Αφηρημένο

Akt /πρωτεϊνική κινάση Β είναι ένα καίριο συστατικό κατάντη της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) μονοπατιού, η δραστηριότητα του οποίου ρυθμίζει την ισορροπία μεταξύ κυτταρική επιβίωση και απόπτωση. Η φωσφορυλίωση της Akt συμβαίνει σε δύο βασικές θέσεις είτε στο χώρο Thr308 στον βρόχο ενεργοποίησης ή στη θέση Ser473 στην υδρόφοβη μοτίβο. Η φωσφορυλιωμένη μορφή της Akt (pAkt) ενεργοποιείται για να προάγουν επιβίωση κυττάρου. Οι μηχανισμοί της pAkt αποφωσφορυλίωσης και πώς η μεταγωγής σήματος της Akt μονοπατιού τερματίζεται είναι ακόμη σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Σε αυτή τη μελέτη, εντοπίσαμε μια CSTP1 νέα πρωτεΐνη φωσφατάση (πλήρης s μετενεργοποίησε πρωτεΐνη 1), το οποίο αλληλεπιδρά και αποφωσφορυλιώνει Akt ειδικά σε Ser473 ιστοσελίδα

in vivo

και

in vitro

, μπλοκ κυτταρικό κύκλο εξέλιξης και προωθεί την κυτταρική απόπτωση. Οι επιδράσεις της CSTP1 στην επιβίωση των κυττάρων και του κυτταρικού κύκλου καταργήθηκαν με εξάντληση της περιοχής φωσφατάσης του CSTP1 ή με έκφραση ενός ιδιοσυστατικά ενεργή μορφή της Akt (S473D), γεγονός που υποδηλώνει Ser473 θέση της Akt ως πρωταρχικό κυτταρικό στόχο του CSTP1. ανάλυση προφίλ έκφρασης έδειξε ότι η έκφραση CSTP1 επιλεκτικά κάτω-ρυθμίζονται σε μη επεμβατικές ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης και η υπερ-έκφραση του CSTP1 κατέστειλε το μέγεθος των όγκων σε γυμνά ποντίκια. Kaplan-Meier καμπύλες έδειξε ότι μειώθηκε η έκφραση της CSTP1 ενοχοποιείται σημαντικά μειωμένη επιβίωση χωρίς υποτροπή σε ασθενείς που έπασχαν από μη διηθητικού καρκίνου της ουροδόχου κύστης

Παράθεση:. Zhuo DX, Zhang XW, Jin Β, Zhang Ζ, Xie BS, Wu CL, et al. (2013) CSTP1, μια νέα πρωτεΐνη φωσφατάση, Μπλοκ του κυτταρικού κύκλου, Προωθεί την κυτταρική απόπτωση, και καταστέλλει την ανάπτυξη όγκων καρκίνου της ουροδόχου κύστης από Άμεσα αποφωσφορυλιωτικό Akt στην Ser473 ιστοσελίδας. PLoS ONE 8 (6): e65679. doi: 10.1371 /journal.pone.0065679

Επιμέλεια: Ferenc Gallyas, Πανεπιστήμιο του Πετς Ιατρική Σχολή, την Ουγγαρία

Ελήφθη: ενδέκατης Δεκεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 17 Απριλίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 17, Ιουνίου 2013

Copyright: © 2013 Zhuo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών της Κίνας παρέχει 81272827 και 30971627. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δήλωσε ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι η δεύτερη πιο συχνή κακοήθεια στο ουροποιητικό σύστημα, με 350.000 νέα κρούσματα και πάνω από 145.000 θανάτους κάθε χρόνο σε όλο τον κόσμο [1]. Επειδή μακροπρόθεσμες παρακολουθήσεις των ασθενών είναι απαραίτητη, μαζί με τις ενδεχόμενες υποτροπές του όγκου και άλλες επιπλοκές, θεραπείες των καρκίνων της ουροδόχου κύστης συνήθως κοστίζουν πολλά χρήματα. Σύμφωνα με τις διαφορές στην κλινική εξέλιξη, προφίλ παθολογία και μοριακή αλλοίωση, οι καρκίνοι της ουροδόχου κύστης ταξινομούνται σε δύο τύπους καρκινωμάτων: η μη επεμβατική μυς επιφανειακή, θηλώδες καρκίνωμα και τα μυϊκά διηθητικά καρκινώματα [2]. Η μη επεμβατική μυών επιφανειακή, θηλώδες καρκίνωμα είναι συνήθως χαμηλή απειλητικές για τη ζωή, αλλά με υψηλές συχνότητες και υψηλή υποτροπές, ενώ ο μυς διηθητικά καρκινώματα συχνά προκαλούν μακρινή μετάσταση και γρήγορη θανάτων [3].

οδών πολλαπλών σημάτων είναι εμπλακεί στην έναρξη και την εξέλιξη των καρκίνων της ουροδόχου κύστης, συμπεριλαμβανομένων μεταλλάξεων στην ΡΙ3Κ /Akt και Ras /ΜΑΡΚ ογκογόνο μονοπάτι τρόπος στοιχεία και αλλαγές στα καταστολείς των όγκων, όπως το ρ53 και Rb. Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι οι μεταβολές σε αυτά τα συστατικά οδού όχι μόνο συνδέονται με την έναρξη των καρκίνων της ουροδόχου κύστης, αλλά και συσχετίζεται έντονα με υποτροπή της νόσου, την εξέλιξη και την επιβίωση. Για παράδειγμα, η απολαβή των μεταλλάξεων λειτουργίας του Ras, FGFR3, PIK3CA συχνά εμπλέκονται στην μη-μυϊκή επεμβατική επιφανειακή, θηλώδες καρκίνωμα, ενώ απώλεια μεταβολών λειτουργίας του ρ53 και Rb γονίδια απαντώνται συχνότερα σε επιθετικές, μυϊκή διηθητικά καρκινώματα [4] -. [6]

Ο φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ3Κ) μονοπατιού ρυθμίζει την ισορροπία μεταξύ κυτταρικής επιβίωσης και της απόπτωσης, και αυτή η ισορροπία διαταράσσεται συχνά σε πολλούς τύπους ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων των ανθρωπίνων urothelial καρκίνους της ουροδόχου κύστης [2 ]. Akt είναι ένα κεντρικό προς τα κάτω συνιστώσα της οδού ΡΙ3Κ, το οποίο μπορεί να ενεργοποιηθεί με διαδοχική φωσφορυλίωση σε δύο θέσεις συντηρημένες στην οικογένεια κινασών AGC [7]. Για παράδειγμα, ένα ανάντη κινάση PDK-1 μπορεί να φωσφορυλιώσει την περιοχή Thr308 στον βρόχο ενεργοποίησης του Akt1 [8], [9], η οποία πυροδοτεί την αυτοφωσφορυλίωση του Akt1 στο C-τερματικό της Ser473 [10], και έτσι ενεργοποιεί πλήρως Akt1. σηματοδότηση Akt μπορεί να τερματιστεί με δύο μηχανισμούς: απομάκρυνση της δραστικής λιπιδίων δεύτερου αγγελιοφόρου που καταλύεται από το λιπίδιο φωσφατάση ΡΤΕΝ (φωσφατάση και tensin ομόλογο διαγράφονται στο χρωμόσωμα δέκα) [11], και αποφωσφορυλίωση της ενεργοποιημένης Akt. Akt μπορεί επίσης να αποφωσφορυλιωθεί άμεσα από τους φωσφατάσες ΡΡ2Α τύπου [12] ή άλλες φωσφατάσες πρωτεΐνης όπως PHLPP1 (PH περιοχή πλούσια σε λευκίνη επανάληψης πρωτεϊνική φωσφατάση 1) και PHLPP2 [13], [14].

Εδώ , αναφέραμε μία πρωτότυπη πρωτεΐνη φωσφατάση, που ονομάζεται το πλήρες s μετενεργοποίησε πρωτεΐνη 1 (CSTP1) [15], του οποίου η έκφραση επιλεκτικά μειωμένη σε μη μυϊκό καρκίνους επεμβατική κύστης. Για να κάνετε μια περαιτέρω κατανοήσουν τη σημασία της CSTP1 στην καρκινογένεση της ουροδόχου κύστης, σε αυτή τη μελέτη, θα πάμε βαθιά γνώση i. οι επιδράσεις των CSTP1 επί καρκίνου της ουροδόχου κύστης του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση και σχηματισμό όγκων in vivo και τις υπογραμμισμένες μοριακών μηχανισμών? ii. οι μοριακοί μηχανισμοί μέσω των οποίων CSTP1 ασκεί τη βιολογική του λειτουργία? iii. η σημασία της μειωμένης έκφρασης της CSTP1 για την επανάληψη και την πρόγνωση των μη διηθητικού καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από τις επιτροπές δεοντολογίας του Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Πρώτη Νοσοκομείο (Αριθμός άδειας: 2008 [96]), και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε θέμα. Όλα τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου του Επιστημονικού Κέντρου Υγείας του Πανεπιστημίου του Πεκίνου. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα του Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Πρώτη Νοσοκομείο (Αριθμός Άδειας: J201112).

Ασθενείς

Ογδόντα έξι ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης που είχαν πρόσφατα διαγνωστεί στο Ινστιτούτο Ουρολογίας, Πανεπιστήμιο του Πεκίνου είχαν εγγραφεί στη μελέτη αυτή. Μεταξύ αυτών, 62 περιπτώσεις είχαν μη-διηθητικού καρκίνου της ουροδόχου κύστης και υποβλήθηκε στα όργανα-συντήρηση μετά διουρηθρική εκτομή των όγκων της ουροδόχου κύστης (TURBT). Το μέσο ηλικία (± SD) των 62 ασθενών ήταν 65,3 ± 11,5 χρόνια παλιά (40 άνδρες και 22 γυναίκες).

Cell Culture

RT4, SV-HUC1, EJ, και τα κύτταρα Τ24 καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. HeLa και 293Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS και 100 U /ml πενικιλίνη. κύτταρα Sf9 διατηρήθηκαν σε μέσο SF-900 II SF που περιέχει πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη σε τελική συγκέντρωση (50 μονάδες /ml πενικιλλίνη, 50 μg /ml στρεπτομυκίνη) στους 27 oC.

Real Time PCR

Ολικό RNA εκχυλίστηκε με χρήση αντιδραστηρίου ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η πρώτη έλικα cDNA συνετέθη χρησιμοποιώντας SuperScript TMIII κιτ πρώτου κλώνου (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Οι CSTP1_RT και GAPDH_RT εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη δίνονται στον Πίνακα 1. Η διαφορά στην έκφραση του mRNA CSTP1 υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2-ΔCt περιγράφεται από Schmittgen [16].

Η

Πείραμα Animal

Έξι έως 8 εβδομάδων θηλυκών γυμνών ποντικών με φόντο BALB /c αγοράσθηκαν από το Πανεπιστήμιο του Πεκίνου. Το 5 χ 106 κυττάρων EJ που υπερεκφράζουν CSTP1 ή CSTP1 ΔPP2Ac και κύτταρα μάρτυρες εγχύθηκαν υποδορίως σε ποντικούς. Το μέγεθος των όγκων μετρήθηκε μία φορά την εβδομάδα με ένα παχύμετρο, και οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον τύπο π /6 χ Μήκος χ πλάτος2. Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει το μέσο ± S.D. για διαφορετικές μετρήσεις των ζώων (η = 6).

Παρασκευή αντισωμάτων

Anti-CSTP1 πολυκλωνικό αντίσωμα παρασκευάστηκε με ανοσοποίηση κουνελιού με το πεπτίδιο 20-μερές, IDEDDDYYFNLSKSTRKKLA και αντιορός καθαρίστηκε με χρωματογραφία συγγένειας .

Κατασκευή πλασμιδίου

Η περιοχή κωδικοποίησης του CSTP1 ελήφθη από cDNA φυσιολογικά ενδοθηλιακά κύστη χρησιμοποιώντας εκκινητές CSTP1_MYC_F και CSTP1_MYC_R, και κλωνοποιήθηκε εντός του myc pcDNA3.1 /φορέα C του για να δημιουργήσει ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pcDNA3 0.1 myc /C -CSTP1 του. Όλες οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη δίνονται στον Πίνακα 1. Για να δημιουργήσετε κατασκεύασμα σύντηξης GFP, ολόκληρη η περιοχή κωδικοποίησης του CSTP1 ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές CSTP1_GFP_F και CSTP1_GFP_R, και υποκλωνοποιήθηκε στον φορέα έκφρασης pEGFP-N1, όπως ρΕΟΡΡ-CSTP1. Η lentivirus πλασμίδιο έκφρασης pZsG-CSTP1 κατασκευάστηκε μέσα από την εισαγωγή του προϊόντος της PCR ενισχύεται από CSTP1_ZsG_F και CSTP1_ZsG_R σε pZsG πλασμίδιο. pZsG-CSTP1 ΔPP2Ac λήφθηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές CSTP1ΔPP2Ac_F και CSTP1ΔPP2Ac_R και τα προϊόντα συνδέθηκαν και πάλι χρησιμοποιώντας Τ4 DNA λιγάση. Η περιοχή κωδικοποίησης του Akt1 ενισχύθηκε με εκκινητές Akt_Tag_F και Akt_Tag_R και κλωνοποιήθηκε σε ρΟΜν Tag-2Β πλασμίδιο. Για την κατασκευή του μεταλλαγμένου phosphomimetic Akt (S473D), άγριου τύπου Akt1 κλωνοποιήθηκε πρώτα σε pZsG πλασμιδίου με χρήση του PCR (εκκινητές Akt_ZsG_F και Akt_ZsG_R δίδονται στον Πίνακα 1). Σημείο μετάλλαξη στο Akt1 (Ser473) που μετατρέπει Ser σε Asp παρήχθη χρησιμοποιώντας την κατευθυνόμενη σε θέση κιτ μεταλλαξογένεσης QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA, USA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή με τους ακόλουθους εκκινητές (Akt_Mut_F και Akt_Mut_R, Πίνακας 1). Για βακτηριακή έκφραση του CSTP1 πρωτεΐνης, CSTP1 cDNA κλωνοποιήθηκε σε φορέα ρΕΤ-42α με εκκινητές (CSTP1_pET_F και CSTP1_ pET_R, Πίνακας 1).

παρεμβολή RNA

Οι αλληλουχίες ανθρώπινου στόχου CSTP1 siRNA (CSTP1_siRNA_target , Πίνακας 1) είναι σε σχέση με το πρώτο νουκλεοτίδιο του κωδικονίου έναρξης της αλληλουχίας που κωδικοποιεί την ανθρώπινη CSTP1. Ένα μη-σχετικό, ομελέτα siRNA χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος (CSTP1_siRNA_neg, Πίνακας 1). Το siRNA συντέθηκε από Σαγκάη Genechem Co., Ltd, Κίνα. CSTP1 knockdown πραγματοποιήθηκε με επιμόλυνση siRNA σε κύτταρα MCF χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Northern Ανάλυση κηλίδος

Ολικό RNA εξήχθη από όγκο κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ Regent (Invitrogen, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Είκοσι μικρογραμμάρια ολικού RNA δείγματα μετουσιώθηκαν, κλασματώθηκε κατά μέγεθος με ηλεκτροφόρηση σε πηκτές 1,2% αγαρόζης-φορμαλδεΰδης, και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νάιλον μεταφορά magna (Osmonics Inc σε Minnetonka, ΜΝ, USA). Για την ανίχνευση του ενδογενούς mRNA CSTP1, ORF του CSTP1 αποκόπηκε από pcDNA3.1 myc /C-CSTP1 πλασμίδιο του, επισημασμένα με [α-32P] dCTP χρησιμοποιώντας Prime-a-Gene Labeling System (Promega, Madison, WI, USA) . Εσωτερικός έλεγχος της GAPDH λήφθηκε με τη μέθοδο PCR με εκκινητές (GAPDH_NB_F και GAPDH_NB_R, Πίνακας 1) και σημάνθηκε ως ανωτέρω. Ο υβριδισμός διεξήχθη σε ExpressHyb διάλυμα υβριδισμού (Clontech, Mountain View CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

In vitro Φωσφατάσης Δοκιμασία

Τα κύτταρα 293Τ επιμολύνθηκαν με pcDNA3.1 myc /του C-CSTP1 πλασμίδιο με τη χρήση της μεθόδου μετεμβολιασμού φωσφορικού ασβεστίου. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα αποθήκευσης φωσφατάσης. Η πρωτεΐνη σύντηξης CSTP1-His καθαρίστηκε με EZview Red HIS-Επιλέξτε HC Nickel Affinity Gel (Sigma, Ronkonkoma, ΝΥ, USA). Οι πρωτεΐνες που χρησιμοποιούνται για Δοκιμασία φωσφατάσης χρησιμοποιώντας σερίνης /θρεονίνης Σύστημα Δοκιμασίας (Promega, Madison, WI, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Για να εξεταστεί εάν καθαρίζεται CSTP1 μπορούσε αποφωσφορυλιώνει Akt, CSTP1 εκφράστηκε ως πρωτεΐνη σύντηξης GST σε BL21 (DE3) βακτηριακές και καθαρισμένο με γλουταθειόνη-Sepharose. Οι αντιδράσεις αποφωσφορυλίωση διεξήχθησαν όπως περιγράφεται από τους Gao Tianyan [13].

Baculovirus Κατασκευή Φορέα, Virus Συσκευασία

Για να ληφθεί με επισύναψη His Akt1, το πλήρους μήκους κωδικεύουσα περιοχή για Akt1 κλωνοποιήθηκε πρώτα σε pcDNA3.1Myc /C του πλασμιδίου με PCR με εκκινητές Akt_His_F και Akt_His_R (Πίνακας 1), τότε, Akt1-His αλληλουχία κωδικοποίησης παρασκευάστηκε με τη μέθοδο PCR με εκκινητές Akt_Bac_F και Akt_Bac_R (Πίνακας 1) με pcDNA3.1Myc /C-Akt1 πλασμίδιο His ως εκμαγείο. Το προϊόν υποκλωνοποιήθηκε εντός των θέσεων BamHI και XhoI του pFastBacTM φορέα ραβδοϊού μεταφοράς (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο δότη pFastBacTM μετατρέπεται σε DH10BacTM για τη μεταφορά στο bacmid. Λευκές αποικίες επιλέχθηκαν περιέχουν τα ανασυνδυασμένα bacmid για την απομόνωση του ανασυνδυασμένου DNA bacmid. Για τη δημιουργία ιικού σωματιδίου, κύτταρα Sf9 σε πλάκες 6-φρεατίων μορφομετατράπηκαν με το ανασυνδυασμένο CSTP1 βακμιδιακό DNA σε CellfectinTM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Πέντε ημέρες αργότερα, το μέσο συλλέχθηκε και το υπερκείμενο διατηρούνται ως απόθεμα ιού Ρ1.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Για την δοκιμασία απόπτωσης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10

-8 mol L gemcitabine /ή 2 μg /mL σισπλατίνης αντίστοιχα. 48 ώρες αργότερα, τα κύτταρα ελήφθησαν και διπλά βάφονται με Annexin V-FITC και ΡΙ (keygen, Nanjing, Κίνα). Κυτταρικής απόπτωσης αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

Για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI1640 πρότυπο με 10% FBS σε περίπου 40% confluencey, και καλλιεργήθηκαν με 2 mM θυμιδίνη για 19 ώρες. Τα κύτταρα εξαντλούνται από θυμιδίνη και επωάζονται για 9 ώρες μέχρις ότου προστέθηκε 2 mM θυμιδίνης για δεύτερη φορά, και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για επιπλέον 16 ώρες. Μετά την απομάκρυνση του θυμιδίνης πάλι, οι θυμιδίνης-συγχρονισμένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο και συλλέχθηκαν σε διαφορετικούς χρόνους για ανάλυση κυτταρικού κύκλου. Σε γενικές γραμμές, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με διάλυμα PBS και σταθεροποιήθηκαν με παγωμένο 70% αλκοόλη στους -20 ° C για 24 ώρες. Κυττάρων ίζημα συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση, πλύθηκε δύο φορές με διάλυμα PBS, επωάζονται με 20 μΙ RNase Α (20 mg /ml) για 30 λεπτά στους 37 ° C, και χρωματίστηκαν με 25 μg /ml ΡΙ για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η κατανομή κυτταρικού κύκλου στη συνέχεια αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής (BD Biosciences, USA).

Ανοσοϊστοχημεία Ανάλυση

Four-μικρόμετρο τομές από σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εγκλεισμένοι σε παραφίνη ιστοί τοποθετήθηκαν σε πολυ-Ε-λυσίνη -επικαλυμμένα διαφάνειες και έπειτα αποπαραφινώθηκαν σε ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν μέσω αλκοόλης προς απεσταγμένο νερό. Η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% επί 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά το μαγείρεμα πίεση τα πλακίδια σε 10 mM EDTA (ρΗ 8,0) για 3 λεπτά, οι τομές επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 ° C με αντι-CSTP1 αντίσωμα κουνελιού (1:200). Πρωτογενή αντισώματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα δύο σταδίων System EnVision (Dako, Denmark). Θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιήθηκαν σαν ρουτίνα. Για αρνητικούς ελέγχους, το πρωτογενές αντίσωμα αντικαταστάθηκε από μη-άνοσο ορό κουνελιού για να επιβεβαιωθεί η εξειδίκευση του.

Αξιολόγηση της χρώσης CSTP1 ήταν κυρίως σύμφωνα με τα κριτήρια βαθμολόγησης που περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Η ανοσοϊστοχημική ποσοτική κλίμακα αναφοράς που κυμαίνεται από 0 έως 3 εξαρτάται από την ένταση της έκφρασης πρωτεΐνης CSTP1. Η σχετική ποσότητα των κυττάρων του όγκου που χρωματίζονται θετικά για CSTP1 (0-100%), σε συνδυασμό με τη βαθμολογία της έντασης χρώσης, είχε ως αποτέλεσμα μια βαθμολογία χρώσης που κυμαίνεται από 0 έως 100.

Στατιστική Ανάλυση

επιβίωσης χωρίς υποτροπή αξιολογήθηκε με καμπύλες Kaplan-Meier. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκαν με τη δοκιμασία log rank. Ελεύθερη νόσου επιβίωση ορίστηκε ως το χρονικό διάστημα μεταξύ χειρουργική επέμβαση και την ανίχνευση της αρχικής τοπικής υποτροπής. Όλη η ανάλυση έγινε με το στατιστικό πρόγραμμα SPSS 12.0 και η τιμή Ρ μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

CSTP1 mRNA έκφραση σε κανονική και όγκου ιστούς και κυτταρικές σειρές

CSTP1

γονίδιο εντοπίστηκε για πρώτη φορά από τον Bai GQ το 2005 [15], το οποίο transactived από πλήρεις S πρωτεΐνη του ιού της ηπατίτιδας Β, και υποτίθεται ότι αυτό μπορεί να σχετίζεται με ανθρώπινους καρκίνους. Εξετάσαμε πρώτα

CSTP1

επίπεδο έκφρασης mRNA σε διάφορα είδη ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του ήπατος, του παγκρέατος, του στομάχου, του παχέος εντέρου, της ουροδόχου κύστης και της νεφρικής καρκίνων. Προς έκπληξή μας,

CSTP1

mRNA μειώθηκε σημαντικά (κατά 40% -90%) σε 80% (8 από 10) της ουροδόχου κύστης ιστούς καρκίνου σε σύγκριση με ζεύγη γειτονικών μη-καρκινικούς ιστούς, ενώ η έκφραση του

CSTP1

mRNA στο συκώτι, πάγκρεας, στομάχι, κόλον και νεφρικούς ιστούς του καρκίνου δεν μεταβλήθηκε σημαντικά (Εικ. 1Α). Στη συνέχεια προσδιορίζεται το επίπεδο έκφρασης του mRNA CSTP1 με κηλίδα Northern σε κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως και SV-HUC1, ένα μη-μετασχηματισμένο ουροθηλιακό κύτταρα. Αποτελέσματα της κηλίδος Northern παρουσιάζεται ένα μέτριο επίπεδο έκφρασης της CSTP1

mRNA

σε κύτταρα SV-HUC1, αλλά σε RT4, EJ και Τ24 καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα,

CSTP1

mRNA δεν θα μπορούσε να ανιχνευθεί (Σχ. 1Β). Επιπλέον, δύο σύνολα του συνόλου δεδομένων μικροσυστοιχιών που λαμβάνονται από Oncomine αποκάλυψε επίσης ότι η έκφραση του mRNA CSTP1 μειώθηκε σε καρκίνους της ουροδόχου κύστης, με τιμές p 0,005 (επάνω) και 2.62E-4 (προς τα κάτω), αντίστοιχα (Εικ. 1Γ).

(Α) σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση του

CSTP1

επίπεδα mRNA σε έξι είδη των ανθρώπινων ιστών καρκίνου.

CSTP1

mRNA ήταν επιλεκτικά ρυθμισμένα προς τα κάτω σε ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με παρακείμενες μη-καρκινικούς ιστούς. (Β) Ανάλυση Northern blot του CSTP1 mRNA σε κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

CSTP1

mRNA εκφράστηκε σε ένα μέτριο επίπεδο σε κύτταρα SV-HUC1, αλλά μπορούσε να ανιχνευθεί μετά βίας σε κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης Τ24 RT4, EJ και, GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (C) CSTP1 mRNA ανάλυση της έκφρασης στο Oncomine. Μειωμένη έκφραση CSTP1 mRNA σε καρκίνους της ουροδόχου κύστης σε δύο σύνολα του συνόλου δεδομένων, με τιμές p 0,005 (επάνω) και 2.62E-4 (προς τα κάτω), αντίστοιχα (1, βλεννογόνο της ουροδόχου κύστης?. 2, διεισδύοντας καρκίνωμα urothelial της ουροδόχου κύστης? 3, του καρκίνου της ουροδόχου κύστης επιφανειακή ).

η

Χαρακτηρισμός CSTP1

Βιοπληροφορική ανάλυση έδειξε ότι CSTP1 mRNA είναι 6156 bp σε μήκος, το οποίο κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 314 αμινοξέων (Εικ. 2Α). Η προβλεπόμενη μοριακή μάζα αυτής της πρωτεΐνης είναι 36 kDa με την θεωρητική ισοηλεκτρικό σημείο 5.99. Το αντίστοιχο γονίδιο χαρτογραφήθηκε στο χρωμόσωμα 16p13.12, που αποτελείται από τέσσερα εξώνια και τρία εσώνια. Ανάλυση αλληλουχίας της προβλεπόμενης πρωτεΐνης έδειξε ότι η πρωτεΐνη CSTP1 περιέχει έναν τομέα PP2Ac (πρωτεϊνικής φωσφατάσης 2Α καταλυτική μονάδα) από το αμινοξύ 50 έως 250 (Σχ. 2Β). Η φυλογενετική ανάλυση έδειξε ότι το γονίδιο CSTP1 διατηρείται μεταξύ των χιμπατζήδων, σκύλος, αγελάδα, ποντικό, αρουραίο, το κοτόπουλο, zebrafish, και P.falciparum (Σχ. 2C).

(Α) την νουκλεοτιδική ακολουθία του

CSTP1

ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης και η συναγόμενη αλληλουχία αμινοξέων. Η αλληλουχία νουκλεοτιδίου δείχνεται στην κατεύθυνση 5 ‘προς 3’. Η προβλεπόμενη αλληλουχία αμινοξέων παρουσιάζεται κάτω από την αλληλουχία νουκλεοτιδίων. Τα υπολείμματα αμινοξέων που αντιστοιχούν στο phosphorase 2Α τομέα καταλυτική μονάδα (PP2Ac) εμφανίζονται με κόκκινα γράμματα. (Β) Ανάλυση βιοπληροφορικής έδειξε ότι CSTP1 πρωτεΐνη περιείχε ένα διατηρημένο πεδίο PP2Ac μεταξύ 50 έως 250 αμινοξέα. (Γ) Η φυλογενετική ανάλυση έδειξε ότι CSTP1 πρωτεΐνη διατηρείται σε χιμπατζή, σκύλος, αγελάδα, ποντικό, αρουραίο, το κοτόπουλο, zebrafish, και P.falciparum. (D) ανάλυση κηλίδας Western της έκφρασης CSTP1 σε κύτταρα HeLa. κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν με pCDNA3.1 Myc /C-CSTP1 His πλασμίδιο, 48 ώρες αργότερα, το επίπεδο της πρωτεΐνης σύντηξης CSTP1-Μγο ελέγχθηκε με αντι-Μγο αντίσωμα. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (Ε) CSTP1 εμφανίζεται μια δραστηριότητα της πρωτεΐνης φωσφατάση PP2B-όπως

in vitro

. Κύτταρα 293Τ διαμολύνθηκαν με pcDNA3.1Myc /His C-CSTP1, 48 ώρες αργότερα, η-His CSTP1 πρωτεΐνη σύντηξης καθαρίστηκε για προσδιορισμό φωσφατάση. Η απελευθέρωση του Ρί προσδιορίστηκε παρουσία 1 mM EGTA, 50 mM MgCl

2, 5 mM NiCl

2 και 250 μg /ml καλμοδουλίνη. 200 nM τριφθοροπεραζίνη ή 0,5 μmol οκαδαϊκού οξέος προστέθηκε επίσης να καταργήσει τη δραστικότητα της φωσφατάσης της PP2B ή ΡΡ2Α.

Η

Στη συνέχεια, επιβεβαίωσε το προβλεπόμενο μοριακό βάρος CSTP1 πρωτεΐνης. Η pcDNA3.1Myc /C-CSTP1 His πλασμίδια επιμολύνθηκαν σε κύτταρα HeLa και πρωτεΐνη σύντηξης CSTP1-Μγο προσδιορίστηκε με κηλίδα western με αντι-Μγο αντίσωμα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2D, το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο που εκφράζεται μια πρωτεΐνη με το αναμενόμενο μοριακό βάρος 36 kDa.

Τέλος, προσδιορίσαμε αν CSTP1 πρωτεΐνη εμφάνισε δραστικότητα φωσφατάσης σερίνης /θρεονίνης in vitro. Κύτταρα 293Τ διαμολύνθηκαν με pcDNA3.1myc /πλασμίδια C-CSTP1 του και ο-His CSTP1 πρωτεΐνη σύντηξης καθαρίστηκαν για δοκιμασία φωσφατάσης. Η ενζυματική δραστικότητα προσδιορίστηκε με μέτρηση της απελευθέρωσης του Pi από το εμπορικό συνθετικό πεπτίδιο υπόστρωμα που περιέχει ένα υπόλειμμα φωσφοθρεονίνη [RRA (PT) VA]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Ε, καταλύεται CSTP1 πρωτεΐνη Pi απελευθερώνεται από RRA πεπτίδια (PT) VA, επιπλέον, PP2B ειδικός αναστολέας, τριφθοροπεραζίνη κατάργησε σχεδόν δράση της φωσφατάσης, ενώ ΡΡ2Α ειδικός αναστολέας οκαδαϊκό οξύ δεν επηρέασε CSTP1 δραστηριότητα.

υποκυτταρικός εντοπισμός της CSTP1

Για να αποκτήσουν γνώσεις σχετικά με την βιολογική λειτουργία της πρωτεΐνης CSTP1, αναλύσαμε την πρώτη υποκυτταρικό εντοπισμό του. πλασμίδια έκφρασης CSTP1 GFP-tagged διαμολύνθηκαν σε κύτταρα HeLa, και ο φθορισμός οπτικοποιήθηκε υπό μικροσκόπιο φθορισμού. Κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα pEGFP εμφανίζεται διάχυτο φθορισμό καθ ‘όλη υποκυτταρικά διαμερίσματα των κυττάρων, ενώ CSTP1-GFP εντοπίζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα (Εικ. 3), γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να ασκήσει CSTP1 είναι συνάρτηση μέσω εντοπισμού να κυτταρόπλασμα.

κύτταρα Hela επιμολύνθηκαν με pEGFPN1 και pEGFPN1-CSTP1 πλασμίδιο αντίστοιχα, 48 ώρες αργότερα, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και κατέστησαν ορατά με μικροσκοπία συνεστιακή φθορισμού. 4, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη χρώση διυδροχλωρίδιο χρησιμοποιήθηκε για να υποδείξει στον πυρήνα του κυττάρου. Τα αποτελέσματα ήταν αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

CSTP1 Υπερ-έκφραση Καταστέλλει τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης πολλαπλασιασμό των κυττάρων και αποικιών σχηματισμός, αλλά δεν εισβολή

Με δεδομένη την παρατήρηση ότι CSTP1 mRNA μειώθηκε στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης ιστούς, εμείς τεκμαίρεται ότι CSTP1 μπορεί να λειτουργήσει ως καταστολέας όγκων σε καρκίνους της ουροδόχου κύστης. Για να ερευνηθεί ο ρόλος του CSTP1 σε κυτταρική λειτουργία, αναλύσαμε πρώτα την επίδραση της υπερέκφρασης CSTP1 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. CSTP1 ήταν σταθερά υπερεκφράζεται σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης EJ κυττάρων μέσω μολύνσεως βραδέος ιού και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων αξιολογήθηκε με τη μέθοδο ΜΤΤ. Η υπερέκφραση του CSTP1 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων EJ κατά 50% μετά από καλλιέργεια 5-ημερών (Εικ. 4Α), ενώ, η εξάντληση του τομέα PP2Ac μειωμένη την ικανότητα αναστολής της ανάπτυξης των CSTP1 για EJ κύτταρα κατά 80% (Σχ. 4Α) . Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα της ανάλυσης ΜΤΤ, η υπερέκφραση του CSTP1 μείωσε την ικανότητα σχηματισμού αποικίας των κυττάρων EJ, και εξάντληση του τομέα PP2Ac διασωθεί η ικανότητα σχηματισμού αποικιών των κυττάρων EJ (Εικ. 4Β). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε ένα άλλο καρκίνο της ουροδόχου κύστης Τ24 κυτταρική γραμμή (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα).

(Α) κύτταρα EJ μετήχθησαν με φακοϊών υπερεκφράζουν CSTP1 (Lv-CSTP1), ο PP2Ac domian διαγράφεται CSTP1 (LV-CSTP1 ΔPP2Ac ), ή τον έλεγχο lenti-φορέα (Lv-CTR). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ανιχνεύθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ. Τα δεδομένα σε κάθε χρονικό σημείο αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD από 8 δειγμάτων. Τα αποτελέσματα ήταν αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β) Τα μετατραπέντα κύτταρα EJ καλλιεργήθηκαν για 14 ημέρες, και οι αποικίες χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν μέσα στο πεδίο ενός αντικειμενικού φακού × 40. Τα αποτελέσματα ήταν αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Γ) Η ανάπτυξη του όγκου ξενομοσχεύματος σε γυμνά ποντίκια αξιοσημείωτα κατέστειλε ακόλουθη CSTP1 υπερέκφραση. Τα δεδομένα σε κάθε χρονικό σημείο αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD, η = 6. δοκιμασίες τμήμα (D) πραγματοποιήθηκαν με μετατραπέντα κύτταρα EJ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι CSTP1 έχει καμία επίδραση στην κυτταρική εισβολή. Τα δεδομένα που δεικνύονται ήταν μέσος αριθμός εισβάλλοντα κύτταρα (χ 100 πεδίο) ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. **, P & lt?. 0.01

Η

Για να διερευνήσουν το ρόλο της CSTP1 in vivo, ιδρύσαμε ανθρώπινων όγκων ξενομοσχεύματος ουροδόχου κύστης σε γυμνά ποντίκια με ένεση των κυττάρων EJ ελέγχου ή κύτταρα EJ σταθερώς εκφράζουν είτε άγριου τύπου CSTP1 ή CSTP1 ΔPP2Ac. Η ανάπτυξη των εμφυτευμένων όγκων μετρήθηκε σε ποντίκια (η = 6 για κάθε ομάδα) σε μια περίοδο 8 εβδομάδων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, σε αθυμικούς ποντικούς που λαμβάνουν τα κύτταρα που υπερεκφράζουν EJ CSTP1, ανάπτυξη όγκου κατεστάλη σημαντικά (-50%), αλλά σε αθυμικούς ποντικούς που λαμβάνουν τα κύτταρα που υπερεκφράζουν EJ CSTP1 ΔPP2Ac, η ανάπτυξη του όγκου σχεδόν δεν άλλαξε σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχ. 4C). Ωστόσο, η υπερέκφραση CSTP1 είχε καμία επίδραση στην εισβολή των κυττάρων EJ όπως προσδιορίζεται με επικοινωνούντα δοκιμασίες (Εικ. 4D).

CSTP1 Επίδραση στη κυτταρικού κύκλου και απόπτωση

Για να διερευνήσει την επίδραση της CSTP1 επί του κυτταρικού κύκλου , lentivirus μεταδιηγερμένα κύτταρα EJ συγχρονίστηκαν σε G0 /G1 φάση με δύο γύρους θεραπείας θυμιδίνης και του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκαν με FACS σε 0 h, 2 h, 4 h, και 8 ώρες μετά την απελευθέρωση από τη φάση G0 /G1 με προσθήκη πλήρους μέσον. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, η υπερέκφραση του CSTP1 καθυστέρησε significantlly την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, τα κύτταρα που υπερεκφράζουν CSTP1 παρουσίασαν χαμηλότερο ποσοστό των κυττάρων στη φάση S σε 2 ώρες και 4 ώρες μετά την απελευθέρωση από τη φάση G0 /G1. Επιπλέον, ένα κατώτερο ποσοστό G2 κύτταρα φάσης /M στις 8 ώρες μετά απελευθερώνεται από το κλείδωμα του κυτταρικού κύκλου παρατηρήθηκαν επίσης σε CSTP1 υπερεκφράζουν κύτταρα, ενώ κύτταρα που υπερεκφράζουν CSTP1 ΔPP2Ac δεν δείχνουν καθυστερημένη εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Για να επιβεβαιώσετε τα αποτελέσματα της ενδογενούς CSTP1 σε κυτταρικό κύκλο, CSTP1 πρωτεΐνης χτυπήθηκε κάτω από siRNA επιμόλυνση σε κύτταρα SV-HUC1 η οποία έδειξε μια μέτρια έκφραση CSTP1 (Εικ. 1Β). CSTP1 πρωτεΐνη ήταν αποτελεσματικά κάτω-ρυθμίζονται από ειδικές siRNA διαμόλυνση (Εικ. 5Β), και η μειωμένη έκφραση του CSTP1 προωθείται πολλαπλασιασμού των κυττάρων με την ανύψωση του ποσοστού των κυττάρων στη φάση S (Σχ. 5C).

(Α) κύτταρα που υπερεκφράζουν EJ CSTP1 (Lv-CSTP1), CSTP1 ΔPP2Ac (Lv-CSTP1 ΔPP2Ac) και τα κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δύο γύρους 2 mM θυμιδίνης. κυτταρικούς κύκλους αναλύθηκαν με FACS μετά την απελευθέρωση από τη φάση G0 /G1 στο υποδεικνυόμενο χρονικό σημείο. Τα αποτελέσματα ήταν αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β) Ανοσοστύπωμα της CSTP1 σε εκχυλίσματα από SV-HUC1cells 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με τον έλεγχο siRNA (Mock) ή siRNA για CSTP1 (CSTP1 siRNA). (Γ) Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου των κυττάρων SV-HUC1 μετά την επιμόλυνση με τον έλεγχο του siRNA ή siRNA για CSTP1. *, P & lt? 0,05. Τα αποτελέσματα ήταν αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Για να εξεταστεί ο ρόλος των CSTP1 στην κυτταρική απόπτωση, κύτταρα που υπερεκφράζουν EJ CSTP1 ή CSTP1Δ PP2Ac και τα κύτταρα ελέγχου καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο με ή χωρίς γεμσιταβίνη και σισπλατίνη, δύο που χρησιμοποιούνται συνήθως φάρμακα χημειοθεραπείας στη θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Τα αποτελέσματα FACS έδειξαν ότι η υπερέκφραση του CSTP1 μόνη ελαφρά μόνο επάγεται EJ κυττάρων απόπτωση, αλλά όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με φάρμακα χημειοθεραπείας, αυξημένο ποσοστό θανάτου παρατηρήθηκε σε CSTP1 υπερεκφράζουν κύτταρα και εξάντληση του τομέα PP2Ac εξασθενημένου αυτή θάνατος που προάγουν την ικανότητα του CSTP1 δραματικά (Εικ. 6).

κύτταρα EJ σταθερώς υπερ-εκφράζοντα κύτταρα CSTP1 ή CSTP1 ΔPP2Ac και ελέγχου καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο με ή χωρίς γεμκιταβίνη (10

-8 mol /L) και σισπλατίνη ( 2 μg /mL), 48 ώρες αργότερα, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με διπλό αννεξίνη V-FITC και ΡΙ, κυτταρική απόπτωση αναλύθηκε με FACS. Τα αποτελέσματα ήταν αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. **, P & lt?. 0.01

Η

CSTP1 αλληλεπιδρά και αποφωσφορυλιώνει pAkt σε Ser473 ιστοσελίδας

Για να εξερευνήσετε τις υπογραμμισμένες μηχανισμών που ευθύνονται για την αυξημένη απόπτωση και καθυστερημένη κυτταρικού κύκλου καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυττάρων που προκαλείται από CSTP1, προσπαθούμε να βρούμε μονοπάτια κατάντη της CSTP1 υπερέκφραση σηματοδότησης. Σηματοδότηση μονοπατιών που εμπλέκονται συνήθως στη βιολογία του καρκίνου, τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου ή τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων εξετάστηκαν σε CSTP1-κύτταρα που υπερεκφράζουν EJ με ανάλυση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας Cignal Reporter Assay Kit. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι παράγοντας FOXO είχε μια πιο ισχυρή μεταγραφική δραστικότητα σε CSTP1 υπερεκφράζουν κύτταρα (Σχ. 7Α). Η αύξηση της δραστηριότητας FOXO αυτή κατέδειξε περαιτέρω μείωση του κατάσταση φωσφορυλίωσης των FOXO3a σε Thr32 site μετά CSTP1 υπερέκφραση (Εικ. 7Β). Από Akt κινάση είναι ο κύριος αρνητικός ρυθμιστής ανάντη του παράγοντα FOXO, εμείς υποτίθεται ότι η δραστηριότητα της κινάσης Akt θα μπορούσε να μειωθεί σε CSTP1-κύτταρα που υπερεκφράζουν. Για να επιβεβαιωθεί αυτή η υπόθεση, η φωσφορυλιωμένη Akt σε Thr308 ή Ser473 site, το οποίο αντιπροσωπεύει την κατάσταση ενεργοποίησης της Akt, ανιχνεύθηκαν. αποτελέσματα κηλίδος Western έδειξαν ότι η υπερέκφραση της CSTP1 μείωσε το επίπεδο της φωσφορυλιωμένης Akt σε Ser473 θέση, αλλά το επίπεδο της φωσφορυλιωμένης Akt σε Thr308 παρέμεινε αμετάβλητη (Εικ. 7Β). Από CSTP1 ρυθμίζεται μειωτικά σε ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης, οπότε το ερώτημα εάν η απώλεια της έκφρασης CSTP1 σε urothelial κύτταρα θα μπορούσε να οδηγήσει στην ενεργοποίηση της Akt κινάσης και αδρανοποίηση του παράγοντα FOXO. Σύμφωνα με την ανάλυση CSTP1 υπερέκφραση, νοκ ντάουν της CSTP1 στο SV-HUC1 αύξησε το επίπεδο φωσφορυλίωσης της Akt στο site Ser473 και FOXO3a σε Thr32 χώρο (Εικ. 7C). Για να διερευνηθεί περαιτέρω η επίδραση της υπερέκφρασης CSTP1 σχετικά με τη δραστηριότητα της Akt, εξετάσαμε επίσης και άλλα τεσσάρων γνωστών πρωτεϊνών που εξαρτώνται από την Akt για φωσφορυλίωση, GSK3α, ΟδΚ3β, p70S6K, και TSC2. Προς έκπληξή μας, CSTP1 υπερέκφραση δεν επηρέασε την κατάσταση φωσφορυλίωσης του GSK3α, ΟδΚ3β, p70S6K, και TSC2 (Εικ. 7Β).

(Α) κύτταρα που υπερεκφράζουν EJ CSTP1 και κύτταρα ελέγχου επιμολύνθηκαν με μια σειρά από cignal ανέφεραν πλασμίδιο, 48 ώρες αργότερα, μετρήθηκε δραστικότητα λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας λουσιφεράσης με φωτόμετρο. σήμα αναφοράς λουσιφεράσης που βασίζεται κανονικοποιείται προς την έκφραση ενός συνδιαμολυνθέν Renilla πλασμίδιο ελέγχου λουσιφεράσης. (Β) ανάλυση κηλίδας Western των επιπέδων φωσφορυλίωσης του FOXO3a, Akt, GSK3α, ΟδΚ3β, p70S6K και TSC2 σε κύτταρα που υπερεκφράζουν EJ CSTP1. πρωτεΐνες μη φωσφορυλιωμένη FOXO3a, Akt, ΟδΚ3α, ΟδΚ3β, p70S6K και TSC2 ανιχνεύθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western των επιπέδων φωσφορυλίωσης του Akt FOXO3a και μετά να χτυπήσει κάτω από CSTP1 σε κύτταρα SV-HUC1. (D) CSTP1 αλληλεπιδρά με Akt σε κύτταρα 293Τ. Κύτταρα 293Τ συνεπιμολύνθηκαν με pcDNA3.1-CSTP1 και Flag-Akt εκφράζουν πλασμίδια, αλληλεπίδραση μεταξύ CSTP1 και Akt αναλύθηκε με συν-ip πείραμα με αντι-Flag (μέχρι πάνελ) ή αντι-CSTP1 αντίσωμα (χαμηλή πάνελ). (Ε) Η αποφωσφορυλίωση της Akt από καθαρισμένο CSTP1

in vitro

. Καθαρό His-Ακί επωάστηκε με GST-tagged CSTP1 ή GST-tagged CSTP1ΔPP2Ac στο ρυθμιστικό φωσφατάσης. Για αρνητικό έλεγχο, πρωτεΐνη CSTP1 παραλείφθηκε από το μείγμα της αντίδρασης (CTR). (F) κύτταρα EJ ήταν υπερεκφράζεται CSTP1 (Lv-CSTP1) ή CSTP1 (Lv-CSTP1) συν φωσφόρου-μιμητική S473D κατασκευή του Akt (CA-Akt) από φακοϊό, κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με FACS. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ.