Αφηρημένο

καρκίνο του θυρεοειδούς 1 (TC-1), ένα εγγενώς διαταραγμένο πρωτεΐνη, είναι εκφράζονται ευρέως στα σπονδυλωτά και υπερεκφράζεται σε πολλά είδη όγκων. Ωστόσο, ακριβής ρόλος του και μηχανισμός ρύθμισης στο ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) εξακολουθούν να είναι ασαφείς. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι TC-1 εκφράζεται εξαιρετικά στον NSCLC και ότι παρεκκλίνουσα έκφραση του συνδέεται στενά με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC. Η εξωγενής TC-1 υπερέκφραση προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, επιταχύνει το κελί G1 στην S-φάση μετάβασης, και μειώνει την απόπτωση σε NSCLC. Η knockdown του TC-1, ωστόσο, αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των NSCLC κυττάρων, μετάβαση κύκλου, και αντίσταση απόπτωση. Επιπλέον, αποδείξαμε επίσης ότι PD173074, το οποίο λειτουργεί ως ένας αναστολέας της TC-1 σε NSCLC, μειώνει την έκφραση του TC-1 και αναστέλλει TC-1 με τη μεσολάβηση υπερέκφραση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων

in vitro

και

σε vivo

. Παρ ‘όλα αυτά, η λειτουργία της αναστολής του PD173074 επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού NSCLC αποβλήθηκε στα κύτταρα με TC-1 νοκ ντάουν. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι PD173074 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην TC-1 με τη μεσολάβηση υπερέκφραση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων NSCLC και μπορεί να είναι ένας πιθανός στόχος παρέμβασης για την πρόληψη του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε NSCLC

Παράθεση:. Lei J, Λι W, Γιανγκ Υ , Lu Q, Ζανγκ Ν, Bai G, et al. (2014) TC-1 Η υπερέκφραση Προωθεί πολλαπλασιασμού κυττάρων στο ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα που μπορεί να ανασταλεί από PD173074. PLoS ONE 9 (6): e100075. doi: 10.1371 /journal.pone.0100075

Επιμέλεια: Philip C. Trackman, Boston University Goldman School of Dental Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20 Γενάρη 2014? Αποδεκτές: 21 Μάη 2014? Δημοσιεύθηκε: 18 του Ιούνη 2014

Copyright: © 2014 Lei et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι μία από τις κύριες αιτίες νοσηρότητας παγκόσμιος. Το 2013, περίπου 228.190 νέες περιπτώσεις αναμένεται να συμβεί στις Ηνωμένες Πολιτείες, αντιπροσωπεύοντας το 13,74% όλων των νέων περιπτώσεων καρκίνου. Ακόμη πιο απειλητικά, παρά τη χρήση μιας θεραπείας πολυτροπικότητας, συμπεριλαμβανομένων χειρουργική αντιμετώπιση, χημειοθεραπεία, ακτινοθεραπεία και, ο καρκίνος του πνεύμονα παραμένει η κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο στις δύο άνδρες και γυναίκες? Στην πραγματικότητα, περίπου 159.480 ασθενείς πεθαίνουν από καρκίνο του πνεύμονα ασθένειες που σχετίζονται στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Ως εκ τούτου, νέες θεραπείες που προκύπτουν από τη βελτίωση της κατανόησης των μοριακών ρυθμιστές της ανάπτυξης του όγκου απαιτούνται επειγόντως. Τα τελευταία χρόνια, έχουν πολλές βιοδείκτες που εμπλέκονται στην εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα έχουν ερευνηθεί, αλλά λίγες μελέτες έχουν αξιολογήσει τις λειτουργίες του TC-1 σε ανάπτυξη καρκίνου του πνεύμονα.

TC-1 κλωνοποιήθηκε αρχικά από την αφαιρετική υβριδισμού μεταξύ ενός θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς και της γύρω φυσιολογικό θυρεοειδή ιστό της [2]. Είναι εκφράζεται παντού σε ένα ευρύ φάσμα των σπονδυλωτών με την υψηλότερη διατήρηση μεταξύ των ειδών επικεντρώθηκε στο ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF). πανταχού παρούσα έκφραση του και η συντήρηση αλληλουχίας υποδεικνύουν ότι TC-1 μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην κυτταρική βιολογία [3]. Κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 106 αμινοξέων χωρίς ένα προσδιορισμένο λειτουργικό πεδίο, το οποίο υποδεικνύει ότι η πρωτεΐνη TC-1 είναι ένα μέλος της εγγενώς διαταραγμένης ομάδα πρωτεΐνη που έχει αποδειχθεί να εκτελεί περιστροφική λειτουργίες στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, του πολλαπλασιασμού, της μετάστασης, και μεταγωγή σήματος [3], [4]. Ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών έχουν καταδείξει ότι TC-1 εκφράζεται εξαιρετικά σε διάφορα καρκινώματα, και παρεκκλίνουσα έκφραση του είχε εμπλακεί στον πολλαπλασιασμό των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων [5] – [9]. Margaret Sunde et al. επιβεβαίωσε ότι TC-1 είναι μία νέα ογκογονική πρωτεΐνη που σχετίζεται με καρκίνο του θυρεοειδούς και διαπίστωσε ότι η υπερέκφραση της TC-1 σε φυσιολογικά κύτταρα του θυρεοειδούς αυξημένο ρυθμό πολλαπλασιασμού τους, ενισχυμένη αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη τους σε μαλακό άγαρ, και μειωμένο ρυθμό απόπτωσης τους [3] . TC-1, το οποίο βρίσκεται στην γενωμική περιοχή του καρκίνου του μαστού ευαίσθητου (8P

11-12), βρέθηκε να ρυθμίζεται αυξητικά σημαντικά σε καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου μαστού και ιστούς, ενοχοποιώντας έτσι αυτή την πρωτεΐνη στην ανάπτυξη του καρκίνου του μαστού [8]. Σε γαστρικό καρκίνο, TC-1 βρέθηκε να είναι ένας από τους απορυθμίζεται γονιδίων σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές και ιστούς καρκινώματος, και η έκφρασή του συσχετίζεται έντονα με σχεδόν όλους τους κλινικοπαθολογικών μεταβλητές της επιθετικής βιολογικής συμπεριφοράς των καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του μεγέθους, προχωρημένο στάδιο, και η κακή επιβίωσης [10], [11]. Εντούτοις, το επίπεδο έκφρασης και η βιολογική λειτουργία των TC-1 σε NSCLC δεν μέχρι σήμερα διαλευκανθεί.

Πρόσφατα, Olivier Ε Pardo et al. ανέφεραν ότι ο υποδοχέας επιλεκτική αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (FGFR) αναστολέα φάρμακο PD173074 μπλοκάρει τον πολλαπλασιασμό και κλωνογονική ανάπτυξη των δύο μικρών κυτταρικών γραμμών καρκίνου του πνεύμονα (Η69 και Η510) σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο και αποτρέπει FGF-2 που προκαλείται χημειοαντίσταση. Παραδόξως, σε ξενομοσχεύματα Η510, ανάπτυξη όγκου ήταν μειωμένη με κατεργασία PD173074, με αποτέλεσμα την αύξηση του μέσου επιβίωση σε σύγκριση με ζώα ελέγχου που έλαβαν placebo, παρομοίως με την επίδραση που παρατηρήθηκε με τη χορήγηση μονοθεραπεία σισπλατίνης? σε Η69 ξενομοσχεύματα, PD173074 προκάλεσε μία πλήρη απόκριση που διήρκεσε τουλάχιστον 6 μήνες σε 50% των ποντικών. Επιπλέον, η επίδραση της σισπλατίνης ήταν σημαντικά ενισχύεται από τη συγχορήγηση της με PD173074. Αυτά τα αποτελέσματα εξηγούνται από το εύρημα ότι η θεραπεία PD173074 μειώθηκε ενδοογκική πολλαπλασιασμού και αύξηση της απόπτωσης των κυττάρων με υψηλό εμφάνιση της αποπτωτικής δείκτη κυτταρικού θανάτου κασπάσης-3 [12]. Αυτά τα ενθαρρυντικά ευρήματα προωθήσει περαιτέρω διερεύνηση της επίδρασης των PD173074 στα κύτταρα NSCLC.

Για να μελετηθεί ο ρόλος της TC-1 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και να αξιολογηθεί η επίδραση των PD173074 σε TC-1 με τη μεσολάβηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, σε αυτό το μελέτη, διερευνήσαμε τη σχέση μεταξύ TC-1 έκφραση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε NSCLC με ανοσοϊστοχημεία, και την επίδραση της PD173074 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων TC-1 με τη μεσολάβηση χρησιμοποιώντας μια σειρά από

in vitro

και

σε vivo

απώλειας λειτουργίας και να αποκτήσουν-του-λειτουργία μελέτες.

Υλικά και Μέθοδοι

2.1 Ηθική Δήλωση

το ανθρώπινο μελέτη εγκρίθηκε από το Νοσοκομείο Tangdu θεσμική Επιτροπή Δεοντολογίας, καθώς και η ερευνητική μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις διατάξεις της Διακήρυξης του 2008. Όλοι οι συμμετέχοντες Ελσίνκι παρείχαν ενυπόγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση πριν τη συμμετοχή στη μελέτη.

Όλες οι μελέτες σε ζώα έχουν διεξαχθεί με ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από την φροντίδα των ζώων και τη χρήση επιτροπής Tangdu Νοσοκομείο.

2.2 Ανοσοϊστοχημεία και αξιολόγησης

Αμέσως μετά την χειρουργική αφαίρεση, δείγματα από 122 ασθενείς με ΜΜΚΠ αποκόπηκαν από παθολόγους και snap-καταψύχεται σε υγρό άζωτο. Τα δείγματα του καρκίνου συλλέχθηκαν από το κέντρο των οζιδίων και τα φυσιολογικά δείγματα ελήφθησαν από μια περιοχή των 5 cm μακριά από τους όζους. Κάθε ένα από τα δείγματα καθορίστηκε με 4% παραφορμαλδεΰδη και εγκλείστηκαν με παραφίνη. Οι ιστοί φέτες για να ληφθεί 4-μm πάχους τομές, και οι τομές αποκηρωμένου με μια σειρά από ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν μέσω διαβαθμισμένης σειράς οινοπνεύματος. ανάκτηση αντιγόνου μικροκυμάτων διεξήχθη στους 750 W για 10 λεπτά σε κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ 6.0) για την ενίσχυση της ανοσοαντιδραστικότητας. Η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης των τμημάτων αποκλείστηκε με υπεροξειδάση υδρογόνου 3% επί 30 λεπτά, και οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν με 5% φυσιολογικό ορό κατσίκας σε PBS για 30 λεπτά στους 25 ° C για να εμποδίσει οποιαδήποτε αντίδραση μη ειδικό αντίσωμα. Οι τομές πλύθηκαν τρεις φορές με PBS για 10 λεπτά, επωάστηκαν με τα πρωτογενή αντισώματα (TC-1, 1:100, Gene Tex, USA? Ki-67, 1:300, NeoMarkers Lab Vision Corp, CA, USA) επί μία νύκτα στους 4 ° C, και στη συνέχεια χρωματίζονται με ένα Envision ™ Detection Kit (Dako, Denmark) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι τομές στη συνέχεια σε επεξεργασία με 0,003% 3, 30-διαμινοβενζιδίνη και με αιματοξυλίνη.

Η αξιολόγηση των TC-1 έκφραση επιτεύχθηκε με δύο παθολόγους χωρίς πρόσβαση στα κλινικά δεδομένα και βασίστηκε τόσο από το βαθμό της TC-1 επισήμανση και την ένταση της χρώσης TC-1. Ο βαθμός της TC-1 σήμανσης μετρήθηκε σύμφωνα με το ποσοστό των θετικών κυττάρων: 0 = 0-5%, 1 = 6-25%, 2 = 26-50%, 3 = 51-75%, και 4 = 76- 100%. Η ένταση της χρώσης TC-1 εκτιμήθηκε οπτικά και στρωματοποιημένη σε τέσσερις ομάδες: 0 = αρνητικό? 1 = αδύναμη? 2 = μέτρια? και 3 = έντονη. Το σκορ TC-1 προσδιορίστηκε ως ο βαθμός TC-1 επισήμανσης πολλαπλασιασμένη με την ένταση της χρώσης TC-1: 0 = 0, 1+ = 1-4, 2+ = 5-8, 3+ = 9-12. Οι εν λόγω όγκοι με σκορ 0 θεωρήθηκαν TC-1-αρνητικά, ενώ οι άλλοι (1+ έως 3+) θεωρήθηκαν θετικά. Τα ποσοστά του Ki-67-αντιδραστικά κύτταρα όγκου αξιολογήθηκαν σε ένα πεδίο υψηλής ισχύος (400 Χ) μετρώντας πάνω από 1000 καρκινικά κύτταρα σε τυχαία επιλεγμένα αντιπροσωπευτικά τμήματα του όγκου [13].

2.3 Cell Culture

NSCLC Α549, SPC-Α-1, 95d, και NCI-H520 κύτταρα και τα βλεννογόνο κύτταρα 16HBE bronchiorum επιθήλιο ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) και διατηρήθηκαν στο εργαστήριο μας . Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, ΝΥ, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (Gibco, Grand Island, ΝΥ, USA) και 100 μονάδες /mL στρεπτομυκίνη /πενικιλίνη και καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε ένα υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2. Για τα πειράματα PD173074, Α549 και A549- Plenti-shRNA1 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ελεύθερο ορού και επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) -δωρεάν μέσο (SITA: RPMI 1640 συμπληρωμένο με 5 μg /mL ινσουλίνη, 10 μg /mL τρανσφερρίνη, 30 nmol /L σεληνικό νάτριο, και 0,25% αλβουμίνη βόειου ορού) συμπληρωμένο με PD173074 (διαλυμένο σε DMSO, Cayman, USA) σε μια τελική συγκέντρωση 1 μΜ. Τα μέσα ανάπτυξης για τα κύτταρα ελέγχου συμπληρώθηκαν με ισοδύναμους όγκους DMSO χωρίς αναστολέα.

2.4 εξόντωση TC-1 με παρεμβολή RNA

Τέσσερις RNAi υποψήφιες αλληλουχίες στόχου για την ανθρώπινη TC-1 (Πίνακας 1) σχεδιάστηκαν και κλωνοποιήθηκαν στον φορέα pGCSIL-GFP από Shanghai GeneChem Co., Ltd. (Κίνα). TC-1 shRNA1 (Πίνακας 1) εμφάνισε την καλύτερη απόδοση knockdown σε κύτταρα 293Τ συνεπιμολύνθηκαν με TC-1 και την έκφραση shRNA κατασκευάσματα, όπως αποκαλύπτεται από δοκιμασίες κηλίδος και ανοσοφθορισμού δυτική, και ως εκ τούτου έχουν επιλεγεί για την knockdown του ενδογενούς TC-1 σε NSCLC κύτταρα. Μη σίγηση-shRNA (NSRNA) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας. Τα ολιγονουκλεοτίδια που κωδικοποιούν το TC-1 αλληλουχία shRNA1 ή NSRNA και μια αλληλουχία βρόχου που χωρίζει τις συμπληρωματικές περιοχές συνετέθησαν και εισάγεται εντός του pGCSIL-GFP από Shanghai GeneChem Co., Ltd. (Κίνα). Το ανασυνδυασμένο ιό συσκευάστηκε χρησιμοποιώντας Συστημάτων Lentivector Έκφρασης (Shanghai GeneChem Co., Ltd., Κίνα). Τα κύτταρα Α549 μολύνθηκαν με μια ενισχυμένη λύση μόλυνση και καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI-1640. Μία εβδομάδα μετά τη μόλυνση, τα GFP-θετικά κύτταρα ταξινομήθηκαν με χρήση κυτταρομέτρου ροής (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA). Η ταξινομημένη GFP

+ κύτταρα (καθαρότητα & gt? 97%) στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν στα επόμενα πειράματα

Η

2.5 Lentivirus Κατασκευή και μεταγωγή των κυττάρων

κατασκευάσει

Το ΗΑ-TC1. στον φορέα Plenti-DEST (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) που περιγράφηκε προηγουμένως [14]. Εν συντομία, ένας κλώνος που περιέχει την καταχώρηση πλήρους μήκους TC-1 δημιουργήθηκε πρώτα από την ομάδα μας με τη χρήση της pENTR κατεύθυνσης τυποποιημένη συσκευασία κλωνοποίησης ΤΟΡΟ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Μετά ο κλώνος είσοδος δημιουργήθηκε, η αντίδραση ανασυνδυασμού LR διεξήχθη για να μεταφέρει το γονίδιο εντός του φορέως Plenti-DEST προκειμένου να δημιουργηθεί ο κλώνος έκφρασης. Το κατασκεύασμα αλληλουχήθηκε για να εξασφαλιστεί ότι οι αλληλουχίες και ο προσανατολισμός ήταν σωστές. Η lentivirus παρήχθη με συν-επιμόλυνση κυττάρων 293Τ με την κατασκευή έκφρασης Plenti χρησιμοποιώντας το βελτιστοποιημένο μείγμα συσκευασιών (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). κύτταρα NCI-H520 μετήχθησαν με φακοϊό, και ο ιός Plenti-LacZ χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Η επιλογή ξεκίνησε 48 ώρες μετά τη μόλυνση σε RPMI-1640 με 10 μg /mL βλαστισιδίνη απουσία ινσουλίνης ή EGF. Μετά την επίτευξη συρροής, τα επιλεγμένα κύπαρα περάστηκαν και σειριακά καλλιεργήθηκαν.

2.6 Real Time-πολυμεράσης

Αλυσιδωτή Αντίδραση

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) , και το cDNA συνετέθη χρησιμοποιώντας τη PrimeScript RT Master Mix (Takara, Ιαπωνία). Ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια συνεχή φθορισμού ανίχνευση θερμικό ανακυκλωτή ΑΒΙ PRISM 7500 Sequence Detection System (ΑΒΙ, CA, USA) με SYBR Προμίγμα Εχ Taq II (Takara, Ιαπωνία). Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν, χρησιμοποιώντας ΟΑΡϋΗ ως ενδογενή έλεγχο ενός. qRT-PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές για TC-1 (5-AGCCACCAAGCCATC ATCAT-3, 5-TGTGTCGAAGTGGTAGCCATG-3) και GAPDH (5-AGGTCCACC ACTGACACGTT-3, 5-GCCTCAAGATCATCAGCA ΑΤ-3).

2.7 Western blotting

κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10]. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν με PBS μετά από καλλιέργεια για 48 ώρες με MG-132 (διαλυμένο σε DMSO, Cayman, Αμερική) σε τελική συγκέντρωση 500 ηΜ. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης από τα δείγματα διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE. Μετά από κηλίδωση σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Amersham Biosciences, Piscataway, ΝΥ, USA), η μεμβράνη επωάστηκε σε ρυθμιστικό δέσμευσης [αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris (TBS), που περιέχει 0,1% Tween 20 και 5% αποβουτυρωμένο γάλα] για 1 ώρα στους 25 ° C και στη συνέχεια με το πρωτογενές αντίσωμα (TC-1, 1:300, Gene Tex, Αμερική? β-ακτίνη, 1:500, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Στη συνέχεια, η μεμβράνη ξεπλύθηκε τρεις φορές με ΤΒδ-Τ και επωάστηκαν με υπεροξειδάση αρμορακίας-επισημασμένο δευτερογενή αντισώματα για 2 ώρες στους 25 ° C. Οι ανοσοαντιδραστικές ζώνες αποκαλύφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), και οι φωτογραφίες των ζωνών αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FluorChemTMIS-8900 (Η Alpha Innotech Co., San Leandro, CA, USA).

2.8 ΜΤΤ Δοκιμασία

κύτταρα (1 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων. Σε μια σειρά από χρονικά σημεία, 20 μί ΜΤΤ προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, και τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C για 4 ώρες. Στη συνέχεια, 150 μλ διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO, Sigma, USA) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Οι πλάκες ανακινήθηκαν επί 10 λεπτά, και μετρήθηκε η τιμή οπτικής πυκνότητας (OD) στα 490 nm χρησιμοποιώντας ένα αναγνώστη μικροπλάκας (Bio-Rad Model 680, USA). Οι καμπύλες ανάπτυξης των κυττάρων στη συνέχεια συντάχθηκε. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές, και εγκρίθηκαν οι μέσες τιμές.

2.9 Πλάκα Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού

Τα κύτταρα (4 × 10

2 κύτταρα /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε έξι -Καλά πλάκες και διασκορπίζεται ομοιόμορφα με ελαφρά ανακίνηση των πλακών. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2 έως ότου εμφανίστηκαν ορατές αποικίες. Οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν με 95% αιθανόλη και χρωματίστηκαν με διάλυμα χρώσης crystal violet. Οι αποικίες με περισσότερα από 40 κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο, και ο ρυθμός σχηματισμού αποικίας υπολογίστηκε με τον ακόλουθο τύπο: αποδοτικότητα σχηματισμού αποικίας Plate = (αριθμός των αποικιών /αριθμός κυττάρων εντυπώθηκαν) × 100%. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές, και εγκρίθηκαν οι μέσες τιμές.

2.10 Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της

Κύκλου Κυττάρου

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και συλλέγονται σε σωλήνες φυγοκέντρησης (2 × 10

6 κύτταρα /σωλήνα). Στη συνέχεια, 1 mL PBS και 2 mL αφυδατωμένης αλκοόλης προστέθηκαν σε κάθε σωλήνα (4 ° C επί μία νύκτα) για να καθορίσει τα κύτταρα. Μετά ΚΝΑσης και PI θεραπεία, το ποσοστό των κυττάρων στη φάση S μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ροής BD FACSAria κυτταρόμετρο (Franklin Lakes, NJ, USA). Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ModFit LT (Verity Software House, USA).

2,11 ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των κυττάρων απόπτωσης

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και συλλέγονται σε σωλήνες φυγοκέντρησης (1 × 10

6 κύτταρα /σωλήνα). Μετά από δύο πλύσεις με παγωμένο PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι σε ένα διάλυμα που περιέχει ΡΕ-Α και PerCP-Cy5.5 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, ΙΝ, USA) για την κυτταρική φθορισμό ενεργοποιούμενη ανάλυση διαλογέα (FACS) χρησιμοποιώντας ένα όργανο FACS εξοπλισμένο με διακριτική μονάδα διπλή (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA). Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό CellQuest (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA). Δέκα χιλιάδες έως 20.000 κύτταρα αναλύθηκαν ανά δείγμα.

2.12

In vivo

Ογκογονικότητα Δοκιμασία

Για την ανάλυση ογκογονικότητας, 4 έως 6 εβδομάδων BALB /c αθυμικά γυμνά ποντίκια (Πειραματικό Κέντρο των ζώων, η τέταρτη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Xi’an, Κίνα) χορηγήθηκαν υποδορίως 5 × 10

6 A549- Plenti-shRNA1, A549- Plenti-NSRNA, NCI-H520-Plenti-TC-1 , ή κύτταρα NCI-H520-Plenti-LacZ. Οι διαστάσεις των όγκων μετρήθηκαν κάθε πέντε ημέρες για μια περίοδο 30 ημερών χρησιμοποιώντας μια γραμμική δαγκάνας. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση: V (mm

3) = a × b

2/2, όπου «α» είναι η μεγαλύτερη διάσταση και το «b» είναι η κάθετος διάμετρο. Κάθε ομάδα περιελάμβανε πέντε ποντίκια. Τα ζώα θανατώθηκαν μετά από 30 ημέρες, και οι όγκοι μετρήθηκαν και να απομακρύνονται για περαιτέρω μελέτη.

2.13

vivo

Δοκιμασία Θεραπεία PD173074 Σε

Ένα σύνολο από 5 × 10

6 A549- Plenti-shRNA1 ή Α549 κύτταρα (1:01 εναιώρημα κυττάρων? Matrigel) εμφυτεύθηκαν στο πλευρό του 4- έως 6-εβδομάδων BALB /c αθυμικά γυμνά ποντίκια. Όταν οι όγκοι έγιναν μετρήσιμοι, 50 mg /kg PD173074 /ποντίκια ή σε ισοδύναμο όγκο ρυθμιστικού μόνη φορά την ημέρα για συνολικά 28 ημέρες. Επιπλέον, τα ποντίκια έλαβαν ή δεν έλαβαν δύο δόσεις των 5 mg /kg σισπλατίνης i.v. τις ημέρες 1 και 15. Το μέγεθος του όγκου παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας μια γραμμική δαγκάνας. Τα ζώα θυσιάστηκαν όταν το φορτίο του όγκου έφτασε το 15 mm σε οποιαδήποτε διάσταση, και η επιβίωση καταγράφηκε χρησιμοποιώντας ένα οικόπεδο Kaplan-Meier.

2.14 Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσο ± τυπική σφάλμα (SE). Το πακέτο λογισμικού SPSS 13.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA) χρησιμοποιήθηκε για τις στατιστικές αναλύσεις. Η Mann-Whitney U εφαρμόστηκε για τα μη παραμετρικά δεδομένα, και η Φοιτητική

t

τεστ χρησιμοποιώντας για τις συγκρίσεις των μέσων μεταξύ των δύο ομάδων των δεδομένων των μετρήσεων. Ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) εφαρμόστηκε για τις συγκρίσεις των μέσων πολλαπλές ομάδες των δεδομένων των μετρήσεων, και ο-Newman-Keuls Student test (SNK) χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω συγκρίσεις της κάθε ομάδας. Η δοκιμασία log-rank (Mantel-Cox) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της καμπύλης επιβίωσης. AP τιμή μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

3.1 TC-1 εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα και συνδέεται στενά με κυτταρικού πολλαπλασιασμού στην Πρωτοβάθμια NSCLC Ανθρωπίνων

Για να αξιολογηθεί η έκφραση των TC-1 σε ανθρώπινα πρωτογενή NSCLC, ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας 122 δείγματα του NSCLC, συμπεριλαμβανομένων 68 πλακώδες καρκίνωμα και 54 δείγματα αδενοκαρκινώματος, οι οποίες ελήφθησαν από 83 αρσενικά και 39 θηλυκά (Πίνακας 2). TC-1 έκφραση ήταν εμφανής σε 49 (72,06%) των δειγμάτων πλακώδες καρκίνωμα και 41 (75,93%) των δειγμάτων αδενοκαρκινώματος. Η έκφραση του TC-1 ως επί το πλείστον εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα, αλλά πυρηνική χρώση ήταν επίσης εν μέρει παρόν. Σε κανονική πνευμονικό ιστό, τα μη νεοπλασματικά βρογχικά και κυψελιδικά κύτταρα επιθήλια ήταν σταθερά μη αντιδραστικά ή χαμηλής-αντιδρώσα για TC-1 (Εικ. 1). Επιπλέον, TC-1 έκφραση που παρουσιάζονται μικρές διαφορές μεταξύ των δύο φύλων, την ηλικία, και ιστολογικές υποτύπους (Ρ & gt? 0,05, Πίνακας 2).

Εντατική ανοσοϊστοχημική χρώση για TC-1 σε αδενοκαρκινώματα πνεύμονα (Α) και καρκινώματα πλακωδών κυττάρων (ΣΙ). Μη αντιδραστικότητα για TC-1 σε κανονικό κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα (C). (Μεγέθυνση χ 200).

Η

Η συσχέτιση μεταξύ TC-1 έκφραση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του NSCLC αναλύθηκε με ανίχνευση της έκφρασης του Ki-67. Όπως συνοψίζεται στον Πίνακα 2, υπήρξε μια στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ της ομάδας υψηλού πολλαπλασιασμού (Ki-67 δείκτης σήμανσης & gt? 10%) και η ομάδα χαμηλής πολλαπλασιασμού (Ki-67 δείκτης επισήμανσης ≤10%) τόσο στην πλακώδους πνεύμονα δείγματα καρκίνωμα και το αδενοκαρκίνωμα (Ρ & lt? 0,05), προτείνοντας ότι TC-1 έκφραση συσχετίζεται έντονα με την κυτταρική εξάπλωση των NSCLC

3.2 Παραγωγή σταθερών κλώνων του NSCLC κύτταρα που υπερεκφράζουν ή προς τα κάτω ρύθμιση TC-1

.

για να μελετηθεί η επίδραση της TC-1 παρεκκλίνουσα έκφραση σε κύτταρα NSCLC, qReal-Time PCR και κηλίδωση Western διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το ανθρώπινο NSCLC κυτταρικές γραμμές Α549, SPC-Α-1, 95d, και NCI-H520, και ο 16HBE κυτταρική γραμμή χρησιμοποιήθηκε ως ομάδα ελέγχου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, το επίπεδο έκφρασης της TC-1 σε Α549, SPC-Α-1, και 95d τα κύτταρα ήταν υψηλότερη από αυτή που λαμβάνεται στα κύτταρα 16HBE, και το επίπεδο έκφρασης της TC-1 σε κύτταρα NCI-H520 ήταν χαμηλότερη από εκείνη που παρατηρήθηκε σε τα κύτταρα 16HBE. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, Α549 και NCI-H520 βρέθηκαν να είναι αντιπροσωπευτικές κύτταρα που παρουσιάζουν το υψηλότερο και ένα χαμηλότερο επίπεδο έκφρασης των TC-1 και επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη. Στη συνέχεια, Plenti-shRNA1 διαμολύνθηκε σε κύτταρα Α549, και Plenti-TC-1 διαμολύνθηκε σε κύτταρα NCI-H520. Σταθεροί κλώνοι απομονώθηκαν μετά από διαλογή κλώνο με φθορισμό ενεργοποιούμενη διαλογή κυττάρων ή βλαστισιδίνη, αντίστοιχα. Η qReal-Time PCR και κηλίδωση Western αποτελέσματα έδειξαν ότι TC-1 έκφραση ήταν σημαντικά μειωμένη ή αυξημένη στα κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με τον μάρτυρα, ενώ ο αρνητικός μάρτυρας δεν παρουσίασε καμία αλλαγή στο επίπεδο των TC-1 έκφραση (Σχ. 2Β και 2C).

qRT-PCR και κηλίδωση Western έδειξε ότι Α549, SPC-Α-1, και 95d κύτταρα εκφράζουν υψηλά επίπεδα TC-1 mRNA και πρωτεΐνης και ότι τα κύτταρα NCI-H520 εκφράζουν χαμηλά επίπεδα TC -1 mRNA και πρωτεΐνης (Α). Οι qRT-PCR και κηλίδωση Western αποτελέσματα φαίνονται στον Β και C, αντίστοιχα, δείχνουν ότι TC-1 mRNA και η πρωτεΐνη μειωτικά σημαντικά σε κύτταρα Α549-Plenti-shRNA1 και σημαντικά αυξητικά σε NCI-H520-Plenti-TC-1 κύτταρα σε σύγκριση με οι έλεγχοι. Οι στήλες αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο της σχετικής ποσότητας mRNA από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι μπάρες δείχνουν την SE. * Υποδεικνύει στατιστικά σημαντικές αλλαγές (P & lt? 0,05). Μεταξύ των πέντε ομάδων (Α) ή τρεις ομάδες (Β, Γ)

Η

3.3 TC-1 προάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και κυτταρικού κύκλου για τη μετάβαση και Αναστέλλει την απόπτωση των κυττάρων στο NSCLC

in vitro

η

Για να διερευνήσουν τη λειτουργία TC-1 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC, απώλειας της λειτουργίας και να αποκτήσουν-μελετών λειτουργία πραγματοποιήθηκαν. Αξίζει να σημειωθεί ότι, στη δοκιμασία ΜΤΤ, η επιμόλυνση των Plenti-TC1 διαμόλυνση ενισχυμένη τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NCI-H520 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Εναλλακτικά, TC1 knockdown χρησιμοποιώντας TC1-shRNA1 έδειξαν σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση του πολλαπλασιασμού σε Α549-Plenti-shRNA1 κυττάρων σε σύγκριση με NSRNA-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 3Α). Επιπλέον, οι αριθμοί των αποικιών των ομάδων RNA Plenti-TC-1 και Plenti-NS ήταν υψηλότερες από εκείνες που λαμβάνονται για τις ομάδες Plenti-LacZ και Plenti-shRNA1, αντίστοιχα (Σχ. 3Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι TC-1 προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε NSCLC

in vitro

.

(Α) δοκιμασία ΜΤΤ. Η τιμή οπτικής πυκνότητας ανιχνεύθηκε σε μία σειρά χρονικών σημείων για την αξιολόγηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. (Β) δοκιμασία σχηματισμού αποικιών Plate. Οι αποικίες βάφτηκαν με διάλυμα χρώσης crystal violet και απαριθμήθηκαν, και ο ρυθμός σχηματισμού κλώνος στη συνέχεια υπολογίστηκε. προσδιορισμού του κύκλου (C) κυττάρων. Το ποσοστό των κυττάρων στη φάση S μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής, και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ModFit LT. (D) δοκιμασία κυτταρικής απόπτωσης. Τα κύτταρα επωάζονται στο σκοτάδι σε ένα διάλυμα που περιέχει ΡΕ-Α και PerCP-Cy5.5. Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων (κάτω δεξιά τεταρτημόριο) αναλύθηκε χρησιμοποιώντας FACS εξοπλισμένο με διακριτική μονάδα διπλή, και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό CellQuest. Οι στήλες αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή σχηματισμό αποικίας (Β), το ποσοστό των κυττάρων S-φάσης (C), και ο ρυθμός κυτταρικής απόπτωσης (D) από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι μπάρες δείχνουν την SE. * Υποδηλώνει στατιστικώς σημαντικές αλλαγές (Ρ & lt? 0,05) μεταξύ των τριών ομάδων

Η

Η κατανομή φάση του κυτταρικού κύκλου μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής.. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το ποσοστό των κυττάρων στη φάση S ήταν σημαντικά αυξημένη μετά τη θεραπεία με Plenti-TC1 σε σύγκριση με εκείνη που λαμβάνεται μετά από κατεργασία με Plenti-LacZ. Αντίθετα, το ποσοστό των κυττάρων στη φάση S μειώθηκε σημαντικά μετά την αγωγή με pLenti- shRNA1 σύγκριση με εκείνη που λαμβάνεται με Plenti-NSRNA (Σχ. 3C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι TC-1 προάγει την μετάβαση G1 στην S-φάση.

Επιπλέον, το αποτέλεσμα των TC-1 στην απόπτωση των κυττάρων NSCLC αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3D, τα κύτταρα επιμολυσμένα με Plenti-TC-1 που εμφανίζεται κάτω αποπτωτικά ρυθμούς σε σύγκριση με τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με Plenti-LacZ, και τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με Plenti-shRNA1 εμφανίζονται υψηλότερα αποπτωτικών ρυθμούς σε σύγκριση με τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με Plenti-NSRNA, υποδηλώνοντας ότι TC -1 αναστέλλει την κυτταρική απόπτωση σε NSCLC.

3.4 TC-1 Προωθεί NSCLC πολλαπλασιασμός κυττάρων

in vivo

η

Για να αξιολογηθεί η λειτουργία των TC-1 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC

in vivo

, ένας

in vivo

δοκιμασία ογκογενετικότητας εκτελέστηκε. Οι διαστάσεις των όγκων μετρήθηκαν κάθε πέντε ημέρες για μια περίοδο 30 ημερών (Σχ. 4Β και 4D). Στο τέλος του πειράματος, οι ποντικοί θυσιάστηκαν, και οι όγκοι αφαιρέθηκαν και φωτογραφήθηκαν (Σχ. 4Α και 4C). Όπως φαίνεται στο Σχ. 4, τα αποτελέσματα της ανάλυσης ογκογονικότητα μας δείχνουν ότι η προς τα πάνω ρύθμιση του επιπέδου έκφρασης TC-1 προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

in vivo

, ενώ η knockdown του επιπέδου έκφρασης TC-1 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

in vivo

.

Η υποδόρια μοντέλο όγκου (n = 5). Τα κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως στο πλευρό αθυμικών γυμνών ποντικών, και ο όγκος του όγκου καταγράφηκε κάθε πέντε ημέρες (C, D). Οι ποντικοί θυσιάστηκαν 30 ημέρες μετά την ένεση, οι όγκοι αφαιρέθηκαν, και ελήφθησαν φωτογραφίες (Α, Β).

Η

Μέρος κάθε υποδόριου οζιδίου ήταν χωρισμένο και υποβλήθηκε σε ανοσοϊστοχημεία για Ki-67. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι υπήρχε σημαντική διαφορά στον αριθμό των Ki-67-αντιδραστικών κυττάρων όγκου στα υποδόρια οζίδια μεταξύ των δύο ομάδων (Το Ki-67 δείκτες των υποδόρια οζίδια ήταν οι εξής: A549- Plenti-NSRNA, 68.98 ± 2,56%? A549- Plenti-shRNA1, 28.63 ± 2.38%? P & lt? 0,05? NCI-H520- Plenti-TC-1, 86.26 ± 3.16%? NCI-H520- Plenti-LacZ, 51.34 ± 1.78%? P & lt? 0,05) . Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι TC-1 ενισχύει σημαντικά την ικανότητα πολλαπλασιασμού των κυττάρων NSCLC

in vivo

.

3.5 PD173074 Μειώνει την Έκφραση της TC-1 με δοσο-ανάλογα τρόπο σε μια ορισμένη σειρά

Για να ελέγξετε αν η προσθήκη PD173074 επηρεάζει την έκφραση των TC-1 σε NSCLC, Α549 και Α549-Plenti-shRNA1 στο SITA υποβλήθηκαν σε θεραπεία με PD173074. Τα αποτελέσματα της RT-PCR και κηλίδωση Western έδειξε ότι το επίπεδο έκφρασης της TC-1 μειώθηκε με την αύξηση της συγκέντρωσης του PD173074 και τα επίπεδα έξω όταν η συγκέντρωση του PD173074 φθάσει το 1 μΜ (Εικ. 5). Η συγκέντρωση του 1 μΜ Έτσι επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτη.

Ο qRT-PCR και κηλίδωση Western αποτελέσματα έδειξαν ότι το επίπεδο έκφρασης της TC-1 μειώθηκε με την αύξηση της συγκέντρωσης του PD173074 και τα επίπεδα έξω όταν η συγκέντρωση του PD173074 φθάσει το 1 μΜ σε Α549 κύτταρα Α549-Plenti-shRNA1 (Β) (Α) και. Οι στήλες αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο της σχετικής ποσότητας mRNA από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι μπάρες δείχνουν την SE. * Υποδεικνύει στατιστικά σημαντικές αλλαγές (P & lt? 0,05). Μεταξύ των πέντε ομάδων

Η

3.6 PD173074 Αναστολές του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, Κύκλος μετάβαση, και την απόπτωση Αντίσταση Εξαρτάται από το TC-1 Έκφραση Επίπεδο

in vitro

για να μελετηθεί η επίδραση της PD173074 επί TC-1 με τη μεσολάβηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε NSCLC, μία δοκιμασία ΜΤΤ, δοκιμασία αποικίας πλάκα σχηματισμό, την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, και η ανάλυση κυτταρικής απόπτωσης διεξήχθησαν. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α, θεραπεία PD173074 έχει μία σημαντική επιρροή στις καμπύλες ανάπτυξης των κυττάρων των μη επιμολυσμένα κύτταρα, όπως απεικονίζεται από τη διαφορά μεταξύ της ομάδας Α549 + PD173074 και την ομάδα Α549, αλλά έχει μικρή επίδραση στις καμπύλες ανάπτυξης των κυττάρων των επιμολυσμένων κυττάρων, όπως αναφέρεται από τη διαφορά μεταξύ της ομάδας Α549-Plenti-shRNA1 + PD173074 και την ομάδα Α549-Plenti-shRNA1. Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε στην δοκιμασία σχηματισμού αποικίας πλάκα: υπήρχε σημαντική διαφορά στο ποσοστό σχηματισμού αποικίας μεταξύ της ομάδας Α549 + PD173074 και την ομάδα Α549, αλλά μόνο μικρές διαφορές στο ποσοστό σχηματισμού αποικιών παρατηρήθηκαν μεταξύ του Α549-pLenti- ομάδα shRNA1 + PD173074 και η ομάδα Α549-Plenti-shRNA1 (Εικ. 6Β). Όπως φαίνεται στο Σχ. 6C, τα ποσοστά των κυττάρων στη φάση S του πληθυσμού των κυττάρων Α549 PD173074 επεξεργασμένα, κύτταρα Α549, PD173074 επεξεργασμένα κύτταρα Α549-Plenti-shRNA1, και Α549-Plenti-shRNA1 κύτταρα ήταν 29,47 ± 0,62%, 49.5 ± 1.89% , 28,02 ± 0,97%, και 29,5 ± 1,02%, αντίστοιχα. Προφανώς, υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ της ομάδας Α549 + PD173074 και την ομάδα Α549, αλλά μόνο μικρή διαφορά μεταξύ της ομάδας Α549-Plenti-shRNA1 + PD173074 και την ομάδα Α549-Plenti-shRNA1. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6D, τα αποπτωτικά ποσοστά των PD173074-κατεργασμένων κυττάρων Α549 ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη των κυττάρων Α549? Ωστόσο, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην αποπτωτική ποσοστό μεταξύ των PD173074 επεξεργασμένα κύτταρα Α549-Plenti-shRNA1 και τα κύτταρα Α549-Plenti-shRNA1. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των PD173074 TC-1 με τη μεσολάβηση κυττάρων, μετάβαση του κυτταρικού κύκλου, και αντίσταση απόπτωση κυττάρων όταν TC-1 είναι εξαιρετικά ή μέτριας εκφράσεως, αλλά όχι όταν ταπεινός εκφράζεται.

(Α ) δοκιμασία ΜΤΤ. Η τιμή οπτικής πυκνότητας ανιχνεύθηκε σε μία σειρά χρονικών σημείων για την αξιολόγηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. (Β) δοκιμασία σχηματισμού αποικιών Plate. Οι αποικίες βάφτηκαν με διάλυμα χρώσης crystal violet και απαριθμήθηκαν, και ο ρυθμός σχηματισμού κλώνος στη συνέχεια υπολογίστηκε. προσδιορισμού του κύκλου (C) κυττάρων. Το ποσοστό των κυττάρων στη φάση S μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής, και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ModFit LT. (D) δοκιμασία κυτταρικής απόπτωσης. Τα κύτταρα επωάζονται στο σκοτάδι σε ένα διάλυμα που περιέχει ΡΕ-Α και PerCP-Cy5.5. Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων (κάτω δεξιά τεταρτημόριο) αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FACS εξοπλισμένο με διακριτική μονάδα διπλή, και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό CellQuest. Οι στήλες αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή σχηματισμό αποικίας (Β), το ποσοστό των κυττάρων S-φάσης (C), και ο ρυθμός κυτταρικής απόπτωσης (D) από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι μπάρες δείχνουν την SE.