 9 (5): e96060. doi: 10.1371 /journal.pone.0096060

Επιμέλεια: Noriko Gotoh, Ινστιτούτο Ιατρικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο του Τόκιο, Ιαπωνία

Ελήφθη: 22 Νοέμβρη, 2013? Αποδεκτές: 2 του Απρίλη 2014? Δημοσιεύθηκε: May 1, 2014

Copyright: © 2014 Ono et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από την εσωτερική νομαρχιακό ταμείο έρευνας των συγγραφέων. Ο χρηματοδότης (Τμήμα Χειρουργικής, Michigan State University) είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα υπάρχει.

Εισαγωγή

ο καρκίνος του παγκρέατος είναι η τέταρτη κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες. [1] Η έκβαση των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος ήταν μελαγχολική, με ποσοστό 5ετούς επιβίωσης 5%. [2] Η θνησιμότητα του καρκίνου του παγκρέατος είναι λόγω της επιθετικής συμπεριφοράς από βιολογικής του, συμπεριλαμβανομένης μιας μεγάλο δυναμικό για την εισβολή και τη μετάσταση, και την αντίσταση σε διαθέσιμα σήμερα αντι-καρκινικούς παράγοντες. Οι μοριακοί μηχανισμοί που ευθύνονται για τα χαρακτηριστικά αυτά είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη, και πρέπει να γίνει κατανοητό για τη βελτίωση των αποτελεσμάτων της θεραπείας των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος.

κινάση τυροσίνης πρωτεΐνης 6 (PTK6), ή του μαστού σχετική με κινάση όγκου (BRK) είναι μια μη-υποδοχέα κινάσης τυροσίνης τύπου. Έχει σχέση με την οικογένεια της κινάσης c-Src, κατέχοντας SH2 και SH3 τομείς. [3] PTK6 προάγει τη διαφοροποίηση των κυττάρων σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα και μετά βίας εκφράζεται σε ώριμα επιθηλιακά κύτταρα στην γαστρεντερική οδό, του μαστού ή του δέρματος. [3] – [5] Αν και παρεκκλίνουσα υπερέκφραση του PTK6 έχει ταυτοποιηθεί σε αρκετά επιθηλιακούς καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων του μαστού, του πνεύμονα, του μελανώματος, του προστάτη, του παχέος εντέρου και των ωοθηκών, οι λειτουργίες της PTK6 στη βιολογία του καρκίνου δεν έχουν πλήρως χαρακτηρισθεί. [3], [6] – [12].

Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε το ρόλο της PTK6 για παγκρέατος εισβολή των καρκινικών κυττάρων και να διερευνηθούν τα κατάντη σήματα που μπορεί να μεσολαβήσει ένα τέτοιο αποτέλεσμα. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι PTK6 ρυθμίζει εισβολής με την ενεργοποίηση της ERK και αυξάνει την πιθανότητα ότι PTK6 μπορεί να είναι ένα σημαντικό νέο μοριακό στόχο να βελτιωθεί η αποτελεσματικότητα της θεραπείας για τον καρκίνο του παγκρέατος.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά

τα μέσα καλλιέργειας, ορό εμβρύου μόσχου (FBS) και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (P /S) ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Αντι-PTK6 αντίσωμα που ελήφθη από την Santa Cruz Βιοχημεία (Santa Cruz, CA), αντι-ρ44 /42 ERK1 /2, αντι-φωσφο-ρ44 /42 ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), αντι-p38 ΜΑΡΚ, αντι-φωσφο -p38 ΜΑΡΚ (Thr180 /Tyr182), αντι-STAT3 και αντι-φωσφο-STAT3 (Tyr705) αντισώματα ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ), και αντι-β-ακτίνης αντίσωμα ελήφθη από την Sigma-Aldrich. Η επιλεκτική ERK1 /2 αναστολέα U0126 ελήφθη από την Sigma-Aldrich.

Ανθρώπινο Ιστών

παγκρέατος διαφάνειες καρκινικού ιστού ελήφθησαν από το Τμήμα Παθολογίας Sparrow Νοσοκομείο, Lansing MI. Η χρήση των αρχειοθετημένα δείγματα για μελέτη αυτή εγκρίθηκε από το Michigan State University (MSU) και Sparrow Νοσοκομείο Institutional Review Boards (IRBs). IRB επιτροπή μας δώσει απαλλαγή από την ανάγκη για συναίνεση. Εννέα ασθενείς που υποβλήθηκαν σε παγκρεατικά εκτομή για πόρου αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος από το 2002 αν και επιλέχθηκαν 2012 και συμπεριλήφθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Τα αρχειοθετημένα, δείγματα παραφίνη-ενσωματωμένες φορμόλη σταθερό κόπηκαν σε περιστροφικό microtome σε 4 μm του. Enzyme επαγόμενη ανάκτηση επιτόπου διεξήχθη με 0.03% πρωτεάση Ε για 10 λεπτά στους 37 ° C. Αντι-PTK6 αντίσωμα αραιώθηκε σε 1/100 με Normal αραιωτικό αντισώματος (NAD) (Scytek – Logan, UT) και επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. αντιδράσεις αντιγόνου-αντισώματος κατέστησαν ορατά με το περίπλοκο σύστημα αβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης (Vectastain R.T.U. Αντιδραστήριο ABC Elite? Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Οι διαφάνειες εξετάστηκαν και έκφραση PTK6 βαθμολογήθηκε σύμφωνα με την κυτταροπλασματική ένταση χρώσης ως εξής? αρνητικό, καμία χρώση ή ασθενή χρώση ένταση σε λιγότερο από 5% των κυττάρων? ασθενής έως μέτρια θετική, ασθενής έως μέτρια intensitiy? ισχυρό θετικό, ισχυρή ένταση.

Κυτταροκαλλιεργειών

Ανθρώπινο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές BxPC3, Capan1, Hs766T, PANC1 και ΜΙΑ PaCa2 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection. BxPC3 διατηρήθηκε σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% Ρ /δ σε έναν υγροποιημένο (37 ° C, 5% CO

2) θάλαμος. Οι άλλες κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε μέσο DMEM που περιείχε 10% FBS και 1% Ρ /δ.

Ανάλυση Western Blot

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης κυττάρου (Cell Signaling Technology) με 1 mM φαινυλυεθανοσουλφονύλ Φθόριο (Cell Signaling Technology). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης του κάθε προϊόντος λύσεως κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασία BCA (Pierce Chemical). Τα κυτταρολύματα που περιέχουν συνολικά 20 μα πρωτεΐνης εφαρμόστηκαν σε 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) μεμβράνες (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ). Αφού αποκλείστηκαν με Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα με 0.2% Tween-20 (TBST) που περιέχει 5% BSA ή άπαχο γάλα για 4 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, οι μεμβράνες επωάστηκαν με αντίσωμα σε κατάλληλη αραίωση στους 4 ° C. Η υπεροξειδάση χράνου-συζευγμένο γαϊδάρου αντι-κουνελιού IgG ή αντι-ποντικού προβάτου IgG (GE Healthcare, Piscataway, NJ) χρησιμοποιήθηκαν ως δευτερεύοντα αντισώματα και επωάζονται με τις μεμβράνες σε αραίωση 1/3000 για 1 ώρα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης ελέγχου φόρτωσης για την ομαλοποίηση της κάθε λωρίδας.

γονιδιακή σίγηση από μικρό παρεμβαλλόμενο RNA

Απώλεια-του-λειτουργία εκτελέστηκε ανάλυση με τη χρήση siRNA που στοχεύουν PTK6 (s11487, Ambion , Grand Island, Νέα Υόρκη: νόημα 5′-CAUCCAUGGUUAAGUCAUAtt-3 ‘, 5′-αντίθετης φοράς UAUGACUUAACCAUGGAUGaa-3′) και αρνητικού ελέγχου (σιλανσιέ Επιλέξτε Negative Control # 2 siRNA, Ambion). Ένα άλλο ζευγάρι των siRNAs που στοχεύουν PTK6 και αρνητικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκαν (PTK6 και αρνητικό μάρτυρα, Invitrogen, St Louis, MO: Stealth RNAi-PTK6HSS183907 νόημα 5’-CAGGCUGUGCGGCACUACAAGAUCU-3 ‘, 5′-antisense- AGAUCUUGUAGUGCCGCACAGCCUG-3’ και Stealth RNAi Αρνητική ελέγχου Medium GC διπλής όψης, αντίστοιχα). Κάθε siRNA (10 nmol /l) επιμολύνθηκε σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη RNA Imax (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η εξουδετέρωση ενός γονιδίου-στόχου επιβεβαιώθηκε στις 96 ώρες με western αποτύπωση

Η υπερέκφραση του PTK6 από Σταθερή διαμόλυνση

PTK6 cDNA του Ανθρώπου (ΟΙοηβΙΟ: 5746034). Αγοράστηκε από την Open Biosystems (Pittsburg, PA ) και ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές (5′-CCCAAGCTTATGGTGTCCCGGGACCAGGC, και 3′-CGGGATCCTCAGGTCGGGTTCTCGTAGC). Το PCR προϊόν εισήχθη εντός φορέα έκφρασης pcDNA3.1-myc /B His (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η καθιερωμένη φορέας έκφρασης PTK6 υποβλήθηκε σε ανάλυση αλληλουχίας DNA για να επιβεβαιωθεί η σωστή εισαγωγή της πλήρους μήκους PTK6 cDNA. PTK6 φορέα έκφρασης ή αντίστοιχα κενό φορέα διαμολύνθηκαν σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από 72 ώρες διαμόλυνσης, τα κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει κατάλληλες συγκεντρώσεις G418. Με καλλιέργεια σε μέσο επιλογής containg G418 για 2 εβδομάδες, σταθερά κύτταρα επιμόλυνσης επιλέχθηκαν έξω. Η έκφραση της πρωτεΐνης PTK6 επιβεβαιώθηκε στη συνέχεια από τη δυτική αποτύπωση.

Transwell τη Μετανάστευση και την εισβολή Δοκιμασία

Transwell τη μετανάστευση και την εισβολή αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε 24-καλά τροποποιημένους θαλάμους Boyden προεπικαλυμμένα με (εισβολή) ή χωρίς (μετανάστευση) Matrigel (transwell-θάλαμο, BD Biosciences, San Jose, CA,). Παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (BxPC3 1 × 10

5 κύτταρα, PANC1, 5 × 10

4 κύτταρα και MIAPaCa2, 7.5 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο, αντίστοιχα) σε μέσο χωρίς ορό σπάρθηκαν πάνω στο trans-μεμβράνης στον άνω θάλαμο με 10% FBS στον κατώτερο θάλαμο ως χημειοελκτικό. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει διαμέσου της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με το Diff-Quik Stain Set (Siemens, Newark, DE). Στη συνέχεια μετρήθηκαν υπό μεγέθυνση σε 5 τυχαία επιλεγμένα πεδία υψηλής ισχύος. Κάθε δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν

Στατιστική Ανάλυση

Η σύγκριση των συνεχών τιμών πραγματοποιήθηκε με τη χρήση t-test και Φοιτητών 2 όψεων

p-τιμές

& lt?. 0.05 θεωρήθηκαν σημαντική.

Αποτελέσματα

Έκφραση PTK6 Κατάσταση σε καρκίνο του παγκρέατος

σύγκριση των επιπέδων PTK6 σε πέντε ιδρύθηκε ανθρώπινου παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές (BxPC3, Capan1, Hs766T, MIAPaCa2 και PANC1 ) και του παγκρέατος καρκινικούς ιστούς που λαμβάνονται απευθείας από 9 ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή. Κηλίδες Western έδειξαν ότι οι 5 παγκρεατικών κυτταρικών γραμμών εξέφρασαν PTK6 σε διάφορα επίπεδα? BxPC3 και Capan1 εξέφρασε PTK6 σθεναρά, ενώ MIAPaCa2 εξέφρασε ένα πολύ χαμηλότερο επίπεδο PTK6 (Εικόνα 1Α). Η ανοσοχρώση για PTK6 σε παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς από 9 ασθενείς έδειξε ότι η PTK6 ήταν εντόνως εκφρασμένο σε 4 ασθενείς (44%), ελαφρώς έως μέτρια εκφράζονται σε 2 ασθενείς (22%), και όχι εκφράζονται καθόλου σε 3 ασθενείς (33%). Στο γειτονικό φυσιολογικό επιθήλιο παγκρεατικού πόρου, ανοσοδραστικά PTK6 δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε κανένα από τα δείγματα εξετάσαμε (Εικόνα 1Β).

A

, ενδογενούς έκφρασης του PTK6 σε ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. έκφραση PTK6 επιβεβαιώθηκε σε 5 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές, BxPC3, Capan1, Hs766T, MIAPaCa2, και PANC1 σε διάφορα επίπεδα με κηλίδωση Western.

Β

, Ανοσοϊστοχημική staning για PTK6 σε γειτονικό φυσιολογικό πάγκρεας και του παγκρέατος καρκινικό ιστό. Ενώ δεν υπήρχε ανιχνεύσιμη έκφραση ΡΤΚ στο γειτονικό φυσιολογικό επιθήλιο παγκρεατικού πόρου (επάνω αριστερά), PTK6 εκφράστηκε σε διάφορα επίπεδα (από αρνητική έως έντονα θετική) σε καρκίνους του παγκρέατος.

Η

Έκφραση PTK6 επηρεάζει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή του καρκίνου του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές

Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι PTK6 επηρεάζει κυτταρικό μηχανισμό που μεσολαβούν τη μετανάστευση και την εισβολή. [13] – [15] Ως εκ τούτου υποθέσαμε ότι PTK6 είναι ένας ρυθμιστής κλειδί της παγκρεατικής μετανάστευση καρκίνου και εισβολή και αξιολογήσαμε την επίδραση της μειωμένης έκφρασης PTK6 επί αυτών των κυτταρικών συμπεριφορές. Μετά την έκφραση PTK6 κατεστάλη με γονιδιακή σίγηση χρησιμοποιώντας siRNA (από Ambion) σε 3 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 2Α), το μεταναστευτικό δυναμικό των παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα θάλαμο Boyden. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, γονιδιακή σίγηση του PTK6 σημαντικά μειωμένη μετανάστευση σε όλες τις 3 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (0,59 φορές μείωση στην BxPC3, 0,61 σε PANC1, 0.42 σε MIAPaCa2, αντίστοιχα,

ρ

& lt? 0,05 για το καθένα) . Cellular επεμβατική δυναμικό παρομοίως προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας επικαλυμμένα με Matrigel θαλάμους Boyden, και εισβολή μειώθηκε σημαντικά με γονιδιακή σίγηση του PTK6 σε όλες τις 3 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Γ (0,49-φορές μείωση στην BxPC3, 0.62 σε PANC1, 0.39 σε MIAPaCa2, αντίστοιχα,

σ

& lt? 0,05 για κάθε μία). Αυτές οι ανασταλτικές επιδράσεις της γονιδιακής αποσιώπησης PTK6 για τη μετανάστευση κυττάρων και εισβολή επιβεβαιώθηκαν από τα παρόμοια πειράματα που χρησιμοποιούν άλλα siRNA που στοχεύει διαφορετική ακολουθία των PTK6 (από την Invitrogen) (Εικόνα S2).

Μια

, PTK6 γονιδιακή σίγηση. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με PTK6-ειδικό siRNA (siRNA-PTK6) ή αρνητικό μάρτυρα-siRNA (siRNA-NC) για 96 ώρες. Νοκ ντάουν της έκφρασης PTK6 ήταν comfirmed από κηλίδωση Western. Οι αριθμοί στο κάτω μέρος δείχνουν τη σχετική ένταση των ζωνών στις PTK6 με τους αντίστοιχους ελέγχους (ομαλοποιήθηκε με β-ακτίνης).

Β

,

C

, Η επίδραση της γονιδιακής αποσιώπησης PTK6 στην κυτταρική κινητικότητα (Β) και της εισβολής (C). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PTK6 ειδικό siRNA ή αρνητικό μάρτυρα-siRNA για 48 ώρες, στη συνέχεια υποβλήθηκε σε μετανάστευση ή η δοκιμασία εισβολή χρησιμοποιώντας θαλάμους Boyden με ή χωρίς Matrigel. Γονιδιακή σίγηση του PTK6 μειωμένη κυτταρική μετανάστευση σε όλες τις 3 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (0,59 φορές μείωση στην BxPC3, 0,61 σε PANC1, 0.42 σε MIAPaCa2, αντίστοιχα, *

ρ

& lt? 0.05 με t-test). Ομοίως, γονιδιακή σίγηση του PTK6 μειωμένη κυτταρική εισβολή και στις 3 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (0,49-φορές μείωση στην BxPC3, 0.62-φορές σε PANC1, 0.39-φορές σε MIAPaCa2, αντίστοιχα, *

ρ

& lt? 0.05 με t-test). Κάθε δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν.

Η

Αντιστρόφως, αξιολογήσαμε την επόμενη την επίδραση της υπερέκφρασης PTK6 για τη μετανάστευση και εισβολή. Ένας φορέας έκφρασης που κωδικοποιεί πλήρους μήκους cDNA PTK6 επιμολύνθηκε σε PANC1 και MIAPaCa2 κύτταρα και σταθερά προϊόντα επιμόλυνσης που υπερεκφράζουν PTK6 καθορίστηκαν για κάθε κυτταρική γραμμή (Σχήμα 3Α). Σε αντίθεση με την επίδραση της γονιδιακής σίγησης PTK6, PTK6 υπερέκφραση αυξημένη κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε σύγκριση με τους ελέγχους. (1.6 /1.7-πλάσια αύξηση PANC1, και 1,4 /1,6 σε MIAPaCa2, για μεταναστευτικά και επεμβατικές δυνατότητες, αντίστοιχα,

ρ

& lt? 0,05) (Σχήμα 3Β, 3C) Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η έκφραση PTK6 σε παγκρεατικά ο καρκίνος σχετίζεται με την κυτταρική μεταναστευτικών και επεμβατική δυναμικό της.

Μια

, υπερέκφραση του PTK6. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με pcDNA3.1-Mock (κενός φορέας) ή pcDNA3.1-PTK6. Η υπερέκφραση του PTK6 σε σταθερές trasfectant επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western σε κύτταρα PANC1 και MIAPaCa2, αντίστοιχα. Οι αριθμοί στο κάτω μέρος δείχνουν την σχετική ένταση της ζώνης για PTK6 στους αντίστοιχους ελέγχους (ομαλοποιήθηκε με β-ακτίνης).

Β

,

C

, Η επίδραση της PTK6 υπερέκφραση στην κυτταρική μετανάστευση (Β) και της εισβολής (C). Ιδρύθηκε κύτταρα επιμόλυνσης αξιολογήθηκε με δοκιμασίες μετανάστευσης και εισβολή. Εξαναγκασμένη υπερέκφραση PTK6 αυξημένη κυτταρική μετανάστευση σε PANC1 και MIAPaCa2 παγκρεατικό καρκίνο κύτταρα (1,6-πλάσια αύξηση για PANC1, και 1,4 φορές για MIAPaCa2, αντίστοιχα, *

ρ

& lt? 0.05 με t-test). Ομοίως, η αναγκαστική υπερέκφραση PTK6 αυξημένη κυτταρική εισβολή σε αυτά τα 2 κυτταρικές σειρές (1,7-πλάσια αύξηση για PANC1, και 1,6 φορές για MIAPaCa2, αντίστοιχα, *

ρ

& lt? 0.05 με t-test). Κάθε δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν.

Η

ΜΑΡΚ /ΕΚΚ Σηματοδοσίας είναι μια Κρίσιμη Mediator σε PTK6 που σχετίζονται με την κυτταρική κινητικότητα

Για να διαλευκανθεί ο μηχανισμός με τον οποίο PTK6 ρυθμίζει την κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή, εμείς διερευνηθούν μονοπάτια προς τα κάτω για να PTK6 σηματοδότησης. Αρκετές μόρια σηματοδότησης έχουν προηγουμένως αναφερθεί ότι είναι προς τα κάτω του PTK6, συμπεριλαμβανομένων STAT3 [16], Akt [17], [18], Erk5 [15], [19], p38 ΜΑΡΚ [19], και ERK1 /2 [20] (αναθεωρηθούν Ostrander 2010). Όταν η έκφραση PTK6 είχε χειριστεί με siRNA, τη φωσφορυλίωση της STAT3, Akt, και ρ38 ΜΑΡΚ δεν μεταβλήθηκαν με συνέπεια μεταξύ 3 κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (Σχήμα S1). Η ενεργοποίηση των ERK5 δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε μελέτες μας (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα) Αντίθετα, ενεργοποιημένο (phospholylated) ERK1 /2 ήταν σημαντικά μειωμένη σε όλα τα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος PTK6-γονίδιο-σιγήσει σε σύγκριση με αντίστοιχα κύτταρα ελέγχου τους, ενώ εξαναγκασμένη υπερέκφραση PTK6 επαγόμενη ενεργοποίηση του ERK1 /2 και στα δύο κύτταρα PANC1 και MIAPaCa2 (Σχήμα 4A.B). Ως εκ τούτου, ERK1 /2 αναδείχθηκε ως υποψήφιος για το διαμεσολαβητή της PTK6 ρυθμιζόμενη κυτταρική κινητικότητα στον καρκίνο του παγκρέατος και κατά συνέπεια ζητείται να προσδιοριστεί αν τα αποτελέσματα της PTK6 στην κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή εξαρτηθεί από 2 δραστηριότητα ERK1 /. Χρησιμοποιήσαμε το εκλεκτικό αναστολέα της ERK1 /2, U0126 να αναστέλλουν δραστικότητα ERK1 /2. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, PTK6 επαγόμενη ενεργοποίηση ERK /1/2 ήταν εντελώς μπλοκαριστεί από U0126 στα 10 μΜ. Όταν αναλύθηκε κυτταρική μετανάστευση και εισβολή των 2 κυττάρων PANC1 και MIAPaCa παρουσία U0126, U0126 μειωμένη βασική κυτταρική μετανάστευση και εισβολή και κατήργησε την ικανότητα του PTK6 υπερ-έκφραση σε αυτά (Σχήμα 5Β) διεγείρουν. Αυτό υποδηλώνει ότι PTK6 ρυθμίζει την κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή μέσω ERK1 /2.

Μια

, Επίδραση της γονιδιακής αποσιώπησης PTK6 επί του συνόλου των ERK1 /2 και ενεργοποιημένη (φωσφορυλιωμένη) ERK1 /2. Γονιδιακή σίγηση του PTK6 μείωσε το επίπεδο της φωσφορυλιωμένης ERK1 /2 και στις 3 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Οι αριθμοί στο κάτω μέρος δείχνουν την σχετική ένταση ζώνης για pERK1 /2 με τους αντίστοιχους ελέγχους (κανονικοποιούνται σύνολο ERK1 /2).

Β

, Επίδραση της PTK6 υπερέκφραση επί του συνόλου των ERK1 /2 και ενεργοποιείται ERK1 /2. Αναγκαστική PTK6 υπερέκφραση προκαλείται από την ενεργοποίηση των ERK1 /2 και στα δύο κύτταρα PANC1 και MIAPaCa2. Οι αριθμοί στο κάτω μέρος δείχνουν την σχετική ένταση μπάντα για pERK1 /2 με τους αντίστοιχους ελέγχους (κανονικοποιημένη με το συνολικό ERK1 /2).

Η

Μια

, κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το συγκεκριμένο ERK1 /2 αναστολέα, U0126 στα 10 μΜ για 24 ώρες. /2 φωσφορυλίωση ERK1 αναστάλθηκε και PTK6 επαγόμενη ενεργοποίηση του ERK1 /2 δεν είναι πλέον ανιχνεύθηκε σε κύτταρα PANC1 ή MIAPaCa2.

Β

, Η επίδραση των ERK1 αναστολής /2 στην κυτταρική μετανάστευση (

αριστερά

) και εισβολή (

δεξιά

) ERK1 /2 αναστολή όχι μόνο μείωσε τα βασικά της μετανάστευσης και της εισβολής στην PANC1 και τα κύτταρα MIAPaCa2, αλλά κατάργησε την επίδραση της PTK6-υπερέκφραση για τη μετανάστευση και την εισβολή. *

σ

& lt? 0,05 έναντι αντίστοιχου ελέγχου με DMSO οχήματος (από

t

-τεστ). **

σ

& lt? 0.05 vs PTK6-υπερεκφράζεται κύτταρα με DMSO οχήματος (από

t

-τεστ). Κάθε δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν.

Η

Συζήτηση

Παρά το γεγονός ότι υπάρχει μια συσσώρευση αποδείξεις ότι PTK6 εκφράζεται μη φυσιολογικά σε διάφορα επιθηλιακά καρκίνους, την εμπλοκή της έκφρασης PTK6 και το ρόλο της στη βιολογική συμπεριφορά των καρκίνων είναι αμφιλεγόμενα και ακαθόριστα. Στην πραγματικότητα, ο ρόλος και η λειτουργία του PTK6 πιστεύεται εξαρτώμενη σε μεγάλο βαθμό από το πλαίσιο στο οποίο εκφράζεται PTK6. Για παράδειγμα, PTK6 έχει μελετηθεί εκτενώς σε καρκίνους του μαστού για

pro

-oncogenic ρόλους συμπεριλαμβανομένης εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [21], η αγγειογένεση [22], αντίσταση anoikis [23] και την κυτταρική μετανάστευση [13], ενώ PTK6 έχει αποδειχθεί ότι λειτουργεί

αντι

-oncogenically σε καρκίνο του οισοφάγου [24]. Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που διερεύνησε την έκφραση και τη λειτουργία των PTK6 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα.

βασικό εύρημα μας σε αυτή τη μελέτη είναι ότι η υπερέκφραση PTK6 αυξάνει την κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή και ότι το γονίδιο PTK6 αποσιώπηση, σε Αντίθετα, τους μειώνεται σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Τα αποτελέσματα της PTK6 στην κυτταρική μετανάστευση μπορεί να διαφέρουν μεταξύ των τύπων cacners. Στις μελέτες του καρκίνου του μαστού, PTK6 έχει αναφερθεί ότι ενισχύει προκαλούμενη από EGF κυτταρική μετανάστευση [13] – [15], [19], ενώ η υπερέκφραση του PTK6 αναφέρθηκε ότι αυξάνει την κυτταρική επεμβατική δυναμικό με επαγωγή επιθηλιακά μετάφραση μεσεγχυματικά (ΕΜΤ) σε κύτταρα καρκίνου προστάτη [25]. Σε αντίθεση, Ma et al ανέφεραν ότι PTK6 μειώνει τη μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του οισοφάγου [24]. Αυτές οι φαινομενικά αντίθετες εκθέσεις σχετικά με την επίδραση της της PTK6 στη βιολογία του καρκίνου υπογραμμίζουν τη σημασία της μελέτες που διερευνούν τις επιπτώσεις των επιμέρους σημάτων σε επιμέρους τύπους καρκίνων. Φαίνεται πιθανό ότι τα αποτελέσματα του PTK6, όπως και πολλά άλλα σήματα, εξαρτάται από το γενικό kinome στο οποίο εκφράζεται η PTK6. Η κατανόηση των kinomic διαφορές μεταξύ των καρκίνων στις οποίες PTK6 προωθεί τη μετανάστευση και εκείνα στα οποία αναστέλλει τη μετανάστευση μπορεί να είναι μια γόνιμη θέμα για μελλοντική μελέτη. Αρκετές μεταγενέστερα μόρια τελεστή που συνδέονται με PTK6 έχουν προηγουμένως εντοπιστεί σε άλλους καρκίνους. Αυτές περιλαμβάνουν p190RhoGAP, Rho, RAS [14], Rac1, παξιλλίνη [13], p38MAPK, και ERK5 [15], [19] στον καρκίνο του μαστού, και ΑΚΤ, ΟδΚ3β και βCatenin [24] σε καρκίνο του οισοφάγου. Στην παρούσα μελέτη των πολλαπλών παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, τα περισσότερα από τα μόρια που έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ότι σχετίζονται με PTK6 σηματοδότηση σε άλλους καρκίνους δεν άλλαξε σε δραστικότητα με χειρισμό της έκφρασης PTK6. Επομένως, είναι λιγότερο πιθανό ότι αυτά τα μόρια παίζουν ένα ρόλο στη διαμεσολάβηση της επίδρασης του PTK6 στην κυτταρική μετανάστευση /εισβολή σε καρκίνο του παγκρέατος. Αντ ‘αυτού, ERK1 /2 αναδειχθεί ως βασική κατάντη μεσολαβητής PTK6 που σχετίζονται με σήμα το οποίο ρυθμίζει παγκρέατος εισβολή του καρκίνου. ERK1 /2 είναι ένα μέλος της οικογένειας που ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) και είναι γνωστό ότι επηρεάζουν την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε διάφορους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παγκρέατος [26], [27]. Οι μηχανισμοί με τους οποίους PTK6 υπερέκφραση προκαλεί την ενεργοποίηση ERK1 /2 δεν έχει ακόμη καθοριστεί και είναι άγνωστο αν PTK6 αλληλεπιδρά άμεσα με ERK1 /2. Κάστρο και Lange ανέφερε ότι σε κύτταρα καρκίνου του μαστού το συγκρότημα /ERK5 PTK6 είναι κρίσιμης σημασίας για τη μετανάστευση που προκαλείται από κύτταρο παράγοντα ανάπτυξης, ενώ PTK6 ακόμα αυξάνει την κυτταρική μετανάστευση από 2 ενεργοποίηση /ERK1 σε κερατινοκύτταρα όταν ERK5 καταρριφθεί [15]. Θα σκεφτεί ότι ERK1 /2 θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μια εναλλακτική οδό για σήματα PTK6 /ERK5 σε ορισμένους τύπους κυττάρων που στερούνται ERK5. Το μοντέλο αυτό θα ήταν σύμφωνο με τις παρατηρήσεις μας, δεδομένου ότι δεν ήταν σε θέση να ανιχνεύσει δραστηριότητα ERK5 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα ανεξάρτητα από την κατάσταση έκφρασης PTK6. Ωστόσο, Xiang et al απέδειξαν ότι PTK6 συνδέεται άμεσα με Erb Β2 και ενεργοποιεί ERK1 /2 σε κύτταρα καρκίνου του μαστού. Erb Β2 είναι καλά γνωστό ότι υπερεκφράζεται συνήθως σε καρκίνους του παγκρέατος [28], [29], έτσι ώστε αυτό να είναι ένας πιθανός μηχανισμός με τον οποίο αναγκάζονται PTK6 υπερέκφραση σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να ενεργοποιεί ERK1 /2 χωρίς δραστηριότητα ERK5.

ήταν ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι ενώ η έκφραση PTK6 ήταν ομοιόμορφα μη ανιχνεύσιμη σε παρακείμενες ιστολογικά φυσιολογικό παγκρεατικό πόρο επιθηλιακά κύτταρα, τα επίπεδα PTK6 ποικίλει σημαντικά μεταξύ των καρκίνων του παγκρέατος μελετήσαμε. Αποκλίνουν από το φυσιολογικό υπερέκφραση του PTK6 έχει περιγραφεί σε άλλους τύπους καρκίνου και έχει προηγουμένως προταθεί ότι PTK6 μπορεί να είναι ένα χρήσιμο βιοδείκτη για την πρόβλεψη των αποτελεσμάτων των ασθενών με διάφορους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του μαστού, της κεφαλής και του τραχήλου, των ωοθηκών και του πνεύμονα [6], [12 ], [30] – [33]. Η δυνητική προγνωστική αξία της μεταβολής PTK6 σε καρκίνο του παγκρέατος αναμένει περαιτέρω μελέτη.

Εν περιλήψει, αποδείξαμε ότι PTK6 εκφράζεται με παρεκκλίνοντα σε καρκίνο του παγκρέατος. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας υποδηλώνουν ότι μπορεί να προάγει PTK6 κυτταρική μετανάστευση και εισβολή στον καρκίνο του παγκρέατος με την ενεργοποίηση ERK1 /2. Περαιτέρω διερεύνηση του μονοπατιού σηματοδότησης PTK6-εξαρτώμενο που οδηγεί εισβολή στον καρκίνο του παγκρέατος μπορεί να αναδείξει τις δυνατότητες προγνωστική και θεραπευτική σημασία αυτού του νέου σήματος στον καρκίνο του παγκρέατος.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Επίδραση της γονιδιακής σίγησης PTK6 σχετικά με τη δραστηριότητα των διαφόρων μορίων σε οδούς σήματος? ρ38, STAT3, και ΑΚΤ δοκιμάστηκαν ως είχαν προηγουμένως αναφερθεί ότι συνδέεται με PTK6. Η δραστηριότητα αυτών των μορίων δεν επηρεάστηκαν με συνέπεια από γονιδιακή αποσιώπηση των PTK6 σε 3 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές, BxPC3, PANC1 και MIAPaCa2

doi:. 10.1371 /journal.pone.0096060.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Μια

, Οι επιπτώσεις της γονιδιακής αποσιώπησης PTK6 επί του συνόλου των ERK1 /2 και φωσφορυλιωμένη ERK1 /2 με τη χρήση siRNA. Αξίζει να σημειωθεί ότι το siRNA που χρησιμοποιείται σε αυτό το πείραμα έχει διαφορετική αλληλουχία στόχευσης PTK6 από το siRNA που χρησιμοποιήθηκαν στο πείραμα σε Figuer 2 και 4. Το φωσφορυλιωμένο ERK1 /2 μειώθηκαν με γονιδιακή σίγηση PTK6 στα δύο κύτταρα PANC1 και MIAPaCa2. Οι αριθμοί στο κάτω μέρος δείχνουν την σχετική ένταση ζώνης για PTK6 και pERK1 /2 με τους αντίστοιχους ελέγχους, αντίστοιχα (ομαλοποιήθηκε με β-ακτίνης για PTK6 και συνολική ERK1 /2 για pERK1 /2).

Β

, Η επίδραση της αποσιώπησης γονιδίου PTK6 για τη μετανάστευση των κυττάρων (αριστερά) και εισβολή (δεξιά). Γονιδιακή σίγηση του PTK6 μειωμένη κυτταρική μετανάστευση σε PANC1 και MIAPaCa2 κύτταρα (μείωση 0,65 φορές σε PANC1, 0.72 σε MIAPaCa2, αντίστοιχα, *

ρ

& lt? 0.05 με t-test). Επιπλέον, η γονιδιακή σίγηση του PTK6 μειωμένη κυτταρική εισβολή σε PANC1 και MIAPaCa2 κύτταρα (μείωση 0,48 φορές σε PANC1, 0,78-φορές σε MIAPaCa2, αντίστοιχα, *

ρ

& lt? 0.05 με t-test). Κάθε δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν

doi:. 10.1371 /journal.pone.0096060.s002

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε William S. Spielman, Amy S. Porter, και Kathy Α Ιωσήφ για την τεχνική βοήθεια.

Παρουσιάζονται εν μέρει, ως αφίσα στην Ετήσια Συνέλευση της Εταιρείας Χειρουργικής του πεπτικού σωλήνα, 18 Μαΐου

ου-21

ου, 2013, Orlando, FL.