Αφηρημένο

Ιστορικό

Μέσω αρνητική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, microRNAs (miRNAs) μπορούν να λειτουργήσουν σε καρκίνους όπως oncosuppressors, και μπορούν να δείξουν αλλοιωμένη έκφραση σε διάφορους τύπους όγκων. Εδώ έχουμε ερευνήσει μυελοβλάστωμα όγκους (MBS), τα οποία προκύπτουν από ένα πρώιμο απομείωση αναπτυξιακών διαδικασιών στην παρεγκεφαλίδα, όπου σηματοδότηση Notch εμπλέκεται σε πολλά στάδια κυτταρικής μοίρα-προσδιορισμού. ΜΒ συμβαίνουν με διπλό τρόπο, με τη συχνότητα εμφάνισης κορυφή παρατηρείται μεταξύ 3-4 ετών και 8-9 ετών, αν και μπορεί επίσης να εμφανιστεί σε ενήλικες. Notch ρυθμίζει ένα υποσύνολο των κυττάρων τα οποία έχουν ΜΒ βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με τις ιδιότητες και μπορεί να προωθήσει την ανάπτυξη του όγκου. Με βάση αυτά τα στοιχεία, υποθέσαμε ότι miRNAs στοχεύουν το μονοπάτι Notch μπορούν να ρυθμιστούν αυτά τα φαινόμενα, και μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε θεραπείες κατά του καρκίνου.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Σε μια προβολή της MB κυτταρικές σειρές, το miRNA miR-199b-5P φάνηκε να είναι μια ρυθμιστική αρχή του μονοπατιού Notch μέσω της στόχευσης της στην HES1 μεταγραφικού παράγοντα. Κάτω ρύθμιση της έκφρασης HES1 από miR-199b-5P ρυθμίζει αρνητικά το ρυθμό πολλαπλασιασμού και αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη των MB κυττάρων. MiR-199b-5P υπερ-έκφραση μπλοκ έκφραση των γονιδίων των βλαστικών κυττάρων αρκετές καρκίνου, μειώνει το δυναμικό μοσχεύματος του ΜΒ κυττάρων στην παρεγκεφαλίδα αθυμικών /γυμνών ποντικών, και παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον, μειώνει το MB βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με (CD133 +) υποπληθυσμού κυττάρων. Στην ανάλυσή μας των 61 ασθενών με ΜΒ, την έκφραση του miR-199b-5P στα μη μεταστατικό περιπτώσεις ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι στις μεταστατικές περιπτώσεις (P = 0,001). Συσχέτιση με την επιβίωση αυτών των ασθενών με υψηλά επίπεδα miR-199b έκφρασης έδειξαν θετική τάση για την καλύτερη συνολική επιβίωση από ό, τι για τους ασθενείς με χαμηλή έκφραση. Τα στοιχεία αυτά δείχνουν την κάτω ρύθμιση του miR-199b-5P στο μεταστατικό ΜΒ υποδηλώνουν μια πιθανή μηχανισμό σίγηση μέσω επιγενετικές ή γενετικές αλλοιώσεις. Μετά την επαγωγή de-μεθυλίωση χρησιμοποιώντας 5-αζα-δεοξυκυτιδίνη, μειώνουν την έκφραση του miR-199b-5P παρατηρήθηκε σε ένα πάνελ κυτταρικών σειρών MB, υποστήριξε μια επιγενετική μηχανισμό ρύθμισης. Επιπλέον, δύο κυτταρικές γραμμές (Med8a και UW228) έδειξαν σημαντική αυξητική ρύθμιση του miR-199b-5P κατά την κατεργασία. Η μόλυνση με ΜΒ κυττάρων σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος που επάγεται στην παρεγκεφαλίδα ποντικού και τη χρήση ενός αδενοϊού που φέρει miR-199b-5P δείχνουν κλινικό όφελος μέσω αυτής της αρνητικής επιρροής των miR-199b-5P στην ανάπτυξη του όγκου και για το υποσύνολο των ΜΒ STEM- κυττάρων, όπως κύτταρα, παρέχοντας περαιτέρω απόδειξη της έννοιας.

Συμπεράσματα /Σημασία

Παρά τις προόδους στην κατανόηση της παθογένειας του ΜΒ, το ένα τρίτο αυτών των ασθενών παραμένει ανίατη και τρέχουσες θεραπείες μπορεί σημαντικά ζημιά μακροχρόνια επιζώντες. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η έκφραση του miR-199b-5P συσχετίζεται με μετάσταση εξάπλωση, προσδιορίζοντας ένα νέο μοριακό δείκτη για μια τάξη φτωχών κινδύνου σε ασθενείς με ΜΒ. Δείχνουμε επίσης ότι σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος, MB φορτίο του όγκου μπορεί να μειωθεί, υποδεικνύοντας τη χρήση των miR199b-5P ως επικουρική θεραπεία μετά από χειρουργική επέμβαση, σε συνδυασμό με ακτινοβολία και χημειοθεραπεία, για τη βελτίωση των αντικαρκινικών MB θεραπείες και την ποιότητα του ασθενούς ΖΩΗ. Μέχρι σήμερα, αυτή είναι η πρώτη αναφορά ότι η έκφραση ενός miRNA μπορεί να καταστρέφουν τα βλαστικά κύτταρα του όγκου, υποδεικνύοντας μια ενδιαφέρουσα θεραπευτική προσέγγιση για τη στόχευση αυτών των κυττάρων σε όγκους του εγκεφάλου

Παράθεση:. Garzia L, Andolfo Ι, Cusanelli Ε, Μαρίνος Ν, Petrosino G, De Martino D, et al. (2009) microRNA-199b-5P μειώνει καρκινικά βλαστικά κύτταρα μέσω αρνητική ρύθμιση της HES1 σε Μυελοβλάστωμα. PLoS ONE 4 (3): e4998. doi: 10.1371 /journal.pone.0004998

Επιμέλεια: Μιχαήλ Β Blagosklonny, Ordway Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28 Νοέμβρη, 2008? Αποδεκτές: 23 Φλεβάρη 2009? Δημοσιεύθηκε: 24 Μαρ, 2009

Copyright: © 2009 Garzia et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από αγωγό FP6-ΕΕΤ LSH-CT-2006-037260 (ΜΖ), το 7ο ΠΠ-Tumic ΥΓΕΙΑ-F2-2008-201662 (ΜΖ), Associazione contro la Lotta al Νευροβλάστωμα Italiana «Progetto Pensiero» (AI, ΜΖ), AIRC επιχορήγηση του 2007 (ΜΖ), Progetto AIRC Tumori Pediatrici 2008 (MZ). Associazione Open Νευροβλάστωμα (AI), το Scuola Europea di Medicina Molecolare (SEMM-CEINGE) υποτροφία (ΕΚ), και AIRC-FIRC υποτροφίες (LG, NM). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα microRNAs (miRNAs) είναι μονόκλωνο RNA των ~ 22 νουκλεοτιδίων σε μήκος, και αποτελούν μια νέα κατηγορία των ρυθμιστικών γονιδίων [1]. Στα ζώα, miRNAs έχουν ρυθμιστικές επιδράσεις μέσω της σύνδεσης τους με ατελή συμπληρωματικές χώρους εντός των 3′-αμετάφραστες περιοχές (3’UTRs) των στόχων mRNA τους. Η αλλαγμένη έκφραση πολλών miRNAs παρατηρείται σε διάφορους τύπους όγκου: π.χ. λεμφώματα Β-κυττάρων (συγκεντρωμένα miR-17) [2], [3], τα κακοήθη λεμφώματα (miR-15a, miR-16-1? στόχευση BCL2) [4], όγκους γλοιοβλαστώματος (miR-21up ρύθμιση) [5] , ορθοκολικό νεοπλασία (mIR-143, miR-145 ρυθμισμένα προς τα κάτω) [6], ο καρκίνος του πνεύμονα (mIR-29) [7], και του καρκίνου του μαστού (mIR-10b) [8], με αρκετά περισσότερους τύπους όγκων υπό ανάλυση.

Εδώ, έχουμε επικεντρωθεί στην πιο κοινή των κακοήθων όγκων του εγκεφάλου, μυελοβλαστωμάτων (MBS). ΜΒ φαίνεται να προέρχονται από βλαστικά κύτταρα και από προδρόμους κόκκος νευρώνα στον εξωτερικό στρώμα κόκκων της παρεγκεφαλίδας [9], ή, εναλλακτικά, από πανίσχυρα προδρόμους στην κοιλιακή ζώνη της παρεγκεφαλίδας [10] – [12]. Από κλινική άποψη, η τρέχουσα πολυτροπική θεραπείες περιλαμβάνουν ριζική χειρουργική εκτομή ακολουθούμενη από ακτινοβολία και χημειοθεραπεία. Αν και αυτές οι θεραπείες μπορεί να βελτιώσει το ποσοστό επιβίωσης, ΜΒ παραμένει αθεράπευτο σε περίπου το ένα τρίτο των ασθενών αυτών. Η κύρια αιτία του θανάτου υποτροπής που σχετίζονται με τη διάδοση του όγκου, στο οποίο σημείο τρέχουσες θεραπευτικές επιλογές έχουν μικρή αποτελεσματικότητα [13]. Οι θεραπείες αυτές είναι επίσης τοξικό και μπορεί να οδηγήσει σε μακροχρόνια αναπηρία [14] – [16]. Κατά συνέπεια, υπάρχει ουσιαστική ανάγκη για νέους, αποτελεσματικές, οι θεραπείες χαμηλής τοξικότητας για τα παιδιά με μυελοβλάστωμα.

MB κύτταρα μπορούν επίσης να περιέχουν λειτουργικά σημαντικές υποομάδες κυττάρων με ιδιότητες βλαστικά παρόμοια που είναι μοναδικά σε θέση να διαδώσει την ανάπτυξη του όγκου [17], [18]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι οι δύο προγονικών κυττάρων και βλαστοκυττάρων μπορεί να ανταποκριθεί προς την οδό Sonic-Hedgehog (Shh) και μπορούν να χρησιμεύσουν ως κύτταρα προέλευσης των MBs [19].

δραστικότητα Notch έχει δειχθεί ότι ρυθμίζουν κόκκος κυττάρων προγονικά κύτταρα από τα οποία προκύπτουν ΜΒ, με αριθμούς αντιγράφων του γονιδίου Notch2 αυξήθηκε στο 15% των ΜΒ [12], [20]. Επίμονη έκφραση του

bHLH HES1

, ο κύριος γονίδιο Notch αποκρίνονται, αποτρέπει τόσο την μετανάστευση των νευρικών προγονικών κυττάρων από την κοιλιακή ζώνη και την έκφραση των νευρωνικών δεικτών [21]. Τα ποντίκια που στερούνται

Hes1

δείχνουν πρόωρη νευρογένεση, θεωρούνται ως up-ρύθμιση των νευρικών παράγοντες μεταγραφής bHLH, η οποία οδηγεί σε σημαντικές ανωμαλίες του νευρικού σωλήνα [22]? προγονικά κύτταρα που προέρχονται από αυτά τα ποντίκια έχουν μειωμένη αυτο-ανανέωση δυναμικό, με τη δέσμευση προς την κατεύθυνση μιας νευρωνικής γενεαλογίας [23].

Αξίζει να σημειωθεί ότι η έκφραση της HES1 σε ΜΒ έχει συσχετιστεί με χειρότερη κλινική έκβαση [24]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, μια αλληλεπίδραση με Shh σε κοκκώδη ανάπτυξη πρόδρομων κυττάρων έχει προταθεί [25], όπως έχει cross-talk με άλλες οδούς, π.χ. το γονίδιο ομάδα Polycomb

ΔΜΣ-1

[26].

Η προσέγγισή μας ξεκίνησε με μια αναζήτηση για miRNAs (miRNA μητρώου) με γονίδια-στόχους που εμπλέκονται στο μονοπάτι Notch, και εντοπίσαμε miR199b-5P ως στόχευση HES1, τον τελεστή Notch. Δείχνουμε ότι η έκφραση του miR-199b-5P χάνεται σε μεταστατικούς ασθενείς και αξιώνουν ένα μηχανισμό ρύθμισης παρακάτω επιγενετικών σίγηση μέσω διαδικασιών μεθυλίωσης που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης, προσδιορίζοντας ένα νέο μοριακό δείκτη για μια τάξη φτωχών κινδύνου σε ασθενείς με ΜΒ. MiR199b-5P έκφραση βλάπτει ειδικά τον καρκίνο-βλαστικών κυττάρων (CD133 +) του πληθυσμού, το οποίο οδηγεί

in vivo

στην απομείωση της ανάπτυξης του όγκου MB στο μοντέλο ποντικού παρεγκεφαλίδα ξενομοσχεύματος, παρέχοντας έτσι απόδειξη της έννοιας. Όπως έχουν microRNAs έχει αποδειχθεί πρόσφατα ότι είναι χρήσιμα εργαλεία για να φιμώσουν τους καρκίνους, θα μπορούσαν να είναι σε θέση να καλύψει αυτό το κενό μέσω του ελέγχου τους, των πολλαπλών γονιδίων στόχων. Παρέχουμε εδώ αποδείξεις για τη χρήση των miRNAs στην κλινική, με αντινεοπλασματική θεραπεία μας στόχευση των καρκινικών βλαστικών κυττάρων από miR-199b-5P.

Αποτελέσματα

HSA-miR-199b- 5P σιωπές HES1 έκφρασης μέσω 3’ΙΙΤΡ δεσμευτική

μας

σε-silico

ανάλυση της mirBase στοχεύει βάση δεδομένων [27] κατευθύνθηκε προς την αναγνώριση των miRNAs δυνητικά στοχεύουν HES1, ένα τελεστή του μονοπατιού Notch , ένας θεμελιώδης μηχανισμός στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού MB. MiR-199b-5P και miR-199α-5P ήταν οι καλύτερες miRNAs βαθμολόγησης, και είχαν προβλεφθεί δεσμεύοντας την 3’UTR της ανθρώπινης bHLH HES1. Έχουμε επικεντρώθηκε στην miR-199b-5P χάρη στην ικανότητά του να μειώνει την έκφραση HES1 υπό παροδικές υπερ-έκφραση, σε σύγκριση με miR-199α-5P (Κείμενο S1, Σχ. S1A, Β). MiR-199b-5P χάνεται σε όγκους του πνεύμονα [28] και έχει χαρτογραφηθεί σε μία γονιδιωματική περιοχή διαγράφεται στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης [29]. MiR-199α * (επίσης γνωστή ως miR-199α-5ρ, και με μια πανομοιότυπη αλληλουχία να miR-199b-5P) έχει επίσης μειωθεί σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [30] – [32]. Η ανάλυση της έκφρασης miR-199b-5P σε κυτταρικές γραμμές δύο MB, ανθρώπινο ενήλικο ιστό και την παρεγκεφαλίδα ποντικού, παρουσιάζεται στο κείμενο S1, Σχ. S1c, D και S2A, Β

Για να προσδιορίσετε αν HES1 είναι ο στόχος του miR-199b-5P, ο HES1 3’UTR κλωνοποιήθηκε κατάντι του φορέα γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης? προ-miR-199b-5P επίσης κλωνοποιήθηκε σε ένα φορέα έκφρασης θηλαστικού (βλέπε κείμενο S1). Τα κύτταρα ΗΕΚ-293 στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με τη σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης δείχνουν ότι miR-199b-5P συν-επιμόλυνσης μειωμένη δραστηριότητα του γονιδίου αναφοράς, υποδεικνύοντας έτσι δέσμευση με το 3’UTR και αποσταθεροποίηση των παραγωγικών μετάφραση του mRNA λουσιφεράσης (Κείμενο S1, Σχ. S1E ). Ως έλεγχοι, HES1 3’UTR μεταλλαγμένη στη θέση σύνδεσης miR-199b-5P δεν επηρεάστηκε από miR-199b-5P (Κείμενο S1, Σχ. S1E), και όταν ένα 2-Ο’-μεθυλ ολιγοριβονουκλεοτίδιο (2-ΟΜ) συμπληρωματικά να ωριμάσουν miR-199b-5P συν-επιμολύνθηκε, αυτό εξουδετερώνουν τις επιδράσεις της διαμόλυνσης miR-199b-5ρ, αποκαθιστώντας δραστηριότητα ανταποκριτή (Κείμενο S1, Σχ. S1E). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε ϋΑΟΥ MB κύτταρα (Κείμενο S1, Εικ. S1F).

Για τον προσδιορισμό του ρόλου του miR-199b-5P στην κυτταρική βιολογία MB, το κατασκεύασμα έκφρασης miR-199b-5P μετασκευάστηκε σε ϋΑΟΥ επιλέχθηκαν κύτταρα, και αρκετούς σταθεροί κλώνοι που υπερεκφράζουν miR-199b-5P. Υπερ-έκφραση επιβεβαιώθηκε με PCR πραγματικού χρόνου (Κείμενο S1, Σχ. S1G). Τρεις κλώνοι έδειξαν μειωμένα επίπεδα πρωτεΐνης HES1, ένα εκ των οποίων (199bSC1) δεν έδειξε ανιχνεύσιμη HES1. Οι κλώνοι 199bSC1 και 199bMC1 επιλέχθηκαν για περαιτέρω διερεύνηση (Κείμενο S1, Σχ. S1H). Αυτές οι επιδράσεις της miR-199b-5P επί έκφρασης πρωτεΐνης HES1 δεν περιορίζεται στα σταθερούς κλώνους ή ϋΑΟΥ κυττάρων, όπως D283MED κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με το κατασκεύασμα έκφρασης για miR-199b-5P έδειξε επίσης μειωμένα επίπεδα HES1 (Κείμενο S1, Σχ. S1B ).

για την ενίσχυση αυτών των ευρημάτων, ο κλώνος 199bSC1 ήταν επιμολυσμένα με 2-OM αντίθετης φοράς να miR-199b-5P και χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος (Κείμενο S1, Εικ. S1I). Εδώ, τα επίπεδα HES1 αποκαταστάθηκαν, προτείνοντας μπλοκ 2-OM των HES1 καταστολής από miR-199b-5P, παρέχοντας περαιτέρω επιβεβαίωση ότι οι στόχοι miR-199b-5P HES1 άμεσα. Άλλες δυνητικοί στόχοι του miR-199b-5P ερευνήθηκαν επίσης με αυτόν τον τρόπο (Κείμενο S1, Σχ. S2C, D).

Υπερ-έκφραση του miR-199b-5P μειώνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και παρεμποδίζει την κλωνογόνο δυναμικό της κυτταρικές σειρές MB

Οι κλώνοι 199bSC1 και 199bMC1 είχαν μειωμένους συντελεστές πολλαπλασιασμού υπό κανονικές συνθήκες καλλιέργειας, σε σύγκριση με τον κλώνο ελέγχου. Έτσι, ψάξαμε για δυνητικούς μεταβολές του κυτταρικού κύκλου σε αυτούς τους κλώνους. ανάλυση FACS επί του κλώνου 199bSC1 παρουσίασαν μείωση 31% στα κλάσματα S-φάση, και την αύξηση των κυττάρων σε Ο0-G1 του 15%, σε σύγκριση με τον κενό φορέα κλώνο (Εικ. 1Α). Αυτό πρότεινε ότι έξοδος από τον κυτταρικό κύκλο έχει ένα ρόλο στο μειωμένο συντελεστή πολλαπλασιασμού του κυττάρου ϋΑΟΥ 199bSC1 κλώνο. Αντιθέτως, ο κλώνος 199bMC1 δεν έδειξε σημαντικές αλλαγές στην κυτταρικού κύκλου της. Πιστεύουμε ότι τα ευρήματα αυτά να οφείλεται σε μια συνολική χαμηλότερη αποτελεσματικότητα του 199bMC1 για τη μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης HES1. Αυτοί οι φαινότυποι του κυτταρικού κύκλου μεταφράζεται σε μειωμένα ποσοστά πολλαπλασιασμού

in vitro

, όπως αξιολογήθηκε από

in-vitro

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού σύγκριση των κλώνων 199bSC1 και 199bMC1 με ένα άδειο-φορέα κλώνο και ένα παροδικό επιμόλυνσης για 2-OM σχεδιαστεί κατά miR-199b-5P (Εικ. 1Β). Τόσο η 199bMC1 και οι 1999SC1 κλώνοι έδειξαν σημαντικά μειωμένους συντελεστές πολλαπλασιασμού. Η επιμόλυνση αυτού του αντινοηματικού 2-ΟΜ προκάλεσε μία αξιοσημείωτη αύξηση στον πολλαπλασιασμό του σταθερού κλώνου 199bSC1, σε συμφωνία με την αποκατάσταση των επιπέδων έκφρασης του HES1. Τα αποτελέσματα στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ϋΑΟΥ επιβεβαιώθηκαν επίσης με D283 και ONS76 κύτταρα (Κείμενο S1, Εικ. S2F). Τα αποτελέσματα του miR-199b-ειδικά 2-OM επιβεβαιώθηκαν επίσης σε κύτταρα ϋΑΟΥ άγριου τύπου, όπου ενδεχομένως δρα επί της ενδογενούς miR-199b (Κείμενο S1, Εικ. S2G).

Α) Αντιπροσωπευτική FACS ανάλυση με προπίδιο ιώδιο που δείχνει μια μείωση στα ποσοστά των κυττάρων στη φάση S και την αύξηση της G0-G1 για τη σταθερή 199bSC1 κλώνο. Η απουσία των σημάτων του ώμου με την G0-G1 κόκκινο κορυφή στους κλώνους 199bSC1 και 199bMC1 αποκλείει αποπτωτικών διεργασιών. Β) δοκιμασίες πολλαπλασιασμού από 3-4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ-5-3-καρβοξυμεθοξυφαινυλο-2-4-σουλφοφαινυλ-2Η-τετραζολίου (MTS), που παρουσιάζει μειωμένα ποσοστά πολλαπλασιασμού του σταθερός κλώνος 199bSC1 (κόκκινο τρίγωνα) και ο κλώνος 199bMC1 (πράσινο σταυροί), σε σύγκριση με την σταθερός κλώνος με κενό φορέα μόνο (μπλε διαμάντι). Αυτή η επίδραση του miR-199b-5P υπερ-έκφραση μειώθηκε κατά 2-ΟΜ διαμόλυνση (ροζ τετράγωνα). Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι μέσοι ± SD από δύο ανεξάρτητα πειράματα, κάθε ένα πραγματοποιούνται εις τριπλούν. C) έκφραση Rapresentative mRNA της διαφοροποίησης (π.χ. MASH1, MATH3 και NEUROGENIN 2) και τον πολλαπλασιασμό (π.χ. c-myc, η κυκλίνη D1) δείκτες κατά miR-199b-5P υπερ-έκφραση, όπως αποκαλύπτεται με πραγματικού χρόνου PCR, συγκρίνοντας την σταθερή 199bSC1 και 199bMC1 κλώνοι με άδειο φορέα κλώνο. Δ) Η σταθερή 199bSC1 κλώνος για miR-199b-5P εμφανίζει διαταραχή σχηματισμού αποικιών σε μαλακό άγαρ προσδιορισμούς. Η γραφική παράσταση δείχνει αποικίες καταμετρώνται ως μέσο ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα, κάθε ένα πραγματοποιούνται εις τριπλούν. Ε) Αντιπροσωπευτικά κηλίδα Western χρησιμοποιώντας αντι-ο-Μγο και αντι-κυκλίνης D1 δείχνουν αυτές τις δύο πρωτεΐνες να είναι ρυθμίζεται προς τα κάτω στο σταθερός κλώνος 199bSC1? βλέπε επίσης την πυκνομετρική ανάλυση στο δεξί πλαίσιο. ΣΤ) Όσο για Ε, δείχνει πρωτεΐνες GABRA6 και MATH3 up-ρυθμίζεται μετά miR-199b έκφρασης, γεγονός που υποδηλώνει την επαγωγή της διαφοροποίησης. Αντι-λαμινίνη β αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για ομαλοποιημένη έκφραση πρωτεΐνης πυρηνικής c-Myc και κυκλίνη D1. Αντι-β-ακτίνης αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για να κανονικοποιούνται κυτταροπλασματική GABRA6 και την έκφραση των πρωτεϊνών MATH3.

Η

Τα αποτελέσματα της επαγωγής του miR-199b-5P αξιολογήθηκαν με μοριακούς δείκτες του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης από ένα πραγματικό προσέγγιση χρόνο. Όπως απεικονίζεται στο Σχ. 1C, ΜΑΡ2, η οποία ως επί το πλείστον εκφράζεται σε ώριμους νευρώνες [33], ήταν επάνω ρυθμισμένη στους σταθερούς κλώνους 199bSC1 και 199bMC1. Παρομοίως, τα κύτταρα ΩΑΟΥ έχουν αναφερθεί ότι εκφράζουν GFAP μετά τη διαφοροποίηση με φαινυλοβουτυρικό [34], και το σταθερό κλώνο 199bSC1, τα επίπεδα GFAP αυξήθηκαν. Συνολικά, η εικόνα της γονιδιακής έκφρασης σε σταθερή κυτταρική γραμμή μας υπερεκφράζουν το miR-199b-5P είναι σε συμφωνία με το φαινότυπο που έχει παρατηρηθεί στον εγκέφαλο του

Hes1 – /-

ποντίκι [23]. Μεταξύ των άλλων γονιδίων, GABRA6, δείκτης της παρεγκεφαλίδας διαφοροποίησης κοκκιοκυττάρων, ήταν επίσης σημαντικά υπερ-εκφράζεται στα σταθερών κλώνων (Εικ. 1 C).

Α τελειοποιηθεί καταρράκτη των θετικών και αρνητικών παραγόντων μεταγραφής bHLH είναι κεντρικής σημασίας για νευρογένεση, με γονίδια όπως

MASH1

,

MATH3

και

NGN2

επάγουν τη νευρογένεση, και HES1-μεταλλαγμένα ποντίκια που δείχνει προς τα πάνω ρύθμιση αυτών των bHLHs ενεργοποιητή τύπου [ ,,,0],35]. Αμφότερες miR-199b-5P σταθερών κλώνων έδειξε αυξήσεις στην έκφραση των προ-νευρικών bHLH. Σε συμφωνία με μείωση τους στο ρυθμό πολλαπλασιασμού, οι δείκτες πολλαπλασιασμού c-Myc και κυκλίνη D1 μειώθηκαν. Από τους δύο κλώνους που αναλύθηκαν, 199bSC1 έδειξε την πιο συνεπή φαινότυπο? να εξηγήσουμε αυτά τα αποτελέσματα από την πιο αποδοτική αποσιώπηση HES1 σε αυτόν τον κλώνο.

Από το miR-199b-5P σταθερή 199bSC1 κλώνος έδειξε μια ισχυρότερη και πιο συνεπή φαινότυπο, που εξέτασε την επόμενη σε μια τυποποιημένη δοκιμασία κλωνοποίησης, να καθορίσει αν αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη επηρεάστηκε από miR-199b-5P. Εδώ, υπήρξε μια μείωση κατά 80% του δυναμικού σχηματισμού αποικιών, σε σύγκριση με τον κενό φορέα-κλώνο (Εικ. 1ϋ). Σε συμφωνία με αυτή την μείωση του ρυθμού πολλαπλασιασμού, η δείκτες πολλαπλασιασμού c-Myc και κυκλίνη D1 μειώθηκαν (Εικ. 1 Ε). Επιβεβαιώσαμε επίσης στο επίπεδο της πρωτεΐνης που GABRA6 και MATH3 ήταν επάνω-ρυθμίζονται στο κλώνο 199bSC1 (Σχήμα 1F.)? το τελευταίο είναι γνωστό ότι καταστέλλεται άμεσα από HES1 [35].

MiR-199b-5P εξαντλεί το διαμέρισμα πλευρά πληθυσμού στην κυτταρική σειρά ϋΑΟΥ και αρνητικά ρυθμίζει MB όγκου πληθυσμούς βλαστικών κυττάρων

Η οδός Notch έχει συνδεθεί με το κλάσμα των κυττάρων όγκου ΜΒ που φιλοξενούν πρόδρομος σημειωτές βλαστοκυττάρων [36], και HES1 έχει ένα ρόλο στην αυτο-ανανέωση των πολυδύναμων προγονικών κυττάρων [23]. Αυτή η πλευρά του πληθυσμού (SP) των κυττάρων του όγκου έχει ένα ρόλο στη μοσχεύματος ενός όγκου σε ζωικά μοντέλα [37]. Εξετάσαμε έτσι την επιρροή του miR-199b-5P για τον πληθυσμό των καρκινικών κυττάρων που αποκλείουν την χρωστική Hoechst 33342, μια στρατηγική για τον εντοπισμό αυτών των κυττάρων SP. Αυτό προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής στην κυτταρική σειρά ϋΑΟΥ, το SP των οποίων αντιπροσωπεύει το 4,9% των κυττάρων, σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα με βεραπαμίλη (ο αρνητικός έλεγχος) (Κείμενο S1, Σχ. S3A, Β). Αυτή η θεραπεία βεραπαμίλη βασίστηκε σε βεραπαμίλη αναστολή του ιόντος-αντλίες υπεύθυνες για χρωστική Hoechst 33342 αποκλεισμό, επιτρέποντας έτσι τα κύτταρα SP για να δει [38]. Χρώση των κυττάρων 199bSC1 και 199bMC1 ανέφερε ότι το SP είχε αφαιρεθεί, καθώς υπήρχαν κοντά σε διαφορές μεταξύ της Hoechst επεξεργασμένο δείγμα και η Hoechst συν δείγματα βεραπαμίλη (Κείμενο S1, Σχ. S3C-F).

είναι επίσης γνωστό ότι στο κεντρικό νευρικό σύστημα βλαστικά καρκινικά κύτταρα εκφράζουν το αντιγόνο CD133, και ότι αυτά τα κύτταρα είναι μοναδικά ικανά σχηματισμού όγκων σε NOD-SCID [18], [39]. Επιπροσθέτως, η οδός Notch έχει έναν κεντρικό ρόλο στην αυτο-ανανέωση διαδικασία, με την αναστολή του οδηγεί σε εξάντληση των κυττάρων CD133-θετικό (CD133 +) ϋΑΟΥ μέσω επαγωγής απόπτωσης των προγονικών κυττάρων που μοιάζουν [36]. Πρόσφατα δείχθηκε ότι τα κύτταρα CD133 + ϋΑΟΥ την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου στο πλευρό γυμνών ποντικών, ενώ CD133- κύτταρα δεν [40]. Για τους λόγους αυτούς, αξιολογήσαμε την θετικότητα CD133 κυττάρων ϋΑΟΥ σε σύγκριση με τα σταθερά 199bSC1 και 199bMC1 κλώνοι (Σχ. 2). Εδώ, τα κύτταρα άγριου τύπου ήταν 14,8% CD133 +, ενώ στους σταθερούς κλώνους 199bSC1 και 199bMC1 αυτό μειώθηκε σε 2,4% και 6,5% CD133 +, αντίστοιχα (Σχ. 2C-F). Αυτό κατέδειξε έτσι ένα ρόλο για το miR-199b-5P στην αρνητική ρύθμιση αυτού του κλάσματος των κυττάρων του όγκου-κίνηση.

Α-F) Εκπρόσωπος FACS αναλύσεις της σταθερής 199bSC1 (D) και 199bMC1 (F) κλώνους έδειξε μια μείωση στο ποσοστό των κυττάρων που ήταν θετικά για το δείκτη βλαστικών κυττάρων CD133 (Β)? Α, C και Ε είναι αρνητικοί μάρτυρες (χωρίς αντίσωμα).

Η

HES1 υπερέκφραση διασώζει τον κλώνο miR-199b-5P φαινότυπο

Για να επιβεβαιώσετε ότι ο κυτταρικός φαινότυπος συσχετίζεται άμεσα με προς τα κάτω ρύθμιση των HES1, πραγματοποιήσαμε

in vitro

πειράματα κύτταρο-διάσωσης. Εμείς επιλέξαμε να σώσει την πιο συνεπή φαινότυπο, φαίνεται από το σταθερό κλώνο 199bSC1. Όταν πλήρους μήκους HES1 cDNA κλωνοποιήθηκε και επιμολύνθηκε σε σταθερή ϋΑΟΥ-κυττάρου 199bSC1 κλώνος, έκφραση HES1 αποκαταστάθηκε, όπως εκτιμήθηκαν από ανοσοαποτύπωση (Εικ. 3Α). Σημειώσαμε επίσης την εκ νέου έκφραση της κυκλίνης D1, η οποία κάτω-ρυθμίζονται στο σταθερό κλώνο 199bSC1. Αναπαλαιωμένη έκφραση HES1 αντιστρέφεται επίσης τα αποτελέσματα της miR-199b-5P επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχ. 3Β). Την ίδια στιγμή, η επιμόλυνση HES1 cDNA στο κλώνο 199bSC1 μειωμένη επαγωγή του προ-νευρικών bHLHs και δείκτες διαφοροποίησης, και αυξημένα επίπεδα γονιδίων πολλαπλασιασμού (Σχ. 3C). Επιπλέον, η παροδική διαμόλυνση HES1 cDNA στο σταθερός κλώνος 199bSC1 οδήγησε σε αύξηση του ποσοστού των κυττάρων σε φάση S, και αφαίρεση του μπλοκ για την φάση G0-G1 (Σχ. 3D). Αυτό ήταν αντίθετο με τις επιδράσεις που παρατηρήθηκαν στο σταθερό κλώνο 199bSC1 υπερεκφράζουν το miR-199b-5P (βλ. Σχήμα 1C και Εικ. 3C). Οι επιδράσεις της αποκατασταθεί έκφραση του HES1 για την SP της σταθερός κλώνος 199bSC1 αξιολογήθηκαν επίσης. Όταν τα HES1 επιμολυσμένα κύτταρα (GFP θετικά) αξιολογήθηκαν για την ικανότητά τους να αποκλείουν Hoechst χρωστική, παρουσίασαν μια ελάχιστη αύξηση στην SP, μέχρι 1,3%. Αν και υψηλότερη από εκείνη που μετράται για τους σταθερούς κλώνους 199b (Σχ. 3Ε-Η), αυτό ήταν ακόμη κάτω από το επίπεδο των κυττάρων SP για τα κύτταρα άγριου τύπου (Κείμενο S1, Σχ. S3). Αυτό πιθανώς οφείλεται στο μικρό χρονικό διάστημα της επανέκφραση του HES1 μετά από παροδική επιμόλυνση, η οποία μπορεί να μην είναι αρκετή για να επιτρέψει την πλήρη διάσωση φαινότυπο. Στη συνέχεια προσπάθησε να διασώσει τις επιπτώσεις στο διαμέρισμα CD133? Ωστόσο, η παροδική διαμόλυνση HES1 στον κλώνο 199bSC1 δεν οδήγησε σε σημαντική αύξηση του CD133 + κύτταρα. Πιστεύουμε ότι αυτό οφείλεται στην σύντομη μεταβατική χρόνο επιμόλυνση, η οποία δεν επιτρέπει την αναδιοργάνωση της ιεραρχίας των κυττάρων ΩΑΟΥ.

Α) Εκπρόσωπος κηλίδος Western και πυκνομετρική ανάλυση δείχνει ότι η διάσωση της έκφρασης HES1 από υπερ- έκφραση του cDNA HES1 στο στάβλο 199bSC1 κλώνο αποκαθιστά την έκφραση της κυκλίνης D1. Β) Δοκιμασία πολλαπλασιασμού με 3-4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ-5-3-καρβοξυμεθοξυφαινυλο-2-4-σουλφοφαινυλ-2Η-τετραζολίου (MTS) που δεικνύει αυξημένο ρυθμό πολλαπλασιασμού του σταθερού 199bSC1 κλώνος με έκφραση HES1 (σκούρο μπλε τετράγωνα), σε σύγκριση με μόνη τη σταθερή κλώνο 199bSC1 (γαλάζιο διαμάντια). Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι μέσοι ± SD από δύο ανεξάρτητα πειράματα, κάθε ένα πραγματοποιούνται εις τριπλούν. C) έκφραση Rapresentative mRNA της διαφοροποίησης (π.χ. MASH1, MATH3 και NEUROGENIN 2) και τον πολλαπλασιασμό (π.χ. c-myc, η κυκλίνη D1) δείκτες κατά την κυτταρική-διάσωσης με HES1 στο στάβλο 199bSC1 κλώνου, σε σύγκριση με τα κύτταρα άγριου τύπου, όπως αποκαλύπτεται από PCR πραγματικού χρόνου. Η έκφραση του Gabra 6 και ΜΑΡ2 είναι ρυθμισμένα προς τα κάτω στο πείραμα διάσωσης. Δ) Ανάλυση FACS Αντιπρόσωπος της HES1 εκφράζουν σταθερός κλώνος 199bSC1 δείχνει αύξηση στο κλάσμα των κυττάρων στη φάση S, και μια μείωση στην G1, σε σχέση με μόνη την σταθερός κλώνος 199bSC1. E-H) Η επίδραση της έκφρασης miR-199b-5P για την SP κυττάρων ϋΑΟΥ αντιστρέφεται από HES1 επανέκφραση. 199bSC1 σταθερός κλώνος επιμολύνθηκε με HES1 cDNA και ένα πλασμίδιο GFP-κωδικοποιητική, στη συνέχεια κατεργάζεται μετά από 48 ώρες με τη Hoechst και βεραπαμίλη (Ε-Ρ) ή Hoechst μόνο (G-Η) και αναλύθηκαν με FACS. Τα ΟΡΡ-θετικά κύτταρα (Ρ5 πύλη), πάνελ Ε και G, αναλύθηκαν για την παρουσία της χρωστικής ουσίας-εξαιρουμένων-κυττάρων (F-Η, P6 πύλη). Τα αρνητικά κύτταρα μη επιμολυσμένα GFP (P3 πύλη), δεν analised.

Η

Η ανάπτυξη του όγκου μειώνεται σε ξενομοσχεύματα που προέρχονται από το σταθερό 199SC1 κλώνο

Τα ευρήματα εδώ έδειξαν ότι το miR-199b- 5p είναι ένας πιθανός αναστολέας του σχηματισμού όγκου. Επομένως, για να ερευνηθεί ο ρόλος του miR-199b-5P σε

in vivo

μοντέλο όγκου, έχουμε σταθεροποιηθεί το 199bSC1 και τον έλεγχο ϋΑΟΥ κλώνοι με έναν φορέα έκφρασης που φέρει cDNA λουσιφεράσης. Οι κλώνοι που ελήφθησαν δοκιμάστηκαν για λουσιφεράση επίπεδα έκφρασης και επίσης επικυρωθεί για συγκράτηση του γονικού φαινότυπο, όσον αφορά τόσο HES1 και έκφραση miR-199b-5P (βλέπε κείμενο S1, Σχ. S4A-D). Αυτά τα σταθερά 199b-Luc1 και CTL-Luc-4 ϋΑΟΥ κλώνοι μετά ενίονται στην αριστερή και δεξιά πλευρές, αντίστοιχα, του πέντε αθυμικών γυμνών /γυμνούς ποντικούς. Η ανάπτυξη του όγκου αξιολογήθηκε με εβδομαδιαία

in-vivo

βιοφωταύγειας απεικόνισης (BLI) του ενεμένους ποντικούς. Στις οκτώ εβδομάδες, όλα τα ποντίκια παρουσίασαν ορατή μάζες σε κάθε πλευρά ελέγχου, ενώ μόνο τρεις πλευρές ένεση με 199b-Luc1 έδειξε μοσχεύματος όγκου. Συνολικά, μια σημαντική διαφορά στον όγκο του όγκου μεταξύ πλευρές ελέγχου και λαγόνες miR-199b-5P παρατηρήθηκε (Σχ. 4Α). Οι μετρήσεις βιοφωταύγεια έδειξαν σημαντικές μειώσεις των εκπομπών για τις πλευρές miR-199b-5P κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου, σε σύγκριση με τις πλευρές ελέγχου (π.χ. ποντίκι # 4, Σχ. 4Β). Μετά από εννέα εβδομάδες τέσσερις από τις πέντε ποντικούς έδειξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές σε αυτά τα σήματα βιοφωταύγεια μεταξύ των πλευρών ελέγχου και μετρητή miR-199b-5P πλευρές (Σχ. 4C). Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι το miR-199b-5P μπορεί να επηρεάσει το σχηματισμό όγκων

in vivo

σε αθυμικά γυμνά /γυμνά ποντίκια. Οι όγκοι ξενομοσχεύματος από ποντικό # 5 και # 4 ποντικού αφαιρέθηκαν και αναλύθηκαν για miR-199b-5P και έκφραση HES1 και αξιολογείται ιστοπαθολογικά (Κείμενο S1, Σχ. S4E-Η).

Α) πείραμα Ξενομοσχεύματος πάνω από εννέα εβδομάδες, μετά από sc έγχυση πέντε ποντίκια με κύτταρα ϋΑΟΥ ελέγχου (CTR πλευρά) και τα κύτταρα ϋΑΟΥ υπερεκφράζουν το miR-199b-5P (199b πλευρά). Με κύτταρα CTR, οι όγκοι ήταν ανιχνεύσιμα μακροσκοπικά σε 5/5 ποντίκια? με υπερ-εκφράζοντα κύτταρα, σε 3/5 ποντίκια. Συνολικός όγκος του όγκου διαφορά μεταξύ του CTR και 199b εγχύεται πλευρές μετά από εννέα εβδομάδες ανάπτυξης ήταν στατιστικά σημαντική, όπως υποδεικνύεται (μέσο ± SD). Β) εκπομπή φωτονίων από ποντίκι # 4 μετά από εννέα εβδομάδες ανάπτυξης του όγκου. Η 199b πλευρά (199bLuc-1) είχε ένα σταθερά χαμηλότερες εκπομπής φωτονίων από την πλευρά ελέγχου (CTL-Luc-4). Οι συγκρίσεις των διαστάσεων του όγκου φαίνονται επίσης. Γ) Όταν εκπομπής φωτονίων (βλέπε Β) μετατράπηκε σε αριθμό κυττάρων? ένα από τα πέντε ποντίκια δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές (μέσο ± SD) (δύο ουρά unpaired

t

τεστ). Δ) εκπομπή φωτονίων από 3 ποντίκια με ένεση στην τέταρτη κοιλία με αντίστοιχα: 199bLuc-1, τα CTL Luc-4 που έχουν μολυνθεί με κοροϊδεύει AdV5, και CTL-Luc-4 που έχουν μολυνθεί με miR-199b-5P AdV5. Ε) ολόκληρο τον εγκέφαλο του ζώου και θέση της ένεσης (λευκό βέλος). χρώση αιματοξυλίνης /ηωσίνης παρεγκεφαλίδας? μαύρο βέλος, χώρο για την έναρξη της ογκογένεσης. ΣΤ) BLI του εγχέονται ποντικούς όπως για D, μετά από ένα μήνα από την ανάπτυξη του όγκου. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων είναι στατιστικά σημαντικές. Ζ) BLI των δύο επιλεγμένων ποντίκια δείχνει την ανάπτυξη της επιβάρυνσης του όγκου με το CTL luc4-AdV5-Mock # 7, και τη μείωση με το CTL luc4-AdV5-199b # 3 πάροδο του χρόνου (0-8 εβδομάδες). H) χρώση με αιματοξυλίνη-ηωσίνη της παρεγκεφαλίδας από AdV5-Mock # 2 και AdV5-199b # 3 ζώα σε 10 εβδομάδες μετά την ορθοτοπική ένεση, δείχνοντας όγκους κύτταρα που περιβάλλουν εξωτερικό στρώμα κόκκων και εντός της IV κοιλίας (λευκό αστέρι). Σε μπλε, χρώση DAPY, μαζί με την ανίχνευση GFP. Μεγέθυνση όπως υποδεικνύεται.

Η

Για να διερευνήσει περαιτέρω την ικανότητα του miR-199b-5P για τη ρύθμιση MB ανάπτυξη, με ένεση το 199bSC1 σταθερό κλώνο ορθοτοπικώς στην τέταρτη κοιλία άτριχων ποντικών 5 εβδομάδων (Εικ . 4D, E). Μετά από τέσσερις εβδομάδες

in vivo

μη επεμβατική ανάπτυξη όγκου με την παρακολούθηση BLI, σε ποντικούς που έχουν εγχυθεί με το 199bSC1 κλωνοποιηθεί η ανάπτυξη του όγκου ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη που παρατηρήθηκε στον έλεγχο (CTL) β-κύτταρα-εγχυθεί πλευρά. Ως περαιτέρω επιβεβαίωση αυτών των αποτελεσμάτων, έχουμε ένεση και τα κύτταρα CTL μολυσμένα με αδενοϊό που κωδικοποιεί για miR-199b-5P: σε συμφωνία με τα προηγούμενα ευρήματα, αυτά τα ποντίκια και έδειξαν μειωμένη BLI μετά από 4 εβδομάδες (Σχήμα 4F.). Οι περαιτέρω εξαγορές BLI μετά από 8 εβδομάδες από την εμφύτευση των κυττάρων φαίνεται στο Σχήμα 4G. Προς το παρόν, δύο ποντικοί θανατώθηκαν και αναλύθηκαν περαιτέρω για ιστοπαθολογία. χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνη των κατεψυγμένων ιστών έδειξε μάζα όγκου στην παρεγκεφαλίδα του AdV5-Mock # 2 και # 3 AdV5-199b εγχέεται ζώα. Serial παράλληλες κατεψυγμένες ιστολογικές τομές εξετάστηκαν με μικροσκοπία φθορισμού για ενδογενή πρωτεΐνη πράσινου φθορισμού (GFP) που εκφράζεται από κύτταρα μολυσμένων με αδενοϊό. Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε έκφραση πρωτεΐνης HES1 με χρώση ανοσοϊστοχημείας άλλων ιστών εγκλεισμένων σε παραφίνη, χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αντι-HES1. Συνολικά, αξιολογήθηκαν τα επίπεδα επιμονής της έκφρασης αδενοϊού σε μολυσμένα κύτταρα, καθώς η προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης HES1 λόγω miR199b μεταφέρουν την έκφραση αδενοϊού, ακολουθώντας έτσι την ανάπτυξη του όγκου συναρτήσει του χρόνου με BLI βλέπε Σχήμα 4G-Η, και αντισώματα χρώση Σχήμα S4L -Μ (Hes1, Ki67, Gabra6, νεστίνη, Μαθηματικά-3, δείτε λεπτομέρειες στο κείμενο πληροφορίες S1). Στη συνέχεια, δύο πρόσθετες γυμνά ποντίκια (AdV5-Mock # 7? AdV5-199b # 5) υποβλήθηκαν σε PET-CT μελέτες στις 12 εβδομάδες μετά την ένεση, για να αξιολογηθεί όγκου πολλαπλασιαστική δραστικότητα (Εικ. 5Α, Β). Πρόσθετα στοιχεία BLI μαζί με δύο ταινίες (ταινία S1 και S2 Movie) που δείχνει την 3D ανακατασκευή του ορθοτοπική μεταμόσχευση περιγράφονται στο κείμενο πληροφοριών S1 και έδειξε στο σχήμα S6. Οι αναλύσεις αυτές έδειξαν σημαντική μείωση της μάζας του όγκου στο AdV5-199b # 5 ζώο, σε σύγκριση με τα AdV5-Mock ποντίκια # 7 ελέγχου, με PET-CT αναλύσεις παρέχουν επίσης οι όγκοι του όγκου (0,024 cm

3 έναντι 0,044 cm

3, αντίστοιχα), όπως περιγράφεται στο S1 κειμένου. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν την ευεργετική επίδραση της υπερέκφρασης του miR199b-5ρ, ως αρνητικός ρυθμιστής της ανάπτυξης του όγκου του ΜΒ κυττάρων σε αυτό το ορθοτοπικό μοντέλο ξενομοσχεύματος γυμνού ποντικού.

PET-CT εικόνες σύντηξη AdV5- mock # 7 (Α) και AdV5-199b # 5 (Β) ποντίκια στις 12 εβδομάδες από τη χειρουργική επέμβαση και η έγχυση, με απόδοση 3D όγκο και ταυτόχρονη απεικόνιση των περιοχών της πρόσληψης FLT (μπλε-πράσινο, λευκό βέλη). Μια ευρύτερη ελάττωμα των οστών στο τμήμα occipito-βρεγματικό του κρανίου είναι εμφανής στην AdV5-Mock # 7 του ποντικιού. Παρακάτω:. Πίνακα μετρήσεων (cm

3) του όγκου μάζας γίνεται με PET-CT απόκτηση (όπως περιγράφεται στο κείμενο S1)

Η

Η έκφραση του miR-199b-5P σε ανθρώπινους όγκους μυελοβλάστωμα

για να προσδιορίσετε αν το miR-199b-5P αποτελεσματικά εκφράζεται σε υγιείς ανθρώπους παιδιατρική παρεγκεφαλίδα, χρησιμοποιήσαμε 13 δείγματα ελέγχου που λαμβάνονται από το NICHD Εγκέφαλος και ιστών Τράπεζα Αναπτυξιακές Διαταραχές, στο Πανεπιστήμιο του Maryland, USA. Μετρήσαμε την έκφραση του miR-199b-5P, συγκρίνοντας πέντε παρεγκεφαλίδα δείγματα που λαμβάνονται 0-1-year-old παιδιά με έξι 13-16-year-old παιδιά (Σχ. 6Α). MiR-199b-5P έδειξαν μεγαλύτερη έκφραση στα μοσχεύματα από τους νεότερους υγιείς μάρτυρες (Mann-Whitney test,

P

= 0,006).

Α) Box-οικόπεδο επίπεδα έκφρασης του ΜΙΚ 199b-5P σε υγιείς ανθρώπους παρεγκεφαλίδα και στις δύο ηλικιακές ομάδες ενδείκνυται. MiR-199b-5P έδειξε υψηλότερη έκφραση σε μοσχεύματα από νεότερους ελέγχους (τεστ Mann-Whitney,

P

= 0,006). Β) MiR-199b-5P εξαιρετικά εκφράζουν τις περιπτώσεις είναι ως επί το πλείστον M0

P

= 0.001 (Pearson Chi-Square test). εκτιμήσεις C) κατά Kaplan-Meier επιβίωσης συγκρίνοντας ασθενείς με χαμηλή

έναντι

υψηλή (σε σχέση με διάμεση τιμή) επίπεδα έκφρασης miR-199b-5P (45 ασθενείς με διαθέσιμα δεδομένα παρακολούθησης). Δ) έκφραση MiR-199b-5P με πραγματικού χρόνου PCR σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών πέντε MB χωρίς θεραπεία ή θεραπεία με 5-Αζα-C (DAC – /+)? Όπως φαίνεται στο Σχ.