Αφηρημένο

microRNAs (Mirs) ρυθμίζουν τα επίπεδα έκφρασης των mRNAs και πρωτεϊνών και μπορεί έτσι να συμβάλει στην έναρξη και εξέλιξη του καρκίνου . Εκτός από ενδοκυτταρικού λειτουργία τους, Mirs απελευθερώνονται από τα κύτταρα και να ρίξει στην κυκλοφορία. Έχουμε δεδομένο ότι κυκλοφορούν Mirs θα μπορούσε να προσφέρει διορατικότητα μονοπάτια μεταβάλλεται κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου και μπορεί να αναφέρει ανταπόκριση στη θεραπεία. Εδώ εστιάζουμε σε καρκίνο του παγκρέατος κακοήθη εξέλιξη. Αναφέρουμε ότι οι αλλαγές στα πρότυπα έκφρασης του miR κατά τη διάρκεια της εξέλιξης των φυσιολογικών ιστών στην επεμβατική αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος στο P48-Cre /LSL-Kras

μοντέλο G12D ποντίκι αντικατοπτρίζει τις αλλαγές miR παρατηρούνται σε ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς. miR-148a /b και miR-375 έκφρασης βρέθηκαν μειώθηκαν ενώ miR-10, miR-21, miR-100 και miR-155 αυξήθηκαν κατά τη σύγκριση των φυσιολογικών ιστών, προκαρκινικές αλλοιώσεις και διηθητικό καρκίνωμα στο μοντέλο ποντικού. Προβλεπόμενο στόχο mRNAs FGFR1 (miR-10) και MLH1 (miR-155) βρέθηκαν μειωτικά. Η ποσοτικοποίηση των εννέα microRNAs σε δείγματα πλάσματος από ασθενείς διακρίνονται καρκίνων του παγκρέατος από άλλους καρκίνους, καθώς και μη-καρκινικές παγκρεατική νόσο. Τέλος, η θεραπεία γεμσιταβίνη των ζώων ελέγχου και Ρ48-Cre /LSL-Kras

G12D ζώα με καρκίνο του παγκρέατος προκάλεσε διακεκριμένες και έως 60 φορές αλλαγές στα κυκλοφορούντα Mirs που δείχνουν διαφορετικές επιδράσεις του φαρμάκου σε φυσιολογικούς και καρκινικούς ιστούς. Τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν τη σημασία της ανίχνευσης Mirs στην κυκλοφορία και δείχνει ότι κυκλοφορούν Mirs θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως δείκτες της ανταπόκρισης των ναρκωτικών

Παράθεση:. LaConti JJ, Shivapurkar Ν, Preet Α, Deslattes Mays Α Πέραν Ι, Κιμ SE , et al. (2011) ιστών και ορού microRNAs στο Kras

G12D διαγονιδιακό μοντέλο των ζώων και σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 6 (6): e20687. doi: 10.1371 /journal.pone.0020687

Επιμέλεια: Janine Santos, Πανεπιστήμιο Ιατρικής και Οδοντιατρικής του Νιου Τζέρσεϊ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20 Γενάρη, 2011? Αποδεκτές: 6 Μαΐου 2011? Δημοσιεύθηκε: 27 του Ιούνη 2011

Copyright: © 2011 LaConti et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγούν CA108440 (AW), US DOD CDMRP (JJL), η Lombardi Cancer Center (NS), το Ίδρυμα Gordon (AW), το Ίδρυμα Lustgarten (ATR) και η Ruesch Center (JLM και AW). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

microRNAs (miRNAs ή Mirs) είναι μικρά, μη-κωδικοποίησης RNAs που παίζουν σημαντικό ρόλο στον έλεγχο των δραστηριοτήτων των κυτταρικών μονοπατιών τόσο στη φυσιολογία και την παθολογία (βλέπε π.χ. [1]). Η διακριτή λειτουργία του Mirs σε διαφορετικές καρκίνους έχει γίνει πιο εμφανής κατά τα τελευταία χρόνια [2], [3], και πολλές μελέτες δείχνουν ότι miR υπογραφές μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη διάκριση διαφορετικών καρκίνων [4], [5], [6], [7] προγνώσεις [8], [9], [10], [11], [12], [13], ή να αποκαλύψει πιθανούς στόχους [14], καθώς μεταβάλλεται μονοπατιών σηματοδότησης [15]. Πιο απροσδόκητα, η σύγκριση των miR και mRNA προφίλ των πρωτογενών και μεταστατικών βλαβών του καρκίνου έδειξαν ότι Mirs παρέχεται μια πιο αξιόπιστη και χαρακτηριστική υπογραφή από mRNAs και διαπίστωσε ότι miR υπογραφές ήταν ανώτερα mRNAs στον εντοπισμό της πηγής όργανο των μεταστάσεων άγνωστης προέλευσης [16] , [17]. Πέρα από αυτές τις αναλύσεις των φυσιολογικών και νοσούντων ιστών, πιο πρόσφατες αναφορές έχουν δείξει ότι τα είδη miR μπορεί να ανιχνευθεί στην κυκλοφορία [18] και πρότεινε ότι η ανάλυση των δειγμάτων ορού για καθορισμένα είδη miR θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τον εντοπισμό ασθενών με καρκίνους [19], [ ,,,0],20], [21], [22], [23], [24], [25], καθώς και άλλες ασθένειες όπως η καρδιακή νόσος [26], [27], [28], [29], [30] ή σακχαρώδη διαβήτη [31].

Ακολουθίες Mirs συχνά συντηρημένη μεταξύ των ειδών και εμείς εικάζουν ότι η ανάλυση των Mirs σε ένα καλά καθορισμένο ζωικό μοντέλο θα μπορούσε να ενημερώσει μελέτες με δείγματα ασθενών. Μας ενδιαφέρει ιδιαίτερα να αξιολογηθεί κατά πόσον αυτό θα μπορούσε να μεταφραστεί στην ανίχνευση και ποσοτικοποίηση της Mirs στην κυκλοφορία, επειδή αυτό θα μπορούσε τελικά να αποκαλύπτουν ενεργοποιηθεί ή τροποποιηθεί οδών νόσου με βάση την ανάλυση ενός δείγματος αίματος και όχι την ανάλυση των νοσούντων δείγματος ιστού [32] . Επιπλέον, οι θεραπείες θα τον πιθανό αντίκτυπο miR μοτίβα στην κυκλοφορία και τα πρότυπα αυτά μπορεί να είναι χρήσιμη για τον καθορισμό των υπογραφών των επιδράσεων του φαρμάκου.

Εδώ επικεντρωθήκαμε για τον καρκίνο του παγκρέατος, που διαγνώστηκε σε 43.140 ασθενείς το 2010. Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια θανατηφόρα ασθένεια, με ποσοστό επιβίωσης 5 ετών μόνο το 6% [33]. Αυτή η κακή έκβαση οφείλεται στην καθυστέρηση ανίχνευσης, καθώς και η έλλειψη αποτελεσματικών θεραπειών [34]. Για τον εντοπισμό ενημερωτικό Mirs, χρησιμοποιήσαμε ένα γενετικά μοντέλο ποντικού, η P48-Cre /LSL-Kras

G12D μοντέλο, που περιγράφηκε για πρώτη φορά από Hingorani

et al.

[35]. Αυτό το μοντέλο αναπαράγει πιστά την κακοήθη εξέλιξη παρατηρείται στην ανάπτυξη του ανθρώπινου PDAC [34], [35], καθώς και πολυάριθμες μελέτες με αυτό το μοντέλο περιόρισε τα κύτταρα προέλευσης των PDAC [36] και έδειξε τη συμβολή των διαφορετικών γονιδίων οδηγού [37], [38 ], [39] που ελέγχουν την βιολογία και την εξέλιξη της νόσου αυτής [40]. Χρησιμοποιήσαμε ιστοί συλλέχθηκαν σε διαφορετικά στάδια της κακοήθη εξέλιξη από αυτό το πρότυπο ποντικού για την αξιολόγηση ενός πάνελ Mirs που είχε δειχθεί ότι είναι ανάντη ή ρυθμίζεται προς τα κάτω σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του παγκρέατος και είχε αναθεωρηθεί και συγκεντρώθηκαν πρόσφατα από Seux και συνεργάτες [41 ]. Η ανάλυση αυτή στη συνέχεια ακολουθείται από ποσοτικό προσδιορισμό της Mirs στην κυκλοφορία ασθενών με παγκρεατικό και άλλους καρκίνους ή ελέγχων και βρήκαμε πρότυπα έκφρασης miR που διακρίνονται μεταξύ των διαφόρων ομάδων. πρότυπα έκφρασης miR σε ορό από πειραματόζωα παράλληλα τα ευρήματα σε ασθενείς. Τέλος, η θεραπεία των ζώων με την γεμσιταβίνη αντικαρκινικό φάρμακο που έχει εγκριθεί για τη θεραπεία πρώτης γραμμής του καρκίνου του παγκρέατος [42], έδειξε μια σαφή αλλαγή μοτίβο σε επίπεδα miR στην κυκλοφορία των ζώων με καρκίνο του παγκρέατος έναντι ελέγχων.

Αποτελέσματα

έκφραση microRNA σε παγκρεατικά ιστούς κατά τη διάρκεια Kras

G12D που προκαλείται από κακοήθη εξέλιξη

Μια ομάδα Mirs σταθερά πάνω ή προς τα κάτω-ρυθμίζονται σε διάφορες μελέτες σε ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς σε σχέση με κανονική παγκρέατος ιστούς επιλέχθηκε από τη λογοτεχνία και τη βάση δεδομένων αναζητήσεις (βλέπε πίνακα S1? Refs [7], [41], [43], [44], [45]). Για αυτό το πάνελ miR ιδρύσαμε ποσοτική ανίχνευση RT-PCR [46] επειδή περιμέναμε ένα ευρύ φάσμα συγκεντρώσεων miR κατά τη σύγκριση εκχυλίσματα ιστού έναντι δειγμάτων αίματος ή σε ολόκληρη την ανθρώπινη και ποντικού δείγματα.

Ποντίκια δείγματα παγκρεατικού ιστού συλλέχθηκαν σε διαφορετικών ηλικιών από το μοντέλο ποντικού Ρ48-Cre /LSL-Kras

G12D. Παγκρέατος επιθήλια αγωγός σε αυτά τα ζώα πρόοδος μέσω πρώιμη και όψιμη δυσπλαστικών αλλοιώσεων, PanIN (= παγκρέατος in situ καρκίνωμα) κατά την περίοδο αρκετών μηνών σε διηθητικό καρκίνο και επομένως μιμούνται κακοήθη εξέλιξη της ανθρώπινης ασθένειας [34], [35]. Κάθε δείγμα ιστού συγκομίζονται ανέβηκε από ιστολογική ανάλυση του παγκρεατικού πόρου αλλαγές (Εικόνα 1Α). Συγκριτικοί ιστοί περιείχαν 100% της κανονικής αγωγούς (Σχήμα 1Β). Πάγκρεας νεότερους ποντίκια (Σχήμα 1C) περιείχε περισσότερο από 50% των αγωγών με αλλοιώσεις δυσπλαστικά πρώιμο στάδιο (PanIN-1 ή -2). Πάγκρεας μεγαλύτερα ποντίκια (Σχήμα 1 D) περιείχε ~ 10% των αγωγών με αλλοιώσεις δυσπλαστικά προχωρημένο στάδιο (PanIN-3) εκτός από -50% των αγωγών με PanIN-1 ή -2. PDAC ιστοί που περιέχονται κυρίως διηθητικό αδενοκαρκίνωμα (Σχήμα 1 Ε).

(Α) Ο ποσοτικός προσδιορισμός της ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις στο πάγκρεας των ελέγχων ή P48-Cre /Kras

ποντίκια G12D. Τα δείγματα χωρίστηκαν σε ελέγχους, πρώιμες βλάβες στάδιο δυσπλαστικά (PanIN-1 και -2), αλλοιώσεις όψιμου σταδίου δυσπλαστικά (PanIN-3 υπάρχει) και επεμβατική παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα αγωγού (PDAC). (Β έως Ε) Εκπρόσωπος ιστοπαθολογική εικόνες από κάθε μία από τις ομάδες: (Β) κανονικό πάγκρεας, (C) PanIN-1 και -2 (αρχές), (Δ) PanIN-3 (τέλη) και (Ε) PDAC. Μέσος ± τυπικό σφάλμα του% του παγκρεατικού ιστού με τις αντίστοιχες αλλοιώσεις δείχνεται (η = 3 ζώα για κάθε ομάδα). 0, δεν ανιχνεύεται

Η

Ανάλυση της έκφρασης των ατομικών Mirs έδειξε τρεις μεγάλες τάσεις (Σχήμα 2Α-C):. Πρώτον, η έκφραση του miR-10, miR-16, miR-21, ΜΙΚ 100 και miR-155 αυξήθηκε στις πρώιμες βλάβες PanIN σχέση με τον έλεγχο, και διατηρήθηκε υψηλή έκφραση στα τέλη της δεκαετίας PanIN και αδενοκαρκίνωμα ιστούς. (Σχήμα 2Α) Δεύτερον, miR-22, miR-148a /b, miR-212, και miR-375 ήταν εντόνως εκφρασμένο σε ιστούς ελέγχου και η έκφραση τους μειώθηκε σε PanIN (Σχήμα 2C), καθώς και σε ιστούς αδενοκαρκίνωμα. Τρίτον, η έκφραση του miR-29b, miR-34a /c, miR-141, miR-199, miR-210C και miR-301a δεν άλλαξε σημαντικά κατά τη διάρκεια του κακοήθους εξέλιξης (Σχήμα 2Β).

(Α- Γ) Τα επίπεδα έκφρασης των ατομικών Mirs στον έλεγχο και παγκρεατικούς ιστούς σε διάφορα στάδια της κακοήθους μετασχηματισμού. Τα επίπεδα Mirs ομαδοποιήθηκαν ως αυξάνεται (Α), σταθερή (Β), ή μειώνοντας (C) με βάση μια σύγκριση των επιπέδων σε κάθε ομάδα (η = 3 ανά ομάδα). Μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα παρουσιάζεται για κάθε έκφραση του miR. (D) Ιεραρχική ομαδοποίηση των ιστών του ποντικιού με βάση την έκφραση του miR. Οι διακριτές ομάδες που υποδεικνύεται από το μπλε και το κίτρινο κουτί. (Ε) Ιεραρχική ομαδοποίηση των Mirs με βάση τα επίπεδα έκφρασης τους. Οι Mirs που εκφράστηκαν σε υψηλά επίπεδα σε έλεγχο (blue box) έναντι των ιστών PDAC (κίτρινο κουτί) που υποδεικνύεται. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001? ελέγχου εναντίον νωρίς PanIN, αργά PanIN, ή PDAC. #: Au & gt? 0,85 και p = 0,06, ##: au & gt? 0,85 και p & lt? 0.05, ###: au & gt? 0,90 και p & lt? 0,01. (Au, περίπου αμερόληπτη πιθανότητα).

Η

Διακριτές ομαδοποίηση των Mirs και των παγκρεατικών ιστών με διαφορετικά στάδια της νόσου

Ένα από ανεξέλεγκτους ομαδοποίηση των ιστών του ποντικιού με βάση τα επίπεδα έκφρασης τους miR εντοπίστηκαν τρεις διακριτές ομάδες (Σχήμα 2D). Οι ιστοί ελέγχου διαχωρίζεται από όλους τους άλλους ιστούς σε μια ομαδοποίηση των δικών τους (blue box). Πέντε από έξι ιστών που ταξινομούνται ως in situ αλλοιώσεις (PanIN) συνενώθηκαν μαζί σε μια δεύτερη ομάδα. Διηθητικό αδενοκαρκίνωμα και ένα από τα τέλη της δεκαετίας ιστών PanIN διαχωρίζονται σε περαιτέρω διασποράς (κίτρινο κουτί). Έτσι, το σύνολο των Mirs αναλύονται εδώ είναι επαρκής για να διακρίνει τα διάφορα στάδια των μεταλλαγμένων Kras που προκαλείται από παγκρεατικά κακοήθη εξέλιξη.

Ανεξέλεγκτη ομαδοποίηση των επιμέρους Mirs διεξήχθη για να καθορίσει ποια Mirs συμπεριφέρονται παράλληλα και μπορεί να χρησιμεύσει ως κοινές υπογραφές συμπίπτει με το στάδιο της νόσου (Σχήμα 2Ε). Μία ομάδα (κίτρινο κουτί) που περιέχονται αυτά τα Mirs που έδειξαν την υψηλότερη έκφραση στους ιστούς αδενοκαρκινώματος και τη χαμηλότερη στους ιστούς ελέγχου. Μια ξεχωριστή ομάδα (blue box) έδειξε μια αμοιβαία πρότυπο έκφρασης miR, με τα υψηλότερα επίπεδα στους ιστούς ελέγχου και τα χαμηλότερα επίπεδα σε αδενοκαρκίνωμα. Αυτές οι ομάδες δείχνουν ότι ένα υποσύνολο των Mirs μπορεί να καθορίσει την κατάταξη ενός ιστού επιβεβαιώνουν προηγούμενη εργασία από τους άλλους με διαφορετικά δείγματα ανθρώπινου καρκίνου [16], [17].

Μια σύγκριση των ευρημάτων στο μοντέλο ποντικού (Σχήμα 1 & amp ? 2) με δημοσιευμένες μελέτες σε ανθρώπινους καρκίνους του παγκρέατος δείχνει τις ίδιες ποιοτικές αλλαγές για τα περισσότερα από δώδεκα Mirs αναλύθηκαν στα δύο ρυθμίσεις (Πίνακας S1? Refs [7], [43], [44], [45]): Επτά Mirs αυξορρυθμίζεται καρκίνος έναντι φυσιολογικών ιστών στο μοντέλο ποντικού ήταν επίσης ρυθμίζεται προς τα πάνω σε ανθρώπινους καρκίνους. Πέντε Mirs βρέθηκαν μειωτικά στο μοντέλο ποντικού, τέσσερα επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω ή δεν έδειξαν καμία αλλαγή σε μελέτες με ανθρώπινα δείγμα. Μόνο miR-212 ρυθμίζεται αυξητικά σε ανθρώπινα και προς τα κάτω σε δείγματα PDAC ποντικού. Είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι η ασυμφωνία του miR-212 μεταξύ των ανθρώπων και των PDAC ποντίκι δείγματα μπορούν να αναφέρουν τα είδη των διαφορών των αλληλεπιδράσεων των επιθηλιακών-στρώματος κατά τη διάρκεια κακοήθη εξέλιξη [47]. Συνολικά, η στενή σύμπτωση των miR αλλάζει σε κακοήθη παγκρέατος ιστούς σε όλα τα είδη και σε διάφορες μελέτες δείχνουν ότι η κλινική του παγκρέατος αδενοκαρκίνωμα εκπροσωπείται επίσης από το P48-Cre /LSL-Kras

G12D ζωικό μοντέλο.

Η έκφραση της γονιδίων στόχων miR και Mirs στο ποντίκι του παγκρέατος ιστούς

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η κύρια δραστηριότητα της Mirs (84%) είναι οι επιπτώσεις τους στο στόχο mRNA επίπεδα σταθερής κατάστασης [48]. Για να assss αυτό στο μοντέλο ποντικού, προσδιορίσαμε στόχους mRNA υποψήφιο από μια αμερόληπτη λίστα των υπό-εκφράζεται mRNAs σε ανθρώπινους καρκίνους του παγκρέατος και αντιστοιχίζονται αυτοί με τον πίνακα miR μελετήθηκαν εδώ (Πίνακας S3). Το σύνολο των γονιδίων που ταιριάζουν προς τα κάτω σε καρκίνο του παγκρέατος περιέχει MLH1 ως προβλεπόμενο στόχο για miR-155, και FGFR1 ως στόχος του miR-10. Σε μια σύγκριση των φυσιολογικών και καρκινικών ιστών που συλλέγονται από την έκφραση του mRNA μοντέλα ποντικών του MLH1 και FGFR1 έδειξε σημαντική, αντίστροφη σχέση miR-155 και miR-10, αντίστοιχα (Σχήμα 3).

Οι ιστοί από Ρ48-Cre /Kras

ποντίκια G12D με επεμβατικές παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα πόρου (PDAC) και φυσιολογικό πάγκρεας αναλύθηκαν για την έκφραση του miR-10 και miR-155 σε σχέση με τις αντίστοιχες υποψήφιες mRNAs στόχου, FGFR1 και MLH1 χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR. Η μέση ± SEM του η = 3 σε κάθε ομάδα? *** P & lt? 0.001 κανονική έναντι του καρκίνου

Η

Γεμσιταβίνη θεραπευτική δράση στην κυκλοφορεί Mirs στο ζωικό μοντέλο

Η παρουσία των προσβεβλημένων ιστών μπορεί να υποδεικνύεται από μεταβληθεί concentraions miR στο. κυκλοφορία (βλέπε Εισαγωγή). Ως λογική επέκταση, οι συγκεντρώσεις του miR στην κυκλοφορία θα μπορούσε επίσης να χρησιμεύσει ως εύκολα προσβάσιμο δείκτες της αποτελεσματικότητας της θεραπείας και ακόμα δείχνουν μονοπάτια μεταβάλλεται από μια συγκεκριμένη θεραπεία. Ελέγξαμε την υπόθεση αυτή στο PDAC μοντέλο ποντικού σε σχέση με τα ζώα ελέγχου χωρίς καρκίνο. Η γεμσιταβίνη είναι μια πρώτης γραμμής φάρμακο που χρησιμοποιείται στη θεραπεία των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος και χορηγήθηκε για μία εβδομάδα σε ζώα με PDAC και με τα ζώα ελέγχου της ίδιας ηλικίας. Το πρόγραμμα δόσεων και η θεραπεία προσαρμόστηκαν από άλλες μελέτες που είχαν δείξει αποτελεσματικότητα σε μεγαλύτερο χρονικό διάστημα θεραπείας [49], [50]. Ένα μικρό δείγμα αίματος (& lt? 0.1 ml) συντάχθηκε πριν από την έναρξη της θεραπείας για να συγκρίνουν τα επίπεδα ορού miR πριν και μετά τη θεραπεία σε αυτές τις δύο ομάδες ζώων. Η παρουσία των PDAC στις Ρ48-Cre /Kras

ζώα G12D επιβεβαιώθηκε με ιστολογική ανάλυση των παγκρεατικών ιστών στο τέλος της μελέτης. Επιλέξαμε έξι Mirs που βρέθηκαν απορυθμίζεται και δύο που ρυθμίζεται προς τα κάτω σε PDAC ιστούς σχέση με τους ελέγχους (βλέπε Σχήμα 2). Α & gt? 10,000-φορές εύρος συγκέντρωσης αυτών των οκτώ Mirs βρέθηκε στην κυκλοφορία των ζώων (Σχήμα 4Α). Πριν από τη θεραπεία (Εικόνα 4Α, ανοιχτό μπαρ), τα επίπεδα του miR-10 στον ορό και miR-155 ήταν αυξημένα & gt? 2-φορές (p & lt? 0,05) στο PDAC (κόκκινο) έναντι της ομάδας ελέγχου (μαύρο). Σε αντίθεση, τα επίπεδα στον ορό του miR-21, miR-148b και miR-375 όπου διακριθεί μεταξύ των ομάδων. θεραπεία γεμσιταμπίνη (Εικόνα 4Α, γεμάτο μπαρ) μείωσε τα επίπεδα ορού του miR-10, miR-21 και miR-155 σε ζώα με PDAC και ελέγχους από 6 έως 60 φορές (p & lt? 0,05 σε & lt? 0,01? Εικόνα 4Β) . Τα επίπεδα ορού του miR-100 και miR-375 μειώθηκαν κατά & gt? 2 φορές μετά τη θεραπεία αν και μόνο οι έλεγχοι έδειξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές (ρ & lt? 0,05). επίπεδα ορού miR-148b δεν μεταβλήθηκαν με την κατεργασία και miR-16 επίπεδα αυξήθηκαν & gt? 5-φορές μετά τη θεραπεία. Είναι αξιοσημείωτο ότι η θεραπεία Γεμσιταβίνη των ζώων με PDAC μειωμένα επίπεδα miR-21, miR-10 και miR-155 στον ορό κατά ένα πρόσθετο 2-, 3- και 6-πλάσια κάτω από την μείωση παρατηρήθηκε σε ζώα ελέγχου, αν και μόνο το ΜΙΚ 155 έφθασαν στατιστική σημαντικότητα στη σύγκριση των PDAC και ελέγχου (Εικόνα 4Β? p & lt? 0,05). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η παρακολούθηση κατάλληλες Mirs στην κυκλοφορία μπορεί να διακρίνει επιδράσεις των φαρμάκων στα νοσούντες ιστούς από τις επιδράσεις του φαρμάκου επί των υγιών ιστών μη-στόχων.

(Α) miR-επίπεδα σε δείγματα ορού που συλλέγονται πριν (κενές ράβδοι) και μετά από μια θεραπεία μία εβδομάδα, με γεμσιταβίνη (5 δόσεις των 40 mg /kg). (Β) λόγος των συγκεντρώσεων στον ορό πριν /μετά τη θεραπεία Γεμσιταβίνη. Η διακεκομμένη γραμμή υποδεικνύει μία διαφορά δύο φορές. *, P & lt? 0,05? **, Ρ & lt?. 0.01

Η

Mirs στην κυκλοφορία ασθενών με παγκρεατικό και άλλων καρκίνων

Εννέα διαφορετικά Mirs απομονώθηκαν και ποσοτικοποιήθηκε από δείγματα ασθενών με καρκίνους του παγκρέατος πλάσματος, άλλες γαστρεντερικών καρκίνων, και οι έλεγχοι μη καρκινικά. Οι διαγνώσεις των ασθενών συνοψίζονται στον Πίνακα S2. miR-100a και miR-10 ήταν σημαντικά αυξημένα στους ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος σε σύγκριση με μάρτυρες μη καρκινικά ενώ ένας αριθμός από τις άλλες Mirs (MIR-16, 21, 155, 199, 221, και 223) έδειξαν μια τάση αυξημένης έκφρασης ότι δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Σχήμα 5Α). Ένα άλλο υποσύνολο Mirs έδειξαν σημαντικές διαφορές μεταξύ της έκφρασης του καρκίνου του παγκρέατος και του παχέος εντέρου ασθενών με καρκίνο, αλλά όχι σε σχέση με τους ασθενείς με άλλους καρκίνους του γαστρεντερικού. Τα πρότυπα έκφρασης των διαφόρων κυκλοφορούντων Mirs δείχνουν ότι κάποιοι είναι καλύτεροι σε διάκριση μεταξύ του καρκίνου και μη καρκινοπαθείς ενώ άλλοι καλύτερα διακρίνουν τα νοσούντα όργανα.

Τα δείγματα από ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος, μάρτυρες μη καρκίνο, και ασθενείς με άλλες μορφές καρκίνου GI. (Α) Οι συγκεντρώσεις των εννέα Mirs ανιχνευθεί στην κυκλοφορία δείχνουν ατομικές διαφορές μεταξύ των ομάδων ασθενών. Σημειώστε τις διαφορετικές σειρές των κλιμάκων στους άξονες Υ. (Β) Ανεξέλεγκτη τυχαία ανάλυση δάσος σύγκριση καρκίνο του παγκρέατος (μαύροι κύκλοι) έναντι των ελέγχων μη καρκίνου με νόσο του παγκρέατος (λευκό τρίγωνο), οι έλεγχοι μη καρκινικά χωρίς νόσο του παγκρέατος (λευκοί κύκλοι), ο καρκίνος του ανώτερου γαστρεντερικού (μπλε κύκλοι), καρκίνοι του παχέος εντέρου ( κόκκινοι κύκλοι), και καρκίνων του ήπατος (κίτρινο κύκλοι). Σε κόκκινο κύκλο είναι η πλειοψηφία των καρκίνων του παγκρέατος. Τα βέλη δείχνουν δύο δείγματος από ασθενείς με καρκίνο του δωδεκαδακτύλου. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001. Τα χαρακτηριστικά των ασθενών παρουσιάζονται στον Πίνακα S2.

Η

Σε μια ανεξέλεγκτη τυχαία δάσος ανάλυσης που θεωρείται η έκφραση όλων των εννέα Mirs απομονωθεί από την κυκλοφορία, πέντε από τους έξι ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος ομαδοποιούνται σε μια ξεχωριστή ομάδα από το πλειοψηφία των άλλων ασθενών (Σχήμα 5Β). Αυτό επιβεβαιώνει ότι η συνδυασμένη μοτίβο έκφρασης αυτών των εννέα Mirs στην κυκλοφορία ήταν επαρκής για τον εντοπισμό ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος ως ξεχωριστά από ασθενείς με άλλους καρκίνους GI και τους ελέγχους. Αξιοσημείωτη ήταν δύο δείγματα από ασθενείς με δωδεκαδακτυλικό νεοπλάσματα (βέλη) που ομαδοποιούνται πλησιέστερη προς ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος, πιθανόν λόγω του παγκρέατος εμπλοκή απαρατήρητα κατά τη στιγμή της δειγματοληψίας. Επίσης, τα δείγματα από ασθενείς με μη καρκινική νόσο του παγκρέατος και μη καρκινικές έλεγχοι συγκεντρώνονται υποδεικνύοντας ότι η ομάδα έκφρασης miR είναι ειδικό για τον καρκίνο του παγκρέατος και όχι οποιασδήποτε ασθένειας που προέρχονται από το πάγκρεας.

Συζήτηση

Το μεταλλαγμένο Kras

G12D με γνώμονα το μοντέλο του καρκίνου του παγκρέατος έχει χαρακτηριστεί σε πολλά μοριακά και βιολογικά επίπεδα [35], [36], [37], [38], [39]. Η ανάλυσή μας των δειγμάτων ιστού δείχνει ότι ορισμένες αλλαγές miR συνδέονται με διηθητικό καρκίνο του παγκρέατος είναι ήδη εμφανής κατά τα πρώτα στάδια της νόσου (Εικόνα 2). Μεγαλύτερη έκπληξη ήταν ο βαθμός στον οποίο οι μεταβολές στην έκφραση του miR στο ζωικό μοντέλο μιμήθηκε miR αλλαγές έκφραση που παρατηρείται σε ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου (βλέπε πίνακα S1). Πράγματι, ένα υποσύνολο Mirs που περιλαμβάνει miR-10 και miR-155 ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω σε παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς των ασθενών και των ποντικών, καθώς και στα αντίστοιχα δείγματα αίματος. Έτσι, αυτή η μελέτη παρέχει στοιχεία που αποδεικνύουν ότι η ομοιότητα μεταξύ των ειδών της έκφρασης miR στο πλαίσιο του καρκίνου του παγκρέατος είναι σχετικά συντηρημένη, πολύ πιθανόν να οφείλεται σε μεταλλαγμένο Kras ως ένα σημαντικό εκκινητή της παρούσας κακοήθειας [42].

Η συγκριτική ανάλυση της έκφρασης miR κατά τη διάρκεια κακοήθη εξέλιξη στο μοντέλο ποντικού μας επιτρέπει να εξαχθούν κάποια συμπεράσματα για τις σχετικές Mirs στην κυκλοφορία που μπορεί να υποδηλώνουν την παρουσία των πρόδρομων αλλοιώσεων. Habbe et al. [51] ανέφερε σχετικά με τα επίπεδα έκφρασης των Mirs στην ανθρώπινη ενδοπορικού θηλώδη βλεννώδη νεοπλάσματα (IPMN) ιστούς, και κατέληξε στο συμπέρασμα ότι το miR-155 ρυθμίζεται προς τα πάνω και μια πιθανή βιοδείκτη ιστό της προ-διεισδυτικής νόσου. Βρήκαμε miR-155 για να ρυθμίζεται προς τα πάνω στα σύνολα που περιέχουν αλλοιώσεις PanIN στο μοντέλο ποντικού και επίσης βρέθηκε miR-155 απορυθμίζεται σε δείγματα πλάσματος από ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος. Άλλες μελέτες που αξιολογούν κυκλοφορούν miR-21, miR-210, το miR-155 και miR-196a σε διαφορετικές ομάδες ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος έχουν καταλήξει σε παρόμοια συμπεράσματα σχετικά με το διαγνωστικό δυναμικό της Mirs [52]. IPMN, βλεννώδες κυστική νεόπλασμα (MCN), και PanIN αντιπροσωπεύουν τρεις γνωστές προκαρκινικές αλλοιώσεις του PDAC. Αυτοί οι τρεις τύποι premalignancies έχουν πολλές γενετικές και παθολογικές ομοιότητες, αλλά και ορισμένες λειτουργίες που επιτρέπουν σε αυτούς [53] διαφοροποιούνται. Τα ευρήματά μας υποστηρίζουν την υπόθεση ότι τα επίπεδα του miR-155 στο πλάσμα μπορεί πράγματι να αντιπροσωπεύουν ένα βιοδείκτη που δείχνει την παρουσία της PanIN βλαβών.

Παρόμοια miR αλλάζει στους ιστούς και στην κυκλοφορία προτείνουν σε μας ότι οι Mirs απελευθερώνονται από τους νοσούντες ιστούς με συνεχή τρόπο, ενδεχομένως μέσω εξωσώματα [54], [55] αν και μπορεί να υπάρχουν συγκεκριμένοι μηχανισμοί απελευθέρωσης που μπορεί να ευνοήσει κάποια Mirs έναντι άλλων [56]. Εδώ έχουμε ως επί το πλείστον επικεντρώθηκε σε Mirs που είναι αυξημένα σε νοσούντες ιστούς και όχι εκείνα των οποίων η έκφραση μειώνεται ή χάνεται. Εμείς αιτιολογημένη ότι μια απώλεια ενός δεδομένου miR θα επηρεάσουν μόνο σε σταθερά επίπεδα στην κυκλοφορία, αν η νοσούντων οργάνων είναι η κύρια πηγή της παρούσης miR στην κυκλοφορία. Π.χ. miR-148a /b και miR-375 είναι μειωτικά πολύ έντονα σε καρκίνο του παγκρέατος σε σχέση με την κανονική του παγκρέατος ιστούς. miR-375 έχει δειχθεί ότι παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη παγκρεατικών νησιδίων [57], και η λειτουργία καθώς και στη διατήρηση της ομοιόστασης της γλυκόζης [58], [59] και είναι αξιοσημείωτο ότι μία πρόωρη σύμπτωμα της PDAC μπορεί να ενηλίκων εκδήλωση σακχαρώδη διαβήτη. miR-148 μπορεί να καταστείλει την έκφραση του DNMT3b μέσα από μια περιοχή στην ακολουθία κωδικοποίησης της [60] και έτσι μπορούν να επηρεάσουν τους μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA

Παρά το & gt?. 100-πλάσια μείωση του miR-375 και miR-148a /β κατά τη διάρκεια κακοήθους μετασχηματισμού των παγκρεατικών ιστών, είναι εντυπωσιακό ότι τα επίπεδα στον ορό τους δεν μειώνονται σε ζώα με PDAC (βλέπε Εικόνα 2C και 4Α). Αυτό υποδηλώνει ότι η παγκρεατική συμβολή στα επίπεδα ορού τους είναι μικρό μόνο. Αυτό είναι πιθανό επίσης ισχύει και για miR-21 όπου αυξήσεις στα επίπεδα του ιστού & gt? 100 φορές κατά τη διάρκεια του παγκρέατος κακοήθους μετασχηματισμού στο ζωικό μοντέλο δεν αντικατοπτρίζονται σε αυξημένα επίπεδα στον ορό (βλέπε Εικόνα 2Α και 4Α). Αντίθετα, οι miR-10 και miR-155 επίπεδα στον ορό αυξήθηκαν κατά τη διάρκεια του παγκρέατος κακοήθη μετασχηματισμό σε ποντικούς και σε ασθενείς που υποστηρίζουν την ιδέα ότι η νοσούντων οργάνων είναι ένας σημαντικός συνεισφέρων επίπεδα ορού αυτών των Mirs (βλέπε Σχήμα 4Α και 5Α).

Πρόσφατες μελέτες από το εργαστήριο Bartel απέδειξαν ότι η κυρίαρχη δραστηριότητα του Mirs είναι να μειώνουν τα επίπεδα mRNA στόχο και διαπίστωσε ότι πάνω από το 84% των αποτελεσμάτων miR επί της παραγωγής πρωτεΐνης οφείλονται σε αυτήν την εξάντληση του στόχου mRNA [48]. Έτσι, Mirs που υπερεκφράζονται στην κυκλοφορία των νοσούντων ατόμων μπορεί να συμπίπτει με μειωμένα επίπεδα των mRNAs στόχου στο νοσούντα ιστό προέλευσης. Υποθέσαμε ότι περαιτέρω Mirs βρέθηκε να αυξηθεί στην κυκλοφορία των ασθενών μπορεί να είναι παρόντες σε πολύ υψηλότερα επίπεδα στους νοσούντες tisses λόγω της αραίωσης κατά ρίχνοντας τους στην κυκλοφορία του αίματος. Εντοπίσαμε στόχους mRNA υποψήφιες και μια αμερόληπτη λίστα των υπο-εκφράζεται mRNA από καρκίνο του παγκρέατος σε σχέση με φυσιολογικούς ιστούς που καταρτίζονται από τις διάφορες μελέτες επέστρεψε 154 mRNAs που θα μπορούσε να καρκίνο σχετικούς στόχους miR. Αυτά συνδυάζονται με το πάνελ miR μελετήθηκαν εδώ (Πίνακας S3).

Το σύνολο των γονιδίων που επέστρεψε από την ανάλυση αυτή περιέχει

MLH1

προβλέπεται ως στόχος για το miR-155. Πράγματι, η υπερέκφραση του miR-155 σε κυτταρικές γραμμές είχε σαν αποτέλεσμα μειορύθμιση hMSH2, hMSH6, και hMLH1. Επίσης, ένας αντίστροφος συσχετισμός μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του miR-155 και πρωτεϊνών MLH1 ή MSH2 αναφέρθηκε για ανθρώπινη παχέος εντέρου [61]. MLH1 είναι μια πρωτεΐνη επισκευή εσφαλμένης σύμπτωσης που συμβάλλει στη συσσώρευση των γενετικών σφαλμάτων στο πλαίσιο της οικογενούς καρκίνου του παγκρέατος και ορισμένες σποραδικές περιπτώσεις [34]. mRNA της βρέθηκε μειωτικά σε παγκρεατικά δείγματα καρκίνου και ένα κλάσμα της απώλειας της έκφρασης MLH1 mRNA σε καρκίνους του παγκρέατος έχει αποδοθεί στην υπερμεθυλίωση προαγωγέα [62]. Παρατηρήσαμε μια σημαντική αντίστροφη σχέση μεταξύ της έκφρασης του miR-155 και MLH1 mRNA κατά τη σύγκριση των φυσιολογικών και καρκινικών ιστών (Σχήμα 3Α). Επιπλέον, FGFR1 mRNA βρέθηκε προς τα κάτω σε παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα ανθρώπου (Πίνακας S3) και παρατηρήσαμε μια σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω στο μοντέλο ποντικού PDAC σε σχέση με φυσιολογικούς ιστούς (Σχήμα 3Β). Αυτά τα ευρήματα με miR-10 και miR-155 και προβλεπόμενο στόχο τους mRNAs MLH1 και FGFR1 υποστηρίζουν την ιδέα μιας πιθανής ρυθμιστικής λειτουργίας αυτών των Mirs κατά τη διάρκεια κακοήθη εξέλιξη.

Σε μια άλλη σειρά από μελέτες σε ζώα με δυνητικές άμεσες κλινικές εφαρμογή, ελέγξαμε εάν Mirs θα μπορούσε να δείξει την αποτελεσματικότητα του φαρμάκου. Το εύρος συγκέντρωσης των κυκλοφορούντων Mirs παρακολουθούνται σε αυτό πειράματα είναι & gt? 10.000 φορές και η επίδραση της φαρμακευτικής αγωγής ήταν άσχετη με τη συγκέντρωση προ-επεξεργασία των οκτώ Mirs παρακολουθούνται (Εικόνα 4Α). Μετά την επεξεργασία γεμσιταβίνη miR-16 βρέθηκε αυξημένη στον ορό κατά 5-φορές σε PDAC καθώς και τα ζώα ελέγχου. έκφραση του miR-16 συνδέεται με την απόπτωση [63], η καταστολή της ανάπτυξης μέσω της p53 [64] και την καταστολή του όγκου [65]. Η αύξηση αυτού του miR-16 στα καρκινικά κυκλοφορία και τον έλεγχο των ζώων ταιριάζει με το κυτταροτοξική δραστικότητα του φαρμάκου σε υγιείς ιστούς. Σε αντίθεση με την αύξηση αυτή, τα επίπεδα στον ορό του miR-148b δεν επηρεάστηκαν μετά την φαρμακευτική αγωγή και ορό miR-10 και miR-155 μειώθηκαν περισσότερο (30- και 60-φορές) μετά την επεξεργασία γεμσιταβίνη. Αυτές οι δύο Mirs είχαν βρεθεί αυξημένα στον ορό PDAC ζώων σε σχέση με τους ελέγχους πριν από την έναρξη της φαρμακευτικής αγωγής. Επιπλέον, τα επίπεδα στον ορό του miR-10 και miR-155 σε ζώα που υπέστησαν αγωγή με PDAC πέσει κάτω από τα επίπεδα στον ορό των ζώων υπό θεραπεία ελέγχου (Σχήμα 4Α & amp? Β) υποδεικνύοντας τους ως πιθανοί δείκτες συγκεκριμένων όγκων επιδράσεις της θεραπείας. Συνολικά, τα ευρήματα σε αυτό το πειραματικό περιβάλλον υποστηρίζει την ιδέα ενός καρκίνου του παγκρέατος επιλεκτική αποτελεσματικότητα της γεμσιταβίνη όμως επιπτώσεις στην ομοιόσταση των άλλων υγιών ιστών, επίσης, έγινε εμφανής.

Συμπέρασμα

miR αλλάζει σε ιστούς και η κυκλοφορία δείχνουν αξιοσημείωτες ομοιότητες μεταξύ του καρκίνου του παγκρέατος σε ασθενείς και η P48-Cre /Kras

μοντέλο ποντικού G12D της νόσου. Πέρα από την mimcry της μοριακής παθολογίας του ανθρώπου στο μοντέλο ποντικού, οι Mirs υπογραφή προσδιορίζονται εδώ μπορεί επίσης να χρησιμεύσει ως ενημερωτική δείκτες της αποτελεσματικότητας του φαρμάκου στην ανάπτυξη χρειάζονται απεγνωσμένα θεραπείες μονοθεραπεία ή συνδυασμό [42] αυτής της καταστροφικής νόσου.

Υλικά και Μέθοδοι

ποντίκι ανάλυση ιστού

πρωτόκολλα μελέτης των ζώων εγκρίθηκαν από το Πανεπιστήμιο Georgetown φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήση (GUACUC # 08-028). Η P48-Cre /LSL-Kras

μοντέλο G12D ποντίκι έχει περιγραφεί στο παρελθόν [35]. Κατά τον έλεγχο, αργά PanIN και ομάδες αδενοκαρκίνωμα, οι ποντικοί θυσιάστηκαν σε 16 μήνες της ηλικίας. Έλεγχοι έλειπε είτε το KRAS

G12D ή το αλληλόμορφο P48-CRE. Για την πρώιμη ομάδα PanIN, ποντίκια σε ηλικίας ενός μηνός υποβλήθηκαν σε θεραπεία με caerulin και θυσιάστηκαν σε ηλικία τεσσάρων μηνών, μετά από καθιερωμένο πρωτόκολλο [66]. Παγκρέατα διχοτομείται από την ουρά στο κεφάλι με ένα ήμισυ σταθεροποιήθηκαν σε φορμαλίνη και το άλλο ήμισυ καταψύχθηκε σε υγρό άζωτο. Ένας παθολόγος σημείωσε τον υψηλότερο βαθμό PanIN ανά λοβό όλων των λόβια μετρήθηκαν σε ένα αντιπροσωπευτικό H & amp? Ε βάφονται διαφάνεια του παγκρέατος κάθε ποντικού [35]. «Normal» περιλαμβάνει οποιοδήποτε φυσιολογικό και αντιδραστική αλλαγή του πόρου. PanIN-1 και -2 ενώθηκαν σε μια ενιαία κατηγορία των «πρόωρη» βλάβες, ενώ οι ιστοί με PanIN-3 συμπεριλήφθηκαν σε μια ξεχωριστή κατηγορία «αργά» βλάβες που οφείλονται στην υψηλή πιθανότητα κακοήθους εξέλιξης.

miR και η έκφραση mRNA σε ποντίκι παγκρεατικό ιστό

Ολικό RNA εκχυλίστηκε από ιστούς χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA) όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή. Mirs περαιτέρω απομονώθηκε από το ολικό RNA χρησιμοποιώντας ένα κιτ απομόνωσης miR (SA Biosciences, Frederick, MD). Το miR μετατράπηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας ροΙγΑ ουράς που ακολουθείται από την καθολική πλήρωση με miR First Strand Kit και ποσοτικά με τη χρήση προ-σχεδιαστεί miR συγκεκριμένες qPCR (Α.Ε. Βιοεπιστημών, Frederick, MD) σε ένα σύστημα HT Real-Time PCR ΑΒΙ 7900 (Applied Biosystems, Foster City, CA). ποσοτικοποίηση του mRNA που περιγράφεται στο [46]. Εν συντομία, το cDNA συνετέθη χρησιμοποιώντας τη ολικό RNA εκχυλίζεται και το iScript cDNA Synthesis Kit, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Bio-Rad Laboratories). qRT-PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories) σε iCycler (BioRad) με: 95 ° C για 3 λεπτά που ακολουθείται από 40 κύκλους (95 ° C για 20 δευτερόλεπτα, 60 ° C για 30 δευτερόλεπτα και 72 ° C για 40 sec) και το βήμα καμπύλη τήξεως (95 ° C για 1 λεπτό, 55 ° C για 1 λεπτό, αυξήθηκε κλίση θερμοκρασίας από 50 ° C κατά 0,5 ° C κάθε 10 sec στους ακόλουθους 80 κύκλους). MLH1 μπροστά αστάρι: GCGGCACCCACTTCCAGTCC? αντίστροφη: CGGAGAGTCTCATGGCACCGC. FGFR1 μπροστά αστάρι: GTAGCTCCCTACTGGACATCC? αντίστροφο εκκινητή:. GCATAGCGAACCTTGTAGCCTC

ανίχνευση και ποσοτικοποίηση miR σε δείγματα ανθρώπινου αίματος και ποντικού

δείγματα ανθρώπινου αίματος που λαμβάνεται από την biorepository του Κέντρου Καρκίνου Lombardi που συλλέγει ανώνυμα δείγμα από καρκίνο και μη καρκινικές ασθενείς για ερευνητικούς σκοπούς. Τα δεδομένα αναλύθηκαν ανώνυμα. το αίμα του ποντικιού (& lt? 0,1 ml) συλλέχθηκε μέσω υπογνάθιους αιμορραγία χρησιμοποιώντας ένα νυστέρι [67]. Τα δείγματα ορού ή πλάσματος αναμίχθηκαν σε αναλογία 1:10 με αντιδραστήριο λύσης Qiazol και στροβιλίστηκε. Το προϊόν της λύσης εκχυλίζεται με CHCl3 και η υδατική φάση περαιτέρω επεξεργασία για ολικό RNA χρησιμοποιώντας το miRNeasy Mini κιτ (Qiagen, Valencia, CA) και εμπλουτίζεται για miRNA χρησιμοποιώντας το RT2 qPCR-Grade miRNA Απομόνωση Kit, ΜΑ-01 (SABiosciences).

θεραπεία γεμσιταμπίνη των ζώων

η γεμσιταμπίνη λήφθηκε από το φαρμακείο του νοσοκομείου και να χορηγηθούν σε 22-23 μηνών P48-Cre /Kras

G12D ή αντίστοιχης ηλικίας ζώα ελέγχου στα 40 mg /kg σε 5 δόσεις κατά τη διάρκεια μιας εβδομάδας. Αυτή η δόση των 200 mg /kg /εβδομάδα βασίστηκε σε Refs. [49], [50]. Λήφθηκε αίμα πριν την έναρξη της θεραπείας (& lt? 0,1 ml) και μία ημέρα μετά την τελευταία δόση. Η παρουσία της PDAC επιβεβαιώθηκε στην G12D P48-Cre /Kras

με μεταθανάτια ιστολογική ανάλυση

Η ανάλυση των δεδομένων

Οι μέθοδοι επεξεργασίας των δεδομένων ήταν κωδικοποιημένα σε R (http:. //Www .r-project.org). Ιεραρχική ομαδοποίηση έγινε με βάση τη μέση στο κέντρο και κλιμακώνονται τα επίπεδα έκφρασης του miR.