Αφηρημένο

Η θυμοσίνη β

10 (Τρ

10) ρυθμίζει δυναμική ακτίνη ως κυτταρόπλασμα G-ακτίνη πρωτεΐνη απομόνωσης. Προηγουμένως, έχουμε δείξει ότι Τρ

10 μειώνει την ανάπτυξη του όγκου, αγγειογένεση, και ο πολλαπλασιασμός με διάρρηξη της ακτίνης και αναστέλλοντας Ras. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για το μηχανισμό δράσης του και η βιολογική λειτουργία. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε δημιουργήσει ένα νέο μοντέλο γονιδιακής θεραπείας με χρήση γενετικώς τροποποιημένων αδενοϊό, που αναφέρεται ως Ad.TERT.Tβ

10, που μπορεί να υπερεκφράζουν την Τρ

10 γονίδιο σε καρκινικά κύτταρα. Αυτό επιτεύχθηκε με την αντικατάσταση του φυσικού Τρ

10 γονίδιο υποκινητή με τον ανθρώπινο προαγωγό TERT σε Ad.TERT.Tβ

10. Ερευνήσαμε την δραστικότητα καταστολής του καρκίνου του Τρ

10 και βρέθηκε ότι Ad.TERT.Tβ

10 εντυπωσιακά προκληθέντα καρκίνο-ειδική έκφραση της Τρ

10 καθώς και την απόπτωση σε ένα μοντέλο συν-καλλιέργειας των ανθρώπινων πρωτογενή ωοθηκική καρκινικών κυττάρων και φυσιολογικών ινοβλαστών. Επιπλέον, Ad.TERT.Tβ

10 μειώθηκε δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης και την αύξηση της αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) παραγωγή. Αυτά τα αποτελέσματα ενισχύθηκαν με συν-θεραπεία με αντικαρκινικά φάρμακα, όπως η πακλιταξέλη και σισπλατίνη. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι η αύξηση της παραγωγής ROS λόγω ακτίνη διάσπαση από την Τρ

10 υπερέκφραση αυξάνει την απόπτωση των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Πράγματι, ο καρκίνος-ειδική υπερέκφραση του Τρ

10 με Ad.TERT.Tβ

10 θα μπορούσε να είναι ένα πολύτιμο αντικαρκινική θεραπευτική για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών, χωρίς τοξικότητα για τα φυσιολογικά κύτταρα.

Citation : Κιμ YC, Kim BG, Lee JH (2012) θυμοσίνη β

10 Έκφραση Καθοδηγείται από την Ανθρώπινη TERT Διοργανωτή Προκαλεί καρκίνο των ωοθηκών-Ειδικές απόπτωση μέσω ROS παραγωγής. PLoS ONE 7 (5): e35399. doi: 10.1371 /journal.pone.0035399

Επιμέλεια: Yoshiaki Tsuji, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο της Βόρειας Καρολίνα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20 Δεκ 2011? Αποδεκτές: 16 Μάρτη, 2012? Δημοσιεύθηκε: May 18, 2012 |

Copyright: © 2012 Kim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η χρηματοδότηση πηγή είναι η κορεατική κυβέρνηση. Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οι θυμοσίνες αποτελούν μια οικογένεια μικρών πρωτεϊνών που απομονώθηκαν αρχικά από θύμο μόσχου, και χωρίζονται σε τρεις κατηγορίες (α, β και γ) με βάση το ισοηλεκτρικό σημείο τους [1]. Οι β-θυμοσίνες, που έχουν ένα μέσο μοριακό βάρος περίπου 5 kDa, είναι πολύ συντηρημένες όξινες πρωτεΐνες που βρίσκονται σχεδόν σε κάθε ευκαρυωτικό κύτταρο. Οι β-θυμοσίνες αναστέλλουν τον πολυμερισμό αγκαθωτό τέλος ακτίνης μέσω απομόνωσης μονομερή ακτίνης [2], [3]. Ως ένα από τα πιο άφθονα β-θυμοσίνες σε είδη θηλαστικών, θυμοσίνη β

10 (Τρ

10) επηρεάζει τη μετάσταση και πολλαπλασιασμό σε πολλά καρκινικά κύτταρα [4] – [6]. Οι αντικαρκινικές επιδράσεις της Τρ

10 φαίνεται να σχετίζονται στενά με τη λειτουργία του ως ρυθμιστής της δυναμικής ακτίνης σε κύτταρα όγκου [7], [8]. δυναμική ακτίνη μπορεί να διαταράσσεται από την προσθήκη των φαρμάκων ακτίνης σταθεροποιητικό ή την εισαγωγή μεταλλάξεων, προκαλώντας αλλαγές στην κυτταρική αρχιτεκτονική και την εσωτερική κυτταρική κίνηση. Επιπλέον, πρόσφατες αναφορές έχουν δείξει ότι οι αλλαγές στην δυναμική ακτίνη μπορεί να οδηγήσει στην απελευθέρωση δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) από μιτοχόνδρια και μετέπειτα το θάνατο των κυττάρων, υπογραμμίζοντας τη σημασία της διατήρησης της δυναμικής ρύθμισης του κυτταροσκελετού ακτίνης [9] – [14].

Πρόσφατα, τελομεράση έχει αναγνωριστεί ως ένας δείκτης όγκου ευρείας κλίμακας και θεωρείται σήμερα ένας από τους πιο σημαντικούς θεραπευτικοί στόχοι για τη θεραπεία του καρκίνου. Ανθρώπινα τελομεράσης ανάστροφης μεταγραφάσης (hTERT), την καταλυτική υπομονάδα της τελομεράσης, εντοπίζεται σε περίπου 90% των καρκινικών κυττάρων από ιστό του όγκου, αλλά δεν είναι ανιχνεύσιμη σε φυσιολογικούς ιστούς [15] – [17]. Προηγούμενες μελέτες έχουν αποδείξει ότι ο υποκινητής hTERT μπορεί να ρυθμίσει την έκτοπη έκφραση των γονιδίων που ενδιαφέρουν σε τελομεράση θετικά καρκινικά κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι ο υποκινητής είναι ένας hTERT υποσχόμενος υποψήφιος για τη δημιουργία καρκινο-ειδικών αδενοϊούς [18] – [22].

Εδώ, περιγράφουμε ένα ανασυνδυασμένο αδενοϊό, Ad.TERT.Tβ

10, που έχει κατασκευασθεί με εισαγωγή του Τρ

10 γονίδιο υπό τον έλεγχο του υποκινητή του γονιδίου hTERT στο πλασμίδιο αδενοϊού ρ-μεταφοράς να επάγει ογκοειδικό έκφραση Τρ

10 γονίδιο. Ιδρύσαμε επίσης ένα μοντέλο συν-καλλιέργεια των πρωτογενών ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών και φυσιολογικούς ινοβλάστες και στη συνέχεια υφίσταται επεξεργασία αυτή συν-καλλιέργεια με Ad.TERT.Tβ

10 για τη διαλεύκανση των καρκινικών-ειδικές επιδράσεις της Ad.TERT.Tβ

10. Επιπλέον, ερευνήσαμε το μηχανισμό της Τρ

10 επαγόμενη απόπτωση σε 2774 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών που υποβλήθηκαν σε αγωγή με Ad.TERT.Tβ

10. Αυτά τα πειράματα αποκάλυψαν ενδείξεις ότι Ad.TERT.Tβ

10 επάγει ειδική για τον καρκίνο έκφραση Τρ

10, οδηγώντας έτσι σε ειδική για τον καρκίνο της απόπτωσης μέσω της παραγωγής ROS. Μαζί αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι η ειδική για τον καρκίνο υπερέκφραση Τρ

10 με Ad.TERT.Tβ

10 θα μπορούσε πράγματι να είναι ένα πολύτιμο αντικαρκινική θεραπευτική για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών χωρίς τοξικότητα σε φυσιολογικά κύτταρα και πιθανώς άλλες κακοήθειες .

Αποτελέσματα

θυμοσίνη β

10 εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα σε καρκίνο των ωοθηκών

σε προηγούμενη μελέτη μας, ανέφερε ότι Τρ

10 επίπεδα mRNA ήταν αυξημένα σε φυσιολογικές ωοθήκες, σε σύγκριση με άλλους ιστούς, όπως σπλήνα, θύμο, προστάτη, όρχεις, λεπτό έντερο, κόλον, και λευκοκύτταρα περιφερικού αίματος, αλλά τα επίπεδα του mRNA της Τρ

10 μειώθηκαν σε καρκίνους των ωοθηκών [23]. Εμείς, ως εκ τούτου, επιβεβαιώθηκαν τα επίπεδα του mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης της θυμοσίνης β

10 (

10 Τρ) σε ορώδες τύπος καρκίνου των ωοθηκών και του καρκίνου των ωοθηκών βλεννώδες τύπου, καθώς επίσης και στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και αθανατοποιημένες κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών, όπως ως 2774, OVCAR3 και SKOV3. Τα ευρήματά μας ότι το mRNA (Σχήμα 1Α) και πρωτεΐνης (Εικόνα 1Β) τα επίπεδα της Τρ

10 ήταν υψηλά σε φυσιολογικό ιστό των ωοθηκών, αλλά μειώθηκε σε όλες τις υδαρής καρκίνωμα, βλεννώδες καρκίνωμα, και τα αθανατοποιημένα κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών, ήταν σύμφωνα με προηγούμενη μελέτη μας. Ωστόσο, δεν ήταν σε θέση να ανιχνεύσουν μεταβολές στην φυσιολογικό τραχηλικό ιστό, αδενοκαρκινώματα, και καρκινώματα πλακωδών κυττάρων. Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα υψηλά επίπεδα έκφρασης του Τρ

10 είναι χαρακτηριστικές φυσιολογικές ωοθήκες, αλλά τα επίπεδα αυτά μειώνονται σε καρκίνο των ωοθηκών, προτείνοντας ότι Τρ

10 παίζει ένα ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου των ωοθηκών.

(Α) mRNA επίπεδα έκφρασης του Τρ

10 προσδιορίστηκαν με πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας ολικό RNA απομονώθηκε από ανθρώπινο φυσιολογικών και καρκινικών ιστών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου κυτταρικές σειρές των ωοθηκών, όπως ορώδες καρκίνωμα (υδαρής. C) και βλεννώδες καρκίνωμα (βλεννώδες. C), αθανατοποιημένων ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών γραμμών ωοθηκών (2774, OVCAR3, και SKOV3), και αδενοκαρκινώματος (αδενο. C) και καρκινώματα πλακωδών κυττάρων (πλακωδών κυττάρων. C) του τραχήλου της μήτρας. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE για η = 3 ξεχωριστά δείγματα ανά κυτταρικό τύπο ομαδοποίηση και εκφράζεται σε όρους ποσοστού των φυσιολογικών ωοθηκών. Σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων σημειώνεται με έναν αστερίσκο (*), Ρ & lt? 0,05? ένα διπλό αστερίσκο (**), Ρ & lt?. 0.01 (Β) Το επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης Τρ

10 προσδιορίστηκε με ανοσοϊστοχημεία σε φυσιολογικό ωοθηκικό ιστό και συγκρίθηκε με εκείνη σε ορώδες και βλεννώδες τύπους καρκίνου των ωοθηκών, αντίστοιχα

Καρκίνος-ειδική έκφραση της θυμοσίνης β

10 από Ad.TERT.Tβ

10

Για να διαλευκανθεί ο ρόλος της Τρ

10 στον ανθρώπινο καρκίνο των ωοθηκών, ιδρύσαμε ένα νέο φυσιολογικό μοντέλο με συν-καλλιέργεια πρωτογενή ωοθηκική καρκινικά κύτταρα με κανονικούς ινοβλάστες και χρησιμοποιώντας ένα σύστημα απελευθέρωσης γονιδίου ειδικό για καρκίνο που περιλαμβάνει ένα γενετικώς τροποποιημένο αδενοϊό. Κατασκευάσαμε ανασυνδυασμένο αδενοϊό, Ad.TERT.Tβ

10, αντικαθιστώντας το

10 γονίδιο υποκινητή της Τρ με τον υποκινητή hTERT, και επιβεβαίωσε την ακεραιότητα της Ad.TERT.Tβ

10 με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ( PCR) χρησιμοποιώντας Ad-TERT, Τρ

10, και E1a εκκινητές (Σχήμα 2Α). Για να επιβεβαιωθεί το επίπεδο της Τρ έκφρασης

10 γονίδιο, υποβάλλαμε σε αγωγή 2774 κυττάρων με Ad.TERT.Tβ

10 σε μια πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) 10 και στη συνέχεια να παρακολουθούνται οι αλλαγές στην Τρ

10 έκφρασης χρησιμοποιώντας ανοσοκυτταροχημεία (ICC) και RT-PCR. Τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν ότι Ad.TERT.Tβ

10 αυξημένα Τρ

10 έκφραση στο κυτταρόπλασμα (Σχήμα 2Β).

(Α) Σχηματικό διάγραμμα του ανασυνδυασμένου αδενοϊού, Ad.TERT.Tβ

10, που παράγονται με ανασυνδυασμό του pSuttle.TERT.Tβ

10 και τη ραχοκοκαλιά του πλασμιδίου pAdEasy-1 σε BJ5183. Το τροποποιημένο πλασμίδιο pShuttle, που αναφέρεται ως pSuttle.TERT.Tβ

10, κλωνοποιήθηκε με ομαλή εισαγωγή του προαγωγού ανθρώπινης TERT και Τρ

10 γονίδιο για την παραγωγή ενός ανασυνδυασμένου αδενοϊού. Η ακεραιότητα του Ad.TERT.Tβ

10 προσδιορίστηκε με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) χρησιμοποιώντας εκκινητές Ad-TERT, Τρ

10, και E1a. (Β) Υποσυρρέοντα 2774 καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών μολύνθηκαν με 10 ΜΟΙ Ad.TERT.LacZ ή Ad.TERT.Tβ

10. Μετά από 24 ώρες, Τρ

10 πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA προσδιορίστηκαν με ανοσοκυτταροχημεία και RT-PCR, αντίστοιχα. (Γ) Υποσυρρέουσες πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα ινοβλαστών εξετέθησαν σε 10 ΜΟΙ Ad.TERT.LacZ για 7 ημέρες. β-γαλακτοσιδάση επίπεδο έκφρασης προσδιορίζεται με χρώση β-gal (μπλε χρώμα). Βέλος στο κέντρο του σχήματος δείχνει μια κύρια μάζα των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. (D) Υποσυρρέουσες πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα ινοβλαστών εκτέθηκαν επίσης σε 10 ΜΟΙ Ad.TERT.Tβ

10 για 24 ώρες. επίπεδο 10 έκφραση

Τρ προσδιορίστηκε με ανοσοκυτταροχημεία (πράσινο χρώμα). Τα βέλη στο κάτω μέρος του σχήματος δείχνουν πρωτοπαθή καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

Η

αξιολογήθηκε επίσης με τον καρκίνο επιλεκτική επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου με ανασυνδυασμένους αδενοϊούς, Ad.TERT.Tβ

10 και Ad.TERT.LacZ , με το μοντέλο συγκαλλιέργειας μας πρωτογενή ωοθηκική καρκινικών κυττάρων και φυσιολογικών ινοβλαστών. Την ημέρα 7 μετά την αγωγή με 10 ΜΟΙ Ad.TERT.LacZ, παρατηρήσαμε ότι τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών είχε αναπτυχθεί καλά στο στρώμα που σχηματίζεται από τα φυσιολογικά κύτταρα ινοβλαστών όπως παρατηρούνται σε χωρίς θεραπεία ομάδα. Επιπλέον, το Χ-gal θετικά κύτταρα, υποδηλώνοντας έκφραση β-γαλακτοσιδάσης από Ad.TERT.LacZ, ανιχνεύθηκαν μόνο σε πρωτογενή καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών (Εικόνα 2C). Την ημέρα 1 μετά την αγωγή με Ad.TERT.Tβ

10, πράσινο φθορισμό, υποδεικνύοντας την Τρ

10 έκφραση, ανιχνεύθηκε σε πρωτογενή καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα ινοβλαστών (Σχήμα 2D), γεγονός που υποδηλώνει ότι ο προαγωγός TERT προσδίδει έκφραση του γονιδίου του καρκίνου των ωοθηκών ειδικών.

επιπτώσεις της θυμοσίνης β

10 για καρκίνο των ωοθηκών κυττάρων μετανάστευση

Προηγούμενες εκθέσεις έδειξαν ότι οι αντικαρκινικές επιδράσεις της Τρ

10 είναι στενά που σχετίζονται με το ρόλο της στην ρύθμιση δυναμική ακτίνης σε κύτταρα όγκου [7], [8]. Εμείς, εξέτασε επομένως ο ρόλος των Τρ

10 στην μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή. Βρήκαμε ότι τόσο η μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή μειώθηκαν σημαντικά στα κύτταρα 2774 μολύνονται από Ad.TERT.Tβ

10, σε σύγκριση με 2.774 κύτταρα μολυσμένα με Ad.TERT.LacZ και μη μολυσμένα κύτταρα 2774 (Σχήμα 3Α). Σε σχέση με τη μετανάστευση των κυττάρων, κυτταρική κίνηση επίσης εκτιμήθηκε με δοκιμασία επούλωση της πληγής. 2774 κυτταρική κινητικότητα σε μια πλαστική επιφάνεια μειώθηκε σημαντικά από Ad.TERT.Tβ

10 αγωγή (Σχήμα 3Β).

(Α) Υποσυρρέουσες 2774 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών μολύνθηκαν με 10 ΜΟΙ Ad.TERT .LacZ ή Ad.TERT.Tβ

10 για 12 ώρες. Μετά την εκ νέου εναιώρημα, τα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω για 12 ώρες στον ανώτερο θάλαμο μιας πλάκας TRANSWELL® επικαλυμμένη με μία μονοστοιβάδα κολλαγόνου για την δοκιμασία μετανάστευσης ή με διπλό στρώμα του κολλαγόνου και matrigel για τη δοκιμασία εισβολή. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστό του μάρτυρα οχήματος και είναι μέσες ± SE (μπάρες) τριών πειραμάτων. Οι σημαντικές διαφορές από την ομάδα ελέγχου οχήματος που δηλώνεται με αστερίσκο (*), η P & lt? 0,05? ένα διπλό αστερίσκο (**), Ρ & lt? 0.01 (Β) Τα κύτταρα μολυσμένα με ιό επίσης περαιτέρω επωάστηκαν σε 35 mm μ-πιάτων, χαμηλό, με μια καλλιέργεια-Insert (Ibidi) για 12 ώρες, και ακολούθησε παρατήρηση η κατεύθυνση και η ταχύτητα της κυτταρικής μετανάστευσης κατά τη διάρκεια της επούλωσης πληγών. Τα αποτελέσματα επούλωση της πληγής εκφράζεται ως ποσοστό του ελέγχου του οχήματος και είναι μέσες ± SE (μπάρες) τριών πειραμάτων. Οι σημαντικές διαφορές από την ομάδα ελέγχου οχημάτων που συμβολίζεται με ένα διπλό αστερίσκο (**), P & lt?. 0.01

Η

πρόκλησης καρκίνου ειδικά απόπτωση από Ad.TERT.Thymosin β

10

για να εξεταστούν οι επιδράσεις της υπερέκφρασης της Τρ

10 για την βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων, συρρέοντα 2774 καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών μολύνθηκαν με Ad.TERT.LacZ ή Ad.TERT.Tβ

10 σε ΜΟΙ 10 και η ΜΤΤ-βιοδοκιμασία διεξήχθη ημερησίως για 6 ημέρες. Βρήκαμε ότι Τρ

10 μειώθηκε σημαντικά η βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, σε σύγκριση με τους μάρτυρες μέσα με ή χωρίς Ad.TERT.LacZ (Σχήμα 4Α). Στη συνέχεια, για να εξεταστεί αν η μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων οφείλεται σε απόπτωση, εκτελέσαμε ανάλυση FACS για Αννεξίνη V-FITC και διαπίστωσε ότι η υπερέκφραση του Τρ

10 επαγόμενη απόπτωση, αλλά όχι νέκρωση, στο 2774 καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών γραμμή (Εικόνα 4Β). Επιπλέον, την ημέρα 1 μετά την αγωγή του Ad.TERT.Tβ

10 σε συν-καλλιέργεια μοντέλο πρωτογενών ανθρώπινων καρκίνου των ωοθηκών με κανονικές ινοβλάστες, εμείς σαφώς παρατηρείται πυρηνική κατάτμηση (μπλε φθορισμός) μόνο σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών που υπερεκφράζονται Τρ

10 (πράσινο φθορισμό). Επιπλέον, ήμασταν σε θέση να ανιχνεύσουν την πυρηνική κατάτμηση ή την Τρ

10 έκφραση πάνω από τα επίπεδα φόντο την κανονική ινοβλαστών. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ο καρκίνος ειδική υπερέκφραση του Τρ

10, η οποία διευκολύνεται από τον υποκινητή TERT, διεγείρει τον καρκίνο ειδικών πυρηνικών κατακερματισμό ως ένα από τα μορφολογικά χαρακτηριστικά της απόπτωσης (Εικόνα 5Α). Επιπλέον παρατηρήσαμε εντυπωσιακές μορφολογικές αλλαγές των κυττάρων του καρκίνου των ωοθηκών σε επεξεργασία με Ad.TERT.Tβ

10 για πάνω από 90 ώρες με τη χρήση μικροσκοπίου απεικόνιση σε πραγματικό χρόνο. Μετά από 10 ώρες επεξεργασίας με Ad.TERT.Tβ

10, παρατηρήσαμε τυπικά αποπτωτικά μορφολογικές αλλαγές στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών όπως διόγκωση μεμβράνης πλάσματος, η απώλεια των αλληλεπιδράσεων κυττάρου-κυττάρου, κυτταροπλασματική σχηματισμό κενοτοπίων, και συρρίκνωση κυττάρου λόγω της ταχείας αφυδάτωση. Αποπτωτικά κύτταρα σταδιακά εξαφανίστηκαν από τον κυτταρικό θάνατο, ενώ τα φυσιολογικά κύτταρα ινοβλαστών φαινόταν να είναι ανεπηρέαστη από Ad.TERT.Tβ

10 για πάνω από 90 ώρες (Εικόνα 5Β? Movie S1)

(Α) Υποσυρρέουσες 2774 ωοθηκών. καρκινικά κύτταρα διατηρήθηκαν επί 5 ημέρες σε πλήρες μέσο καλλιέργειας που περιέχει Ad.TERT.LacZ ή Ad.TERT.Tβ

10 σε ΜΟΙ 10 ή 100, και το ΜΤΤ-βιοδοκιμασία διεξήχθη ημερησίως. (Β) Την δεύτερη ημέρα μετά ιογενή λοίμωξη, a /(ΡΙ) FACS δοκιμασία αννεξίνης V ιωδιούχου προπιδίου διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Clontech). Αντιπροσωπευτικά διαγράμματα διασποράς που δείχνει την κατανομή των αννεξίνη V- και τα κύτταρα ΡΙ-χρώση. Στην κορυφή πάνελ, το X-άξονα (FL1-Η) δείχνει αννεξίνη V-FITC φθορισμός ανιχνεύθηκε στα 518 nm, και ο Υ-άξονας (FL2-Η) δείχνει ΡΙ φθορισμός ανιχνεύθηκε στα 620 nm. Καθώς το κάτω αριστερά (LL) τεταρτημόριο δείχνει ζωντανά κύτταρα, το επάνω αριστερά (UL) τεταρτημόρια δείχνουν νεκρωτικών κυττάρων, η επάνω δεξιά (UR) quadrats δείχνουν τα τέλη αποπτωτικά κύτταρα, και κάτω δεξιά (LR) τεταρτημόριο δείχνει πρώιμα αποπτωτικά κύτταρα (επάνω πάνελ) , τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστό του συνολικού αριθμού κυττάρων και είναι μέσες ± SE (bars) τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Οι σημαντικές διαφορές από την ομάδα του οχήματος που δηλώνεται με αστερίσκο (*), η P & lt? 0,05? ένα διπλό αστερίσκο (**), P & lt?. 0.01

Η

(Α) Συν-καλλιέργειες υποσυμβάλλουσες πρωτογενή ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών και των ινοβλαστών είχαν εκτεθεί σε 10 ΜΟΙ Ad.TERT.Tβ

10 για 24 ώρες, και στη συνέχεια ανοσοκυτταροχημεία εκτελέστηκε για την παρατήρηση των πυρηνικών μορφολογικές αλλαγές που προκαλούνται από την Τρ

10 έκφρασης. αντίθεση διαφορικής παρεμβολής (DIC) εικόνα συγχωνεύθηκε με 4,6-διαμινο-2-φαινυλινδόλη (DAPI) χρώση (μπλε) και Alexa 488 χρώση (πράσινο) για την αξιολόγηση της πυρηνικής κατακερματισμού από την Τρ

10 έκφρασης. Τα βέλη δείχνουν την πυρηνική θρυμματισμός. (Β) συν-καλλιεργήθηκαν συρρέοντα πρωτογενή ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών και ινοβλάστες εκτέθηκαν σε 10 ΜΟΙ Ad.TERT.Tβ

10 για πάνω από 90 ώρες, και μορφολογικές αλλαγές παρατηρήθηκαν στη συνέχεια χρησιμοποιώντας ένα σύστημα απεικόνισης σε πραγματικό χρόνο. Λευκό βέλη δείχνουν επιλεκτική μορφολογικά χαρακτηριστικά της απόπτωσης, όπως διόγκωση κυττάρου πλάσματος μεμβράνης, κυτταροπλασματική σχηματισμό κενοτοπίων, και συρρίκνωση κυττάρου (μετά από 10 ώρες), ακολουθούμενη από την απώλεια του κυττάρου-προς-κύτταρο αλληλεπιδράσεις (μετά από 15 ώρες). Και μαύρα βέλη εντοπισμού ενός από ινοβλάστες δείχνουν ότι ινοβλάστες είναι ενεργά κινούνται για ακόμη μέχρι 90 ώρες.

Η

Η σχέση μεταξύ θυμοσίνη β

10 και Fas Έκφραση

Για να εξεταστεί αν ωοθηκών καρκίνος ειδική απόπτωση οφείλεται στην έκφραση του γονιδίου απόπτωση προώθηση και την επακόλουθη μεταγωγή σήματος, αξιολογήσαμε έκφραση Fas και κασπάσης ενεργοποίηση 3 χρησιμοποιώντας πρωτογενή καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με τους φυσιολογικούς ινοβλάστες, καθώς και την ωοθηκική καρκινική κυτταρική σειρά 2774. Βρήκαμε ότι Ad.TERT.Tβ

10 επαγόμενη Fas mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε 2774 ωοθηκών καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 6Α). Στην πρωτογενή μοντέλο συν-καλλιέργειας, η έκφραση Fas ανιχνεύθηκε σε πρωτογενή καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, αλλά όχι σε φυσιολογικούς ινοβλάστες. Αυτά τα ευρήματα είναι συνεπή με την ειδική για τον καρκίνο έκφραση Τρ

10 μετά τη μόλυνση με Ad.TERT.Tβ

10 (Σχήμα 6Β). Είναι σημαντικό, Τρ

10 αυξημένη δραστηριότητα της κασπάσης 3, όπως έκανε Cytochalasin D (Cyt D), ένας ισχυρός αναστολέας του πολυμερισμού της ακτίνης. Η αυξημένη δραστηριότητα κασπάσης 3 ανεστάλη επίσης με την προσθήκη του αναστολέα κασπάσης Ζ-VAD-FMK. Επιπλέον, αυτά τα δεδομένα είναι συνεπή με τα αποτελέσματα κυτταρικής βιωσιμότητας που λαμβάνεται από την alarmar Μπλε δοκιμασίας (Σχήμα 6C).

(Α) Υποσυρρέουσες 2774 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών εκτέθηκαν σε Ad.TERT.LacZ ή Ad.TERT. Τρ

10 σε ΜΟΙ 10 για 48 ώρες και ακολούθησε επόμενα πειράματα όπως RT-PCR και κηλίδωση Western για την ανίχνευση FAS (CD95) mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης, αντίστοιχα. (Β) Υποσυρρέουσες πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών συν-καλλιεργήθηκαν με ινοβλάστες εκτέθηκαν επίσης σε 10 ΜΟΙ Ad.TERT.Tβ

10 για 24 ώρες και ακολούθησε ανοσοκυτταροχημεία. Ειδική χρώση του αντισώματος FAS /CD95 (Alexa 488, πράσινο) συγχωνεύτηκε με διαφορική αντίθεση παρέμβασης (DIC) εικόνες και εικόνες πυρηνική χρώση (DAPI, μπλε) με τη χρήση του λογισμικού απεικόνισης. Λευκό και βέλη υποδεικνύουν πορτοκαλί ινοβλάστες και καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, αντίστοιχα. (C) Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε Ad.TERT.LacZ ή Ad.TERT.Tβ

10 σε ΜΟΙ 10 με ή χωρίς αναστολέα κασπάσης (zVAD, 40 μΜ), και αναστολέα πολυμερισμού της ακτίνης (κυτοχαλασίνης D, 1 μg /ml) για 48 ώρες. Οι 2.774 ωοθηκών καρκινικά κύτταρα στη συνέχεια βάφτηκαν σύμφωνα με την εμπορική κασπάσης 3 πρωτόκολλο κιτ δοκιμασίας (Thermo) και απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης Thermo Scientific Cellomics ArrayScan υψηλής περιεκτικότητας διαλογής (HCS). Στο γράφημα ράβδων, οι τιμές που αντιπροσωπεύουν ποσοστό του μάρτυρα οχήματος ακολουθείται από την αναλογία μεταξύ του εμβαδού της κασπάσης 3 ενεργοποίησης και την περιοχή του πυρήνα. Και τα αποτελέσματα είναι μέσος όρος ± SE (μπάρες) τριών διαφορετικών πειραμάτων. Οι σημαντικές διαφορές από την ομάδα των οχημάτων που συμβολίζεται με ένα διπλό αστερίσκο (**), P & lt? 0,01 (αριστερά ραβδόγραμμα). Η κυτταροτοξικότητα υπό τις ίδιες συνθήκες προσδιορίστηκε σε καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών χρησιμοποιώντας το Alamar Blue (ΑΒ) δοκιμασία ως

in vitro

εναλλακτικό μοντέλο. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστό του μάρτυρα οχήματος και είναι μέσες ± SE (μπάρες) τριών πειραμάτων. Οι σημαντικές διαφορές από την ομάδα ελέγχου οχήματος που δηλώνεται με αστερίσκο (*), η P & lt? 0,05? ένα διπλό αστερίσκο (**), P & lt? 0,01 (δεξιά ραβδόγραμμα)

Η

Οι Επιδράσεις της θυμοσίνης β

10 για μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και ROS

Παραγωγής

Προηγούμενες αναφορές έχουν δείξει ότι διακοπή του ακτίνης του κυτταροσκελετού επάγει την εξωκυτταρική παραγωγή των ROS, ιδίως O

2

-, η οποία ενισχύει Fas εξαρτώμενη απόπτωση [13], [24]. Επιπλέον, η μειωμένη δυναμική ακτίνη αιτία αποπόλωση της μιτοχονδριακής μεμβράνης και την αύξηση της παραγωγής ROS, με αποτέλεσμα το θάνατο του κυττάρου [14]. Στο σύνολό τους, υποθέσαμε ότι η αναστολή πολυμερισμού ακτίνης από την Τρ

10 ανοίγει μιτοχονδριακής πόρων της μεμβράνης ή διαύλους για ένα παρατεταμένο χρονικό διάστημα, με αποτέλεσμα τη μείωση της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό (ΜΜΡ) και αύξηση στην απελευθέρωση της ROS στο κυτταρόπλασμα. Συνεπώς, μετρήσαμε την Τρ

10 επαγόμενη αλλαγές στα επίπεδα ΜΜΡ ROS και διαπίστωσε ότι αρχικά υψηλά επίπεδα ΜΜΡ ήταν σημαντικά μειωμένα κατά Τρ

10 υπερέκφραση (Σχήμα 7Α). Επιπλέον, η παραγωγή ROS αυξήθηκε κατά Τρ

10 υπερέκφραση, η οποία είναι συνεπής με το αποτέλεσμα της βιολογικής δοκιμασίας ΜΤΤ.

(Α) Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε Ad.TERT.LacZ (10 ΜΟΙ), Ad. TERT.Tβ

10 (10 ΜΟΙ), και αναστολέα πολυμερισμού της ακτίνης (κυτοχαλασίνης D, 1 μg /ml) για 48 ώρες, και στη συνέχεια ένα δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ) δοκιμασία διεξήχθη. Η δοκιμασία ΜΜΡ εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο κιτ δοκιμασίας ΜΜΡ (Thermo), και τα αποτελέσματα απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας αναγνώστη Thermo Scientific Cellomics ArrayScan υψηλής περιεκτικότητας διαλογής (HCS). (Β) Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε Ad.TERT.LacZ (10 ΜΟΙ), Ad.TERT.Tβ

10 (10 ΜΟΙ) με ή χωρίς αντικαρκινικούς παράγοντες, όπως είναι η πακλιταξέλη (ταξόλη, 5 μg /ml) και cisplatin (πλατίνα, 10 μg /ml), για 48 ώρες. Τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με εκείνα από άλλες θεραπείες, για παράδειγμα, κάθε αντικαρκινικό παράγοντα ή αναστολέα ακτίνης πολυμερισμού (κυτοχαλασίνης D, 1 μg /ml). Τα επίπεδα της ενδοκυτταρικής αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) ανιχνεύθηκαν από ένα σύστημα φθορισμού ELISA με την οξείδωση ευαίσθητο φθορίζοντα ανιχνευτή 2, διοξική 7-διχλωροφθορεσκεϊνης (DCF-DA). Εκτός από τη δοκιμασία ROS, ένας προσδιορισμός ΜΤΤ-bio εκτελέστηκε επίσης υπό τις ίδιες συνθήκες. Τα όλα τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστό του ελέγχου του οχήματος και είναι μέσες ± SE (μπάρες) τριών πειραμάτων. Οι σημαντικές διαφορές από την ομάδα ελέγχου οχήματος που δηλώνεται με αστερίσκο (*), η P & lt? 0,05? ένα διπλό αστερίσκο (**), Ρ & lt?. 0.01

Η

Έχει αναφερθεί ότι τα κυτταρικά επίπεδα ROS αυξάνουν υπό συνθήκες στρες με κατεργασία με αντικαρκινικούς παράγοντες όπως η ταξόλη (πακλιταξέλη) και λευκόχρυσος (σισπλατίνη) . Αυτή η αύξηση ROS οδηγεί στην επαγωγή του προ-αποπτωτικών μορίων, όπως ρ53 και ενεργοποιείται από μιτογόνο κινασών πρωτεΐνης (MAPKs), που οδηγεί σε κυτταρική απόπτωση [25] – [30]. Χρησιμοποιήσαμε Ad.TERT.Tβ

10 ως συν-θεραπεία με δύο κατηγορίες των αντικαρκινικών παραγόντων, και βρήκαν ότι η συν-θεραπεία είχε ως αποτέλεσμα συνεργικά αποτελέσματα, η αύξηση της παραγωγής ROS και μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων (Σχήμα 7Β). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι ωοθηκών απόπτωση του καρκίνου που προκαλείται από την Τρ

10 υπερέκφραση οφείλεται στην παραγωγή ROS ως απάντηση στην μειωμένη ΜΜΡ.

Συζήτηση

Από τα μέλη της οικογένειας β-θυμοσίνη, θυμοσίνη β

4 (Τρ

4), β θυμοσίνη

10 (Τρ

10), και θυμοσίνη

15 (Τρ

15) έχουν μελετηθεί σε καρκινογένεση. Έχουν εμπλακεί σε παγίδευση ακτίνης. Ωστόσο, η λειτουργία των β-θυμοσίνες είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη, και ο ρόλος τους στη νεοπλασματική εξέλιξη της νόσου παραμένει αμφιλεγόμενη.

Η αυξημένη έκφραση του Τρ

4 και την Τρ

10 έχει θεωρηθεί ως χαρακτηριστικό της ανθρώπινη καρκινογένεση. Η υπερέκφραση του Τρ

4 παρουσιάζεται σε μια ευρεία ποικιλία ανθρώπινων καρκινωμάτων. Τρ

4 επηρεάζει την αγγειογένεση και τον καρκίνο μετανάστευση των κυττάρων σε πολλούς τύπους καρκινικών κυττάρων [31] – [34]. Παρομοίως, υπερέκφραση της Τρ

10 έχει αναφερθεί σε πολυάριθμες ανθρώπινα καρκινώματα, περιλαμβανομένων των μελανωμάτων [1], καρκινώματα των νεφρών, του παγκρέατος [35], και το στομάχι [36], καθώς και μυελώδη καρκινώματα του θυρεοειδούς [37].

Παραδόξως, Τρ

4 και την Τρ

10 μπορεί να εμπλέκεται σε εκφυλισμό του καρκίνου, όπως αναφορές έχουν δείξει ότι Τρ

4 έχει όγκου κατασταλτικά αποτελέσματα σε μυελώματος [38], και Τρ

10 απορυθμισμένη σε νεφροκυτταρικό καρκίνωμα [39] και τον καρκίνο των ωοθηκών [40]. Επιπλέον, Τρ

10 ανέστειλαν μετανάστευση κυττάρου και τριχοειδή σαν σχηματισμός σωλήνα της ανθρώπινης στεφανιαίας αρτηρίας ενδοθηλιακών κυττάρων [6]. Τα ευρήματά μας εμπλέκουν επίσης την Τρ

10 στον εκφυλισμό του καρκίνου, καθώς το υψηλό επίπεδο της Τρ

10 μεταγραφές σε κανονική ωοθήκη ήταν αξιόλογα μειωμένη σε καρκίνωμα ωοθήκης. Επιπλέον, έκτοπη έκφραση της Τρ

10 σε κυτταρικές γραμμές καρκινώματος των ωοθηκών, μειωμένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την κίνηση, και η απόπτωση επιταχύνθηκε. Ως εκ τούτου, Τρ

10 υπερέκφραση σε φυσιολογικά κύτταρα ωοθηκών φαίνεται να δρα ως αρνητικός ρυθμιστής της καρκινογένεσης, αν και ο ακριβής μηχανισμός δεν είναι σαφής. Ωστόσο, όπως Τρ

4 επάγεται στον καρκίνο των ωοθηκών [34] και παίζει ένα ρόλο στην απομόνωση ακτίνης όπως Τρ

10, έκτοπη έκφραση της Τρ

10 σε πειραματικό μας σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένη δραστηριότητα των SS- θυμοσίνες και η επακόλουθη διαταραχή της δυναμικής της ακτίνης. Αυτή η έννοια υποστηρίζεται από αναφορές ότι Τρ

4 και Τρ

10 πράξη για την ανάπτυξη των αγγείων με συμπληρωματικό τρόπο in vivo [6] και ότι η ανισορροπία της G-ακτίνης και F-ακτίνης προκαλεί κυτταρικό στρογγυλοποίησης και του θανάτου [41 ]. Έτσι, θεωρείται μια πιθανή στρατηγική για την έρευνα για τον καρκίνο και την γονιδιακή θεραπεία με την Τρ

10. Εμείς, ως εκ τούτου, να κατασκευάζονται ενός ανασυνδυασμένου αδενοϊού, Ad.TERT.Tβ

10, να χρησιμοποιούν για γονιδιακή θεραπεία του ανθρώπου και για τη διαλεύκανση του μηχανισμού Τρ

10 στην πρόληψη του καρκίνου των ωοθηκών.

Τα ανασυνδυασμένα συστήματα αδενοϊού είναι ευέλικτο για μελέτες γονιδιακής έκφρασης και θεραπευτικές εφαρμογές, και πολλοί ερευνητές έχουν χρησιμοποιήσει ανασυνδυαστικούς αδενοϊούς με μεγάλη επιτυχία όλα αυτά τα χρόνια. Ωστόσο, το χαμηλό τους εξειδίκευση είναι ένα μειονέκτημα που περιορίζουν τη χρησιμότητα αυτών των φορέων ως

in vivo

θεραπευτικούς παράγοντες. Φορείς που συνδυάζουν υψηλή μολυσματικότητα με έκφραση καρκινικών κυττάρων ειδικών είναι, ως εκ τούτου, χρειάζεται. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η ανθρώπινη τελομεράσης ανάστροφης μεταγραφάσης (hTERT) εκφράζεται έντονα στους περισσότερους ιστούς όγκων αλλά όχι σε φυσιολογικούς ιστούς. Για παράδειγμα, η δραστηριότητα hTERT προαγωγός είναι υψηλότερη σε ανθρώπου και ποντικού καρκινικά κύτταρα που προέρχονται από τον πνεύμονα, του παχέος εντέρου, του ήπατος, του μαστού, των ωοθηκών, του εγκεφάλου και [42] – [47]. Αντίθετα, έχουν δείξει ότι ο προαγωγός hTERT είναι ανενεργό σε κανονικούς ανθρώπινους ινοβλάστες [42], και κανονικά ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα από την τραχεία [42], του μαστού [47], και των ωοθηκών [45], [48]. Επομένως, εξετάσαμε το ρόλο της Τρ

10 στον καρκίνο των ωοθηκών χρησιμοποιώντας ένα ανασυνδυασμένο αδενοϊό (Ad.TERT.Tβ

10). Ad.TERT.Tβ

10 δομήθηκε με εισαγωγή του

10 γονίδιο Τρ υπό τον έλεγχο του υποκινητή hTERT μέσα στο πλασμίδιο αδενοϊού ρ-μεταφοράς να ληφθεί έκφραση ειδική για τον καρκίνο, και συγκρίθηκε με Ad.TERT .LacZ ως έλεγχος. Σε ένα μοντέλο συν-καλλιέργειας των πρωτογενών ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών και φυσιολογικούς ινοβλάστες, β-γαλακτοσιδάση που κινείται από τον προωθητή hTERT εκφράστηκε σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών μόνο αλλά όχι σε φυσιολογικούς ινοβλάστες. Κυτταροτοξικές και αποπτωτικές μορφολογικές μεταβολές ήταν απούσες από τις κανονικές ινοβλάστες επεξεργασία με 10 ΜΟΙ Ad.TERT.LacZ επί μία περίοδο 7 ημερών, σε αντίθεση με την ωοθηκική ειδική για τον καρκίνο απόπτωση που επάγεται από επεξεργασία των κυττάρων με 10 ΜΟΙ Ad.TERT. Τρ

10 κατά τη διάρκεια μιας περιόδου 10 ωρών. Επιπλέον, βρήκαμε ότι ο καρκίνος-ειδική έκφραση της Τρ

10 από Ad.TERT.Tβ

10 συνοδεύτηκε από την αυξημένη έκφραση του Fas, καταλήγοντας σε ειδική για τον καρκίνο απόπτωση. Ως εκ τούτου, θεωρείται ότι η αντικαρκινική δράση του Ad.TERT.Tβ φάνηκε να σχετίζεται με την υπερέκφραση του Τρ

10

10 παρά μη-ειδική τοξικότητα ιογενή.

Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι ένα υψηλό επίπεδο των ROS έχει θετική επίδραση στην ανάπτυξη του καρκίνου και του πολλαπλασιασμού [49] – [56]. Ωστόσο, βρήκαμε ότι η παγίδευση ακτίνης από υπερέκφραση Τρ

10 οφειλόταν στην μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και ROS ανύψωση, με την οποία να σηματοδοτήσει απόπτωση ενεργοποιήθηκε. Η ιδέα ότι τα καρκινικά κύτταρα είναι ευάλωτα σε επιθέσεις από ROS υποστηρίζεται από τη θεραπευτική χρήση των ευρέως αποδεκτές αντικαρκινικών φαρμάκων όπως είναι η ταξόλη και τη σισπλατίνη. Και τα δύο αυτά φάρμακα αυξάνουν την παραγωγή ROS στο 2774, και της ταυτόχρονης θεραπείας αντικαρκινικών παραγόντων με την Τρ

10 αποτέλεσμα σε μία αθροιστική δράση των ROS ανύψωση και την επακόλουθη επαγωγή της απόπτωσης. Ως εκ τούτου, η μοίρα του καρκινικού κυττάρου φαίνεται να καθορίζεται από την ισορροπία ROS. Ήπια ανύψωση του ROS μπορεί να βοηθήσει την ανάπτυξη του καρκίνου, αλλά η υπερβολική ανύψωση ROS στα καρκινικά κύτταρα κάτω από ορισμένες τάσεις, όπως Τρ

10 υπερέκφραση και τη θεραπεία των αντικαρκινικών φαρμάκων φαίνεται να διεγείρουν αποπτωτικά σήματα.

Εκτός από επαγωγή της απόπτωσης , Τρ

10 υπερέκφραση μειώνεται ισχυρά κινητικότητα στα 2774 ωοθηκών καρκινικά κύτταρα, και αυτό το αποτέλεσμα ήταν ανεξάρτητη από την επαγωγή απόπτωσης. Στα 2774 ωοθηκών καρκινικά κύτταρα, η απόπτωση που επάγεται πολύ αργότερα από ό, τι στην πρωτοβάθμια καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Ad.TERT.Tβ

10 επαγόμενη απόπτωση σε πρωτογενή καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών και αθανατοποιημένες κυτταρικές σειρές καρκίνου όπως 2774, OVCAR3, και SKOV3, εμφανίστηκαν 10- και 48-ώρες αργότερα, αντίστοιχα. Καθώς οι δοκιμασίες της εισβολής και της μετανάστευσης διεξήχθησαν πριν από την παρατήρηση της απόπτωσης, προτείνουμε ότι Τρ

10 υπερέκφραση στον καρκίνο των ωοθηκών μπορεί να έχει ευεργετικά κύτταρο-θανάτωσης επιδράσεις των πρωτογενών κυττάρων όγκου όπως επίσης και μεταστατικών κυττάρων.

τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η αντικαρκινική δράση της Τρ

10 μπορεί να οφείλεται στην παραγωγή ROS. Επιπλέον, Τρ

10 και αντικαρκινικούς παράγοντες, όπως είναι η ταξόλη και σισπλατίνη, είχε μια συνεργιστική επίδραση στον καρκίνο του κυτταρικού θανάτου. Βρήκαμε επίσης ότι η ειδική για τον καρκίνο υπερέκφραση Τρ

10 οδηγείται από τον υποκινητή hTERT οδήγησε σε καρκίνο επιλεκτικό απόπτωση μέσω ενίσχυσης του FAS σηματοδότησης. Αυτή η μελέτη παρέχει ενδείξεις για το μηχανισμό που διέπει τις αντικαρκινικές επιδράσεις του Τρ

10 στην ωοθήκη, η οποία μπορεί να αποδειχθεί χρήσιμη για την ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπειών του καρκίνου των ωοθηκών χωρίς παρενέργειες.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Τα έργα που χρησιμοποιούν ανθρώπινα δείγμα λάβει τη γραπτή συγκατάθεση του ασθενούς και έχει εγκριθεί από την Ένωση κορεατική του Διοικητικού κριτική Θεσμικών (KAIRB).

Γραμμές κυττάρων και κύρια καλλιέργεια κυττάρων

Η ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών 2774 ελήφθη από την American Type Culture Collection (ATCC), και πρωτογενή ανθρώπινα καρκίνου των ωοθηκών και των ινοβλαστών κύτταρα απομονώθηκαν από ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα βαθμού III ενδομητριοειδές (καρκίνος) και συν-καλλιεργήθηκαν επί γυάλινες επιφάνειες. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ? Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS? Upstate Biotechnology, Lake Placid, ΝΥ, USA), και 100 U /ml πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Invitrogen ).

Viral Vectors

Ο ανασυνδυασμένος αδενοϊός, «Ad.TERT.Tβ

10″, δομήθηκε σύμφωνα με την τυπική διαδικασία που χρησιμοποιείται στην ™ αδενοϊό Vector System AdEasy (Stratagene, La Jolla, CA, USA).