Αφηρημένο

Γονιδίωμα-ευρύ μελέτες συσχέτισης (GWAS) του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) έχουν οδηγήσει στον προσδιορισμό ενός αριθμού κοινών παραλλαγές που σχετίζονται με μέτρια κίνδυνο. Αρκετές κίνδυνο παραλλαγές χάρτη μέσα στην περιοχή του TGFβ /BMP σηματοδότησης γονίδια οδού, συμπεριλαμβανομένης rs4939827 μέσα σε ένα ιντρόνιο του

Smad7

στο 18q21.1. Μια προηγούμενη μελέτη εμπλέκεται μία νέα SNP (νέα 1 ή rs58920878) ως λειτουργική παραλλαγή εντός ενός στοιχείου ενισχυτή σε

Smad7

ιντρονίου 4. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι τέσσερα SNPs συμπεριλαμβανομένων νέων 1 (rs6507874, rs6507875, rs8085824 , και rs58920878) σε ανισορροπία σύνδεσης (LD) με τα rs4939827 δείκτη SNP αλληλόμορφο καταδεικνύουν-ειδικές επιδράσεις ενισχυτή σε ένα μεγάλο, πολλών συστατικών ενισχυτή του

Smad7

. Όλα τα τέσσερα SNPs επιδεικνύουν πρόσδεση σε πυρηνικά εκχυλίσματα από κυτταρικές σειρές CRC αλληλόμορφο-ειδική πρωτεΐνη. Επιπλέον, ορισμένα από τα αλληλόμορφα κινδύνου που σχετίζεται συσχετίζονται με αυξημένη έκφραση του

Smad7

σε φυσιολογικούς ιστούς κόλου. Τέλος, δείχνουμε ότι ο ενισχυτής αποκρίνεται σε ΒΜΡ4 διέγερση. Στο σύνολό τους, προτείνουμε ότι ο σχετικός κίνδυνος CRC στο 18q21.1 οφείλεται σε τέσσερις λειτουργικές παραλλαγές που ρυθμίζουν

Smad7

έκφρασης και ενδεχομένως να διαταράξει μια ΒΜΡ βρόχο αρνητικής ανάδρασης στον TGFβ /BMP μονοπάτια σηματοδότησης.

Παράθεση: Fortini BK, Tring S, Plummer SJ, Edlund CK, Moreno V, Bresalier RS, et al. (2014) Πολλαπλές Λειτουργική Κίνδυνος Παραλλαγές σε ένα Smad7 Enhancer εμπλέκουν ένα Καρκίνος παχέος κινδύνου απλότυπος. PLoS ONE 9 (11): e111914. doi: 10.1371 /journal.pone.0111914

Επιμέλεια: Ludmila Prokunina-Olsson, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 16, 2014? Δεκτές: 1 Οκτωβρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 6 Νοεμβρίου, 2014

Copyright: © 2014 Fortini et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (R01 CA143237, U19 CA148107 με GC). Η επιστημονική ανάπτυξη και τη χρηματοδότηση του έργου αυτού ήταν εν μέρει υποστηρίζεται από τις γενετικές συσχετίσεις και Μηχανισμοί στην Ογκολογία (GAME-ON), μια πρωτοβουλία μετά GWAS Καρκίνος NCI. Το περιεχόμενο είναι αποκλειστική ευθύνη των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύουν απαραίτητα τις επίσημες απόψεις του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου ή το National Institutes of Health, οι οποίοι δεν είχαν ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία της χειρόγραφο

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

TGFβ σηματοδότησης έχει συνδεθεί από καιρό με καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC). Εκτός από την κανονική τους ρόλους στη ρύθμιση της απόπτωσης, τη διαφοροποίηση των κυττάρων, και την ανάπτυξη των κυττάρων του εντερικού επιθηλίου, TGFβ σηματοδότηση είναι ένας σημαντικός παίκτης στην ανοσολογική απόκριση και η φλεγμονώδης νόσος του εντέρου, παράγοντας κινδύνου για CRC (κριτικές [1] – [3] ). TGFβ και σηματοδότηση BMP ορίζουν τα δύο κύριους κλάδους της οδού TGFβ. Η ενεργοποίηση του σκέλη οδηγεί στην πρόσληψη R-Smads, SMAD2 /3 στην περίπτωση του ΤΟΡβ ή SMAD1 /5/8 στην περίπτωση των ΒΜΡ, τα οποία σχηματίζουν ένα σύμπλοκο με Smad4. Αυτό το σύμπλοκο στη συνέχεια κατευθύνει τη μεταγραφή πολλών γονιδίων στόχων, συμπεριλαμβανομένων των

Smad7

. Smad7, μία ανασταλτική SMAD σαν SMAD6, με τη σειρά του χρησιμεύει ως αρνητικός ρυθμιστής ανατροφοδότησης του ΤΟΡβ και ΒΜΡ σηματοδότηση, επιπροσθέτως της δράσης της ως κόμβος στιχομυθία με άλλες οδούς, συμπεριλαμβανομένων TNF [4], [5].

Smad7 παίζει επίσης και άλλα σημαντικούς ρόλους στην αιτιολογία του CRC, όπως αλληλεπίδραση με β-κατενίνης για τη ρύθμιση

MYC

έκφραση και σηματοδότηση Wnt [6].

Smad7

υπερέκφραση έχει παρατηρηθεί σε μερικά κύτταρα CRC, και τη μείωση του

Smad7

έκφραση χρησιμοποιώντας αντι-νόημα RNA οδηγεί σε μείωση του πολλαπλασιασμού στο CRC κυτταρική γραμμή HCT-116 και τα ανθρώπινα νεοπλαστικά εκφυτεύματα CRC, και μειωμένη ογκογένεση στο APC

min /- ποντικό [7]

CRC GWAS έχουν οδηγήσει στην ταυτοποίηση αρκετών γονιδιωματικών περιοχών που σχετίζονται με τον κίνδυνο που περιλαμβάνουν τα γονίδια στο μονοπάτι σηματοδότησης ΤΟΡβ συμπεριλαμβανομένης

Smad7.

,

ΒΜΡ2

,

BMP4

, και

GREM1

[8] – [14]. Αυτό περιλαμβάνει πολυμορφισμού ενός νουκλεοτιδίου (SNP) rs4939827, που βρίσκεται στο

Smad7

ιντρόνιο 4, η οποία έχει αναφερθεί σε πολλές μελέτες. Pittman et al. ανέφερε ότι μια νέα SNP (που ονομάζεται μυθιστόρημα 1, που αργότερα μετονομάστηκε σε rs58920878) αντιστοιχίζεται σε ένα στοιχείο ενισχυτή που οδήγησε την έκφραση GFP στο

Xenopus

μυς γυρίνος και παχέος εντέρου σε ένα αλληλόμορφο συγκεκριμένο τρόπο, εμπλέκοντας rs58920878 ως λειτουργική παραλλαγή σε αυτή την περιοχή [15].

με αφορμή την ανακάλυψη πολλαπλών λειτουργικών παραλλαγές μέσα στο 11q23 CRC GWAS περιοχή [16], έχουμε διεξοδικά εξέτασε τη γενωμική περιοχή που περιβάλλει τις rs4939827 CRC tagSNP σε 18q21.1 για άλλες πιθανές λειτουργικές SNPs. Εντοπίσαμε 4 SNPs, rs6507874, rs6507875, rs8085824 και rs58920878 (νέα 1), σε μια περιοχή περίπου 2 kb, κάθε αποδεικνύοντας αλληλόμορφο-ειδική δραστικότητα ενισχυτή. Προσδιορίσαμε επίσης ότι τα αλληλόμορφα που αντιστοιχεί στον απλότυπο κινδύνου συσχετίζεται με αυξημένη έκφραση του

Smad7

σε φυσιολογικούς ιστούς επιθηλιακά κόλον. Αλληλουχίες που συμπεριλαμβάνουν και τα τέσσερα SNPs δεσμεύεται επίσης να πυρηνικές πρωτεΐνες από κυτταρικές σειρές CRC σε ένα αλληλόμορφο-ειδικό τρόπο σε δοκιμασίες μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (EMSAs). Τέλος, δείξαμε ότι ο ενισχυτής ήταν αποκρίνεται σε ΒΜΡ4 επαγόμενη σηματοδότηση σε δοκιμασίες λουσιφεράσης, ενώ ούτε απλότυπος ήταν αποκρίνεται σε TGFβ1. Στο σύνολό τους, προτείνουμε ότι ο κίνδυνος CRC στο χρωμόσωμα 18q21.1 οφείλεται στις συνεισφορές των 4 λειτουργικές παραλλαγές σε ένα ενισχυτή που επηρεάζουν την έκφραση του

Smad7

, πιθανώς οδηγώντας σε διαταραγμένη ρύθμιση του ΒΜΡ βρόχο αρνητικής ανάδρασης στην BMP /ΤΟΡβ μονοπάτια σηματοδότησης.

Αποτελέσματα

Περιοχή Ανάλυση

η rs4939827 δείκτη SNP συνδέονται με CRC στο χρωμόσωμα 18q21.1 βρίσκεται στο ιντρόνιο 4 του

Smad7

γονίδιο. Υπάρχουν 20 SNPs σε LD με rs4939827 με r

2≥0.2 στον πληθυσμό CEU (1000 γονιδιώματος του έργου, Ιούνιος 2011 ΔΕΛΤΙΟ), επιλεγμένο κατώφλι LD μας για τους πιθανούς υποψηφίους λειτουργική (Σχήμα 1Α και 1C). Όλα τα 21 SNPs κείνται εντός μιας περιοχής 16 kb του

Smad7

ιντρονίου 4. Προκειμένου για τον εντοπισμό πιθανών γονιδιωματικών ρυθμιστικών αλληλουχιών από την περιοχή αυτή, η SNPs σε LD με rs4939827 ευθυγραμμίστηκαν με χρωματίνη ανοσοκαταβύθιση και ανάλυση αλληλουχίας (τσιπ seq ) κομμάτια για ιστόνης μεθυλίωση και ακετυλίωση σήματα που συνδέονται με ενισχυτές, H3K4me1 και H3K27ac (Σχήμα 1Β). Για τη μελέτη αυτή, που αναφέρεται σιγμοειδούς ακετυλίωση του παχέος εντέρου H3K27 από τον Οδικό Χάρτη Epigenomics κοινοπραξία [17], και CRC κυτταρικές σειρές SW480 και HCT-116 H3K4 μονομεθύλωσης παράγεται στο εργαστήριο μας και από το έργο κωδικοποιούν, αντίστοιχα [16], [18], [ ,,,0],19]. Αρκετές δυναμικό κορυφές ενισχυτή περιέχουν SNPs σε LD με rs4939827 ταυτοποιήθηκαν στο σιγμοειδές κόλον, SW480, ή HCT-116 κυττάρων, συμπεριλαμβανομένου ενός περιοχή 2kb που περιέχει rs58920878 (πράσινη ρίγα, Εικόνα 1Β). Για να χαρακτηρίζουν την περιοχή συνολικά, μικρότερες κορυφές κάτω από το όριο για το μέγιστο καλώντας λογισμικό κλωνοποιήθηκαν επίσης και δοκιμάστηκαν για δράση, εάν περιείχε ένα SNP συνάντηση LD μας cut-off. DNase Ι hypersenstitivity κομμάτια από το έργο ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ επίσης ευθυγραμμίζονται, αλλά δεν κορυφές επικαλύπτεται με οποιαδήποτε από τις υποψήφιες SNPs στο LD με rs4939827 [20], [21].

(Α) Το

Smad7

γονίδιο που απεικονίζεται με γονιδιωματική συντεταγμένες (hg19) και τη θέση των SNPs στο LD (r

2≥0.2, CEU πληθυσμού) με tagSNP rs4939827. (Β) UCSC γονιδίωμα προβολή του προγράμματος περιήγησης της Smad7 με SNPs σε LD με rs4939827 ενδείκνυται. Τσιπ επόμενα κομμάτια για τα σήματα των ιστονών ενισχυτή είναι σιγμοειδές (SC) H3K27ac από REMC /UCSD για τον Οδικό Χάρτη Epigenomics Consortium, SW480 (ΝΔ) H3K4me1, και HCT-116 (HCT) H3K4me1 από την κοινοπραξία ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ. DNase Ι υπερευαισθησία παρακολουθεί HCT-116 (HCT) και Caco-2 που ακολουθεί είναι από την ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ σύνολο δεδομένων UW. Η πράσινη λωρίδα αντιπροσωπεύει το θραύσμα ενισχυτή Α Κόκκινες ρίγες δείχνουν κλωνοποιημένα τμήματα Β έως G (από αριστερά προς τα δεξιά) που φαίνεται να στερούνται δραστηριότητας ενισχυτή. Συντεταγμένες για κάθε τεμάχιο παρέχονται σε S1 αρχείου. οικόπεδο ανισορροπίας (C) Σύνδεση για rs4939827, συμπεριλαμβανομένων όλων των SNPs στο έργο 1 KG με r

2≥0.2, που δημιουργήθηκε με Haploview. r

2 = 1 μαύρο, 1 & gt? r

2 & gt? 0.2 – γκρι κλίμακας. (Δ) την εστίαση όψη του θραύσματος Α που δείχνει υπο-θραύσματα Α1-Α4. Η ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ Πολυεπίπεδη H3K4me1 κομμάτι των 7 κυτταρικών σειρών φαίνεται να προσδιοριστούν συγκεκριμένες κορυφές κυτταρικό τύπο. (Ε) απλότυποι και τα ποσοστά (CEU πληθυσμού) για τις 4 SNPs στο θραύσμα Α και rs4939827. Οι απλότυποι που συνδέεται με το αλληλόμορφο κινδύνου rs4939827 Τ είναι σε φως μωβ.

Η

Δοκιμασίες ενισχυτή δράσης

Επτά υποθετικές περιοχές ενισχυτή κλωνοποιήθηκαν σε ένα φορέα δοκιμασία λουσιφεράσης για να προσδιοριστεί δραστικότητα ενισχυτή σε κυτταρικές γραμμές CRC HCT-116 και SW480. Μόνο το 2 kb τεμάχιο (πράσινη λωρίδα στο Σχήμα 1Β) στο 3 ‘άκρο του

Smad7

ιντρόνιο 4 έδειξαν δραστικότητα σε δοκιμασίες μας, αλλά μόνο στον αντίστροφο προσανατολισμό (Εικόνα 2Α). Περιοχές δοκιμαστεί αλλά με έλλειψη δραστηριότητας σε αυτή τη δοκιμασία υποδεικνύονται με κόκκινο ρίγες στο Σχήμα 1Β (Σχήμα 2Β). Η περιοχή ενισχυτή 2 kb, εμείς όρος θραύσμα Α, περιέχει 4 SNPs σε LD με rs4939827: rs6507874, rs6507875, rs8085824, και rs58920878 (μυθιστόρημα 1). Μια διευρυμένη άποψη του θραύσματος Α παρουσιάζεται στο Σχήμα 1D. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 C, αυτά τα τέσσερα SNPs είναι LD (r

2 = 1 έως 0,494), με το ένα το άλλο και ορίζουν 5 απλότυποι στον πληθυσμό CEU. Αυτές οι απλότυποι φαίνεται σε σχέση με την παραλλαγή rs4939827 (αλληλόμορφο κινδύνου Τ) στο Σχήμα 1Ε [22], [23].

(Α) Σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης για το θετικό μάρτυρα, το θραύσμα Α στο εμπρός και θραύσμα Ένα στον αντίστροφο προσανατολισμό. Φως στήλες δείχνουν δραστηριότητα σε HCT-116, σκούρο στήλες δείχνουν δραστηριότητα SW480. (Β) θραύσματα Β έως G, που παρουσιάζεται στο σχήμα 1 Β ως κόκκινες λωρίδες δεν παρουσιάζουν δραστηριότητα ενισχυτή σε κάθε προσανατολισμό σε HCT-116. Οι θετικοί έλεγχοι παρουσιάζονται για κάθε ομάδα των κατασκευασμάτων που αναλύθηκαν στην ίδια πλάκα. Θραύσμα Ε περιέχει τις rs4939827 tagSNP. (Γ) Δραστηριότητα του θραύσματος Α στον αντίστροφο προσανατολισμό με όλους τους SNPs στο θραύσμα με αλληλόμορφο τους C, με κάθε αλληλόμορφο αλλάξει ανεξάρτητα στην εναλλακτική αλληλόμορφο, εμφανίζεται ως φορές μεταβολής σε σχέση με το κατασκεύασμα που περιέχει τα τέσσερα C αλληλόμορφα. Και τα τέσσερα αλληλόμορφα οδήγησε σε στατιστικά σημαντική μείωση της δραστηριότητας: rs6507874 Τ

σ

= 8.25 × 10

-3 (HTC-116),

σ

= 3.30 × 10

-2 (SW480)? rs6507875 G

σ

= 3.40 × 10

-2 (HCT-116),

p =

6,79 × 10

-3 (SW480)? rs8085824 Τ

p =

1,20 × 10

-2 (HCT-116),

p =

3,12 × 10

-3 (SW480)? rs58920878 G

p =

2,09 × 10

-3 (HCT-116),

p =

3,05 × 10

-3 (SW480).

Η

Θα πρέπει πρώτα ελεγχθεί αν υπήρχαν αλληλόμορφο-ειδικές διαφορές στη δραστηριότητα ενισχυτή για κάθε ένα από τα SNPs ξεχωριστά ξεκινώντας με ένα θραύσμα 2 kb με όλες τις 4 SNPs που περιέχει αλληλόμορφα C. Ενώ αυτό απλότυπο δεν παρατηρείται στον πληθυσμό CEU, αυτός ο συνδυασμός αλληλόμορφο έδειξε την υψηλότερη δραστικότητα ενισχυτή όλων των θραυσμάτων που δοκιμάστηκαν. Παρατηρήσαμε αλληλόμορφο-ειδική αλλαγές στη δραστηριότητα ενισχυτή για κάθε μία από τις τέσσερις παραλλαγές όταν αλληλόμορφα άλλαξαν με τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση (Σχήμα 2C). Όλα τα 4 SNPs παρουσίασαν μείωση της δραστηριότητας ενισχυτή όταν αλληλόμορφα αλλάχθηκαν σε μορφή αναπληρωτή. Η μεγαλύτερη μείωση στην ενεργότητα δεν παρατηρήθηκε όταν rs58920878 άλλαξε από Ο έως Ζ Ενώ οι ελάσσονες αλληλόμορφα για SNPs rs6507874 (Τ, έλασσον συχνότητα αλληλίου (MAF) = 0.44) και rs58920878 (G, MAF = 0.34) έδειξε μια χαμηλότερη δραστικότητα ενισχυτή, τα ανήλικα αλληλόμορφα για SNP rs8085824 (C, MAF = 0,34) και rs6507875 (C, MAF = 0.49) έδειξε υψηλότερη δραστικότητα ενισχυτή σε αυτές τις δοκιμασίες.

το θραύσμα Α περιλαμβάνει αρκετές αιχμές μικρότερα διακριτά HCT-116 H3K4me1, με η αριστερή πιο αιχμής ειδικά για HCT-116 σε σύγκριση με την πολυεπίπεδη H3K4me1 υπερ-κομμάτι των 7 κυτταρικών σειρών ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ Tier 1 [19] (Σχήμα 1D). Για να ελέγξετε τις σχετικές συνεισφορές των περιοχών αυτών και SNPs ξεχωριστά στη συνολική δραστηριότητα ενισχυτή, 4 μικρότερες κατασκευές, Α1-Α4, σχεδιάστηκαν (Σχήμα 1D). Το θραύσμα Α1 περιλαμβάνει SNPs rs6507874 και rs6507875 και περικλείει την ειδική κορυφή HCT-116. Αυτές οι δύο SNPs χωρίζονται μόνο από 13 bp και είναι σε LD ένα με το άλλο με r

2 = 0.794, D ‘= 1. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, το Α1 θραύσματος κατέδειξε δραστηριότητα ενισχυτή. Η κύρια απλότυπος του rs6507874 και rs6507875 αλληλόμορφα στον πληθυσμό CEU, CG, κατέδειξαν το χαμηλότερο επίπεδο δραστηριότητας ενισχυτή σε σύγκριση με τις άλλες τρεις πιθανές αλληλόμορφο συνδυασμούς (Σχήμα 3Β). Οι TC και CC ελάσσονα απλοτύπων έδειξαν περίπου 1.3 έως 1.5 φορές και 2-2,5 φορές υψηλότερη δραστικότητα σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, HCT-116 και SW480, αντίστοιχα (Σχήμα 3Β). Ο συνδυασμός αλληλόμορφο TG, ενώ δεν είναι γνωστό απλότυπος CEU, έδειξαν χαμηλότερη δραστικότητα από την απλότυπος TC. Στο σύνολό τους, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι ενώ και οι δύο SNPs, rs6507874 και rs6507875, συμβάλλουν στο συνολικό επίπεδο δραστηριότητας ενισχυτή του θραύσματος Α1, rs6507875 αλληλόμορφα δείχνουν μια μεγαλύτερη αλληλόμορφο-ειδική επίδραση από rs6507874, στην κατεύθυνση συνεπή με το θραύσμα 2 kb (Σχήμα 2C ). Σε αντίθεση, η επίδραση του αλληλόμορφου rs6507874 στην δραστικότητα ενισχυτή εξαρτάται από το ποιά αλληλόμορφο rs6507875 ήταν παρούσα, υποδηλώνει μια συμφραζόμενα επίδραση εντός των συστατικών ενισχυτή. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν υπάρχει μια σύνθετη λειτουργική σχέση μεταξύ γειτονικών SNPs.

(Α) θραύσμα Α διαιρέθηκε σε 4 μικρότερα θραύσματα DNA, Α1-Α4, που απεικονίζεται στην Εικόνα 1ϋ. Κάθε μικρότερο κομμάτι αποδεικνύεται δραστηριότητα ενισχυτή τόσο HCT-116 (φωτεινές μπάρες) και SW480 (σκοτεινές μπάρες). Για το πείραμα που παρουσιάζεται, όλες οι SNPs που περιέχονται C αλληλόμορφα τους. (Β) Δραστηριότητα του Θραύσμα Α1 περιέχει rs6507874 και rs6507875, εμφανίζεται ως φορές μεταβολής σε σχέση με το μείζον απλότυπο CG για HCT-116 (ελαφρά ράβδοι) και SW480 (σκοτεινές ράβδοι). Ο ανήλικος TC απλότυπος (

σ

= 2.25 × 10

-2 (HCT-116),

σ

= 8,59 × 10

-2 (SW480)), και ο συνδυασμός CC (

σ

= 5.06 × 10

-5 (HCT-116),

σ

= 1.75 × 10

-5 (SW480)) δεν έχει παρατηρηθεί στον πληθυσμό CEU εμφανίζουν υψηλότερη δραστικότητα από το μείζον απλότυπο. Συνδυασμός TG (

σ

= 0.450 (HCT-116),

σ

= 0,287 (SW480)) αποδεικνύει δραστηριότητα παρόμοια με CG. (C) Θραύσμα Α2 περιέχει rs8085824 δείχνει 2 φορές υψηλότερη δραστηριότητα ενισχυτή με τον ανήλικο αλληλόμορφο C του από το μείζον αλληλόμορφο Τ (

p =

4,75 × 10

-3 (HCT-116),

p =

3,61 × 10

-4 (SW480)). (D) Δραστηριότητα του θραύσματος Α3 περιέχει rs8085824 και rs58920878 σε σχέση με σημαντικές TC απλότυπος. Ο ανήλικος απλότυπος CG επιδεικνύει υψηλότερη δραστικότητα από την TC (

p =

2,49 × 10

-2 (HCT-116),

p =

6,32 × 10

-3 (SW480 )). Ο Τ (μείζον) αλληλόμορφο του rs8085824 παρουσιάζει χαμηλότερη δραστικότητα από C (ήσσονος σημασίας) αλληλόμορφο, ανεξάρτητα από το αλληλόμορφο rs58920878. Η υψηλότερη δραστηριότητα παρατηρείται σε CC απλότυπος που δεν αναφέρεται στον πληθυσμό CEU (

p =

6,35 × 10

-7 (HCT-116),

p =

1,47 × 10

-6 (SW480)). (Ε) Δράση του θραύσματος Α4 περικλείει την κορυφή που περιέχει rs58920878. Το έλασσον αλληλόμορφο G της rs58920878 δείχνει δραματικά μικρότερη δράση από τη σημαντική αλληλόμορφο C (

p =

1,92 × 10

-4 (HCT-116),

p =

1,52 × 10

-5 (SW480)). (F) θραύσμα Α ελέγχθηκε για δραστικότητα με τις δύο πιο κοινές απλότυποι (Σχήμα 1 Ε) στον πληθυσμό CEU. Ο απλότυπος CGTC παρουσιάζει υψηλότερη δραστηριότητα σε HCT-116 (φως μπαρ,

σ

= 1,04 × 10

-11) και SW480 (μέσο μπαρ,

σ

= 8.60 × 10

-11), αλλά καμία σημαντική διαφορά στη δραστηριότητα RKO (σκοτεινές μπάρες).

Η

το θραύσμα Α2 περιέχει SNP rs8085824 και διασχίζεται από την περιοχή μεταξύ των δύο πιο σημαντικές κορυφές HCT-116 H3K4me1 σε ενισχυτή A (Σχήμα 1 D). Ενώ θραύσμα Α2 είχαν δραστικότητα από μόνη της, δεν έδειξε την χαμηλότερη δραστικότητα από τα 4 υπο-περιοχές που δοκιμάστηκαν (Εικόνα 3Α). Όταν το αλληλόμορφο rs8085824 άλλαξε από T (μείζον αλληλόμορφο) έως C (ελάχιστο αλληλόμορφο), η δραστηριότητα αυξήθηκε δυο φορές (Σχήμα 3C) σύμφωνο με αποτελέσματα για το μεγαλύτερο θραύσμα (Σχήμα 2C). Το θραύσμα Α3 περιλαμβάνει την περιοχή Α2 (συμπεριλαμβανομένων rs8085824) και ένα επιπλέον 160 bp για να συμπεριλάβει rs58920878. Αυτό το θραύσμα έδειξε 2 φορές περισσότερη δραστηριότητα από το θραύσμα Α2. Η κύρια απλότυπος του rs8085824 και rs58920878 (r

2 = 1, D ‘= 1, CEU) είναι TC. Το δευτερεύον απλότυπος CG απέδειξε 1,3 να 1,6 φορές υψηλότερη δραστικότητα από την μείζονα απλότυπο σε HTC-116 και SW480 κύτταρα, αντίστοιχα. Η τεχνητά κατασκευασμένα συνδυασμός CC αλλήλιο είχε το υψηλότερο επίπεδο της δραστηριότητας δοκιμάστηκε για το θραύσμα Α3. Συγκρίνοντας το θραύσμα CC στα θραύσματα απλότυπος TC και CG, παρατηρήσαμε ότι μια μεγαλύτερη πτώση της δραστηριότητας προέκυψε από την αλλαγή του αλληλόμορφου rs8085824 από rs58920878. Αντιστρόφως, αλλάζοντας rs58920878 στο απλότυπο TC να TG δεν είχε ως αποτέλεσμα μία σημαντική διαφορά στη δραστικότητα ενισχυτή. Όπως και με το θραύσμα Α2, για rs8085824 SNP αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με αλληλόμορφο-ειδικές επιδράσεις δει χρησιμοποιώντας το μεγαλύτερο θραύσμα (Σχήμα 2C). Ωστόσο, για SNP rs58920878, η επίδραση που προβλέπεται από το θραύσμα 2 kb ήταν εξαρτάται από το ποιά αλληλόμορφο rs8085824 ήταν παρούσα, και πάλι, γεγονός που υποδηλώνει ότι υπάρχει μια πολύπλοκη λειτουργική σχέση μεταξύ γειτονικών SNPs.

Τέλος, θραύσμα Α4, περιλαμβάνει το δεύτερο μικρότερες HCT-116 H3K4me1 κορυφή, περιείχε μόνο SNP rs58920878 και έδειξε παρόμοια δραστηριότητα με θραύσματα Α1 και Α3 (Σχήμα 3Α). Αυτό το θραύσμα έδειξε δραστικότητα ενισχυτή μειώθηκε 3 φορές όταν το κύριο αλληλόμορφο C άλλαξε στο ελάχιστο αλληλόμορφο G (Σχήμα 3Ε). Το Α4 κομμάτι που περιέχει rs58920878 ήταν το μόνο από τα μικρότερα τεμάχια, όπου ο ανήλικος αλληλόμορφο ή απλότυπος αποδειχθεί χαμηλότερη δραστικότητα από το μείζον αλληλόμορφο /απλότυπος.

Οι δύο πιο κοινές απλοτύπων στο CEU για αυτή την ομάδα των 4 SNPs είναι CGTC (49,9%) και TCCG (33,4%) (Σχήμα 1 Ε). Αυτοί οι συνδυασμοί ελέγχθηκαν στο πλαίσιο του ενισχυτή Ένα μόρφωμα 2 kb. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3F, συνολικά η μείζων απλότυπος CGTC αποδειχθεί υψηλότερη δραστικότητα ενισχυτή από την μικρή απλότυπος TCCG σε HCT-116 και SW480. Είναι ενδιαφέρον ότι, όταν εξετάσαμε τα δύο απλοτύπους στην κυτταρική σειρά CRC RKO, CGTC δεν ήταν σημαντικά πιο δραστική από την απλότυπο TCCG, υποδεικνύοντας υπήρξε κάποια ειδικότητα προς το θραύσμα Α δραστηριότητα ακόμη και μεταξύ κυτταρικών γραμμών CRC. Ούτε απλότυπος του θραύσματος Α ήταν ενεργό σε μη-CRC κυτταρική σειρά ΗΕΚ293 που χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος (Σχήμα S1 Α). Θραύσματα που περιέχουν απλοτύπων TCTC (9,5% του πληθυσμού CEU) και CCTC (5,9% του πληθυσμού CEU) έδειξε τα επίπεδα δραστηριότητας μεταξύ εκείνης των απλοτύπων CGTC και TCCG (Σχήμα S1B).

Κινητικότητα Ηλεκτροφορητική Αναλύσεις Shift

για την καλύτερη κατανόηση αυτών των αλληλόμορφο-ειδικές επιδράσεις ενισχυτή, έχουμε την επόμενη διερευνήθηκε η σύνδεση προς τις αλληλουχίες που περιέχουν κάθε ένα από τα 4 SNPs, rs6507874, rs6507875, rs8085824 και rs58920878 πυρηνική πρωτεΐνη. Υποθέσαμε ότι παράγοντες μεταγραφής θα δεσμεύονται επιλεκτικά με τα αλληλόμορφα C με υψηλότερη συγγένεια, καθώς το τεμάχιο 2 kb και θραύσματα Α1-Α4 με αλληλόμορφα C έδειξε το υψηλότερο επίπεδο δραστηριότητας ενισχυτή. Αντιστρόφως, ανασταλτικές πρωτεΐνες μπορεί να συνδέονται με το Τ ή G αλληλόμορφα προτίμηση να ρυθμίσουν αρνητικά την δραστηριότητα ενισχυτή. Για το σκοπό αυτό, 33 bp δίκλωνα ολιγονουκλεοτίδια επίκεντρο κάθε SNP, συνετέθησαν. Σε κάθε περίπτωση, το αλληλόμορφο C σημάνθηκε με τη χρωστική IR κόκκινο (700). Τα αναπληρωματικά αλληλόμορφα, είτε Τ ή G επισημάνθηκαν με οικολογικές βαφές (800) IR (τα μεμονωμένα κανάλια που παρουσιάζονται ως μαύρο και άσπρο εικόνες στα σχήματα S2-S5 για την ευκολία της αναπαραγωγής και ανάλυση). Πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν από κυτταρικές γραμμές SW480, HCT-116 και RKO CRC και επωάστηκαν με μη-ειδικά και ειδικών μη σημασμένο DNA ανταγωνιστής όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 4. Οι δύο αλληλόμορφα του κάθε SNP επισημασμένα με διαφορετικά χρώματα, που επιτρέπει την άμεση σύγκριση των σύνδεση του κάθε αλληλόμορφου προς πυρηνικές πρωτεΐνες στην ίδια αντίδραση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, για κάθε σύνολο ανιχνευτή που δοκιμάστηκαν, υπάρχουν ζώνες ειδικές για ένα αλληλόμορφο σε σχέση με το άλλο αλληλόμορφο.

(Α) πυρηνικά εκχυλίσματα από SW480, HCT-116, και κυτταρικές γραμμές RKO επωάστηκαν με IR -dye επισημαίνονται 33mers επίκεντρο rs6507874 C (κόκκινη ετικέτα) και Τ (πράσινο ετικέτες) πριν από την μητρική EMSA. Οι διαδρομές 1 και 2 δείχνουν καθετήρα χωρίς πυρηνικού εκχυλίσματος. Οι διαδρομές 3, 4, 9, 10, 15, και 16 δείχνουν δεσμευτικός κάθε σημασμένο ανιχνευτή για πυρηνικές πρωτεΐνες ατομικά με κυτταρική γραμμή, όπως σημειώνεται παραπάνω. Λωρίδες 5-8, 11-14, και 17-20 αποτελούν 1:01 ανταγωνισμό με σημασμένο C και Τ ανιχνευτές αλληλόμορφο. Οι λωρίδες 6, 12 και 18 περιέχουν 200 φορές περίσσειας μη επισημασμένου ανταγωνιστή αλληλόμορφο C. Οι διαδρομές 7, 13, και 19 περιέχουν 200 φορές περίσσειας μη επισημασμένου ανταγωνιστή αλληλόμορφο Τ. Λωρίδες 8, 14, και 20 περιέχουν 200 φορές περίσσεια ανταγωνιστή ενός αναίρεση αντιστοίχισης ακολουθίας με παρόμοιο περιεχόμενο νουκλεοτιδίων. Οι ζώνες ειδικά για ένα αλληλόμορφο και έχασε στον ανταγωνισμό που σημειώνονται με βέλη. Δείτε το Σχήμα S2 για κόκκινο εικόνα (700) του καναλιού του καθετήρα C και το πράσινο (800) του καναλιού του καθετήρα Τ σε μαύρο και άσπρο. (Β) Όπως στον πίνακα Α, με αλληλόμορφο rs6507875 C (κόκκινο καθετήρα) και το G αλληλόμορφο (πράσινο). Δείτε το Σχήμα S3 για κόκκινο εικόνα (700) του καναλιού του καθετήρα C και το πράσινο (800) του καναλιού του αισθητήρα G σε μαύρο και άσπρο. (C) όπως στο πάνελ Α, με αλληλόμορφο rs8085824 C (κόκκινο) και Τ αλληλίου (πράσινο). Δείτε το Σχήμα S4 για κόκκινο εικόνα (700) του καναλιού του καθετήρα C και το πράσινο (800) του καναλιού του καθετήρα Τ σε μαύρο και άσπρο. (D) Όπως στο πάνελ Α, με rs58920878 C αλληλόμορφο (κόκκινο) και G αλληλόμορφο (πράσινο). Δείτε το Σχήμα S5 κανάλι για το κόκκινο (700) εικόνα του καναλιού του καθετήρα C και το πράσινο (800) του καθετήρα G σε μαύρο και άσπρο.

Η

Για κάθε σύνολο αλληλόμορφο, λωρίδες 3, 4, 9, , 10, 15 και 16 δείχνουν ένα μόνο ανιχνευτή αλληλόμορφου επωάστηκαν με το πυρηνικό εκχύλισμα. Λωρίδες 5-8, 11-14, 17-20 και να περιέχουν αντιδράσεις με 1:01 ποσότητες εκάστου επισημασμένου αλληλόμορφο. Για τον προσδιορισμό ειδικότητας των συμπλεγμάτων μετατοπίζεται, μη επισημασμένα ολιγονουκλεοτίδια ανταγωνιστική για κάθε αλληλόμορφο προστέθηκαν σε 200-πλάσια περίσσεια. Οι λωρίδες 6, 12, και 18 περιλαμβάνουν τα μη επισημασμένα αλληλόμορφα C και λωρίδες 7, 13 και 19 περιέχουν τα μη επισημασμένα αλληλόμορφα Τ ή G. Στις λωρίδες 8, 14, και 20, ένα μη επισημασμένο ανταγωνιστή παρόμοιας σύνθεσης βάση, αλλά δεν ταιριάζουν οποιαδήποτε από τις αλληλουχίες προστέθηκε σε μία ίση ποσότητα. Συγκροτήματα που εξαφανίστηκε όταν αγωνίστηκε είτε με SNP αλληλόμορφο, αλλά παρόν με το άσχετο (μη-ειδική) ανταγωνιστή θεωρήθηκαν ειδικά για την ακολουθία SNP. Το πιο σημαντικό από τις συγκεκριμένες ζώνες σημειώνονται στο περιθώριο με τα βέλη.

Στην περίπτωση του rs6507874 και rs58920878 (Εικόνα 4Α, 4D), υπήρχαν συγκροτήματα που βρέθηκαν σε HCT-116 και SW480, τα οποία δεν είχαν δει σε RKO. Αυτό μπορεί να εξηγήσει γιατί απλότυπο ειδική δραστικότητα δεν παρατηρήθηκε στο πείραμα δραστικότητα λουσιφεράσης RKO. Στα Σχήματα 4Α και S2, η μπάντα που χαρακτηρίζεται από το βέλος ήταν ειδικά για το rs6507874 C καθετήρα αλληλόμορφο. Σημειώστε ότι σε HCT-116 και τα εκχυλίσματα RKO, ακόμη και 200-πλάσια περίσσεια του μη επισημασμένου ολιγονουκλεοτιδίου αλληλόμορφο Τ δεν μπόρεσε να ανταγωνιστεί έξω-το αλληλόμορφο C για δέσμευση. Για τους ανιχνευτές rs6507875 (Σχήμα 4Β και S3), ενώ υπήρχαν ειδικές ζώνες για τα δύο αλληλόμορφα (βέλη), το αλληλόμορφο G δεσμεύεται με περισσότερη συγγένεια από το αλληλόμορφο C. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι ανιχνευτές rs6507875 δεσμεύονται ισχυρά με τα συστατικά του εκχυλίσματος RKO, ακόμη και με την παρουσία περίσσειας μη επισημασμένου DNA (Σχήμα 4Β).

Για τους ανιχνευτές rs8085824, βρήκαμε πάλι αρκετές ειδικά σύμπλοκα για κάθε αλληλόμορφο. Ένας προεξέχων συγκρότημα, που χαρακτηρίζεται από το κάτω βέλος, έδειξαν ότι ο ανιχνευτής αλληλόμορφο C δεν ήταν πλήρως outcompeted με 200-πλάσια περίσσεια του αλληλόμορφου Τ. Φαίνεται ότι οι δεσμευμένες πρωτεΐνες του σύνθετου αυτού βρέθηκαν σε υψηλότερα ποσά σε SW480 και HCT-116 από RKO πυρηνικά εκχυλίσματα. Στην περίπτωση των ανιχνευτών rs58920878 βρήκαμε πολλά συγκροτήματα ειδικό για το αλληλόμορφο C, ενώ το αλληλόμορφο G βρέθηκε κυρίως σε μεγαλύτερα συγκροτήματα (υψηλότερες κατηγορίες) από το αλληλόμορφο C.

προσδιορισμό της ταυτότητας αυτών αλληλόμορφους ειδικές πρωτεΐνες δέσμευσης θα πρέπει να κατανοήσει πλήρως τη δράση του ενισχυτή Smad7. Συνδετικής πρωτεΐνης λογισμικό πρόβλεψης BIOBASE Match, που βασίζεται στη βάση δεδομένων TRANSFAC μοτίβο, χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των υποψηφίων για κάθε περιοχή SNP [24]. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης παρουσιάζονται ως πίνακες S1, S2 και S3 σε S1 αρχείου. Η πρωτεΐνη που δεσμεύεται με DNA με την κορυφή διαφορά στην προβλεπόμενη δεσμευτική βαθμολογίες μεταξύ αλληλόμορφα για rs6507874 /rs6507875 (αναλύθηκε μαζί λόγω της εγγύτητας) ήταν NF-1A, για rs8085824 ήταν Churchill, και για rs58920878 ήταν ZF5. Ωστόσο, για κάθε τόπο, καμία από τις πρωτεΐνες με τις μεγαλύτερες προβλεπόμενες αλληλόμορφο διαφορές ήταν οι πρωτεΐνες με τις υψηλότερες πυρήνα ή μήτρα βαθμολογίες για κάθε ακολουθία.

eQTL Ανάλυση σε φυσιολογικό κόλον Tissue

επόμενο η ερώτηση εάν ο γονότυπος σε αυτές SNPs συσχετίζονται με τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης σε φυσιολογικούς ιστούς κόλου. Καθώς ο ενισχυτής βρίσκεται στο ιντρόνιο 4 του

Smad7

γονίδιο,

Smad7

ήταν μια προφανής υποψηφίου γονιδίου-στόχου. Εκτός από rs6507874, rs6507875 και rs8085824, εμείς γονότυπος επίσης τις rs4939827 tagSNP σε παθολογικά δείγματα φυσιολογικού ανθρώπινου ιστού που ελήφθη από την κολονοσκόπηση επιτήρησης μέσω της ασπιρίνης /Φυλλικό οξύ πολύποδας Μελέτη Πρόληψης [25] – [27]. Ήμασταν σε θέση να σχεδιάσει μια δοκιμασία TaqMan για rs58920878, ωστόσο SNPs rs8085824 και rs58920878 είναι σε τέλεια LD (r

2 = 1, D ‘= 1)? Ως εκ τούτου, rs8085824 αντιπροσωπεύει επίσης ένα πληρεξούσιο για rs58920878. Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των δύο άλλων γονιδίων μέσα σε 0,5 Mb της rs4939827,

CTIF

ή

DYM

, και οποιοδήποτε από τα γονότυπου SNPs θεωρήθηκε (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Βρήκαμε ότι οι rs4939827 tagSNP δεν έδειξε στατιστικά σημαντική συσχέτιση με το

Smad7

επίπεδα έκφρασης, αν και υψηλότερη έκφραση κινήθηκαν με το αλληλόμορφο κινδύνου Τ GWAS (p = 0.1130) (Σχήμα 5). Ωστόσο, SNP rs8085824 C (ήσσονος σημασίας) αλληλόμορφο έδειξε στατιστικά σημαντική συσχέτιση (

σ

= 0,01197), με αυξημένη

Smad7

έκφρασης. Δεδομένου ότι SNPs rs8085824 και rs58920878 είναι σε τέλεια LD, το αποτέλεσμα αυτό μπορεί να επεκταθούν σε υποδηλώνει συσχέτιση μεταξύ rs58920878 G (ήσσονος σημασίας) αλληλόμορφο και υψηλότερα επίπεδα

Smad7

έκφρασης. Η rs6507874 Τ (ήσσονος σημασίας) αλληλόμορφο (p = 0,07531) και το αλληλόμορφο rs6507875 C (ήσσονος σημασίας) (

σ

= 0,1337) δεν παρουσίασαν στατιστικά σημαντική συσχέτιση με την αύξηση της

Smad7

έκφρασης. Σημειώστε ότι συνολικά ο απλότυπος TCCG (ελάσσων απλότυπος) συσχετίστηκαν με υψηλότερη

Smad7

έκφραση σε ιστούς και σε λουσιφεράση δοκιμασίες στο πλαίσιο των θραυσμάτων Α1, Α2 και Α3, αλλά απέναντι στο φαινόμενο παρατηρήθηκε για δραστικότητα ενισχυτή το θραύσμα 2 kb σε πειράματα λουσιφεράσης όπου το θραύσμα που περιέχει τον απλότυπο TCCG (ελάσσων απλότυπος) συσχετίζεται με μειωμένη δράση ενισχυτή σε σύγκριση με το θραύσμα που περιέχει τον απλότυπο CGTC.

Fold μεταβολή (FC) της έκφρασης Smad7 μετρήθηκε σε κανονική δείγματα ιστού του παχέος εντέρου από κολονοσκοπήσεις επιτήρησης. Κατάταξη με βάση το μη-παραμετρική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η επίδραση της κάθε επιπλέον έλασσον αλληλόμορφο για rs6507874, rs6507875, rs8085824 και rs4939827 (προσθετικό μοντέλο) στη γονιδιακή έκφραση προσαρμογή για το φύλο, την ηλικία και τη φυλή. Δύο όψεων

σ

-τιμές ελήφθησαν από ένα τεστ λόγου πιθανοφανειών. Σύνδεση

2 (ΔΔCt) σχεδιάστηκαν ως συνάρτηση των γονότυπων χρησιμοποιώντας ένα Θηκόγραμμα – τελεία επικάλυψη οικόπεδο. Αριθμός των δειγμάτων που σημειώνεται κάτω από κάθε γονότυπο. Μια στατιστικά σημαντική συσχέτιση βρέθηκε για rs8085824.

Η

Περαιτέρω μελέτες θα χρειαστούν για να καθορίσουν τον τρόπο αυτό πολλαπλών στοιχείων ελέγχου ενισχυτή

Smad7

γονιδιακής έκφρασης κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του παχέος εντέρου και την ανάπτυξη των κυττάρων, και να καθοριστεί εάν ή όχι τα επιμέρους συστατικά του ενισχυτή ενεργούν ανεξάρτητα ο ένας τον άλλο.

κανονισμός του Smad7 Enhancer

Είμαστε δίπλα ήθελε να καθορίσουν τη σχέση μεταξύ της δραστηριότητας ενισχυτή και σηματοδότησης BMP /TGFβ. Όπως αναφέρθηκε στην εισαγωγή, Smad7 δρα ως ένας μεσολαβητής κλειδί της αρνητικής ανάδρασης για αμφότερες τις οδούς σηματοδότησης ΤΟΡβ και ΒΜΡ. Ήμασταν ενδιαφέρει ως εκ τούτου, να καθορίσει εάν ενισχυτή Α ήταν μέρος ενός βρόχου ανάδρασης, όλο και πιο ενεργά σε απόκριση είτε TGFβ1 ή σηματοδότησης BMP4. HCT-116 και τα κύτταρα SW480 στερήθηκαν ορού όλη τη νύκτα πριν από 6 ώρες θεραπείας με 100 pmol TGFβ1 ή ΒΜΡ4, και το θραύσμα 2 kb Α χρησιμοποιήθηκε για τη δοκιμή για δραστικότητα λουσιφεράσης. Μετά τη θεραπεία με TGFβ1, θραύσματα που περιέχουν είτε το CGTC (μείζον) απλότυπος ή το TCCG (minor) απλότυπος δεν έδειξαν στατιστικά σημαντική αλλαγή στην δραστηριότητα είτε σε κυτταρική γραμμή (Σχήμα 6Α). Αντίθετα, μετά από αγωγή με ΒΜΡ4, δραστικότητα ενισχυτή του θραύσματος που περιέχει το CGTC μείζονα απλότυπο αυξήθηκε 1,2 φορές σε HCT-116 κύτταρα και 1,5 φορές σε κύτταρα SW480 (Σχήμα 6Β). Μια αύξηση στην δραστηριότητα ενισχυτή παρατηρήθηκε επίσης με το θραύσμα που περιέχει το TCCG ανήλικος απλότυπο σε κύτταρα SW480 όπου θεραπεία ΒΜΡ οδήγησε σε διπλάσια αύξηση 1,4 στη δραστικότητα ενισχυτή, αλλά όχι σε HCT-116 κύτταρα, όπου δεν παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση (

p

= 0,38) (Σχήμα 6Β). Επειδή τα θραύσματα DNA που περιέχει και τις δύο απλότυποι διεγέρθηκαν με BMP4 σε SW480 σε παρόμοια έκταση (fold change), εμείς υποθέτουν ότι οι 4 SNPs στο απλότυπο κινδύνου δεν διαταράσσουν τις πραγματικές ΒΜΡ αποκρίνεται συστατικά του ενισχυτή. Ωστόσο, λόγω του ελλείμματος σε δραστηριότητα με την ελάσσονα απλότυπο, μετά από διέγερση ΒΜΡ4, το κατασκεύασμα απλότυπος TCCG ακόμη επιδεικνύει χαμηλότερη δραστικότητα ενισχυτού από τον απλότυπο CGTC χωρίς ΒΜΡ4 διέγερση (Σχήμα 6C). Συνολικά, αυτά τα δεδομένα εμπλέκουν τον ενισχυτή σε μια αρνητική αλληλεπίδραση σε απόκριση προς σηματοδότηση BMP αλλά όχι στο σκέλος ΤΟΡβ του καταρράκτη σηματοδότησης.

(Α) Enhancer δραστικότητα μετρήθηκε με δοκιμασία λουσιφεράσης για το θραύσμα Α που περιέχει η κύρια (CGTC) και μικρές (TCCG) απλότυποι σε HCT-116 και SW480 κύτταρα λιμοκτονούν ορού επωάζονται με TGFβ1 για 6 ώρες. Τα δείγματα σημειώνονται σαν φορές αλλαγή σε δραστικότητα σε σχέση με μη επεξεργασμένα κύτταρα στην ίδια πλάκα. δραστηριότητα (Β) Enhancer υποκινήθηκε από 6 ώρες από τη θεραπεία BMP4 για την απλότυπος CGTC σε HCT-116 (

σ

= 4.14 × 10

-3) και τα κύτταρα SW480 (

p

= 1,22 × 10

-10). Ο απλότυπος TCCG στο θραύσμα Α δείχνει χαμηλότερα επίπεδα διέγερσης, και μόνο σε SW480 (

σ

= 1,61 × 10

-6). (ΗΟΤ-116

σ

= 0,38). Επίδραση της ΒΜΡ σχεδιάζεται ως φορές μεταβολής έναντι των μη κατεργασμένων δειγμάτων για κάθε απλότυπο επί της ίδιας πλάκας. (C) Enhancer σύγκριση δραστηριότητα μεταξύ των CGTC και TCCG απλοτύπων μετά τη θεραπεία BMP4. Σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης καταγράφονται για κάθε απλότυπου σε HCT-116 και SW480 χρησιμοποιώντας το ίδιο πειραματικό σύνολο δεδομένων όπως (Β).

Η

Συζήτηση

Πρόσφατα, το εργαστήριο μας και άλλοι έχουν αρχίσει να εξετάζουν οι επιπτώσεις των πολλαπλών λειτουργικών παραλλαγές σε ανισορροπία σύνδεσης (LD) συμβάλλουν στον κίνδυνο της νόσου εντοπίζονται μέσω GWAS αντί για ενιαία λειτουργική παραλλαγή [28]. Για παράδειγμα, στο χρωμόσωμα 11q23.1, εργαστήριο μας προσδιόρισε δύο SNPs σε LD (r

2 = 1) που συνδυάζεται με CRC κίνδυνο, ένας σε ένα ενισχυτή και ένα, σε ένα υποκινητή διπλής κατεύθυνσης, που κατέδειξαν αλληλόμορφο-ειδική δραστικότητα και συσχετίζεται με τα επίπεδα έκφρασης των τριών προηγουμένως μη στόχους γονίδιο [16].