Αφηρημένο

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι μία από τις κύριες αιτίες που σχετίζονται με τον καρκίνο θανάτους και την αναζήτηση για προγνωστικούς βιοδείκτες που θα μπορούσαν να βελτιώσουν τις αποφάσεις τους μεταχείριση δικαιολογείται. Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρής μη-κωδικοποίησης RNA μόρια που εμπλέκονται στην ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων και έχουν προταθεί ως πιθανές βιοδείκτες σε CRC. Για να χαρακτηρίζουν το μεταγραφικό miRNA, μια μεγάλη ομάδα, συμπεριλαμβανομένων 88 CRC όγκων με μακροχρόνια παρακολούθηση ήταν βαθιά αλληλουχία. 523 ώριμη miRNAs εκφράστηκαν στην ομάδα μας, και εκτίθενται σε μεγάλο βαθμό ομοιόμορφη πρότυπα έκφρασης σε όλη δείγματα όγκων. Λίγοι ενώσεις βρέθηκαν μεταξύ κλινικών παραμέτρων και της έκφρασης miRNA, μεταξύ αυτών, χαμηλή έκφραση του miR-592 και υψηλή έκφραση του miR-10b-5P και miR-615-3p συσχετίστηκαν με όγκους που βρίσκεται στο δεξί κόλον σε σχέση με το αριστερό κόλον και πρωκτός. Υψηλή έκφραση του miR-615-3p συσχετίστηκε επίσης με χαμηλή διαφοροποίηση όγκων. Δεν προγνωστική υποψηφίων βιοδεικτών για τη συνολική και μετάσταση επιβίωση χωρίς εντοπίστηκαν από την εφαρμογή λάσο μέθοδο σε ένα Cox αναλογικό μοντέλο κινδύνους ή μονοπαραγοντική Cox. Από την εξέταση των πέντε πιο άφθονα εκφράζεται miRNAs στην ομάδα (miR-10a-5P, miR-21-5p, miR-22-3p, miR-143-3p και miR-192-5p) αποκάλυψε ότι η συλλογική έκφρασή τους αντιπροσώπευαν το 54% από τις εντοπισμένες ακολουθίες miRNA. ανάλυση μονοπατιού των γονιδίων στόχων ρυθμίζεται από τις πέντε πιο εντόνως εκφρασμένα miRNAs αποκάλυψε ένα σημαντικό αριθμό γονιδίων που εμπλέκεται στο μονοπάτι CRC, συμπεριλαμβανομένης της APC, ΤΟΡβ και ΡΙ3Κ, υποδηλώνοντας έτσι ότι αυτές οι miRNAs είναι σχετικές με CRC.

Citation : Schee K, Lorenz S, Worren MM, Günther CC, Holden Μ, Hovig E, et al. (2013) Βαθιά αλληλουχίας η microRNA μεταγραφικό στον Καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (6): e66165. doi: 10.1371 /journal.pone.0066165

Επιμέλεια: Τζωρτζίνα Λ Κρατήστε, Πανεπιστήμιο του Αμπερντίν, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 17 Φεβρουαρίου, 2013? Αποδεκτές: 2η Μαΐου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 18 Ιουνίου 2013

Copyright: © 2013 Schee et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από τη Νότιο-Ανατολική Νορβηγία Περιφερειακή Αρχή Υγείας και από τη νορβηγική Εταιρεία Καρκίνου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα microRNAs (miRNA) είναι εξελικτικά συντηρημένες μικρές (~20-22 nt μακρύ), μη-κωδικοποίησης RNAs που ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση μέσω δέσμευσης με την 3’UTR του mRNA, αναστέλλοντας έτσι τη μετάφραση [1]. Μπορούν να συνδεθούν με μερική συμπληρωματικότητα προς mRNA σε πιθανώς ρυθμίζουν προς τα κάτω αρκετές mRNAs. Το γεγονός αυτό καθιστά τα κατάντη μελέτες κάπως δύσκολο με πολλούς πιθανούς στόχους για κάθε miRNA. Σήμερα υπάρχουν περίπου 1.500 miRNAs σχολιάζονται στη βάση δεδομένων miRNA (miRBase) [2] και εκτιμάται ότι έως και το 60% των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες μπορούν να ρυθμίζονται από miRNAs [3]. MiRNAs είναι απαραίτητα για τη φυσιολογική ανάπτυξη των θηλαστικών και εμπλέκονται στην τελειοποίηση πολλές βιολογικές διεργασίες, όπως ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, τη διαφοροποίηση, την απόπτωση και τον μεταβολισμό, και η συμμετοχή τους στον καρκίνο έχει προκαλέσει αυξημένο ενδιαφέρον για miRNA βιολογία [4] – [6]. Έχουν προταθεί ως πιθανές βιοδείκτες, λόγω των κανονιστικών λειτουργιών τους, τη χημική σταθερότητα και τη δυνατότητα μέτρησης miRNA στον ορό, πλάσμα, τα κόπρανα και τα δείγματα ιστού [7] – [10].

καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι μία από τις πιο κοινές μορφές καρκίνου σε δυτικές χώρες και κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους. Είναι μια ετερογενής νόσος που χαρακτηρίζεται από συσσώρευση γενετικών και επιγενετικών εκδηλώσεις, και επηρεάζεται από τον τρόπο ζωής [11], [12]. Οι αποφάσεις για τη θεραπεία εξακολουθεί να βασίζεται ουσιαστικά στην ανατομική έκταση της νόσου κατά τη διάγνωση, και η αναζήτηση για την καλύτερη βιοδείκτες είναι δικαιολογημένη. Οι miRNAs εξεταστεί για πιθανό ρόλο τους ως διαγνωστικά, προγνωστικά και θεραπευτικά βιοδεικτών σε CRC χρησιμοποιώντας υβριδισμό τεχνολογίες που βασίζονται σε συστοιχία και ποσοτική RT-PCR (qRT-PCR) [13] – [16]. Χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες έκφρασης, έκφραση μιας μεγάλης ποσότητας των προ-επιλεγμένων miRNAs μπορεί να ανιχνευθεί, και η ανίχνευση miRNA βασίζεται σε εντάσεις σήματος. Σχετική έκφραση μπορεί να υπολογιστεί χρησιμοποιώντας qRT-PCR, αλλά όταν επεκτείνεται για να πολλαπλές παράλληλες αναλύσεις, ο αριθμός των miRNAs δυνατή την ανάλυση και την ποσότητα του RNA μπορεί να αντιπροσωπεύουν περιορισμούς. Βαθιά αλληλουχίας έχει αναδειχθεί ως μια ελκυστική προσέγγιση για την παγκόσμια ανάλυση miRNA, πλεονεκτήματα όπως η συγκέντρωση των δειγμάτων για σκοπούς υψηλής απόδοσης, ένα ευρύ φάσμα ανιχνεύσιμη έκφραση, την ικανότητα να αναλύσει την έκφραση όλων των σχολιασμένη miRNAs και τη δυνατότητα εντοπισμού νέων miRNAs.

σε αυτό το έργο, βαθιά αλληλουχίας χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η έκφραση των miRNAs σε 88 δείγματα όγκων CRC, και τις ενώσεις μεταξύ των επιπέδων έκφρασης και κλινικοπαθολογοανατομικές δεδομένα και τα αποτελέσματα αναλύθηκαν.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενών Cohort και Παρασκευή Δείγματος

Μεταξύ των ετών 1998-2000, 316 ασθενείς είχαν προσληφθεί από πέντε νοσοκομεία στην περιοχή του Όσλο [17], και μελλοντικά περιλαμβάνονται στη μελέτη κατά το χρόνο της πρωτοβάθμιας χειρουργική επέμβαση για την υπόθεση ή να επαληθεύονται καρκίνο του παχέος εντέρου . Η μελέτη εγκρίθηκε από την περιφερειακή επιτροπή Δεοντολογίας (Υγεία Περιοχή ΙΙ, Νορβηγία) και ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από τους ασθενείς. Εκτομή δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία συνήθως για ιστοπαθολογική αξιολόγηση κατά το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης και ταξινομούνται ανάλογα με τον όγκο σύστημα σταδιοποίησης Κόμβος Μετάσταση (TNM). Δειγματοληψία επιπλέον ιστού όγκου διεξήχθη από τον χειρουργό στο χειρουργείο μετά το δείγμα αφαιρέθηκε από τον ασθενή, και τα δείγματα αμέσως συμπληρωματικό καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο. Τα δείγματα στη συνέχεια μεταφέρθηκαν στο εργαστήριο έρευνας και φυλάσσονται για μακροχρόνια αποθήκευση στους -80 ° C. Οι βιοψίες κόπηκαν σε τομές χρησιμοποιώντας μικροτόμο κρυοστάτη και αιματοξυλίνη-ηωσίνη χρωματισμένο πλακίδια αξιολογήθηκαν για την περιεκτικότητα του όγκου από έναν παθολόγο (μέση περιεκτικότητα του όγκου στα δείγματα ήταν 50%, περιοχή 30-80%). Ο ιστός του όγκου στη συνέχεια τεμαχίστηκε σε 10 μm τομές χρησιμοποιώντας μικροτόμο κρυοστάτη και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C μέχρι την απομόνωση του RNA. 120 περιπτώσεις που δεν περιελήφθησαν στη μελέτη για τους ακόλουθους λόγους: όχι διηθητικού καρκίνου (25), ιστολογία, εκτός από αδενοκαρκίνωμα (5), μακρινή μετάσταση κατά τον χρόνο της χειρουργικής επέμβασης (34), η προεγχειρητική χημειοακτινοθεραπεία (2), ανεπαρκή χειρουργικά όρια (7 ) και άγνωστες στάδιο της νόσου (1). Επιπλέον, τα δείγματα κατεψυγμένου ιστού δεν αποκτηθούν σε 46 περιπτώσεις. Από τα 196 δείγματα στο στάδιο TNM Ι-ΙΙΙ, 90 δείγματα όγκων επιλέχθηκαν τυχαία για βαθιά αλληλουχίας. Μετά αλληλούχιση, δύο δείγματα από την ομάδα κρίθηκαν υποβαθμισμένη και απομακρύνθηκαν από περαιτέρω μελέτες, αφήνοντας ένα δείγμα κοόρτη 88 ασθενών (Πίνακας 1). Συνέχεια δεδομένα που λαμβάνονται από τα συμμετέχοντα νοσοκομεία και από τους ιατρούς γενικής ιατρικής (για τους ασθενείς που δεν πηγαίνουν προγραμματιστεί έλεγχοι). Μετάσταση επαληθεύτηκε από ακτινολογικών δεδομένων εξέταση και επιβίωσης ελήφθη από το Εθνικό Μητρώο της Νορβηγίας και ενημερώθηκε μέχρι την 1η Οκτωβρίου 2008.

Η

Απομόνωση RNA και Deep αλληλουχίας

RNA απομονώθηκε από ιστό του όγκου χρησιμοποιώντας TriReagent (Ambion Inc, ΤΧ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και η συνολική συγκέντρωση RNA μετρήθηκε με Nanodrop (ND-1000). Η ποιότητα εκτιμήθηκε από την Agilent 2100 Bioanalyzer και τα δείγματα με μια τιμή RIN των 7 και άνω χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Μικρές βιβλιοθήκες αλληλουχίας RNA δημιουργήθηκαν ακολουθώντας το πρωτόκολλο Παρασκευή δείγματος Illumina®TruSeq ™ μικρά RNA. Εν συντομία, 3` και 5` προσαρμογέα RNA, ειδικά τροποποιημένα για τη στόχευση των άκρων των μικρών μορίων RNA, συνδέθηκαν σε 1 μg υψηλής ποιότητας ολικού RNA. Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε για να δημιουργήσει βιβλιοθήκες cDNA και PCR χρησιμοποιήθηκε για να ενισχύσει και να προσθέσει μοναδικές αλληλουχίες δείκτη για κάθε βιβλιοθήκη.

Μικρές βιβλιοθήκες RNA συνενώθηκαν και 32 βάσεις αλληλουχήθηκαν για κάθε μόριο cDNA χρησιμοποιώντας ένα Illumina® Genome Analyzer IIx . Ευρετήρια αλληλουχήθηκαν προκειμένου να προσδιοριστεί η πηγή της κάθε ανάγνωσης. Η πρώτη εκτέλεση, που περιέχει 48 δείγματα, εμποδίστηκε από μερικώς μη λειτουργικό λωρίδες στο κελί ροής και επομένως επαναλαμβάνεται. Τα στοιχεία για την πορεία 1 και να τρέξει 2 συνδυάστηκαν για ανάλυση της έκφρασης κατάντη, καθώς και αναλύθηκαν ξεχωριστά για να προσδιοριστεί η τεχνική επαναληψιμότητα των πειραμάτων.

αλληλουχίας Ανάλυση Δεδομένων και Κανονικοποίηση

ανάλυση σε πραγματικό χρόνο , βάση κλήση και το φιλτράρισμα των χαμηλής ποιότητας αναγνώσεις έγιναν από πακέτα λογισμικού Illumina του (SCS2.9 /RTA1.9 και off-line Basecaller v1.9). Novoalign (V2.08.01 Novocraft 2010? Www.novocraft.com) χρησιμοποιήθηκε για να κόψει υπόλοιπη αλληλουχία προσαρμογέα και να χαρτογραφήσει το διαβάζει στο ανθρώπινο γονιδίωμα αναφοράς (hg19). Όλα διαβάζει χαρτογράφηση σε 10 ή περισσότερα γονιδιωματικές περιοχές αποκλείστηκαν από περαιτέρω ανάλυση. Η χαρτογραφηθεί διαβάζει σχολιάστηκαν χρησιμοποιώντας γνωστές βάσεις δεδομένων. Η απελευθέρωση της βάσης δεδομένων miRBase 18 (Νοέμβριος 2011) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιορίσει miRNAs, χρησιμοποιώντας BEDTools Έκδοση-2.16.2 [18]. Το NCBI χτίσει «Homo_sapiens.NCBI.36.58» χρησιμοποιήθηκε για να προσδιορίσει άλλα είδη μικρών RNA και mRNA.

Για να υπολογίσετε το διαβάσετε μέτρηση για miRNAs, αναφέρει ότι χαρτογραφείται μοναδικά μέσα σε μια ώριμη ακολουθία miRNA με μέγιστο χρονικό διάστημα ενός αναντιστοιχία θεωρήθηκαν επιτυχίες. Διαβάζει χαρτογράφηση σε περισσότερες από μία ώριμη ακολουθία miRNA έχουν ανατεθεί σύμφωνα με τη συχνότητα του μοναδικά χαρτογραφηθεί διαβάζει βρεθεί για αυτά τα miRNAs. Αυτό σημαίνει ότι όταν δυο miRNAs μοιράζεται ένας δεδομένος αριθμός πολλαπλών χαρτογραφηθεί διαβάζει, προσδιορίσαμε την αναλογία των μοναδικών διαβάζει μεταξύ αυτών των δύο miRNAs. Η αναλογία αυτή εφαρμόστηκε για να διαιρέσει τον αριθμό των πολλαπλών χαρτογραφηθεί διαβάζει και να τους εκχωρήσετε. Εάν βρέθηκαν πολλαπλά χτυπήματα να χαρτογραφηθεί πλήρως σε μία γονιδιωματική περιοχή και χαρτογραφήθηκαν με αναντιστοιχία σε ένα άλλο, μόνο το τέλειο αγώνες θεωρήθηκαν.

Για την εξομάλυνση των μετρήσεων ανάγνωσης, τέσσερις διαφορετικές προσεγγίσεις εξετάστηκαν. Υπολογίσαμε το συντελεστή κανονικοποίησης για όλα τα δείγματα από τη διαίρεση του συνολικού αριθμού των διαβάζει, ο αριθμός των διαβάζει ευθυγραμμιστεί με το γονιδίωμα, επιτρέποντας πολλαπλές επιτυχίες ή εκείνο το χάρτη μοναδικά, ή τον αριθμό των διαβάζει αντιστοιχίζονται σε σχολιασμένο ώριμη miRNAs με 1 εκατομμύριο. Οι κανονικοποιημένες τιμές έκφρασης για κάθε miRNA δημιουργήθηκαν από τη διαίρεση του διαβάσει μέτρηση του miRNA με τη σύμφωνα παράγοντα κανονικοποίησης. Μετά την κανονικοποίηση, όλα τα miRNAs με ανάγνωσης μετρά λιγότερο από 10 σε ολόκληρη όλα τα δείγματα ασθενών οριστεί σε 0. Το σύνολο δεδομένων ομαλοποιηθεί κατά σχολιασμένο ώριμη miRNAs επιλέχθηκε για τις υπόλοιπες αναλύσεις. έχουν εξομαλυνθεί και un-κανονικοποιημένη μετράει ανάγνωσης για όλα τα δείγματα που έχουν διατεθεί στο Array ιστοσελίδα Express, αριθμός πρόσβασης E-mtab-1649 (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/).

Ποσοτική Real Time-PCR

qRT-PCR είχε προηγουμένως πραγματοποιηθεί για ολόκληρη την ομάδα των 196 δειγμάτων από την οποία πρόσφατα κατεψυγμένο ιστό ήταν διαθέσιμη για να προσδιοριστεί η έκφραση των έξι miRNAs: miR-21, miR-31, miR-92a , miR-101, miR-106a και miR-145 [19]. Εν συντομία, η σύνθεση cDNA και qRT-PCR διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς TaqMan microRNA (Applied Biosystems, Foster City, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις διπλούν. τιμές Ct για miRNAs κανονικοποιήθηκαν έναντι RNU44 και η σχετική έκφραση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας 2

-dCt μέθοδο [20]. Τα αποτελέσματα για αυτά τα έξι miRNAs από τις 88 δείγματα που είχαν αναλυθεί και με τις δύο μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση των δεδομένων από το βαθύ αλληλούχιση με qRT-PCR. Συσχετίσεις μεταξύ των αποτελεσμάτων από το βαθύ αλληλουχίας και qRT-PCR μελετήθηκαν με ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης.

Ιεραρχική Ομαδοποίηση και Στατιστική Ανάλυση

Ιεραρχική ομαδοποίηση έγινε για να απεικονίσει πρότυπα έκφρασης όλων των miRNAs. Οι κανονικοποιημένες τιμές έκφρασης log2 μεταμορφώνεται και χωρίς επίβλεψη αμφίδρομη ιεραρχική ομαδοποίηση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Ευκλείδεια απόσταση και το μέσο σταθμικό σύνδεση (WPGMA) να συγκεντρώνονται miRNAs και δείγματα ταυτόχρονα.

Δύο κατηγορία αταίριαστο ανάλυση σημασίας με πολλαπλές δοκιμές (10000 μεταθέσεις ) (SAM) [21] χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό miRNAs που σχετίζονται με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους, χρησιμοποιώντας J-Express (2012 έκδοση) [22]. Η είσοδος για το SAM ομαλοποιήθηκε και log2 μεταμορφωθεί και κλινικοπαθολογικών παραμέτρων χρησιμοποιήθηκαν ως μεταβλητές απόκρισης. Δέκα χιλιάδες επανάληψη μεταθέσεις των δεδομένων που χρησιμοποιήθηκαν για να καθοριστεί εάν η έκφραση του miRNAs συσχετίστηκε σημαντικά με μία από τις ακόλουθες κλινικοπαθολογοανατομικών παραμέτρους: ΤΝΜ, PT, PN, εντοπισμού όγκων, διαφοροποίηση, perinodal διήθηση, η αγγειακή εισβολή και νευρική διήθηση. Το ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη εκφράζεται ως Q-τιμές μικρότερες από 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Σε γενικές γραμμές και μετάσταση επιβίωση χωρίς υπολογίζεται από την ημερομηνία της επέμβασης μέχρι την ημερομηνία του θανάτου ή διάγνωση μετάστασης. Για τον προσδιορισμό των miRNAs που σχετίζονται με τη συνολική και μετάσταση επιβίωση χωρίς μονοπαραγοντική Cox παλινδρόμησης αναλογικών κινδύνων εφαρμόστηκε σε κάθε miRNA, δοκιμή για τις ενώσεις με μετάσταση-δωρεάν ή συνολική επιβίωση. Για να ληφθεί υπόψη για πολλαπλές δοκιμές, ρυθμίστηκε ρ-τιμές υπολογίστηκαν με τον έλεγχο του ρυθμού ψευδών ανακάλυψη (FDR), χρησιμοποιώντας τη διαδικασία Benjamini-Hochberg [23]. Στη συνέχεια, για το σύνολο των miRNAs ταυτόχρονα, λάσο μέθοδος στο μοντέλο αναλογικών κινδύνων κατά Cox [24], όπως εφαρμόστηκε στο παρελθόν [25], χρησιμοποιήθηκε για να ανακαλύψετε μια σειρά από miRNAs που σχετίζονται με τα τελικά σημεία. «Στην λάσο ανάλυση επιλέχθηκαν δεν miRNAs. Δεν miRNAs ήταν σημαντικές στην μονοπαραγοντική ανάλυση Cox μετά από διόρθωση για πολλαπλές δοκιμές. Σε αυτή την τελευταία ανάλυση, επτά miRNAs (miR-339-5p, miR-7-1-3p, miR-365Β-3ρ, miR-454-3p, miR-194-3p, miR-15b-3ρ και HSA-ΜΙΚ 4461) είχε p-τιμή κάτω από 0,01 με την ανάπτυξη μεταστάσεων σαν τελικό σημείο, ενώ τρεις miRNAs (miR-101-5p, HSA-miR-873-5p και HSA-miR-3144-3p) είχαν p-τιμή κάτω από 0,01 με καταληκτικό σημείο τη συνολική επιβίωση . Όλα αυτά τα δέκα miRNAs εκφράστηκαν σε πολύ χαμηλά επίπεδα σε ομάδα μας με την υψηλότερη μέση έκφραση παρατηρήθηκε για miR-454-3p με 187 διαβάζει στο χαμηλότερο για miR-873-3p με 0 διαβάζει.

Pathway Ανάλυση για γονίδια στόχου από τις πέντε πιο υψηλή έκφραση miRNAs

Για να διερευνηθεί η βιολογική επίδραση από τα πιο ιδιαίτερα εξέφρασε miRNAs, τα γονίδια-στόχους εντοπίστηκαν χρησιμοποιώντας TarBase 6.0 [26]. Αυτή η βάση δεδομένων περιέχει γονίδια-στόχους που έχουν πειραματική υποστήριξη εκτός από την πρόβλεψη ακολουθία που βασίζονται. Οι ταυτότητες γονίδιο ανέβηκαν στο web-based DAVID λειτουργικό εργαλείο σχολιασμού για την ανάλυση της οδού χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων KEGG [27], [28].

Αποτελέσματα

Μικρές RNA αλληλουχίας και σχολιασμού

το μήκος των ακολουθιών ανιχνεύεται κυμάνθηκε μεταξύ 13 και 29 νουκλεοτίδια μετά την απομάκρυνση της αλληλουχίας προσαρμογέα (πλέον διαβάζει απομακρύνθηκαν). Το κύριο τμήμα του διαβάζει, 97,9%, ήταν μεταξύ 19 και 23 βάσεις. Κατά μέσο όρο, 2,6 εκατομμύρια διαβάζει χαρτογράφηση στο ανθρώπινο γονιδίωμα ελήφθησαν ανά δείγμα όγκου (Σχήμα 1Α). Έχουμε εντοπίσει τις συχνότητες των διαβάζει εμπίπτουν σε διαφορετικές κατηγορίες των μικρών RNA ή άλλες περιοχές του γονιδιώματος και υπολογίζεται η μέση συχνότητα συγκρίνοντας όλα τα δείγματα όγκων 88. Η συχνότητα των διαβάζει χαρτογράφησης για να ωριμάσει miRNAs κυμαινόταν από 37 έως 77% στις βιβλιοθήκες και έδωσε μια διάμεση τιμή 61% (Σχήμα 1 Β). Για εσονικές /διαγονιδιακές περιοχές διάμεση διαβάσετε συχνότητα 33% βρέθηκε, και για την πρόωρη miRNAs και snoRNAs, η διάμεση διαβάσετε συχνότητες ήταν 4% και 2%, αντίστοιχα (Σχήμα 1C). Επιπλέον ένα μικρό κλάσμα του αναγνώσεις αντιστοιχίζονται με snRNA, miscRNA, tRNA, rRNA, και mRNA, από κοινού περιλαμβάνει μία συχνότητα ~0.05%. MiRNAs με λιγότερο από 10 διαβάζει ολόκληρη όλα τα δείγματα ασθενών θεωρείται ότι δεν εκφράστηκαν. Συνολικά, 523 miRNAs εκφράστηκαν στο σύνολο δεδομένων.

Α. Αριθμός διαβάζει (x10

6) χαρτογραφηθεί στο ανθρώπινο γονιδίωμα (hg19) για όλα τα δείγματα. Αυτές περιλαμβάνουν όλα τα είδη RNA (πρόωρη miRNA, snoRNA, snRNA, miscRNA, rRNA, tRNA και mRNA) .Οι ακολουθίες που δεν ταιριάζει με γνωστή αλληλουχία αντιστοιχήθηκαν εναντίον των βάσεων δεδομένων των διαγονιδιακές και ιντρονικές περιοχές του ανθρώπινου γονιδιώματος. B. Οι συχνότητες των διαβάζει αντιστοιχίζονται σε σχολιασμένο ώριμη miRNAs για όλα τα δείγματα χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων microRNA (miRBase απελευθερώσει 18). Γ πίτα-γράφημα που αντιπροσωπεύει τα ποσοστά των διαφόρων κατηγοριών RNA που βρέθηκε στο σύνολο δεδομένων.

Η

Κανονικοποίηση και Τεχνική αναπαράγει

Σε γενικές γραμμές, να συγκρίνουν τιμές έκφρασης μεταξύ των δειγμάτων, είναι αναγκαίο να ομαλοποίηση κατά τη διαβάσει καταμέτρηση μέσω υπολογισμού του συντελεστή κανονικοποίησης. Οι τέσσερις διαφορετικές μέθοδοι κανονικοποίησης έδωσε πολύ παρόμοια αποτελέσματα όταν συγκρίνεται η μέση μεταβολή υπολογίζεται από τη διαφορά σε επί τοις εκατό για κάθε miRNA διαβάστε μετρούν ανά miRNA (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα σχήματα 2Β και 2Γ δείχνουν την κατανομή των log2 μετατραπεί μη κανονικοποιημένη διαβάσετε μετράει και να διαβάσετε μετράει κανονικοποιούνται κατά ώριμη miRNAs για πέντε τυχαία δείγματα ασθενών. Οι χαμηλότερες μετρήσεις ανάγνωσης δεν ήταν τόσο επηρεάζεται από κανονικοποίηση σε σύγκριση με τις υψηλότερες τιμές. Συνολικά, κανονικοποίηση δημιουργούνται σχετικά ισομερώς κατανεμημένα διαβάσετε μετράει για την πλειοψηφία των miRNAs σε όλα τα δείγματα.

Α. Σύγκριση των τεχνικών επαναλήψεις μεταξύ μετρήσεων 1 και τρέξιμο 2. Κάθε τελεία αντιπροσωπεύει τη συνολική έκφραση μιας ενιαίας miRNA από όλα τα δείγματα ασθενών. Τα στοιχεία έκφρασης των miRNAs ομαλοποιήθηκε και log2 μεταμορφωθεί. B. μη κανονικοποιημένη miRNA διαβάσετε μετράει (log2) για πέντε τυχαία επιλεγμένους ασθενείς. Γ Κανονικοποιημένη miRNA διαβάσετε μετράει (log2) για τους ίδιους πέντε ασθενείς όπως στο Β

Η

48 δείγματα βαθιά αλληλουχία δύο φορές, συμβολίζεται τρέχει 1 και να τρέξει 2, και αυτά τα σύνολα δεδομένων που χρησιμοποιήθηκαν για να συγκρίνουν το αποτελέσματα από τις ξεχωριστές εκτελέσεις. Τα αποτελέσματα έδειξαν μια πολύ καλή συσχέτιση μεταξύ των τεχνικών επαναλήψεων φαίνεται από τη γραμμή μηδενική κλίση (Εικόνα 2Α).

Οι πέντε πιο υψηλή έκφραση miRNAs

Οι πέντε πιο άφθονα εξέφρασε miRNAs σε αυτή την ομάδα ήταν miR-10a-5P, miR-21-5p, miR-22-3p, miR-143-3p και miR-192-5p (Σχήμα 3). Οι μετρήσεις ανάγνωσης για αυτά τα miRNAs αντιπροσώπευαν το 53,7% του συνολικού αριθμού των miRNA ακολουθίες ανιχνεύθηκαν στα δείγματα ασθενών, ενώ οι 20 κορυφαίες miRNAs αντιπροσώπευαν το 82,6% του διαβάζει (Πίνακας S1). Τα υπόλοιπα 503 miRNAs αντιπροσώπευαν το 17,4% του διαβάζει. Από την πρώτη πεντάδα miRNA, miR-192-5p είχε την υψηλότερη μέση τιμή έκφρασης (156.413 αναγνώσεις) ενώ miR-22-3p είχε το χαμηλότερο (35284 αναγνώσεις).

Η διαφορική έκφραση των πέντε πιο άφθονα εκφράζεται miRNAs σε CRC ομάδα μας. Ο συνολικός αριθμός των miRNA αναγνώσεις log2 μεταμορφωθεί. Οι κύκλοι αντιπροσωπεύουν ακραίες τιμές και τα αστέρια αντιπροσωπεύουν ακραίες ακραίες τιμές.

Η

Πολλά γονίδια miRNA που βρίσκονται σε άμεση γειτνίαση με άλλα γονίδια miRNA σε συστάδες γονιδίων, και δύο από τις πέντε πιο υψηλή έκφραση miRNAs (miR-143 -3p και miR-192-5p) αποτελούν μέρος αυτών των συσπειρώσεων. MiR-143-3p και miR-145-5p και οι δύο βρίσκονται στο χρωμόσωμα 5 & lt? 10kb χώρια, ενώ miR-192-5p και miR-194-5p βρίσκονται στο χρωμόσωμα 11 & lt? 10kb χώρια. Τα επίπεδα έκφρασης του miR-143-3p και miR-192-5p και δύο miRNAs που ανήκουν στις αντίστοιχες συστάδες γονιδίων τους που απεικονίζεται στην Εικόνα 4. Δεν συν-έκφραση ήταν εμφανής για τους miRNAs που ανήκουν σε αυτές τις συστάδες γονιδίων, η οποία είναι σε συμφωνία με τις προηγούμενες αποτελέσματα [29].

Α. MiR-143-3p βρίσκεται στο ίδιο σύμπλεγμα γονιδίων όπως miR-145-5p στο χρωμόσωμα 5 (θέσεις 148808481 με 148.808.586 και 148.810.209 έως 148.810.296, αντίστοιχα). MiR-192-5p βρίσκεται στο ίδιο σύμπλεγμα γονιδίων όπως miR-194-5p στο χρωμόσωμα 11 (θέσεις 64658609000000-64658718000000 εκατομμύρια και 64658827 με 64.658.911, αντίστοιχα). Παρά το γεγονός ότι τα miRNAs σε κάθε συστάδα γονιδίων είναι & lt? Δεν παρατηρήθηκε 10kb πέρα, συν-έκφραση

Η

Ανάλυση δρόμος για τα πέντε πιο υψηλή έκφραση miRNAs

1490 γονίδια-στόχους εντοπίστηκαν ως. δυνητικά ρυθμίζεται από miR-10a-5P, miR-21-5p, miR-22-3p, miR-143-3p και miR-192-5p. Οι οδοί με την πιο σημαντική γονίδιο εμπλουτισμού φαίνεται στον Πίνακα 2, και περιλαμβάνονται «Pathways στον καρκίνο» (55 γονίδια? ρ = 3,3 × 10

-7), «κυτταρικού κύκλου» (28 γονίδια? ρ = 2.2 × 10

-6), και «καρκίνος του παχέος εντέρου» (21 γονίδια? p = 1.0 × 10

-5). Εστιάζοντας στην οδό CRC, βρήκαμε ότι τα γονίδια που ρυθμίζονται από τις πέντε πιο υψηλή έκφραση miRNAs περιλαμβάνονται ογκογονίδια (

KRAS, PI3K

), καταστολείς όγκων (APC και ΤΟΡβΚΙΙ), και τα γονίδια επιδιόρθωσης του DNA (hMSH6) και γονίδια που ανήκουν με τις οδούς Wnt και ΜΑΡΚ σηματοδότηση (Εικόνα 5).

αποτελέσματα ανάλυσης οδός για τα γονίδια στόχους των πέντε πιο υψηλής έκφρασης miRNAs στο ορθοκολικό καρκίνο μονοπάτι. Η εικόνα πάρθηκε από τη βάση δεδομένων KEGG και τα miRNAs προστέθηκαν σε μπλε γραμματοσειρά για να υποδείξει τους στόχους που ρυθμίζονται από αυτά τα miRNAs.

Η

Συσχέτιση μεταξύ qRT-PCR και Deep αλληλουχίας δεδομένων

οι τιμές έκφρασης για έξι miRNA miR-21, miR-31, miR-92a, miR-101, miR-106a και miR-145, είχαν προηγουμένως καθοριστεί χρησιμοποιώντας qRT-PCR [19]. Η έκφραση μετρήθηκε με miRNA qRT-PCR σε σύγκριση με τα δεδομένα βαθιά αλληλούχιση χρησιμοποιώντας ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης των κανονικοποιημένων τιμών Ct (qRT-PCR) και τα δεδομένα αλληλούχισης βαθιά log2-μεταμορφωθεί. Τα R

2 τιμές για τις 6 miRNAs που εξετάστηκαν ήταν 0,06, 0,38, 0,10, 0,001, 0,03, και 0,28 για το miR-21, miR-31, miR-92a, miR-101, miR-106a και miR-145 , αντίστοιχα. Το άθροισμα των συνολικών επιπέδων έκφρασης υπολογίστηκε επίσης για αυτά τα miRNAs για κάθε μέθοδο, και τα σχετικά επίπεδα που φαίνεται στο Σχήμα 6. Η σχετική έκφραση μεταξύ των επιμέρους miRNAs ήταν εύλογα συνεπείς μεταξύ μέθοδοι για τέσσερα από τα miRNAs (MIR-21, miR-31 , miR-92a και miR-106a), ενώ υπήρχαν σαφείς διαφορές για miR-101 και miR-145. MiR-101 ήταν δύσκολα ανιχνεύσιμη με qRT-PCR, αλλά παρουσίασαν ανιχνεύσιμες τιμές έκφραση με βαθιά αλληλουχίας, ενώ miR-145 ανιχνεύθηκε από qRT-PCR και δύσκολα ανιχνεύονται χρησιμοποιώντας βαθιά αλληλουχίας.

Οι κανονικοποιημένες τιμές έκφρασης log2 μεταμορφωθεί και αναλύθηκαν από ανεξέλεγκτους αμφίδρομη ιεραρχική ομαδοποίηση με μέσο σταθμισμένο σύνδεση (WPGMA). Η παγκόσμια χάρτης περιέχει όλες τις εκφράζονται miRNAs εμφανίζονται κάθετα και τα δείγματα ασθενών σε οριζόντια θέση.

Η

Ιεραρχική Ομαδοποίηση και Συλλόγων μεταξύ miRNA έκφραση και κλινικοπαθολογικών παραμέτρων

Τα πρότυπα έκφρασης των miRNAs που παρατηρήθηκαν με ιεραρχική ομαδοποίηση εμφανίζονται στην Εικόνα 7 με miRNAs στον κάθετο άξονα και τα δείγματα ασθενούς στον οριζόντιο άξονα. Τα περισσότερα από τα miRNAs παρουσίασαν πολύ παρόμοια επίπεδα έκφρασης σε όλη δείγματα ασθενών. Σε περιοχές του οικοπέδου, μερικοί miRNAs φάνηκε να εκφράζονται διαφορικά, αλλά αυτά ήταν σχεδόν αποκλειστικά βρίσκεται μεταξύ των miRNA που είχαν πολύ χαμηλή έκφραση. SAM ανάλυση των στοιχείων έκφρασης και κλινικοπαθολογικών παραμέτρων έδειξε ότι η υψηλή έκφραση του miR-10b-5P και miR-615-3p και χαμηλή έκφραση του miR-592 συσχετίσθηκαν με όγκους που βρίσκεται στην δεξιά κόλον (συμπεριλαμβανομένου του αύξουσα και εγκάρσιο κόλον) σε σύγκριση με το αριστερό κόλον και το ορθό (Πίνακας 3). Η έκφραση αυτών των miRNAs έδειξε 2.4-φορές, 41.4 φορές και 3,9-φορές διαφορές, αντίστοιχα (q & lt? 0,05 για όλες τις miRNAs) (Σχήμα 8). Υψηλή έκφραση του miR-615-3p συσχετίστηκε επίσης με ελάχιστα διαφοροποιημένο όγκους σε σύγκριση με ενδιαμέσως και καλά διαφοροποιημένου όγκων (πάσο αλλαγή 44,4, q & lt? 0,05).

Η έκφραση των έξι miRNAs (miR-21, ΜΙΚ 31, miR-92a, miR-101, miR-106a και miR-145) παρουσιάζεται από βαθιά αλληλουχίας και qRT-PCR για 88 δείγματα ασθενών που αναλύθηκαν με τις δύο μεθόδους. A. Οι μπάρες αντιπροσωπεύουν το άθροισμα του συνολικού αριθμού των διαβάζει (x10

6) για κάθε miRNA από βαθιά αλληλουχίας. B. Οι μπάρες αντιπροσωπεύουν το άθροισμα της σχετικής έκφρασης (2

-dCt) από qRT-PCR.

Η

Υψηλή έκφραση του miR-10b-5P και miR-615-3p και χαμηλή έκφραση του miR-592 συνδέθηκαν με όγκο εντοπίζεται στο δεξιό κόλον σε σχέση με το αριστερό του παχέος εντέρου και του ορθού (Q & lt? 0.001 και p & lt? 0.001).

η

Σύλλογοι μεταξύ miRNA έκφραση και Αποτέλεσμα

στην λάσο και μονοπαραγοντική ανάλυση Cox, 5 miRNAs (miR-339-5p, miR-7-1-3p, miR-365Β-3ρ, miR-454-3p, miR-194-3p και ΜΙΚ 15β-3ρ) με την ανάπτυξη μεταστάσεων σαν τελικό σημείο εμφανίστηκε και ένα miRNA (miR-101-5p) με τελικό σημείο τη συνολική επιβίωση είχε εντοπιστεί, ωστόσο κανένα από αυτά παρέμεινε σημαντικά σχετίζονται είτε με συνολικά- ή μετάσταση επιβίωση χωρίς εξέλιξη μετά την προσαρμογή για πολλαπλές δοκιμές. Όλα τα miRNAs που προσδιορίζονται από τις αναλύσεις αυτές εκφράστηκαν σε πολύ χαμηλά επίπεδα σε ομάδα μας με την υψηλότερη μέση έκφραση παρατηρήθηκε για miR-454-3p με 187 διαβάζει στο χαμηλότερο για miR-194-3p με μόνο 19 διαβάζει.

Συζήτηση

στην παρούσα εργασία, βαθιά αλληλουχίας χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης των miRNAs σε μια μεγάλη ομάδα των δειγμάτων όγκου CRC. Αυτή η προσέγγιση μπορεί να συμβάλει πιθανά πλεονεκτήματα σε σφαιρική ανάλυση της έκφρασης των miRNAs, αλλά συνεπάγεται επίσης νέες προκλήσεις όσον αφορά την ανάλυση των δεδομένων, καθώς η ποσότητα των δεδομένων που συλλέγονται μετά από βαθιά αλληλουχίας περιέχει εκατομμύρια διαβάζει τα οποία πρέπει να αντιστοιχιστεί στο γονιδίωμα και ομαλοποιημένη [30]. Στις 88 CRC ασθενείς που αναλύθηκαν με επιτυχία, 523 ώριμη miRNAs εντοπίστηκαν. Άλλες μικρές αλληλουχίες RNA ανιχνεύθηκαν επίσης, αλλά οι χαμηλές συχνότητες ανίχνευση άλλων κλάσεων RNA και γενωμικές περιοχές έδειξαν ότι η επιλογή για miRNAs ήταν επιτυχής, και σύμφωνα με τα προηγούμενα αποτελέσματα [29], [31]. Επιπλέον, η εξαιρετική συμφωνία που παρατηρείται μεταξύ της τεχνικής επαναλήψεων πρότεινε επαρκή επαναληψιμότητα.

Οι πέντε miRNAs πιο άφθονα εκφράζεται στο εξετάστηκαν CRC ομάδα ήταν miR-10a-5P, miR-21-5p, miR-22-3p, miR-143-3p και miR-192-5p, και όλα αυτά έχουν δείξει προηγουμένως να απορυθμίζεται σε CRC [32] – [38]. Αυτά τα miRNAs ήταν επίσης μεταξύ των πιο υψηλή έκφραση miRNAs σε μια προηγούμενη μελέτη πραγματοποιήθηκε με τη χρήση βαθιά αλληλουχίας των 8 δειγμάτων CRC και των αντίστοιχων φυσιολογικών ιστών [39]. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι πέντε πιο υψηλή έκφραση miRNAs αντιπροσωπεύουν όσο το 54% του συνολικού αριθμού των miRNA ακολουθίες ανιχνεύονται. Αυτό είναι σε συμφωνία με μια προηγούμενη μελέτη βαθύ αλληλούχιση πραγματοποιήθηκε σε δείγματα περιφερικού αίματος, στην οποία η οικογένεια ας-7 αντιπροσώπευε το 77% του συνόλου των miRNA διαβάσει μετρήσεις [29]. Η σχετική σημασία της υψηλής έναντι χαμηλής έκφρασης των miRNAs είναι δύσκολο να ερμηνευθούν, δεδομένου ότι η απουσία ή η άφθονη παρουσία miRNAs μπορούν να αντιπροσωπεύουν εξίσου σημαντικές βιολογικές ρυθμιστικά σήματα. Ωστόσο, υπερεκπροσώπηση ενός μικρού αριθμού των miRNAs μπορεί να σημαίνει ότι αυτά τα miRNA παίζουν σημαντικό ρόλο ως αρνητικοί ρυθμιστές της κατάντη στόχους και τις βιολογικές οδούς που επηρεάζονται από αυτούς τους στόχους. Οι προβλεπόμενες στόχοι των 5 πιο εντόνως εκφρασμένα miRNAs συσχετίστηκαν σε σημαντικό βαθμό με τον καρκίνο σχετικές οδούς, συμπεριλαμβανομένων της οδού CRC. Μεταξύ των προβλεπόμενων στόχων στην οδό CRC ήταν ογκογονίδια, καταστολείς όγκων και των γονιδίων επιδιόρθωσης του DNA τα οποία εμπλέκονται σε αρκετές σημαντικές μονοπάτια σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένων Wnt, ΜΑΡΚ, του κυτταρικού κύκλου, ΤΟΡ-β, και ρ53. Προβλεπόμενη στόχους (hMSH2 και hMSH6) συμμετείχαν επίσης με αρνητική ρύθμιση των γονιδίων επιδιόρθωσης του DNA που επηρεάζουν μικροδορυφόρων και έτσι εμπλέκονται στην μικροδορυφορικού μονοπάτι αστάθειας. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η εντοπίστηκαν πέντε πιο υψηλή έκφραση των miRNAs είναι καρκίνος σχετικές και πιθανώς σχετικές με CRC, αλλά απαιτείται περαιτέρω έρευνα για την επικύρωση των στόχων και να αξιολογήσουν κατάντη αποτελέσματα.

Ένα από τα υποτιθέμενα πλεονεκτήματα της βαθιάς αλληλουχίας σε σύγκριση με ανάλυση μικροσυστοιχιών και qRT-PCR είναι βελτιωμένη ειδικότητα και ευαισθησία, γεγονός που υποδηλώνει ότι η μέθοδος αυτή θα επιστρέψει πιο σωστές μετρήσεις κάθε miRNA από τις άλλες μεθόδους. Κατά τη σύγκριση των προηγούμενων αποτελεσμάτων μας, μετρώντας την έκφραση των έξι miRNA χρησιμοποιώντας qRT-PCR με τα δεδομένα βαθιά αλληλουχίας, η συσχέτιση στο επίπεδο επιμέρους δείγμα ήταν κακή για όλα τα miRNAs που εξετάστηκαν. Βαθιά αλληλουχίας συχνά επικυρώνονται από qRT-PCR, αλλά περιεκτική συγκρίσεις μεταξύ των δύο προσεγγίσεων δεν έχουν πραγματοποιηθεί. Σε μια μελέτη βαθιά αλληλουχίας σε δείγματα καρκίνου της ουροδόχου κύστης 9, επιλέγεται miRNAs από βαθιά αλληλουχίας επικυρώθηκαν από qRT-PCR, και ανέφερε ότι συσχετίζονται καλά όταν αναλυθούν από φορές διαφορές έκφρασης σε οικόπεδο μπαρ [40]. Σε μια άλλη μελέτη που πραγματοποιήθηκε σε 10 δείγματα νευροβλαστώματος, συντελεστές συσχέτισης μεταξύ 0,1 και 1 αποτελέσματα κατά τη σύγκριση του αθροίσματος της έκφρασης miRNA από qRT-PCR και αλληλούχιση βαθιά [41]. Οι μεγαλύτερες διαφορές σε σχέση μας μεταξύ qRT-PCR και αλληλούχιση αποτελέσματα για miR-101 και miR-145. Η δοκιμασία που χρησιμοποιείται για qRT-PCR, καθώς και η ανάλυση αλληλουχίας και οι δύο σε θέση να ανιχνεύσει, αλλά όχι για το διαχωρισμό μεταξύ γνωστές ισομορφές αυτών miRNAs. Στα δεδομένα αλληλουχίας, να μην υπάρχουν μεταβολές νουκλεοτιδίων βρέθηκαν που θα μπορούσε να εξηγήσει τις διαφορές. Στη θεωρία, η απουσία ανίχνευσης miR-101 με qRT-PCR μπορεί να είναι ένα ζήτημα ευαισθησία, ενώ για miR-145, έλλειψη εξειδίκευσης της δοκιμασίας qRT-PCR μπορεί να εξηγήσει τις διαφορές. Έτσι, φαίνεται ασαφές αν qRT-PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί για σκοπούς επικύρωσης, αφού qRT-PCR και τα δεδομένα βαθιά αλληλουχίας παράγονται με διαφορετικές μεθόδους και εμφανίζονται σε διαφορετικές κλίμακες με μεταβλητό εύρος έκφρασης, γεγονός που καθιστά δύσκολο να συγκριθούν τα δύο σύνολα δεδομένων σε έναν ασθενή -να-ασθενή βάση.

Ένας από τους στόχους της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση συσχετίσεων μεταξύ της έκφρασης των miRNAs και κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους και το αποτέλεσμα. Δεδομένης της χαμηλής μεταβλητότητας που παρατηρείται μεταξύ των δειγμάτων, δεν είναι έκπληξη το γεγονός ότι εντοπίστηκαν λίγες τέτοιες ενώσεις. Χρησιμοποιώντας μονοπαραγοντική Cox παλινδρόμησης αναλογικών κινδύνων, δεν miRNAs βρέθηκαν να σχετίζονται με την ανάπτυξη μετάσταση ή τη συνολική επιβίωση μετά από διόρθωση για πολλαπλές δοκιμές. Δεν miRNA επιλέχθηκαν στο λάσο ανάλυση. Χαμηλή έκφραση του miR-592 και υψηλή έκφραση του miR-10b-5P και miR-615-3p συσχετίστηκαν με όγκους που βρίσκεται στο δεξί κόλον σε σύγκριση με όγκους στο αριστερό κόλον και του ορθού. Υψηλή έκφραση του miR-615-3p συσχετίστηκε επίσης με χαμηλή διαφοροποίηση όγκων. MiR-10b προηγουμένως αναφερθεί ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω σε CRC και υψηλή έκφραση συσχετίστηκε με προχωρημένο pT-στάδιο [42], αλλά κανένα τέτοιο ενώσεις ανιχνεύθηκαν σε ομάδα μας. MiR-592 έχει προηγουμένως βρεθεί να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε όγκους με ανεπάρκεια επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων σε σύγκριση με αναντιστοιχία επισκευή ικανός όγκους [43], [44]. Ελλιπή επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων προκαλεί αστάθεια μικροδορυφόρου, και σε σποραδικές CRC, μικροδορυφόρων ασταθή όγκοι συχνά βρίσκονται στη δεξιά πλευρά του παχέος εντέρου [45], [46]. Έτσι, η χαμηλή έκφραση του miR-592 σε όγκους του δικαιώματος του παχέος εντέρου στην παρούσα μελέτη θα είναι συνεπής με τα προηγούμενα ευρήματα, αλλά δεδομένου ότι πολύ λίγα είναι σήμερα γνωστά σχετικά με τους στόχους του παρόντος miRNA, διευκρινίζοντας αυτό το ζήτημα θα απαιτηθούν περαιτέρω μελέτες. MiR-615 παρουσίασαν την πιο εντυπωσιακή διαφορά σε έκφραση μεταξύ του δεξιού και του αριστερού κόλον σε αυτή την ομάδα, και ήταν επίσης εντόνως εκφρασμένο σε φτωχά διαφοροποιημένοι όγκοι. Υπάρχουν μερικές αναφορές σχετικά με την έκφραση και τη λειτουργία αυτού του miRNA, αλλά σε μία μελέτη, miR-615 έκφρασης μειωτικά όταν η προτεινόμενη ογκοκατασταλτικό NGX6 πειραματικά εισήχθη στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά CRC ΗΤ29. Στην ομάδα μας, 7 από τα 10 χαμηλής διαφοροποίησης όγκοι βρίσκονται στο δεξιό κόλον.