Τα κύτταρα

Abstract

Τετραπλοειδής (4Ν) θεωρείται σημαντική στον καρκίνο, επειδή μπορούν να εμφανίζουν αυξημένη ογκογονικότητα, αντοχή στις συμβατικές θεραπείες, και πιστεύεται ότι είναι πρόδρομοι προς ολόκληρο ανευπλοειδία χρωμόσωμα. Συνεπώς, είναι σημαντικό να καθορίσει πώς τετραπλοειδούς τα καρκινικά κύτταρα να προκύψουν, και πώς να τους στοχεύσουν. P53 είναι ένα ογκοκατασταλτικό πρωτεΐνης και βασικό ρυθμιστή της tetraploidy. Ως μέρος του «tetraploidy σημείο ελέγχου», p53 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων τετραπλοειδούς προωθώντας μια G1-σύλληψη στην αρχόμενη τετραπλοειδούς κύτταρα (αναφέρεται ως τετραπλοειδούς G1 σύλληψη). Νουτλίνη-3a είναι ένα προκλινικό φάρμακο που σταθεροποιεί την ρ53 αναστέλλοντας την αλληλεπίδραση μεταξύ ρ53 και MDM2. Στην παρούσα μελέτη, νουτλίνη-3a προώθησε μια ρ53-εξαρτώμενη τετραπλοειδούς σύλληψη G1 σε δύο διπλοειδή κλώνους του καρκίνου κυτταρικής γραμμής κόλου HCT116. Και οι δύο κλώνοι υποβλήθηκαν σε ενδοαναδιπλασιασμό μετά την απομάκρυνση νουτλίνη, προκαλώντας σταθερή τετραπλοειδούς κλώνοι που παρουσίασαν αυξημένη αντοχή σε ιονίζουσα ακτινοβολία (IR) και σισπλατίνη (CP) επαγόμενη απόπτωση σε σύγκριση με διπλοειδή προδρόμους τους. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι η ενεργοποίηση παροδική ρ53 με νουτλίνη μπορεί να προωθήσει το σχηματισμό τετραπλοειδούς κύτταρο από διπλοειδείς προδρόμους, και τα προκύπτοντα κύτταρα είναι τετραπλοειδούς θεραπεία (IR /CP) ανθεκτικός. Σημαντικά, οι τετραπλοειδούς κλώνοι επιλέγονται μετά από θεραπεία νουτλίνη εκφράζεται περίπου διπλάσια

Ρ53

και

MDM2

mRNA ως διπλοειδής προδρόμους, εκφράζονται περίπου διπλάσιες σύμπλοκα πρωτεΐνης p53-MDM2 (με συν-ανοσοκαταβύθιση) , και ήταν περισσότερο επιρρεπή σε ρ53-εξαρτώμενη απόπτωση και διακοπή της ανάπτυξης που προκαλείται από νουτλίνη. Με βάση αυτά τα ευρήματα, προτείνουμε ότι η p53 παίζει μυθιστόρημα ρόλους τόσο στο σχηματισμό και τη στόχευση των τετραπλοειδούς κυττάρων. Συγκεκριμένα, προτείνουμε ότι 1) παροδική ενεργοποίηση ρ53 μπορεί να προωθήσει μια σύλληψη τετραπλοειδούς-G1 και, ως αποτέλεσμα, μπορεί ακούσια προάγουν σχηματισμό τετραπλοειδών κυττάρων θεραπεία ανθεκτικά, και 2) τετραπλοειδούς κύτταρα θεραπεία ανθεκτικών, λόγω του ότι έχουν υψηλότερη

ρ53

αριθμού αντιγράφων γονιδίου και έκφραση διπλάσιες σύμπλοκα ρ53-MDM2, είναι πιο ευαίσθητα σε απόπτωση ή /και διακοπή της ανάπτυξης από ανταγωνιστές MDM2 αντικαρκινικά (π.χ. νουτλίνη)

Παράθεση:. Davaadelger Β, Shen η, Μάκη CG (2014) Μυθιστόρημα Ρόλοι για Ρ53 στην Γένεση και τη στόχευση κυττάρων του καρκίνου Τετραπλοειδής. PLoS ONE 9 (11): e110844. doi: 10.1371 /journal.pone.0110844

Επιμέλεια: Αντρέι Λ Gartel, Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27 του Ιουνίου του 2014? Αποδεκτές: 24, Σεπ, 2014? Δημοσιεύθηκε: 7, Νοεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Davaadelger et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας Grant 1RO1CA137598-01A1 από το Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (NCI) (σε C.G.M.). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Συγγραφέας Καρλ Μάκη είναι μέλος του διοικητικού συμβουλίου συντακτικής PLoS ONE. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE Editorial πολιτικές και κριτήρια.

Εισαγωγή

Τετραπλοειδής κύτταρα περιέχουν διπλάσιο της κανονικής ποσότητας του DNA και είναι σπάνια σε πιο φυσιολογικούς ιστούς. Ωστόσο, τετραπλοειδούς κύτταρα είναι σχετικά κοινή στον καρκίνο και πιστεύεται ότι συμβάλλουν στην ανάπτυξη του όγκου, ανευπλοειδία, και αντίσταση θεραπεία [1]. Άμεση απόδειξη για την ογκογόνο δυναμικό των κυττάρων τετραπλοειδών παρασχέθηκε από Fujiwara et al. [2] που απομονώνονται διπύρηνα, τετραπλοειδούς μαστικά επιθηλιακά κύτταρα από ρ53-ηυΙΙ ποντικούς. Αξιοσημείωτα, αυτά τα κύτταρα ήταν περισσότερο ευαίσθητα σε καρκινογόνο επαγόμενη μεταμόρφωση (αύξηση μαλακού άγαρ) από διπλοειδή ομολόγους, και τα κύτταρα που σχηματίζονται τετραπλοειδούς όγκων σε γυμνούς ποντικούς, ενώ διπλοειδή κύτταρα δεν το έκανε. Άλλες μελέτες έχουν συνδέσει tetraploidy σε ακτινοβολία και την αντίσταση χημειοθεραπεία. Για παράδειγμα, Castedo et al. [3], [4] απομονωθεί τετραπλοειδούς και διπλοειδή κλώνους από δύο ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές γραμμές με άγριου-τύπου ρ53. Είναι σημαντικό, τετραπλοειδούς κλώνοι ήταν ανθεκτικά στην ακτινοβολία και πολλαπλές χημειοθεραπευτικούς παράγοντες σε σχέση με διπλοειδή ομολόγους. Τέλος, υπάρχουν ενδείξεις τοποθέτηση ότι οι ανευπλοειδικών καρκινικά κύτταρα που δημιουργούνται είτε από ασύμμετρη διαίρεση ή προοδευτική χρωμοσωμική ζημία από τετραπλοειδείς πρόδρομες ουσίες. Νωρίς στοιχεία για αυτό προήλθε από μελέτες σε οισοφάγο Barrett προκαρκινικές του. Σε αυτές τις μελέτες, η εμφάνιση των τετραπλοειδών κυττάρων συσχετίζεται με την απώλεια p53 και προηγήθηκε ακαθάριστο ανευπλοειδίας και καρκινογένεση [5], [6]. Εν ολίγοις, τετραπλοειδούς κύτταρα μπορεί να έχουν υψηλότερο ογκογόνο δυναμικό, είναι η θεραπεία και ανθεκτικά στην ακτινοβολία, και είναι πρόδρομες ουσίες για την ανευπλοειδία καρκίνο. Συνεπώς, είναι σημαντικό να προσδιορίσει πώς τετραπλοειδούς κύτταρα να προκύψουν και πώς μπορούν να απευθύνονται για τη θεραπεία του καρκίνου.

P53 είναι ένα ογκοκατασταλτικό και σημαντικός ρυθμιστής της tetraploidy [7]. ρ53 διατηρείται σε χαμηλά επίπεδα από MDM2, μια Ε3-λιγάση που δεσμεύει το ρ53 και προωθεί την υποβάθμιση του [8], [9]. βλάβες στο DNA και άλλες πιέσεις διασπούν την δέσμευση p53-MDM2, προκαλώντας τα επίπεδα p53 να αυξάνεται. Αυξημένη ρ53 σταματά τον πολλαπλασιασμό επάγοντας την έκφραση των γονιδίων που προάγουν την G1-σύλληψη (

P21

) ή απόπτωση (

PUMA, NOXA, ΒΑΧ

) [10]. Η απόδειξη ότι λειτουργεί p53 σε μια «tetraploidy σημείο ελέγχου» προέρχεται σε μεγάλο βαθμό από μελέτες που χρησιμοποιούν αναστολείς μικροσωληνίσκων (MTIs) ότι τα κύτταρα μπλοκ σε μετάφαση. Κύτταρα συνελήφθη σε μετάφαση ύστερα από παρατεταμένη έκθεση MTI μπορεί τελικά να βγείτε από τη μίτωση και εισάγετε μια κατάσταση ψευδο-G1, που αναφέρεται ως τετραπλοειδούς G1 [11], [12]. Ενδοαναδιπλασιασμό αναφέρεται στην περίπτωση κατά την οποία οι εν λόγω τετραπλοειδούς κύτταρα εισάγετε S-φάσης και αναπαράγουν το DNA τους, που οδηγεί σε υψηλές κύτταρα πλοειδίας με την αύξηση επαναλήψεις του γονιδιώματος (8Ν, 16Ν, 32Ν, κλπ). Τα κύτταρα που στερούνται ρ53 /ρ21 είναι πιο επιρρεπή σε ΜΤΙ επαγόμενη ενδοαναδιπλασιασμό από τα κύτταρα άγριου τύπου [11] – [14]. Αυτό υποστηρίζει μία ρ53-ρ21 εξαρτώμενη tetraploidy οδοφράγματος ότι η είσοδος μπλοκ S-φάση με 4Ν κύτταρα.

Τετραπλοειδής G1-σύλληψη τυπικά χαρακτηρίζεται από την εξάντληση των πρωτεϊνών G2 /M (π.χ. κυκλίνες Α /Β, CDC2) και αυξημένη έκφραση πρωτεϊνών G1 σύλληψης (π.χ. Ρ53, ρ21) σε κύτταρα 4Ν [15] – [19]. παράγοντες βλάβης του DNA, π.χ. ιονίζουσα ακτινοβολία (IR) ενεργοποιούν ρ53 και τη σύλληψη των κυττάρων στο G1 και G2 φάσεις. Δύο πρώιμες αναφορές βρέθηκαν IR προκαλούνται ρ53 και ρ21-εξαρτώμενη μείωση της CDC2, κυκλίνη Α και κυκλίνη Β mRNA και η πρωτεΐνη [20], [21]. Σε μία περίπτωση, η εξάντληση αυτών των G2 /M δείκτες συνέπεσε με ενδοαναδιπλασιασμό 1-6 ημέρες μετά την αγωγή [21]. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η ενεργοποίηση p53-p21 στα κύτταρα IR-θεραπεία θα μπορούσε να προωθήσει μια τετραπλοειδούς σύλληψη G1 που ακολουθείται στη συνέχεια από ενδοαναδιπλασιασμό. Νουτλίνη-3α (νουτλίνη) είναι ένα προκλινικό φάρμακο που σταθεροποιεί p53 μπλοκάροντας δέσμευσης ρ53-MDM2. Έχουμε αναφέρει ότι θα μπορούσε να προωθήσει νουτλίνη τετραπλοειδούς σύλληψη G1 σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές άγριου-τύπου ρ53, που χαρακτηρίζεται από την εξάντληση του G2 πρωτεϊνών /M και αυξημένη έκφραση της ρ53 και ρ21 σε 4Ν κύτταρα [18], [19]. Μετά την απομάκρυνση νουτλίνη, ρ53 και ρ21 μειώθηκε και, σε μερικές περιπτώσεις, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ενδοαναδιπλασιασμό [18]. p53 και p21 είχαν απαιτούνται τόσο για την τετραπλοειδούς G1 σύλληψη και για ενδοαναδιπλασιασμό μετά την αφαίρεση νουτλίνη. Είναι σημαντικό ότι, σταθερή τετραπλοειδούς κλώνοι θα μπορούσαν να απομονωθούν από νουτλίνη επεξεργασμένα κύτταρα, και αυτοί οι κλώνοι τετραπλοειδούς ήταν ανθεκτικά στην IR και σισπλατίνη (CP) επαγόμενη απόπτωση [19]. Αυτές οι μελέτες προτείνουν ρ53-ρ21 ενεργοποιήθηκε με νουτλίνη μπορεί να προωθήσει μια τετραπλοειδούς G1-σύλληψης και, όταν τα επίπεδα ρ53 μείωση (αφαίρεση νουτλίνη) τα κύτταρα μπορούν να αναπαράγουν το DNA τους (ενδοαναδιπλασιασμό) και δημιουργούν τετραπλοειδούς κύτταρα που είναι IR και CP-ανθεκτικά. Ωστόσο, μια προειδοποίηση από αυτές τις προηγούμενες μελέτες είναι ότι έγιναν σε καρκινικές κυτταρικές γραμμές, οι οποίες μπορεί να περιλαμβάνουν ένα μίγμα από διπλοειδή και τετραπλοειδής κύτταρα, μερικά από τα οποία μπορεί να είναι εγγενώς IR /CP-ανθεκτικά. Είναι πιθανό ότι είχαμε απομονωθεί IR /τετραπλοειδούς κλώνους CP-ανθεκτική που υπήρχαν ήδη στον πληθυσμό, ή ότι οι κλώνοι τετραπλοειδή απομονώσαμε προήλθαν από διπλοειδή κύτταρα τα οποία ήταν ήδη IR /CP-ανθεκτικά. Ετσι, δεν ήταν σαφές αν η ενεργοποίηση παροδική ρ53 με νουτλίνη θα μπορούσε να μετατρέψει διπλοειδή κύτταρα σε τετραπλοειδή κύτταρα και, αν ναι, αν τα προκύπτοντα τετραπλοειδούς κλώνων θα εμφανίσει αυξημένη αντοχή σε θεραπεία επαγόμενη απόπτωση. Η παρούσα μελέτη ξεκίνησε να αντιμετωπίσει αυτές τις ερωτήσεις, και να δοκιμάσει την πιθανότητα ότι τετραπλοειδούς καρκινικά κύτταρα μπορεί να είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη σε ανταγωνιστές MDM2.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων και συνθήκες καλλιέργειας

ρ53 άγριου τύπου και ρ53-ηυΙΙ κύτταρα HCT116 (που περιγράφεται στο [11] ελήφθησαν από τον Dr. Bert Vogelstein (John Hopkins University). D3 και D8 έχουν περιγραφεί [22] και είναι διπλοειδή κλώνους που απομονώθηκαν από ρ53 κύτταρα HCT116 άγριου τύπου με περιοριστική αραίωση. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο McCoy 5Α με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), πενικιλλίνη (100 U /ml) και στρεπτομυκίνη (100 μg /mL). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν 24 ώρες πριν να κατεργάζεται με νουτλίνη-3 (10 μmol /L? Sigma), ακτινοβολία (10 Gy), σισπλατίνη (Bedford Laboratory), ή όπως υποδεικνύεται

ανοσοαποτύπωσης

εκχυλίσματα ολόκληρου κυττάρου παρασκευάστηκαν με επαναιώρηση. σφαιρίδια κυττάρων σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5% Nonidet Ρ-40, 50 mM Tris, ρΗ 7.5), επιλύονται με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (ΝΕΝ Life Science Products). Αντισώματα έναντι ρ21 (Η-164), η κυκλίνη Α (Η-432), Geminin (FL-309), Cdk2 (Μ2) και p53 (ΑΒ-6) ήταν από την Santa Cruz Biotechnology? αντισώματα έναντι κυκλίνης Β1 (V152), CDC2 (POH1), και Tyr-15 φωσφο-CDC2 ήταν από τη Cell Signaling? αντισώματα για MDM2 (2Α10) ήταν από την Calbiochem. Αντίσωμα προς Κυκλίνη Ε (ΗΕ-2) ήταν από BD Pharmingen. Πρωτογενή αντισώματα ανιχνεύτηκαν με κατσίκας αντι-ποντικού (Pierce) ή αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού (Life Technologies) δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αγριοραπανιού, χρησιμοποιώντας χημειοφωταύγεια σαφήνεια (Bio-Rad).

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής και ζωντανών κυττάρων Διαλογής

Για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε 25% αιθανόλη όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (25 μg /ml? Calbiochem). Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε σε Γάλλιο κυτταρόμετρο ροής (Beckman Coulter) και αναλύθηκαν με CellQuest (Becton Dickinson) και FlowJo 8.7 (Treestar, Inc). Για κάθε δείγμα, 10.000 γεγονότα συλλέχθηκαν. Για τα ζωντανά ταξινόμηση κυττάρων, τα κύτταρα επωάστηκαν με Hoechst 33342 (2 μmol /λίτρο? Invitrogen) για 90 λεπτά στους 37 ° C και στη συνέχεια συλλέχθηκαν. Διαλογή κυττάρων διεξήχθη με βάση το περιεχόμενο του DNA χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο MoFlo εξοπλισμένο με λέιζερ UV διέγερση. Τα ταξινομημένα κύτταρα απλώθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα.

MRNA ανάλυση

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR) διεξήχθη για να μετρηθούν τα επίπεδα mRNA για Κυκλίνης Α2, κυκλίνη Β1, CDC2, Ρ21, Bax, Noxa, PUMA, P53R2, ακτίνης σε κύτταρα που δεν υποβλήθηκαν σε αγωγή ή θεραπεία με νουτλίνη, σισπλατίνη, ή IR όπως υποδεικνύεται. Η ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR αντίδραση εκτελείται σε ένα 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Foster, CA) χρησιμοποιώντας SybrGreen PCR κύριο μείγμα, (Applied Biosystems, Foster City, CA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Θερμοκυκλοποίηση έγινε σε τελικό όγκο 20 μL που περιέχει 2 μι cDNA και 400 nmol /L εκκινητές (Οι εκκινητές που παρατίθενται στον Πίνακα S1). Όλα τα δείγματα ενισχύθηκαν εις τριπλούν χρησιμοποιώντας το ακόλουθο σχήμα κύκλος: 95 ° C για 2 λεπτά, 40 κύκλοι των 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα και 55 ° C για 60 δευτερόλεπτα. Ο φθορισμός μετρήθηκε σε κάθε κύκλο και τα επίπεδα mRNA ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τις τιμές ακτίνης σε όλα τα δείγματα. Μία μονή κορυφή λήφθηκε για τους στόχους, υποστηρίζοντας την ειδικότητα της αντίδρασης.

μεταφάσης Απλώνεται

κυττάρων επωάστηκαν με κολσεμίδη (50 ng /μL) (Sigma-Aldrich) για μία ώρα στους 37 ° C, συλλέχθηκαν και πλύθηκαν με PBS και υποτονικό διάλυμα (2 μέρη 0.075 Μ KCl και 1 μέρος κιτρικού νατρίου 0.7%). Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε στερεωτικό (3 μέρος μεθανόλης και 1 μέρος οξικό οξύ) και απλώνονται πάνω σε μια διαφάνεια. Τα spreads εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης.

FISH Ανάλυση

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν με PBS. Στη συνέχεια, επωάζονται με υποτονικό διάλυμα (2 μέρη 0.075 Μ KCl και 1 μέρος κιτρικού νατρίου 0.7%) για 20 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε στερεωτικό (3 μέρος μεθανόλης και 1 μέρος οξικό οξύ). Τα πλακίδια παρασκευάστηκαν και γήρανση στους 55 ° C για 3 λεπτά σε ένα thermobrite. Τα πλακίδια επωάστηκαν με 0,05% πεψίνη (Fisher # P53-100) για 16 λεπτά στους 37 ° C και στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και αφυδατώθηκαν σε 70%, 85% και 100% αιθανόλη για 1 λεπτό κάθε σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, ο καθετήρας Vysis LSI ΤΡ53 SpectrumOrange /CEP 17 SpectrumGreen (Abbott Molecular Inc # 01N17-020) προστέθηκε υβριδοποιηθεί στους 73 ° C για 5 λεπτά και 37 μοιρών για 18 ώρες. Στη συνέχεια, τα πλακίδια πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα SSC (Gibco # 15557-044) με 0.5% ΝΡ-40 (Fisher # P53-100) για 2 λεπτά στους 73 ° C και αντίθετα με DAPI II (Abbott Molecular Inc # 30 – 804.818). Τα πλακίδια εξετάστηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού.

κλωνογονική δοκιμασία.

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν 24 ώρες πριν να μη επεξεργασμένα ή επεξεργασμένα με CP, IR, ή νουτλίνη σε κατάλληλες αραιώσεις για να σχηματίσουν 50-100 αποικίες. Μετά από 2-3 εβδομάδες οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν με φορμαλδεΰδη και βάφτηκαν με 0.05% κρυσταλλικό ιώδες. Οι αποικίες μετρήθηκαν και κανονικοποιούνται με την απόδοση επένδυσης των μη επεξεργασμένων κυττάρων.

Αποτελέσματα

νουτλίνη προωθεί ένα τετραπλοειδούς G1-σύλληψη στο διπλοειδή κύτταρα

Θα ήθελε να ρωτήσω αν παροδική p53 ενεργοποίηση από νουτλίνη θα μπορούσε να προωθήσει το σχηματισμό τετραπλοειδούς κύτταρο από διπλοειδείς προδρόμους και, αν ναι, αν τα προκύπτοντα τετραπλοειδούς κύτταρα θα έχουν αυξημένη αντοχή σε θεραπεία επαγόμενη απόπτωση. HCT116 είναι μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου που εκφράζει άγριου τύπου ρ53. Σε προηγούμενη μελέτη μας, HCT116 επιστρώθηκαν σε ενιαία πυκνότητα κυττάρων και δέκα μεμονωμένες διπλοειδή κλώνοι απομονώθηκαν (κλώνοι καθορισμένη D1-D10) η οποία μεταβάλλεται σε σχετική ευαισθησία τους σε σισπλατίνη (CP) προκληθείσα απόπτωση [22]. Επιλέξαμε κλώνους διπλοειδή D3 και D8 για την τρέχουσα μελέτη, επειδή αυτοί οι κλώνοι παρουσίασαν μια σχετικά υψηλή ευαισθησία σε CP σε προηγούμενη μελέτη μας. D3 και D8 που έλαβαν θεραπεία με νουτλίνη για 24 ώρες συσσωρευμένη με 2Ν και το περιεχόμενο 4Ν DNA (Σχήμα 1Α). Τα ανοσοαποτυπώματα έδειξαν ότι η θεραπεία νουτλίνη σε αμφότερους τους κλώνους που προκαλείται πλήρη ή σχεδόν πλήρη εξάντληση Κυκλίνης Α, κυκλίνη Β1, και Tyr-15 φωσφορυλιώνεται CDC2 (pCDC2), και η μερική εξάντληση της συνολικής πρωτεΐνης CDC2 (Σχήμα 1Β). Η κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, και CDC2 mRNA ήταν επίσης εξαντλημένο σε νουτλίνη επεξεργασμένα κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει την μειωμένο επίπεδο αυτών των G2 /M πρωτεΐνες μπορεί να προκύψει από μειωμένη μεταγραφή (Σχήμα 1 C). Σε αντίθεση, τα επίπεδα ρ53 και ρ21 πρωτεΐνης ήταν σημαντικά αυξημένη με κατεργασία νουτλίνη (Σχήμα 1Β). προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ρ53 και ρ21 αυξήθηκαν τόσο στο 2Ν και 4Ν νουτλίνη-συνελήφθησαν κύτταρα [18]. Έτσι, νουτλίνη προκαλεί εξάντληση των G2 πρωτεϊνών /M και αυξημένη έκφραση των πρωτεϊνών G1-σύλληψη (p53, p21) στις 4Ν συνελήφθη κύτταρα, ενδεικτική μιας τετραπλοειδούς G1 σύλληψη. Σημαντικά, νουτλίνη είχε καμία επίδραση στην κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, pCDC2, και συνολικά επίπεδα CDC2 σε ρ53-ηυΙΙ HCT116 κυττάρων (Σχήμα 1Β), και δεν προκάλεσε 2Ν και 4Ν σύλληψης σε αυτά τα κύτταρα (Σχήμα 1Α), αποδεικνύοντας την τετραπλοειδείς G1 σύλληψη επάγεται από νουτλίνη είναι ρ53-εξαρτώμενη. Παρακολουθήσαμε επίσης τα επίπεδα της Geminin, ενός αναστολέα αναδιπλασιασμού του DNA που απουσιάζει σε G1 και συσσωρεύεται στο S, G2, και Μ-φάσης [23]. Geminin είχε εξαντληθεί από νουτλίνη στα κελιά D3 και D8, σύμφωνα με τα κύτταρα είναι G1-συνελήφθησαν (Σχήμα 1Β). επίπεδα Cdk2 παρέμειναν αμετάβλητες από νουτλίνη, ενώ τα επίπεδα των πρωτεϊνών κυκλίνης G1 φάσης κυκλίνης D1 και κυκλίνης Ε αυξήθηκαν, επίσης συνεπής με τα κύτταρα που συνελήφθησαν στη G1 φάση. Εν ολίγοις, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι νουτλίνη προκαλεί ρ53-εξαρτώμενη τετραπλοειδούς G1-συλλήψεως διπλοειδή κλώνους HCT116 D3 και D8.

Α) HCT116 διπλοειδή κλώνων D3 και D8, και HCT116 που εκφράζουν άγριου τύπου ρ53 (ρ53 + /+) ή ρ53-ηυΙΙ (ρ53 – /-) ήσαν μη επεξεργασμένα ή επεξεργασμένα με νουτλίνη (NUT 10 μΜ) για 24 ώρες, και το προφίλ του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. Β) Έκφραση των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών παρακολουθήθηκε με ανοσοκηλίδα σε κύτταρα μη επεξεργασμένα ή επεξεργασμένα με νουτλίνη (NUT 10 μΜ) για 24 ώρες. επίπεδα C) mRNA για τις υποδεικνυόμενες παράγοντες μη επεξεργασμένα κύτταρα ή κύτταρα που κατεργάζονται με νουτλίνη (NUT 10 μΜ) για 24 ώρες προσδιορίστηκε με qRT-PCR.

Η

θεραπεία Παροδική νουτλίνη προάγει τον σχηματισμό ανθεκτικών θεραπεία tetrapolid κλώνων από διπλοειδή πρόδρομα κύτταρα

Είμαστε στο παρελθόν έδειξαν 4Ν συνελήφθη κύτταρα μπορούν να ξαναρχίσει τη σύνθεση του DNA μετά την αφαίρεση νουτλίνη και αναπαράγουν το DNA τους, χωρίς να μεσολαβήσει μιτωτική διαίρεση, μια διαδικασία γνωστή ως ενδοαναδιπλασιασμό [18], [19]. Να ρωτήσει εάν D3 και D8 υποβάλλονται ενδοαναδιπλασιασμό μετά την απομάκρυνση νουτλίνη, τα κύτταρα νουτλίνη θεραπεία για 24 ώρες, ακολουθούμενη από απομάκρυνση νουτλίνη για διάφορα χρονικά σημεία. Η κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε για να παρακολουθηθεί προφίλ κυτταρικού κύκλου και ανοσοστυπώματα χρησιμοποιείται για την παρακολούθηση των επιπέδων πρωτεΐνης μετά την απομάκρυνση νουτλίνη (Σχήμα 2). D3 και D8 συσσωρευμένη με περιεχόμενο 2Ν και 4Ν DNA όταν νουτλίνη θεραπεία για 24 ώρες, όπως στην Εικόνα 1. Και οι δύο κλώνοι υποβλήθηκαν σε ενδοαναδιπλασιασμό μετά την απομάκρυνση νουτλίνη, αποδεικνύεται από την έντονη εμφάνιση & gt? Κύτταρα 4Ν 16 ώρες μετά την απομάκρυνση νουτλίνη και παροδικές συσσώρευση τους σε μια κορυφή 8N. Η εμφάνιση & gt? Κύτταρα 4Ν και η συσσώρευση τους σε μια κορυφή 8Ν είναι ενδεικτική των κυττάρων 4Ν έναρξη της σύνθεσης του DNA, η αντιγραφή του DNA τους, και εισαγωγή μίτωση. Η κυκλίνη Α2, Β1 Κυκλίνη, και τα επίπεδα CDC2 επέστρεψε 16 ώρες μετά την απομάκρυνση νουτλίνη, συνεπής με τα κύτταρα που είναι ως επί το πλείστον σε G2 /M σε αυτό το χρονικό σημείο. Κυκλίνη E-CDK2 δραστηριότητα πιστεύεται ότι προωθούν ή να απαιτούνται για την έναρξη της σύνθεσης του DNA [24], [25], και ρ21 συνδέεται με και αναστέλλει Κυκλίνη Ε-CDK2 δραστηριότητα [26]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η εμφάνιση & gt? 4Ν, το κυτταρικό DNA αντιγραφή 12-16 ώρες μετά την απομάκρυνση νουτλίνη συνέπεσε με μια απότομη μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης ρ21. Έχουμε σκεφτεί τα μειωμένα επίπεδα του p21 μετά την αφαίρεση νουτλίνη επιτρέπεται η ενεργοποίηση της κυκλίνης συγκροτήματα E-CDK2 που θα μπορούσε στη συνέχεια να οδηγήσετε τη σύνθεση του DNA.

Α) διπλοειδή κλώνους HCT116 D3 και D8 ήταν χωρίς θεραπεία (ΝΤ) ή εκτίθενται σε νουτλίνη (NUT 10 μΜ) για 24 ώρες, ακολουθούμενη από απομάκρυνση νουτλίνη. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στους χρόνους που υποδεικνύονται μετά την απομάκρυνση νουτλίνη. Σταθεροποιημένα κύτταρα βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (25 μg /ml) και υποβλήθηκε σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Β) Τα κύτταρα χωρίς θεραπεία (ΝΤ) ή εκτέθηκαν σε νουτλίνη (NUT 10 μΜ) για 24 ώρες, ακολουθούμενη από απομάκρυνση νουτλίνη. Τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν στα ενδεικνυόμενα χρονικά σημεία και αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Ακτίνη ως έλεγχο φόρτισης.

P-Οάο2

, φωσφόρου-Οάο2 (Tyr-15).

Η

Στη συνέχεια, θελήσαμε να ρωτήσω αν ενδοαναδιπλασιασμό μετά την απομάκρυνση νουτλίνη θα μπορούσε να οδηγήσει σε σταθερή τετραπλοειδής κλώνους και, αν ναι, , αν οι προκύπτουσες τετραπλοειδούς κλώνοι θα είναι ανθεκτικά σε CP ή ιονίζουσα ακτινοβολία (IR) επαγόμενη απόπτωση. Για το σκοπό αυτό, D3 και D8 υποβλήθηκαν νουτλίνη θεραπεία για 24 ώρες ακολουθούμενη από αφαίρεση νουτλίνη για επιπλέον 16 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια επισημαίνονται με το λεκέ live-κύτταρο DNA Hoechst 33342. 2Ν και 8Ν κύτταρα απομονώθηκαν με κυτταρομετρία ροής και ανακαλλιεργήθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα για την απομόνωση μεμονωμένων κλώνων (Εικόνα 3Α). Ένα σύνολο των 11 κλώνων D3 και 12 κλώνοι D8 ελήφθησαν από απομονωμένους πληθυσμούς 8N που προέκυψε μετά την αφαίρεση νουτλίνη. 7 από τους 11 κλώνους D3 (63%) και 8 από τους 12 κλώνους D8 (66%) αυξήθηκε ως τετραπλοειδούς κύτταρα 4Ν. Αυτό αποδεικνύεται από: 1) την κορυφή G1 αυτών των κλώνων επικαλύπτει το G2 /M κορυφή των διπλοειδή κύτταρα D3 και D8 (Σχήμα 3Β), 2) μέτρηση χρωμόσωμα του επάλειψη μετάφασης που υποστήριξαν τις τετραπλοειδούς κλώνων έχοντας δύο φορές το περιεχόμενο DNA των διπλοειδή D3 και των προδρόμων D8 (Σχήμα 3C), και 3) την ανάλυση FISH χρησιμοποιώντας

Ρ53

και χρωμοσώματος 17-ειδικούς ανιχνευτές. Αυτή η ανάλυση FISH έδειξαν τετραπλοειδούς κλώνοι έχουν 4 αντίγραφα του χρωμοσώματος 17 και

Ρ53

, ενώ διπλοειδή κύτταρα D3 και D8 έχουν 2 αντίγραφα του χρωμοσώματος 17 και

P53

(Σχήμα 3D). Τέλος, εξετάσαμε εάν τετραπλοειδούς κλώνοι που προέκυψαν μετά την κατεργασία νουτλίνη ήταν πιο ανθεκτικά στην CP και IR απόπτωση που επάγεται από διπλοειδή ομολόγους. Πρώτον, 5 τετραπλοειδούς κλώνους και 5 διπλοειδείς κλώνους που απομονώθηκαν από νουτλίνη αγωγή D3 ή D8 κύτταρα εκτέθηκαν σε CP (20 μΜ) ή IR (10 Gy), και την απόπτωση παρακολουθούνται 48 ώρες αργότερα με περιεχόμενο DNA υπο-G1. Όπως φαίνεται στο Σχ 4Α, οι κλώνοι τετραπλοειδούς ως ομάδα ήταν σημαντικά πιο ανθεκτικά στην CP και IR απόπτωση που επάγεται από γονικά κύτταρα και διπλοειδή κλώνοι απομονώθηκαν μετά τη θεραπεία νουτλίνη. Ατομική τετραπλοειδείς κλώνοι (Τ3 και TD6) ήταν επίσης πιο ανθεκτικά στη CP και IR-επαγόμενη απόπτωση σε σχέση με διπλοειδή ομολόγους (D3 και D81B), αποδεικνύεται από ένα χαμηλότερο ποσοστό κυττάρων υπο-G1 μετά CP και θεραπεία IR (Σχήμα 4Β) και χαμηλότερη έκφραση του διασπασμένη PARP και διασπασμένη κασπάση 3 (Εικόνα 4D). Τα αποτελέσματα αυτά είναι συνεπή με τις εκθέσεις από εμάς και άλλους που έδειξε τετραπλοειδούς κύτταρα μπορεί να είναι ανθεκτικοί στη θεραπεία [3], [19]. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι η ρ53 και ρ21 μπορεί να συνεισφέρει στην CP και IR-αντίσταση σε HCT116 και άλλα κύτταρα, πιθανότατα μέσω επαγωγής ή επιβολή ενός διακοπή του κυτταρικού κύκλου που μπλοκάρει CP ή IR-επεξεργασμένα κύτταρα από πολλαπλασιαζόμενα και προσπαθεί να διαιρέσει [27] – [31]. Αξιοσημείωτα, βρήκαμε ρ53, MDM2 και ρ21 πρωτεΐνες επήχθησαν σε συγκρίσιμα επίπεδα σε CP και IR-αγωγή διπλοειδή και τετραπλοειδείς κλώνους (σχήμα 4Γ), και ότι η ρ53-γονιδίων που αποκρίνονται διακοπή του κυτταρικού κύκλου (

Ρ21

), γονίδια επιδιόρθωσης του DNA (

P53R2

), και αποπτωτικών γονιδίων (

PUMA, Noxa, Bax

), επίσης προκαλούμενη συγκριτικά με το CP και IR-αντιμετωπίζονται διπλοειδή και τετραπλοειδούς κλώνους (Σχήμα 4Ε). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν CP και IR-αντίσταση στα τετραπλοειδούς κλώνους δεν σχετίζεται με αυξημένα επίπεδα ρ53 ή δραστηριότητα. Συνολικά, τα αποτελέσματα δείχνουν παροδική ενεργοποίηση p53 από νουτλίνη μπορεί να προωθήσει μια τετραπλοειδούς σύλληψη G1 και ενδοαναδιπλασιασμό μετά την αφαίρεση νουτλίνη σε διπλοειδή πρόδρομα κύτταρα, οδηγώντας στη δημιουργία της θεραπείας (CP /IR) ανθεκτικών τετραπλοειδούς κλώνους.

) Ορατή είναι η διαδικασία για την απομόνωση διπλοειδή και τετραπλοειδούς κλώνων από κύτταρα παροδικά εκτίθενται σε νουτλίνη. D3 και D8 ήταν χωρίς θεραπεία (ΝΤ) ή υπέστησαν αγωγή με 10 μΜ νουτλίνη (NUT) επί 24 ώρες, ακολουθούμενη από απομάκρυνση νουτλίνη για επιπλέον 16 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια live-χρωματίστηκαν με Hoechst 33342 (5 μg /ml). Διαλογή κυττάρων διεξήχθη σε MoFlo κυτταρόμετρο εξοπλισμένη με ένα λέιζερ μήκους κύματος διέγερσης UV. Ταξινόμηση 2Ν και 8Ν κύτταρα επιστρώθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα σε κανονικό μέσο (μείον νουτλίνη) και ξεχωριστοί κλώνοι απομονώθηκαν. Β)

Top

, η σύγκριση των προφίλ DNA μεταξύ D3 και έναν εκπρόσωπο τετραπλοειδούς κλώνος που απομονώθηκε από D3.

Κάτω

, σύγκριση των προφίλ DNA μεταξύ ενός εκπροσώπου διπλοειδή κλώνος (D81B) απομονώνεται από κύτταρα D8, και έναν εκπρόσωπο τετραπλοειδούς κλώνος (TD6) που απομονώνεται από κύτταρα D8. Γ) Εκπρόσωπος μετάφαση εξάπλωση από διπλοειδή κύτταρα D3 και τετραπλοειδούς κύτταρα Τ3. Ο αριθμός στην κάτω δεξιά δείχνει τον αριθμό των χρωμοσωμάτων μετρήθηκαν. Δ) Ανάλυση FISH με το χρωμόσωμα 17 (Chr 17) και p53-ειδικούς ανιχνευτές δείχνει τετραπλοειδούς κύτταρα (Τ3) περιέχει 4 αντίγραφα της p53 και Χρ 17, ενώ διπλοειδή κύτταρα (D3) περιέχουν 2 αντίγραφα των p53 και Χρ 17.

Α) πέντε διπλοειδή κλώνους που απομονώθηκαν από νουτλίνη επεξεργασμένα κύτταρα D3 (D3 διπλοειδή) και κύτταρα D8 (D8 διπλοειδή), και πέντε τετραπλοειδούς κλώνους που απομονώθηκαν από νουτλίνη επεξεργασμένα κύτταρα D3 (D3 Τετραπλοειδής) και κύτταρα D8 (D8 Τετραπλοειδής) ήσαν χωρίς αγωγή (ΝΤ) ή εκτέθηκαν σε CP (20 μΜ) ή IR (10 Gy) για 48 ώρες. Το ποσοστό των κυττάρων με υπο-G1 DNA προσδιορίστηκε. Παρουσιάζονται οι μέσες αποτελέσματα από τρία ξεχωριστά πειράματα,

bars

, τυπικό σφάλμα (SE). * Τιμή σημαντικότητας (P & lt? 0,05). Β) Τετραπλοειδής κλώνοι (Τ3, TD6) και διπλοειδή αντίστοιχά τους (D3, D81B) ήταν χωρίς θεραπεία (ΝΤ) ή εκτέθηκαν σε CP (20 μΜ) ή IR (10 Gy) για 72 ώρες. Το ποσοστό των κυττάρων με υπο-G1 DNA (χρώση με ιωδιούχο προπίδιο) προσδιορίστηκε. Παρουσιάζονται οι μέσες αποτελέσματα από τρία ξεχωριστά πειράματα,

bars

, τυπικό σφάλμα (SE). * Τιμή σημαντικότητας (P & lt? 0,05). Γ) Η υποδεικνυόμενη διπλοειδή και τετραπλοειδούς κλώνοι ήταν χωρίς θεραπεία (ΝΤ) ή εκτέθηκαν σε CP (20 μΜ) ή IR (10 Gy) για 24 ώρες. ρ53, ρ21, και τα επίπεδα πρωτεΐνης MDM2 προσδιορίστηκαν με ανοσοαποτύπωση και ποσοτικά. Οι αριθμοί δείχνουν το σχετικό επίπεδο κάθε πρωτεΐνη. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Δ) Η υποδεικνυόμενη διπλοειδή και τετραπλοειδείς κλώνοι χωρίς αγωγή (ΝΤ) ή εκτέθηκαν σε CP (20 μΜ) ή IR (10 Gy) για 48 ώρες. επίπεδα Διασπασμένη PARP και πρωτεΐνη Caspase-3 προσδιορίστηκε με ανοσοκηλίδωση και ποσοτικά σε σχέση με το χωρίς θεραπεία. Ε) qRT-PCR χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστούν τα επίπεδα mRNA για τις υποδεικνυόμενες γονίδια σε διπλοειδή (D3, D81B) και τετραπλοειδή (Τ3, TD6) κλώνους που ήταν είτε χωρίς θεραπεία (ΝΤ) ή εκτέθηκαν σε CP (20 μΜ) ή IR (10 Gy ) για 24 ώρες. θεωρήθηκε το επίπεδο του κάθε αντιγράφου mRNA σε μη επεξεργασμένα διπλοειδή κλώνους (D3 NT, D81B NT) «1.0», και όλες οι άλλες τιμές απεικονίζονται σε σχέση με αυτό.

Η

Τετραπλοειδής κλώνοι είναι πιο επιρρεπή σε ρ53- εξαρτώμενη απόπτωση και διακοπή της ανάπτυξης που προκαλείται από νουτλίνη

ήταν κάπως περίεργο ότι η p53 προκλήθηκε συγκριτικά με CP και IR σε διπλοειδή και τετραπλοειδούς κλώνοι, παρά το γεγονός ότι οι τετραπλοειδούς κλώνοι λιμάνι διπλάσιες αντίγραφα του

P53

γονίδιο (FISH, Σχήμα 3D). Αυτό δείχνει το επίπεδο στο οποίο ρ53 επάγεται από CP και IR δεν εξαρτάται από

Ρ53

αριθμό αντιγράφων, αλλά αντ ‘αυτού μπορεί να περιορίζεται από άλλους παράγοντες, ίσως το ποσό των κατεστραμμένων DNA ή το επίπεδο ενεργοποίησης του στρες που προκαλείται από κινάσες που σταθεροποιούν ρ53. Παρ ‘όλα αυτά, έχουμε σκεφτεί το επίπεδο στο οποίο p53 προκαλείται από ανταγωνιστές MDM2 (π.χ. νουτλίνη) μπορεί να εξαρτάται από το

P53

αριθμό αντιγράφων, και ότι τετραπλοειδούς κύτταρα μπορεί, ως εκ τούτου εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα p53 σε απάντηση νουτλίνη και να είναι υπερ- ευαίσθητα σε νουτλίνη μεσολάβηση αναστολή της ανάπτυξης. Για να δοκιμάσετε αυτό, διπλοειδή D3 και D81B και τετραπλοειδούς ομολόγους Τ3 τους και TD6 ήταν νουτλίνη θεραπεία για 24 ώρες. τα επίπεδα Ρ53 και της πρωτεΐνης MDM2 προσδιορίστηκαν με ανοσοστύπωμα και τα επίπεδα mRNA προσδιορίστηκε με qRT-PCR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι κλώνοι εκφράζουν τετραπλοειδούς αυξημένα (~2X περισσότερα) ρ53 και ΜΌΜ2 mRNA και πρωτεΐνη από διπλοειδή κλώνους, και βασικά (Σχήμα 5Α) και μετά τη θεραπεία νουτλίνη 24 ώρες (Σχήματα 5C). Για την εκτίμηση των επιπέδων σύμπλεγμα ρ53-MDM2, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αναστολέα πρωτεασώματος MG132 να εμποδίσει την υποβάθμιση ρ53, και τα σύμπλοκα ρ53-MDM2 προσδιορίστηκε με συν-ανοσοκαταβύθιση. Αυτές οι μελέτες έδειξαν τετραπλοειδούς κλώνοι είχαν περισσότερα σύμπλοκα p53-MDM2 μετά τη θεραπεία MG132 από τα διπλοειδή κλώνων από τους οποίους προέκυψαν (Σχήμα 5Β). Έτσι, τετραπλοειδούς κλώνοι εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα ρ53 και ΜΌΜ2, και περιέχουν υψηλότερα επίπεδα συμπλοκών ρ53-MDM2. Εμείς εικασίες σε τετραπλοειδούς κλώνους αυτό θα μεταφραστεί σε υψηλότερα επίπεδα ρ53 μετά τη θεραπεία νουτλίνη, και μια επακόλουθη αύξηση σε ρ53-εξαρτώμενη G1 σύλληψη και απόπτωση. Για να ελεγχθεί αυτό, συγκρίναμε την σχετική ευαισθησία του διπλοειδούς και τετραπλοειδών κλώνων νουτλίνη επαγόμενη διακοπή του κυτταρικού κύκλου ή απόπτωση. Πρώτον, διπλοειδή και τετραπλοειδούς κλώνοι υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες δόσεις νουτλίνη (1,0-5,0 μΜ) για 24 ώρες. Αυξημένη G1 /S αναλογία, αντανακλώντας εξάντληση των κυττάρων φάσης S και μία συσσώρευση των κυττάρων στην G1 φάση, χρησιμοποιήθηκε ως μέτρο της νουτλίνη επαγόμενης σύλληψη G1. Όπως φαίνεται στο Σχ 6Α, οι κλώνοι τετραπλοειδούς ως ομάδα ήταν περισσότερο επιρρεπή σε επαγόμενη από νουτλίνη G1 σύλληψη από γονικά κύτταρα ή διπλοειδή κλώνους (αναλογία G1 /S αυξήθηκε περισσότερο με την αύξηση των δόσεων σε νουτλίνη τετραπλοειδούς κλώνους από τη γονική ή διπλοειδή κλώνοι). Μεμονωμένα τετραπλοειδούς κλώνοι Τ3 και TD6 ήταν επίσης πιο επιρρεπείς σε νουτλίνη επαγόμενη G1 σύλληψη από διπλοειδή ομολόγους D3 και D81B (Σχήμα 6Β). Όπως φαίνεται στο Σχ 6C, ρ53 και ρ21 πρωτεΐνης επάγεται σε υψηλότερα επίπεδα και σε χαμηλότερες δόσεις νουτλίνη στις τετραπλοειδούς κλώνους σε σύγκριση με τα διπλοειδή κλώνους. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν οι τετραπλοειδούς κλώνοι εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα της p53 και p21 μετά τη θεραπεία νουτλίνη και είναι πιο επιρρεπή από τα διπλοειδή κλώνους για να νουτλίνη που προκαλείται από τη σύλληψη G1. Στη συνέχεια, διπλοειδή και τετραπλοειδούς κλώνοι υποβλήθηκαν σε αγωγή με υψηλότερη δόση νουτλίνη (20 μΜ) για 72 ώρες, και την απόπτωση παρακολουθείται από τοις εκατό κυττάρων με περιεχόμενο DNA υπο-G1 και /ή έκφραση της διασπασμένης ΡΑΚΡ και διασπασμένη κασπάση-3. Όπως φαίνεται στο Σχ 6D, τετραπλοειδούς κλώνοι ως ομάδα ήταν περισσότερο επιρρεπή σε νουτλίνη επαγόμενη απόπτωση από διπλοειδή κλώνους. Ατομική τετραπλοειδείς κλώνοι (Τ3 και TD6) ήταν επίσης πιο επιρρεπείς σε νουτλίνη επαγόμενη απόπτωση από διπλοειδή ομολόγους (D3 και D81B), αποδεικνύεται από ένα υψηλότερο ποσοστό κυττάρων υπο-G1 μετά τη θεραπεία νουτλίνη και αυξημένη έκφραση διασπασμένης ΡΑΚΡ και διασπασμένη κασπάση 3 ( τα σχήματα 6Ε και F).

Α) Ρ53 και τα επίπεδα mRNA MDM2 συγκρίθηκαν σε μη επεξεργασμένα τετραπλοειδείς κλώνους (Τ3, TD6) και διπλοειδή αντίστοιχά τους (D3, D81B). Β) Τα διπλοειδή (D3, D81B) και τετραπλοειδή (Τ3, TD6) κλώνοι ήταν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με MG132 αναστολέα πρωτεασώματος (10 μΜ) για 8 ώρες.

Άνω

Επίπεδα MDM2, p53, και ακτίνη (φόρτωση έλεγχος) σε θεραπεία και MG132 αντιμετωπίζονται τα κύτταρα εμφανίζονται.

Κάτω

Για τον προσδιορισμό των επιπέδων των συμπλοκών ρ53-MDM2 σε διπλοειδή και τετραπλοειδής κυττάρων, προϊόντα λύσης πρωτεΐνης ανοσοκαταβυθίζονται με αντίσωμα αντι-ρ53, που ακολουθείται από ανοσοστύπωση για MDM2. Γ) διπλοειδή (D3, D81B) και τετραπλοειδή (Τ3, TD6) κλώνοι ήταν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με νουτλίνη (10 μΜ) για 24 ώρες. τα επίπεδα ρ53 και ΜΌΜ2 πρωτείνη ανιχνεύθηκαν με ανοσοκηλίδωση και ποσοτικά με τη χρήση του λογισμικού Image-J. Η σχετική ποσότητα του ρ53 και της πρωτεΐνης MDM2 στα μη επεξεργασμένα διπλοειδή κλώνους δόθηκε μια τιμή «1.0». Οι αριθμοί δείχνουν το σχετικό επίπεδο κάθε πρωτεΐνη. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Α) Πέντε διπλοειδή κλώνους που απομονώθηκαν από νουτλίνη επεξεργασμένα κύτταρα D3 (D3 διπλοειδή) και κύτταρα D8 (D8 διπλοειδή), και πέντε τετραπλοειδούς κλώνους που απομονώθηκαν από νουτλίνη επεξεργασμένα κύτταρα D3 (D3 Τετραπλοειδής) και κύτταρα D8 (D8 Τετραπλοειδής) ήσαν μη επεξεργασμένα ή επεξεργασμένα με αυξανόμενες νουτλίνη (1,0-5,0 μΜ) για 24 ώρες. Τα κύτταρα τοις εκατό G1 και S-φάση προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής, και η πτυχή αλλαγή G1 /S αναλογία σχεδιάζεται. Ανεπεξέργαστα διπλοειδή κλώνους G1 αναλογία /S δόθηκε μια τιμή 1.0. Ορατή είναι ο μέσος όρος των τριών ξεχωριστών πειραμάτων, +/- SE. Β) Τετραπλοειδής κλώνοι (Τ3, TD6) και διπλοειδή ομολόγους (D3, D81B) ήσαν μη επεξεργασμένα ή επεξεργασμένα με νουτλίνη (1,0-5,0 μΜ) για 24 ώρες. Η πολλαπλή μεταβολή της αναλογίας G1 /S σχεδιάζεται. Ορατή είναι ο μέσος όρος των τριών ξεχωριστών πειραμάτων, +/- SE. Γ) διπλοειδή (D3, D81B) και τετραπλοειδής (Τ3, TD6) κλώνοι ήταν ακατέργαστα ή κατεργασμένα με την αύξηση νουτλίνη (1,0-5,0 μΜ) 24 ώρες. επίπεδα Ρ53 και της πρωτεΐνης p21 ήταν ποσοτικά με τη χρήση του λογισμικού Image-J. Οι αριθμοί δείχνουν τα σχετικά επίπεδα της κάθε πρωτεΐνης. επίπεδα Ρ53 και ρ21 σε μη επεξεργασμένα διπλοειδή κλώνους δόθηκε μια τιμή «1.0». Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Δ) Πέντε διπλοειδή κλώνους που απομονώθηκαν από νουτλίνη επεξεργασμένα κύτταρα D3 (D3 διπλοειδή) και κύτταρα D8 (D8 διπλοειδή), και πέντε τετραπλοειδούς κλώνους που απομονώθηκαν από κύτταρα κατεργασμένα νουτλίνη D3 (D3 Τετραπλοειδής) και κύτταρα D8 (D8 Τετραπλοειδής) ήταν χωρίς αγωγή (ΝΤ) ή κατεργάζεται με νουτλίνη (20 μΜ) 72 ώρες και η απόπτωση προσδιορίστηκε. Παρουσιάζονται οι μέσες αποτελέσματα από τρία ξεχωριστά πειράματα,

bars

, τυπικό σφάλμα (SE). * (P & lt? 0,05). Ε) Αντιπροσωπευτικά διπλοειδή (D3, D81B) και τετραπλοειδή (Τ3, TD6) κλώνοι ήταν χωρίς αγωγή (ΝΤ) ή υπέστησαν αγωγή με νουτλίνη (20 μΜ) για 72 ώρες. Το ποσοστό των κυττάρων με το περιεχόμενο DNA υπο-G1 (χρώση με ιωδιούχο προπίδιο) προσδιορίστηκε. Παρουσιάζονται οι μέσες αποτελέσματα από τρία ξεχωριστά πειράματα,

bars

, τυπικό σφάλμα (SE).