Αφηρημένο

Το γονιδίωμα είναι οργανωμένο και συσκευάζονται εντός του πυρήνα μέσω αλληλεπιδράσεων με πρωτεΐνες πυρήνα ιστόνης. Αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι οι όγκοι είναι πολύ ανταποκρίνεται στις επιγενετικές αλλαγές που προκαλούν τα γεγονότα της χρωματίνης με βάση και δυναμικά επηρεάζουν τη συμπεριφορά του όγκου. Εξετάσαμε οργάνωση χρωματίνης στο κεφάλι και το καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων του λαιμού (HNSCC) χρησιμοποιώντας επίπεδα ακετυλίωσης ιστόνης 3 ως δείκτη της χρωματίνης συμπίεσης. Σε σύγκριση με τον έλεγχο του στόματος κερατινοκύτταρα, βρήκαμε ότι τα κύτταρα HNSCC υποακετυλιωμένη και ότι τα συνθήματα μικροπεριβάλλον (π.χ., ενδοθηλιακά κύτταρα μικροαγγείων) επάγουν ακετυλίωση όγκου. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η χημική αναστολή του αποακετυλασών ιστόνης (HDAC) μειώνει τον αριθμό των καρκινικών βλαστοκυττάρων (CSC) και αναστέλλει τον σχηματισμό κλωνογονικού σφαίρα. Παραδόξως, η αναστολή της HDAC που επάγεται επίσης επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) σε κύτταρα HNSCC, συσσώρευση ΒΜΙ-1, ένα ογκογονίδιο που σχετίζεται με την επιθετικότητα του όγκου, και η έκφραση του βιμεντίνη μεσεγχυματικών δείκτη. Σημαντικά, παρατηρήσαμε συν-έκφραση βιμεντίνη και ακετυλιωμένης ιστόνης 3 στο μπροστινό εισβολή ιστών ανθρώπινης HNSCC όγκου. Συλλογικά, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι οι περιβαλλοντικές νύξεις, όπως κύτταρο-εκκρίνονται παράγοντες ενδοθηλιακά, ρυθμίζουν την πλαστικότητα του όγκου με τον περιορισμό του πληθυσμού των CSC και επαγωγής EMT. Ως εκ τούτου, η αναστολή της HDAC μπορεί να αποτελεί μία νέα στρατηγική να διαταράξουν τον πληθυσμό της CSC σε όγκους κεφαλής και τραχήλου για τη δημιουργία ενός ομογενούς πληθυσμού καρκινικών κυττάρων με βιολογικά ορίζεται υπογραφές και προβλέψιμη συμπεριφορά

Παράθεση:. Giudice FS, Pinto DS Jr, ούτε JE, Squarize CH, Castilho RM (2013) Αναστολή της ιστόνης Καρκίνου αποακετυλάσης Επιπτώσεις βλαστικά κύτταρα και προκαλεί επιθηλιακά μεσέγχυμα μετάβαση του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου. PLoS ONE 8 (3): e58672. doi: 10.1371 /journal.pone.0058672

Επιμέλεια: Ειρήνη Söderhäll, Πανεπιστήμιο της Ουψάλα, Σουηδία

Ελήφθη: 6 Νοεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 5 Φεβ του 2013? Δημοσιεύθηκε: 20 Μάρτη 2013

Copyright: © 2013 Giudice et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH /NCI) P50-CA97248 (Πανεπιστήμιο του Μίσιγκαν Κεφαλής και Τραχήλου SPORE)? και με την επιχορήγηση R01-DE21139 από το ΝΙΗ /NIDCR (JEN). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Μεταξύ κακοήθεις όγκους κεφαλής και τραχήλου, της κεφαλής και του λαιμού καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (HNSCC) είναι οι πιο κοινές επιθηλιακά νεοπλασίας και αποτελεί ένα από τα έξι πιο κοινές κακοήθειες παγκοσμίως [1]. HNSCC χαρακτηρίζεται από αλλοιώσεις στην στοματική κοιλότητα, του λάρυγγα, του φάρυγγα και. Παρά τις προσπάθειες για την ανάπτυξη βιολογικών δεικτών για την έγκαιρη διάγνωση και την πρόγνωση, η επιβίωση των ασθενών HNSCC δεν έχει βελτιωθεί σημαντικά [2]. Η ανάπτυξη νέων θεραπειών που βελτιώνουν την επιβίωση και την ποιότητα ζωής των ασθενών με HNSCC απαιτείται επειγόντως.

Η έναρξη και εξέλιξη του καρκίνου ελέγχεται κυρίως από γενετικούς και επιγενετικές γεγονότα που επηρεάζουν την έκφραση του γονιδίου [3]. Επιγενετικές μεταβολές μπορεί να ρυθμίσει την γονιδιακή έκφραση ανεξάρτητα από γονιδιωματικών μεταλλάξεων. Οι επιγενετικές εναλλαγές παρατηρείται συνήθως μετά από μεθυλίωση του DNA και των ιστονών τροποποίηση [4], [5]. Οι ιστόνες μπορεί να τροποποιηθεί μετα-μεταφραστικά μέσω ακετυλίωσης λυσίνης και ουβικιτινίωση, η φωσφορυλίωση της σερίνης, τροποποίησή της με SUMO, και μεθυλίωση του λυσίνες και αργινίνες [6]. ακετυλτρανσφεράσες ιστόνης (ΗΑΤ) καταλύουν τη μεταφορά μιας ακετυλομάδας από ακετυλο-Οο-Α στο e-αμινο θέση της λυσίνης, οδηγώντας σε αποσυμπύκνωση της χρωματίνης. Σε αντίθεση, αποακετυλάσες ιστόνης (HDAC) πράξη σχετικά με τα κατάλοιπα λυσίνης σε συμπαγή χρωματίνης και την καταστολή γονιδίου μεταγραφής [7], [8]. Είναι ενδιαφέρον ότι η επίδραση της HDAC οργάνωσης χρωματίνης συνδέεται επίσης με τη ρύθμιση και τη συντήρηση των βλαστικών κυττάρων πλειοδυναμίας σε συντονισμό με τα πολυάριθμα μονοπάτια σηματοδότησης [9], [10]. Ωστόσο, η συμπύκνωση της χρωματίνης συνδέεται επίσης με χημειοαντίσταση σε όγκους [11] – [14]. Αυτός ο φαινότυπος είναι εν μέρει αποδοθεί σε εξειδικευμένα κύτταρα που επανενεργοποιήσει βλαστικών προγράμματα μεταγραφής κυττάρων-όπως [15]. Αυτά τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (CSC), που χαρακτηρίζεται από υψηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού, επιθετική συμπεριφορά, μεταστατικό δυναμικό, και την ικανότητα να αυτο-ανανέωση [16] – [25]. CSC είναι σημαντικοί θεραπευτικοί στόχοι για τον καρκίνο [26], και το κλινικό όφελος της απευθείας στόχευση CSC είναι υπό έρευνα. Θελήσαμε να προσδιορίσει αν παρεμβαίνει με συμπύκνωση της χρωματίνης, που είναι γνωστό ότι παίζουν ένα βασικό ρόλο στη διατήρηση των φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων [9], [10], θα επηρεάζουν τη συμπεριφορά του όγκου και του περιεχομένου CSC. Παρατηρήσαμε υποακετυλιωμένη χρωματίνη σε ένα πάνελ HNSCC κυτταρικές γραμμές που παράγονται και προσδιόρισε μια ξεχωριστή πληθυσμός της CSC σε αυτά τα κύτταρα. Αυτές οι παρατηρήσεις μας ώθησε να ρωτήσω αν χρωματίνης ακετυλίωση υπαγορεύει τη βιολογική συμπεριφορά των όγκων και αν φαρμακολογική παρέμβαση με HDAC μεταβάλλει τη συμπεριφορά CSC. Βρήκαμε ότι η αναστολή της HDAC διαταράσσει τη συσσώρευση CSC και παραδόξως επάγει κύτταρα όγκου να υποβληθούν σε επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ).

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρικές σειρές και συνθήκες καλλιέργειας

Χρησιμοποιήσαμε κυτταρικές σειρές HNSCC παράγεται από την χειρουργική αφαίρεση των πρωτοπαθών όγκων εντοπίζεται στην γλώσσα (HN6, HN13 και Cal 27), του φάρυγγα (HN30), του λάρυγγα (Hep2) και προέρχεται από έναν όγκο γλώσσα που κάνει μετάσταση στους λεμφαδένες (ΗΝ12 ) [27], [28]. Κανονικά από το στόμα κερατινοκυττάρων αυθόρμητα αθανατοποιημένη κυτταρική γραμμή (ΝΟΚ-SI) έχει προηγουμένως αποδειχθεί και παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Dr. Gutkind από το Εθνικό Ινστιτούτο Οδοντιατρικής και Κρανιοπροσωπικής Έρευνας (NIDCR /NIH) [29]. Η κανονική κυτταρική γραμμή ινοβλάστης ΝΙΗ /3Τ3 ελήφθη από την American Type Culture Collection (ATCC – Manassas, VA, USA) και καλλιεργήθηκαν με χρήση ϋΜΕΜ (Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ, USA) συμπληρωμένο με 10% βόειο ορό μοσχαριού ( Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, μΑ, USA), 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, και 250 ng /ml αμφοτερικίνη Β (Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, μΑ, USA). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε ένα 5% CO2-υγροποιημένο επωαστήρα. Πρωτογενή ανθρώπινα δερματικά μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα. (HDMEC? Lonza, Walkersville, MD, USA) παρασκευάστηκαν σε ενδοθηλιακό βασικό μέσο άνευ ορού (Lonza, Walkersville, MD, USA)

κηλίδωση Western

καρκινικά κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα κυτταρικής λύσης που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης και εν συντομία σε υπερήχους. Η συνολική πρωτεΐνη αναλύθηκε σε 10-15% δωδεκυλικού νατρίου ηλεκτροφόρηση πηκτής θειικού-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και μεταφέρεται σε ένα Immobilon-FL μεμβράνη πολυβινυλο διφθοριούχου (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 5% άπαχο ξηρό γάλα που περιέχει 0.1 Μ Tris (ρΗ 7,5), 0,9% NaCl και 0.05% Tween-20 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με βιμεντίνη (κλώνος V9, 1 500, Dako, Carpinteria, CA, USA), ΒΜΙ-1 (1 500, Millipore, Billerica, ΜΑ, USA), ακετυλο-ιστόνης Η3 Lys9 (1 1500, Cell Signaling, Danvers , MA, USA) ή ακετυλο-ιστόνης Η4 Lys 5, 8, 12 και 16 (1 2000, EMD Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) πρωτογενή αντισώματα στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με τα κατάλληλα δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα σε υπεροξειδάση (Santa Cruz Biotechnology, Sta. Cruz, CA, USA) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Το σήμα αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας το ECL SuperSignal West Pico υπόστρωμα (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA), και οι πρωτεΐνες έγιναν ορατές με τη χρήση του μηχανήματος UVP (BioSpectrum System Imaging). GAPDH χρησίμευσε ως μάρτυρας φόρτωσης (1:20.000, Calbiochem, Gibbstown, NJ, USA).

FACS της κεφαλής και του τραχήλου CSC

κύτταρα των κυττάρων-όπως το κεφάλι και το στέλεχος του καρκίνου του τραχήλου εντοπίστηκαν από διαλογή κυττάρων για ALDH (αφυδρογονάση αλδεΰδης) δραστηριότητα. Το κιτ Aldefluor (StemCell Technologies, Durham, NC, USA) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή για τον εντοπισμό των κυττάρων με ενζυματική δραστηριότητα υψηλή ALDH. Εν συντομία, HN6 και HN13 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 300 ηΜ Τριχοστατίνη Α (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, ΜΟ, USA) για 24 ώρες και αναρτάται με ενεργοποιημένο υπόστρωμα Aldefluor (ΒΟϋΙΡΥ-αμινοξικού) ή αρνητικό μάρτυρα (diethylaminobenzaldehyde, ένα συγκεκριμένο αναστολέας ΑΙ_ϋΗ) για 45 λεπτά στους 37 ° C. Τα δείγματα αναλύθηκαν στο ταξινόμησης FACSDiVA κυττάρων (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA).

τηλέφωνα εισβολή δοκιμασία

HN6 και τα κύτταρα HN13 (5 × 10

4) ήταν εμβολιάστηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε μία ομοιογενή λεπτή στρώση της φιμπρονεκτίνης (BD Biosciences, Bedford, ΜΑ, USA) σε Millicell Cell Culture Ένθετα (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) που περιείχε πολυανθρακικές μεμβράνες φίλτρων με πόρους μm διαμέτρου 8. Προσδιορίσαμε ότι ο βέλτιστος χρόνος εισβολή των κυττάρων του όγκου HNSCC ήταν 8 ώρες, μετά την σπορά, όπως αποδεικνύεται από το σημαντικό αριθμό των κυττάρων που εισέβαλαν στο κάτω μέρος της μεμβράνης φίλτρου πολυανθρακικό (~60-70% των κυττάρων /συνολικό εμβαδόν) (Σχ. S1). Καρκινικά κύτταρα από την ομάδα ελέγχου διατηρήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% αντιβιοτικά, και η ομάδα αναστολέας HDAC έλαβε 300 nm του Τριχοστατίνη Α (TSA) αραιωμένο σε μέσο. Το κάτω θάλαμος περιείχε DMEM συμπληρωμένο με 20% FBS και 1% αντιβιοτικά. Μετά την επίστρωση, τα κύτταρα επωάστηκαν για 8 ώρες, με βάση την βέλτιστος χρόνος εισβολή (Εικ. S1), στους 37 ° C σε 5% CO2 υγροποιημένο επωαστήρα-. Μεταστατικών κυττάρων στον κατώτερο θάλαμο βάφτηκαν με αιματοξυλίνη και εοσίνη (Η &? Ε). Εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα QImaging ExiAqua μονόχρωμη ψηφιακή φωτογραφική μηχανή που συνδέεται με ένα Nikon Eclipse 80i μικροσκόπιο (Nikon, Melville, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) και εμφανίσθηκε με τη χρήση του λογισμικού QCapturePro.

IF-παραφίνης ενσωμάτωση, γραμμές IF-κυττάρων, και αντισώματα

Ανθρώπινο βιοψίες ασθενών εγκλείστηκαν σε παραφίνη, και 3-μm τομές χρησιμοποιούνται για χρώση ανοσοφθορισμού. Εν συντομία, οι τομές επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα όλη τη νύχτα, πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με ένα δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με φλουορεσκεΐνη είτε (Jackson ImmunoResearch Labs 1: 100) ή ροδαμίνη (Jackson Immuno Research Labs 1: 100). Τα πλακίδια τοποθετήθηκαν με DAPI περιέχουν μέσα στερέωσης (εργαστήρια Vector) και επωάστηκε στους 4 ° C όλη τη νύχτα με βιμεντίνη (κλώνος V9, 1: 500, Dako, Carpinteria, CA, USA) και ΒΜΙ-1 (1:500, Millipore, Billerica , MA, USA) αντισώματα. Για την ανάλυση ανοσοφθορισμού, τα κύτταρα σπάρθηκαν επί γυάλινων καλυπτρίδων και σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη επί 6 λεπτά στους -20 ° C. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TSA (300 ηΜ) ή όχημα για 24 ώρες, όπου ενδείκνυται και χρωματίστηκαν για Κί-67 (1:100, Dako, Carpinteria, CA, USA), Cytokeratin 14 (1:1000, Covance, 155P) και ροδαμίνη -phalloidin (1:150, Κυτταροσκελετός, Denver, CO, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Τα κύτταρα συν-χρώση με Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, ΜΟ, USA) για την απεικόνιση του περιεχομένου DNA. Εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα QImaging ExiAqua μονόχρωμη ψηφιακή φωτογραφική μηχανή που συνδέεται με ένα Nikon Eclipse 80i μικροσκόπιο (Nikon, Melville, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) και οπτικοποιούνται με το λογισμικό QCapturePro.

Σφαίρα δοκιμασία

Για να αξιολογηθεί η ικανότητα κυτταρικών γραμμών όγκου να αναπτύσσονται σε εναιώρημα, όπως σφαίρες, HN6 και κυττάρων HN13 (10

3) καλλιεργήθηκαν σε πλάκες εξαιρετικά χαμηλής προσκόλλησης (Corning? New York, ΝΥ, USA) για 5 ημέρες. Όχημα ή TSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, ΜΟ, USA) προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας σε τελική συγκέντρωση 300 ηΜ και να παρακολουθούνται στενά για 24 ώρες για να προσδιοριστεί η επίδραση της υπερ-ακετυλίωσης για τη διατήρηση της CSC σφαίρες.

Στατιστική ανάλυση

η στατιστική ανάλυση της εισβολής και του ρυθμού πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων αναλύθηκε χρησιμοποιώντας μη ζευγαρωμένο t-test. Σφαίρα ποσοτικοποίηση δοκιμασία σχηματισμού διεξήχθη με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) που ακολουθείται από τις δοκιμές πολλαπλής συγκρίσεως του Tukey και Bonferroni. Αξιολόγηση της κυτταρική μορφολογία και την έκφραση του βιμεντίνης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 4.03 (GraphPad Software, San Diego, CA). Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστική σημαντικότητα (NS, P & gt? 0,05? * P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? Και *** P & lt? 0.001).

Αποτελέσματα και Συζήτηση

χρωματίνης ακετυλίωση και κυτταρική συμπεριφορά των HNSCC

Για να διερευνήσουν το ρόλο της αναδιαμόρφωσης χρωματίνης στη συμπεριφορά HNSCC, εξετάσαμε χρωματίνη ακετυλίωση σε ένα πάνελ κυτταρικών σειρών 6 HNSCC. Μια αυθορμήτως αθανατοποιημένη στοματικό βλεννογόνο κυτταρική γραμμή (ΝΟΚ-SI) χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας [29]. πρωτεΐνες ιστόνης παίξει δομικά και λειτουργικά ρόλους σε όλες τις πυρηνικές διεργασίες και υφίστανται διάφορες τροποποιήσεις [30], συμπεριλαμβανομένων ακετυλίωση, μεθυλίωση, φωσφορυλίωση, ουβικιτινίωση, τροποποίησή της με SUMO, και πολυ-ΑϋΡ-ριβοσυλίωση να ρυθμίζει τη δομή της χρωματίνης και την γονιδιακή έκφραση [31]. Ακετυλίωση ιστόνης Η3, παρατηρείται συνήθως σε Lys9, 14, 18, 23, 27, και 56, παίζει ένα ρόλο στην δραστηριότητα του γονιδίου [32], [33]. Ειδικότερα, λειτουργικά ακετυλίωση της ιστόνης 3 στο Lys 9 έχει μελετηθεί εκτενώς και συνδέεται με την εναπόθεση ιστόνης, χρωματίνη συναρμολόγηση, και την ενεργοποίηση του γονιδίου [34] – [36]. Τα καρκινικά κύτταρα έχουν διαφορετικά επίπεδα ακετυλίωσης ιστόνης 3 στη λυσίνη 9, το οποίο είναι ένας δείκτης του δραστικού γονιδίων [32], [33]. Όλα HNSCC κυτταρικές σειρές αναλύσαμε εμφανίζεται υποακετυλίωση της χρωματίνης σε σύγκριση με τους μάρτυρες NOK-SI (Εικ. 1Α), γεγονός που υποδηλώνει HNSCC έχουν συμπυκνωμένη χρωματίνη υπό βασικές συνθήκες καλλιέργειας. Μειωμένα επίπεδα ακετυλίωσης ιστόνης 3 στη λυσίνη 9 αναφέρθηκαν επίσης σε όγκους από πνεύμονα και του οισοφάγου [37] – [39] και σε 3D καλλιέργειες κυττάρων νευροβλαστώματος και σφαιροειδή όγκου που προέρχονται από κύτταρα μελανώματος [40] – [42]. Μεταβολές στην οργάνωση της χρωματίνης παίζουν ένα ρόλο σε πολλές ανθρώπινες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [43], όπου θεωρούνται ένα πολύτιμο προγνωστικό δείκτη [44].

(Α) ανάλυση κηλίδας Western που δείχνει την παγκόσμια χρωματίνη υποακετυλίωση HNSCC, όπως αποδεικνύεται από χαμηλά επίπεδα έκφρασης του ακετυλ-ιστόνης Η3 Lys9 (Ac.H3) σε σύγκριση με τον έλεγχο της κανονικής του στόματος κερατινοκύτταρα (ΝΟΚ-SI). (Β) Εκπρόσωπος εικόνες και μπαρ γραφική παράσταση των δοκιμασιών εισβολής. HN6 δείχνουν σημαντική επεμβατική ικανότητα σε σύγκριση με HN13 (*** p & lt? 0.001). Η διήθηση προσδιορίστηκε με μέτρηση των κυττάρων HNSCC στο κάτω μέρος της μεμβράνης (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι για λεπτομέρειες) σε πολλαπλά πεδία (20Χ). (Γ) ανάλυση κηλίδας Western που δείχνει υψηλά επίπεδα έκφρασης του ενδογενούς βιμεντίνης, ένα κανονικό δείκτη ΕΜΤ, σε κύτταρα HN6 αλλά όχι σε κύτταρα HN13. (D) Αξιολόγηση της ΑΙ_ϋΗ δείκτη CSC καταδεικνύει ότι HN6 έχουν υψηλό αριθμό ΑΙ_ϋΗ + κυττάρων, αθροίζοντας σε περισσότερο από το 11% του συνολικού πληθυσμού των κυττάρων του όγκου. Περίπου 6% των κυττάρων HN13 είναι ΑΙ_ϋΗ +. (Ε) Αντιπροσωπευτικό παράδειγμα holoclones (βέλος), meroclones (βέλος) και paraclones (αστερίσκος) που σχηματίζονται κατά τη διάρκεια της κλωνογονική δοκιμασία HN6. καρκινικά κύτταρα HN13 σχηματίζουν κυρίως αδιαφοροποίητο holoclones (βέλος). Ποσοτικοποίηση των σφαιρών αποκαλύπτει αυξημένη ικανότητα HN6 κυττάρων να παράγουν σφαίρες σε σύγκριση με HN13 (** p & lt? 0,01).

Η

Εξετάσαμε την επόμενη την επιθετικότητα των κυττάρων HNSCC με χαμηλά επίπεδα ακετυλίωση. καρκινικά κύτταρα HN6, τα οποία είναι ευαίσθητα σε σισπλατίνη (Almeida ΟΑ και Castilho RM, αδημοσίευτα δεδομένα), επέδειξε αυξημένη διεισδυτικότητα (Σχήμα 1Β, *** ρ & lt?. 0.001) και υψηλή έκφραση του ενδογενούς βιμεντίνης, ένα ενδιάμεσο νήμα βρίσκονται συχνά σε επιθετικές κακοήθεις επιθηλιακών όγκων που υφίστανται μετάβαση επιθηλιακά-μεσέγχυμα (ΕΜΤ) [45] – [47] (Εικόνα 1C).. Στη συνέχεια, επιδιώξαμε να χαρακτηρίσει την ύπαρξη ενός υποπληθυσμού CSC που είναι γνωστό ότι ενισχύουν την έναρξη του όγκου, την ανάπτυξη, και μετάσταση [16] – [25] και συνδέονται με την ανάπτυξη του ΕΜΤ [48] – [50]. Παρά το γεγονός ότι αρκετές δείκτες έχουν προταθεί για τον προσδιορισμό του πληθυσμού CSC εντός καρκίνους της κεφαλής και του αυχένα, τα επίπεδα δραστικότητας του ενζύμου αφυδρογονάσης αλδεΰδης (ΑΙ_ϋΗ) θεωρείται ότι είναι ένας εξαιρετικά εκλεκτικός δείκτης για CSC και βλαστικών κυττάρων βιοδείκτης για διάφορα φυσιολογικά και καρκινικά βλαστικά κύτταρα [51] – [54]. Επεμβατική HN6 έχουν μια παρουσίασε υψηλό αριθμό κυττάρων ΑΙ_ϋΗ-θετικό (ΑΙ_ϋΗ +), αθροίζοντας περισσότερα από τα οποία αντιστοιχούσε σε πάνω από το 11% του συνολικού πληθυσμού (Εικ. 1D_HN6). Σε αντίθεση με τα κύτταρα HN6, HN13 κύτταρα δεν εκφράζουν vimentin, έδειξαν μειωμένη εισβολής, και μόνο το 6% του συνολικού πληθυσμού των κυττάρων τους αποτελούνταν από ΑΙ_ϋΗ + κυττάρων ενδιαφέρον, τα καρκινικά κύτταρα HN13 συμπεριφέρονταν διαφορετικά σε σύγκριση με τα κύτταρα HN6 παρουσιάζοντας ένα πληθυσμό 6% των ΑΙ_ϋΗ + κύτταρα, απουσία έκφρασης βιμεντίνη, και μειωμένη ικανότητα επεμβατική (Εικ. 1 Β, C, και D_HN13). Σε μια δοκιμασία κλωνοποίησης, HN6 και HN13 κύτταρα σχηματίζονται 3 διαφορετικά σχέδια σφαίρα, που προσδιορίζονται ως holoclones, meroclones και paraclones, που έχουν άμεση σχέση με την «βλαστική ικανότητα» Μετά, κλωνογονικού προσδιορισμό των κυτταρικών σειρών κεφαλής και του όγκου του λαιμού εμφανίζεται το σχηματισμό 3 διαφορετικά σχέδια σφαίρα συνδέονται άμεσα με την «βλαστική ικανότητα» συμπεριφορά, οι holoclones, meroclones και paraclones [55] – [57]. Οι Holoclones χαρακτηρίζονται από καλά οριοθετημένες άκρες και διαθέτουν το μεγαλύτερο δυναμικό ανάπτυξης, έτσι είναι πιθανό να αποτελείται από αδιαφοροποίητα βλαστικά κύτταρα. Οι Paraclones χαρακτηρίζεται από ταχεία ανάπτυξη, ακόμα, αλλά περιορίζεται κυτταρική βιωσιμότητα. Meroclones βρίσκονται μεταξύ των άλλων δύο μοτίβα σφαίρα και χαρακτηρίζονται από τα δύο προηγούμενα περιγράφεται CSC σφαίρες μοτίβα, παρουσιάζοντας αποικίες με ζαρωμένο περιμέτρους και ενισχυμένη κυτταρική βιωσιμότητα σε σύγκριση με paraclones [55]. Παρατηρήσαμε ότι η επεμβατική τα καρκινικά κύτταρα HN6 δημιουργούνται περισσότερες κλώνους σε σύγκριση με HN13. Αξίζει να σημειωθεί ότι, σφαίρα που σχηματίζουν κύτταρα από HN6 ήταν ένα μείγμα από holoclones (Εικ. 1E_arrow), meroclones (κεφάλι. Εικ 1E_arrow) και paraclones (Εικ. 1E_asterisk). Ωστόσο, HN13 σφαίρες περιέχονται μόνο οι μεγάλες holoclones και δεν meroclones ή paraclones (Εικ. 1E_arrow), γεγονός που υποδηλώνει μια ομοιογενή πληθυσμό της CSC.

Συλλογικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι καρκίνου κεφαλής και τραχήλου κύτταρα να διατηρούν σταθερά υποακετυλιωμένη χρωματίνης παρά την επιθετική τους συμπεριφορά. Η αυξημένη συμπύκνωση χρωματίνης συσχετίζεται με αντίσταση όγκου σε χημειοθεραπείες [11] – [14], πιθανόν να οφείλεται σε διαταράσσεται εισροή μορίων επιδιόρθωσης του DNA στον πυρήνα και μειωμένη απόπτωση [58]. Στην πραγματικότητα, αποσυμπύκνωση της χρωματίνης είναι απαραίτητο για την επιδιόρθωση του DNA [59] – [62], σύμφωνα με την οποία τα μέλη της μηχανής επιδιόρθωσης του DNA παίζει ένα ρόλο στην αναδιοργάνωση χρωματίνη μέσω μεγάλης κλίμακας χρωματίνης ξεδίπλωμα [59], [63]. Η παρουσία του CSC, όπως ανιχνεύεται με ενζυματική δραστηριότητα ΑΙ_ϋΗ, σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές κεφαλής και του τραχήλου είναι ενδιαφέρουσα και αποδεικνύει την ικανότητα των κυττάρων του όγκου να διατηρηθεί μια ετερογενή πληθυσμό. Συγκεκριμένα, βρήκαμε ότι τα επιθετικά καρκινικά κύτταρα που αποτελούνται από έναν ετερογενή πληθυσμό κυττάρων σχηματισμού σφαίρας αποτελείται από holoclones, meroclones, και paraclones και μια συνολική μεγάλο αριθμό σφαιρών (Σχ 1Ε, ** ρ & lt?. 0.01). Το ετερογενές μοτίβο CSC δεν παρατηρήθηκε σε νωχελικός κεφάλι και το λαιμό του όγκου των κυττάρων. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν τη συνύπαρξη των καρκινικών κυττάρων με ποικίλους βαθμούς «βλαστική ικανότητα» που αντιπροσωπεύει τόσο για τον πληθυσμό τους CSC και εισβολής.

μικροπεριβάλλον του όγκου και ο αναστολέας HDAC διαμορφώνει χρωματίνης ακετυλίωση και CSC περιεχόμενο

Μετά μας προηγούμενες παρατηρήσεις ότι τα καρκινικά κύτταρα βρίσκονται υποακετυλιωμένη, αποφασίσαμε να ψάξετε για τα περιβαλλοντικά συνθήματα που θα μπορούσαν να επηρεάσουν τη χρωματίνη ακετυλίωση κατά τη διάρκεια της εισβολής των όγκων. Επιλέξαμε τα πλούσια σε αργινίνη ιστόνες Η3 και Η4 ως δείκτες για χρωματίνη ακετυλίωση με βάση την ικανότητά τους να οργανώσουν DNA εντός νουκλεοσώματα. Ακετυλιωμένων ιστονών Η3 και Η4 απελευθέρωση υπερελικωμένου DNA από νουκλεοσώματα να κάνουν τα γονίδια πιο προσιτή [64]. Επιπλέον, η ακετυλίωση των ιστονών Η3 και Η4 επηρεάζει δομές χρωματίνης υψηλής τάξης και καθιστά θέσεις πρόσδεσης DNA προσιτές σε trans-δρώντες παράγοντες [65], [66]. Εμείς κατεργασμένα κύτταρα όγκου με ρυθμισμένο μέσο (CM) που προέρχεται από ινοβλάστες και ενδοθηλιακά κύτταρα, δύο κύρια συστατικά του μικροπεριβάλλον του όγκου [67] – [69]. Παρά το γεγονός ότι οι ινοβλάστες αντιπροσωπεύουν το μεγαλύτερο κυτταρικό συστατικό του χορίου και των επιμέρους βλεννογόνο, CM από αυτά τα κύτταρα απέτυχαν να επάγουν μεταβολές στην ακετυλίωση των ιστονών Η3 (Ac. Η3) και Η4 (Ac. H4) (Σχ. 2A_Fibroblast CM). Ωστόσο, CM από ενδοθηλιακά κύτταρα είχαν έντονη επίδραση στην οργάνωση της χρωματίνης όγκου (Εικ 2A_Endothelial CM -.. Ac Η3 και Η4 Ac.). Είναι ενδιαφέρον ότι, σε απάντηση CM από ενδοθηλιακά κύτταρα, κύτταρα HN6 εμφάνισε ακετυλιωμένης χρωματίνης και αυξημένη έκφραση του βιμεντίνης, η οποία παρατηρείται κυρίως κατά ΕΜΤ [45] – [47]. ΒΜΙ-1, ένα μέλος του συμπλέγματος Polycomb καταστολέα 1 που εμπλέκεται στην επαναμοντελοποίηση χρωματίνης και εντόνως εκφρασμένο σε καρκινικά κύτταρα [70] – [72], ρυθμίζεται αυξητικά σε HN6 σε απόκριση σε ενδοθηλιακά CM (Σχ 2A_ Endothelial CM_HN6.). Παραδόξως, τα ενδοθηλιακά CM επάγεται χρωματίνη συμπίεση σε κύτταρα HN13 (Σχ. 2A_ Endothelial CM_HN13) με τρόπο παρόμοιο με την τρέχουσα διαδικασία δύο σταδίων της μεταγραφικής καταστολής που προκαλείται από την οικογένεια ομάδα Polycomb γονιδίων (PCG). Αυτή η διαδικασία επηρεάζει αρνητικά την προσβασιμότητα DNA από μεταγραφικά και την αναδιαμόρφωση παράγοντες, με αποτέλεσμα χρωματίνης συμπίεσης (επανεξετάζονται από Sparmann Α,

et al

. [73]). Αποακετυλίωση των κυττάρων HN13 δεν μετέβαλε ΔΜΣ-1 και βιμεντίνη έκφρασης (Εικ. 2_Endothelial CM). Διαφορές μεταξύ της συμπεριφοράς του όγκου και την ανταπόκριση χρωματίνης στις περιβαλλοντικές αλλαγές μπορεί να οφείλονται σε μεταλλάξεις στα μέλη της οικογένειας PCG που προκαλούν την επιθετική συμπεριφορά που παρατηρείται σε όγκους HN6 κύτταρα (Εικ. 1 Β και C).

(Α) ανάλυση κηλίδας Western καταδεικνύει ότι ινοβλαστών-ρυθμισμένο μέσο (FCM-αριστερό πάνελ) δεν διαμορφώνει χρωματίνη ακετυλίωση (Ac. Η3 και Ac. Η4), ΒΜΙ-1 ή βιμεντίνη επίπεδα σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. Ενδοθηλιακά που προέρχονται από ρυθμισμένο μέσο (ECM-δεξιά πάνελ) επηρεάζει ακετυλίωση όγκου όπως απεικονίζεται από αυξημένα Ac. Η3 και Ac. επιπέδων Η4 στα κύτταρα HN6 και κατάλυση του Ac. Η3 και Ac. επιπέδων Η4 στα κύτταρα HN13. Να σημειωθεί ότι μαζί με Ac. Η3 και Ac. Η4, κύτταρα HN6 δείχνουν μικρές αυξήσεις του ΔΜΣ-1 και βιμεντίνης επίπεδα. πολλαπλασιασμό (Β) Tumor αξιολογήθηκε με Ki67 παρουσιάζει μειωμένη πολλαπλασιασμός μετά τη χορήγηση του HDACi TSA (300 ηΜ) για 24 ώρες. (Γ) Η χορήγηση του TSA (300 ηΜ) επί 24 ώρες μειώνει τον συνολικό πληθυσμό της CSC σε HN6 και HN13 κύτταρα, όπως αποδεικνύεται από την παρουσία ΑΙ_ϋΗ + κυττάρων. (D) HDACi (TSA) διαταράσσει holoclones όγκου όπως απεικονίζεται σε αντιπροσωπευτικές εικόνες των σφαιρών του όγκου και με ποσοτικοποίηση των σφαιρών (HN6 ** p & lt? 0,01, HN13 * & lt? P & lt? 0,05).

Η

επόμενη καθοριστεί αν χρωματίνης ακετυλίωση μόνη επιρροές της κεφαλής και του όγκου του λαιμού συμπεριφορά. Χρησιμοποιήσαμε τον αναστολέα HDAC Τριχοστατίνη Α (TSA) για να προκληθεί χημικά χρωματίνη ακετυλίωση. TSA αναστέλλει εκλεκτικά τάξεις HDAC Ι και II, οι οποίες διαθέτουν επιγενετική δραστηριότητα. Πιο πρόσφατα, TSA έχει επίσης δειχθεί ότι αναστέλλει μη ιστόνης μεταγραφικοί παράγοντες και συν-ρυθμιστές, συμπεριλαμβανομένης ρ53, STAT, και ΝΡκΒ [74], [75]. Μετά τον προσδιορισμό της βέλτιστης συγκέντρωσης του TSA (300 ηΜ) ικανή να επάγει κεφαλής και του τραχήλου ακετυλίωση των καρκινικών κυττάρων (Σχ S2.) [76] – [82], βρήκαμε ότι η αναστολή των HDAC απομείωση άμεσα τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HNSCC (Σχήμα 2Β. , HN6 * p & lt? 0,05, HN13 *** p & lt? 0.001). Παρατηρήσαμε επίσης μια αναπάντεχη μείωση στο κλάσμα των CSC κατά την κατεργασία με TSA (Εικ. 2C_TSA), με μία μείωση κατά 7% ΑΙ_ϋΗ + κύτταρα απομονώνονται από HN6 και μια κατά προσέγγιση μείωση 6% σε ΑΙ_ϋΗ + κύτταρα από HN13 (Εικ. 1D_Vehicle). Ως λειτουργική δοκιμασία, αξιολογήσαμε την επίδραση της TSA για την κλωνογόνο σχηματισμό CSC σφαιρών. Χρησιμοποιώντας πλάκες εξαιρετικά χαμηλής πρόσφυσης, καλλιεργήσαμε κύτταρα όγκου σε χαμηλή συμβολή για 5 ημέρες και παρατηρήθηκαν μέχρι σχηματισμό καλώς καθορισμένων σφαίρες. Μετά τον σχηματισμό σφαίρας, TSA χορηγήθηκε, και οι σφαίρες παρακολουθείται στενά. Παραδόξως, η επαγωγή της χρωματίνης ακετυλίωσης οδήγησε σε ταχεία και προοδευτική διαταραχή των σφαιρών (Σχ 2D, HN6 ** ρ & lt?. 0.01, HN13 * ρ & lt? 0,05). Η διακοπή των σφαιρών του όγκου δείχνει ότι χρωματίνης ακετυλίωση που προκαλείται από την αναστολή HDAC διαταράσσει τις φυσιολογικές απαιτήσεις για τη διατήρηση CSC. Πράγματι, χρωματίνη ακετυλίωση έχει από καιρό γνωστό ότι επάγει κυτταρική διαφοροποίηση και περιορίζουν κυτταρικό μετασχηματισμό [83], [84]. Επομένως, οι αναστολείς HDAC (HDACi) μπορεί να είναι μια νέα θεραπευτική στρατηγική για αλλοιώνοντας τα επιβλαβή αποτελέσματα της CSC. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν μια δυναμική διαδικασία κατά την οποία καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα σε περιβάλλον με γνώμονα επιγενετικές μεταβολές, υποστηρίζοντας την ιδέα ότι επιγενετικό στόχευση μπορεί να είναι μια αποτελεσματική και πολύτιμη προσέγγιση για τη χημειοθεραπεία και χημειοπροφύλαξη του καρκίνου [4]. HDAC αναστολείς (HDACi) είναι φάρμακα που στοχεύουν ειδικά ένζυμα που εμπλέκονται στην επιγενετική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης και είναι δυνητικά μια νέα τάξη αντικαρκινικών παραγόντων [4], [5], [7], [12], [85]. Παρά το γεγονός ότι HDACi είναι επιτυχείς στη θεραπεία αιματολογικών κακοηθειών, η χρήση τους σε συμπαγείς όγκους παραμένει αμφιλεγόμενη [86], [87].

Χημικά προκαλούμενη ακετυλίωση της χρωματίνης προωθεί EMT στα κύτταρα HNSCC

Η επίδραση της HDACi για CSC μας ώθησε να προσδιοριστεί αν η χορήγηση του TSA θα αλλοίωναν πρόσθετα χαρακτηριστικά του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου. Οι κακοήθεις όγκοι που προέρχονται από επιθηλιακά κύτταρα (καρκινώματα) υποβάλλονται σε εξαίσια διαδικασία γνωστή ως EMT που προηγείται εισβολή και την εξέλιξη των καρκινικών κυττάρων [46], [88] – [91]. EMT χαρακτηρίζεται από απώλεια της κυτταρικής προσκόλλησης, αυξημένη κινητικότητα, επιθετική συμπεριφορά, και την απόκτηση ενός επιμήκους ινοβλαστοειδή μορφολογία και την έκφραση του βιμεντίνης, ένας κανονικός δείκτης της ΕΜΤ [45] – [47]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, επιθετικά κύτταρα HN6 είχε συστατική έκφραση της βιμεντίνης (Εικ. 1Γ) και κυρίως πλακόστρωτα εμφάνιση (Εικ. 3A_Vehicle_HN6). Η φαρμακολογική αναστολή της HDAC που προκαλούνται στα κύτταρα να μεταβάλλει ταχέως μορφολογία τους σε ένα σχήμα ατράκτου και να αυξηθεί η έκφραση βιμεντίνη (Εικ. 3A_ TSA_HN6). Επιπλέον, η χορήγηση της TSA που προκαλείται από τη μορφολογία της ατράκτου και της έκφρασης vimentin στα κύτταρα HN13 (Εικ. 3A_ TSA_HN13) που συνήθως δεν εκφράζουν αυτό το ενδιάμεσο νήματος (Εικ. 1C_HN13_Vimentin). Δεν παρατηρήσαμε TSA προκαλούμενη μορφολογικές αλλαγές ή έκφραση βιμεντίνη σε φυσιολογικά κύτταρα (Σχ. 3A_NOK-SI), υποδηλώνοντας ότι η υπερακετυλίωση της χρωματίνης διαφορικά ρυθμίζει φυσιολογικά και νεοπλασματικά κύτταρα. Αν και ο συνολικός αριθμός των κυττάρων HN6 εκφράζουν βιμεντίνη αυξήθηκε οριακά μόνο σε απόκριση σε TSA (Εικ 3B_HN6, * ρ & lt?. 0.05), κύτταρα όγκου που εμφανίζουν ινοβλαστοειδή μορφολογία ήταν σε μεγάλο βαθμό θετικά για βιμεντίνη (Σχ 3C_HN6, *** ρ & lt?. 0.001). Ο συνδυασμός της έκφρασης βιμεντίνη και ινοβλαστοειδή μορφολογία παρατηρήθηκε επίσης σε κύτταρα HN13 εξής χρωματίνη ακετυλίωση (Σχ 3Β και C_HN13 *** ρ & lt?. 0.001). Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν έναν ισχυρό ρόλο για την αποσυμπύκνωση της χρωματίνης κατά την απόκτηση ενός φαινοτύπου EMT στα κύτταρα HNSCC.

Η αναστολή της δεακετυλάσης ιστόνης προκαλεί την έκφραση vimentin στα κύτταρα HNSCC και κτήση του σχήματος ατράκτου μορφολογία. (Α) Τα αντιπροσωπευτικά παραδείγματα των μορφολογικές αλλαγές και η έκφραση του κυτοκερατίνης 14 (CK14) δείκτης επιθηλιακών κυττάρων και του δείκτη βιμεντίνη μεσεγχυματικά. Σημειώστε ότι φυσιολογικά κερατινοκύτταρα εκφράζουν CK14 με την παρουσία του οχήματος ή TSA και η μορφολογία των κυττάρων είναι συνεχώς επιθηλιοειδής (καλντερίμια ή δισκοειδή εμφάνιση). Τόσο HN6 και τα κύτταρα HN13 εκφράζουν CK14 και μια επιθηλιοειδή σχήμα (Α, όχημα). Μετά τη θεραπεία TSA, HN6 και HN13 εκφράζουν βιμεντίνης και να γίνει ατρακτοειδή. (Β) Γραφικά αντιπροσωπεύουν το ποσοστό των κυττάρων που είναι θετικά για βιμεντίνη εξής TSA ή θεραπεία οχήματος. TSA που προκαλείται από τα αποτελέσματα ακετυλίωση της χρωματίνης σε αυξημένη έκφραση vimentin στην HN6 και κύτταρα HN13 (* p & lt? 0,05 και *** ρ & lt? 0.001). (C) Γραφικές εκπροσωπούν vimentin έκφραση σε ατράκτου κύτταρα σχήμα (τα καρκινικά κύτταρα με EMT-όπως μορφολογία). HN6 και HN13 κύτταρα εμφανίζουν σημαντικές αυξήσεις στην έκφραση βιμεντίνη μετά την κατεργασία TSA (*** ρ & lt? 0.001).

Η

χρωματίνης υπερακετυλίωση ενισχύει εισβολή και την έκφραση του ΒΜΙ-1 στο κεφάλι και το λαιμό καρκίνων

Ο

ΔΜΣ-1

γονίδιο υπερεκφράζεται σε μία ποικιλία καρκίνων και σχετίζεται με αυξημένη επιθετικότητα του όγκου και των φτωχών ποσοστά επιβίωσης [71], [92] – [97]. Το ογκογόνο δράση του ΒΜΙ-1 κυρίως προκαλείται με καταστολή της ρ16

ΙΝΚ4 ογκοκατασταλτικό γονίδιο, οδηγώντας σε ενεργοποίηση των pRB και p53 σηματοδότηση [98], [99]. Βρήκαμε ότι TSA-αγωγή όγκων έδειξαν αυξημένη έκφραση του ΒΜΙ-1 (Εικ. 4Α) εντοπίζεται στον πυρήνα (Εικ. 4Β), η ανάπτυξη ενός σχήματος ατράκτου φαινότυπο, και πόλωση του F-ακτίνης νημάτια (Εικ. 4Β). Είναι ενδιαφέρον, πόλωση των νημάτων ακτίνης παρατηρήθηκε μόνο σε καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με TSA. Φυσιολογικά ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα δεν μετέβαλε την μορφολογία τους σε απόκριση σε αποσυμπύκνωση της χρωματίνης, υποδηλώνοντας μια επιλεκτική επίδραση των HDACi σε κύτταρα όγκου (Σχ. S3_NOK-SI). Προς τα πάνω ρύθμιση του ΔΜΣ-1 συσχετίστηκε επίσης με αυξημένο εισβολής των HN6 και κυττάρων HN13 (Σχήμα 4C, HN6 * ρ & lt?. 0.05 και HN13 *** p & lt? 0.001). Συλλογικά, βρήκαμε ότι ανεξάρτητα από το αρχικό επεμβατική ικανότητα των HN6 και κυττάρων HN13 (Εικ. 1 Β και C), χημικές προκαλούμενη χρωματίνης ακετυλίωση προκαλείται HNSCC να υποβληθούν EMT (Εικ. 3) και ρυθμίζουν προς τα πάνω ΒΜΙ-1 (Εικ. 4Α και Β ). Παραδόξως, η αναστολή της HDACs απομείωση επίσης τον πληθυσμό CSC (Σχ. 2C). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η ακετυλίωση του HNSCC χρωματίνης παρεμποδίζει άμεσα το υποπληθυσμό ΑΙ_ϋΗ + καρκινικά κύτταρα, επιλέγοντας έτσι για μια ομοιογενή υποπληθυσμό στερείται χαρακτηριστικών πολυδυναμικότητα [16] – [25]. Επιπλέον, η κλινική χρήση HDACi είναι άκρως επιτυχημένη στη θεραπεία αιματολογικών κακοηθειών που συχνά συμπεριφέρονται ως ομοιογενές ασθένειες. Έτσι, επιγενετικών παραγόντων που ρυθμίζουν χρωματίνη ακετυλίωση μπορεί να είναι υπεύθυνη για την ενεργοποίηση αλλαγές στη συμπεριφορά HNSCC εναλλάσσοντας τα καρκινικά κύτταρα μεταξύ ηρεμίας και «βλαστική ικανότητα» στάδιο που αντιστέκεται χημειοθεραπεία σε μια πιο επιθετική και διεισδυτική συμπεριφορά που προωθεί την μετάσταση του όγκου. Αυτός ο μηχανισμός είναι σύμφωνη με την αναδυόμενη μοντέλο ογκογονικότητας κυτταρικών «πλαστικότητα» και μπορεί να αντιπροσωπεύει έναν σημαντικό μηχανισμό που χρησιμοποιείται από HNSCC να αποκτήσουν ταυτόχρονα μια επεμβατική συμπεριφορά και χημειοαντίσταση. Η αρχική χρήση των HDACi μπορεί να παρέχει μια μοριακά ορίζεται παράθυρο ευκαιρίας για τους ασθενείς με καρκίνο κεφαλής και τραχήλου από χημικά αποκόλληση του όγκου «πλαστικότητα» πριν από τη χορήγηση της γενοτοξική χημειοθεραπείας. Ανάλυση

(Α) Western blot απεικονίζει αυξημένη ΔΜΣ -1 έκφραση σε κύτταρα HNSCC μετά από θεραπεία TSA. (Β) Αντιπροσωπευτικές εικόνες των πυρηνικών ΒΜΙ-1 (FITC /πράσινο) και πόλωση των F-ακτίνης νημάτια (TRITC /κόκκινο) σε κύτταρα όγκου που υφίστανται ΕΜΤ μετά τη θεραπεία TSA. (Γ) Τα αντιπροσωπευτικά παραδείγματα της αυξημένης εισβολής καρκινικών κυττάρων μετά τη θεραπεία με αναστολείς HDAC. Σημειώστε τη σημαντική αύξηση της διεισδυτικότητας των HN6 και κυττάρων HN13 (* p & lt? 0,05 και *** ρ & lt? 0.001 αντίστοιχα). (D) Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα της ανθρώπινης δείγματα φυσιολογικού βλεννογόνου του στόματος και HNSCC (Η &? Ε χρώση). Σημείωση ακετυλιωμένη κύτταρα όγκου (Ac. Η3-FITC) ότι συν-εκφράζουν υψηλά επίπεδα βιμεντίνης (TRICT /πράσινο) στο μπροστινό εισβολή HNSCC.