Αφηρημένο

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) είναι υπεύθυνοι για την εξέλιξη του καρκίνου, μετάσταση, και την επανάληψη. Μέχρι σήμερα, οι ειδικοί δείκτες των ΚΕΠ παραμένει ανεξερεύνητο. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει νέων βιολογικών δεικτών του γαστρικού ΚΕΠ για την κλινική διάγνωση με τη χρήση της τεχνολογίας πρωτεομικής. CSC-όπως τα κύτταρα SP, κύτταρα OCUM-12 /SP, κύτταρα OCUM-2MD3 /SP, και η μητρική OCUM-12 κύτταρα και κύτταρα OCUM-2MD3 χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. προϊόντα λύσης πρωτεΐνης από κάθε κυτταρική σειρά αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας QSTAR Elite Υγρή Χρωματογραφία με Tandem Φασματομετρίας Μάζας, σε συνδυασμό με ισοβαρικών ετικετών για σχετική και η απόλυτη τεχνολογία ποσοτικοποίηση. Υποψήφιες πρωτεΐνες ανιχνεύονται με τεχνολογία πρωτεομικής επικυρώθηκαν με ανοσοϊστοχημική ανάλυση 300 γαστρικών καρκίνων. Με βάση τα αποτελέσματα της LC-MS /MS, οκτώ πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA και KRT18, ήταν επάνω-ρυθμίζονται σε δύο OCUM-12 κύτταρα /SP και OCUM-2MD3 /SP κύτταρα σε σύγκριση με τα αντίστοιχα γονικά κύτταρα τους. RT-PCR ανάλυση έδειξε ότι το επίπεδο έκφρασης του

RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1

, και

CK18

ήταν υψηλή σε OCUM-12 /SP και OCUM-2MD3 /SP, σε σύγκριση με τον έλεγχο της μητρικής OCUM-12 και OCUM-2MD3. Αυτές οι πρωτεΐνες σχετίζονταν σημαντικά με προχωρημένο βάθος εισβολή, λεμφικό μετάσταση στους λεμφαδένες, μακρινή μετάσταση, ή προχωρημένο κλινικό στάδιο. έκφραση RBBP6, DCTPP1, HSPA4, και ALDOA ιδιαίτερα σημαντικά σχετίζεται με κακή πρόγνωση σε ασθενείς 300 γαστρικό καρκίνο. RBBP6 προσδιορίστηκε να είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας. Η δυνατότητα κινητικότητας-τόνωση της OCUM-12 κύτταρα /SP και κύτταρα /SP OCUM-2MD3 ανεστάλη από

RBBP6

siRNA. Τα ευρήματα αυτά θα μπορούσαν να υποδηλώνουν ότι οι οκτώ πρωτεΐνες, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA και KRT18, χρησιμοποιώντας συγκριτική ανάλυση πρωτεομική, θεωρήθηκαν ότι είναι πιθανοί δείκτες CSC του καρκίνου του στομάχου. Από τις οκτώ υποψήφιες πρωτεΐνες, RBBP6 προτάθηκε να είναι μια πολλά υποσχόμενη προγνωστικό βιοδείκτη και ένα θεραπευτικό στόχο για καρκίνο του στομάχου

Παράθεση:. Morisaki T, Yashiro M, Kakehashi Α, Ιναγάκι Α, Kinoshita Η, Φουκουόκα T, et al. (2014) Συγκριτική Ανάλυση Πρωτεομική του γαστρικού καρκίνου βλαστικών κυττάρων. PLoS ONE 9 (11): e110736. doi: 10.1371 /journal.pone.0110736

Επιμέλεια: Anita Β Hjelmeland, Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 Μαΐου 2014? Αποδεκτές: 16 Σεπ, 2014? Δημοσιεύθηκε: 7, Νοεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Morisaki et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και. Οι αριθμοί πρόσβασης για τα δεδομένα της πρωτεΐνης περιλαμβάνονται ως UniProt /Swiss-Prot στον Πίνακα 2.

Χρηματοδότηση: Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από KAKENHI (Grant-in-Ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα, Νο 22390262, 23390329 και 26293307. ), από το Εθνικό Κέντρο Καρκίνου του Ταμείου Έρευνας και Ανάπτυξης (23-Α-9), και με την προτεραιότητα του Ταμείου Έρευνας της Osaka City University. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή οι

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) ορίζεται ως ένα μοναδικό υποπληθυσμό σε όγκους που έχουν την ικανότητα να κινήσει την ανάπτυξη του όγκου και να διατηρηθεί αυτο-ανανέωση [1]. Έχει προταθεί ότι μπορεί να προκαλέσει την ετερογενή γενεαλογία των καρκινικών κυττάρων που αποτελούν τον όγκο όσο και παίζουν σημαντικό ρόλο στην κακοήθη εξέλιξη του καρκινώματος, όπως μακρινή μετάσταση, επανάληψη, και χημειοαντίσταση [2] – [4]. ΚΕΠ αρχικά προσδιορίζονται στην οξεία μυελοειδή λευχαιμία [5], αλλά έχουν πρόσφατα αναφερθεί ότι υπάρχουν σε μια ευρεία ποικιλία καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του στομάχου [6]. Ο προσδιορισμός των δεικτών CSC μπορεί να ανοίξει μια νέα θεραπευτική προοπτική με βάση την επιλεκτική στόχευση αυτού του μικρού πληθυσμού των κυττάρων [7], [8]. Πρόσφατα, έχει αναφερθεί ότι η ΚΕΠ πιθανώς εκφράζουν τις δικές τους μοναδικές δείκτες, όπως αφυδρογονάση αλδεΰδης 1 (ΑΙ_ϋΗ1) [9], CD44 [10], [11], και CD133 [12]. Ωστόσο, πολλές από τις δημοσιευμένες δείκτες δεν είναι μοναδικά για ΚΕΠ. Ποσοτική προφίλ έκφρασης πρωτεΐνης επιτρέπει την αποτελεσματική ταυτοποίηση ακριβή και αναπαραγώγιμη διαφορικές τιμές έκφρασης για πρωτεΐνες [13]. Ισοβαρή ετικέτες για τη σχετική και απόλυτη ποσοτικοποίηση (iTRAQ) σε συνδυασμό με την πολυδιάστατη υγρή χρωματογραφία (LC) και διαδοχική φασματομετρία μάζας (LC-MS /MS) ανάλυση αναδύεται ως μια ισχυρή μεθοδολογία για την αναζήτηση βιολογικών δεικτών όγκου [14]. Αναφέραμε προηγουμένως ότι τα κύτταρα πλευρά του πληθυσμού (SP) είναι σε θέση να αυτο-ανανέωση και παράγουν κύτταρα μη-SP, και ότι τα καρκινικά κύτταρα σε κλάσματα SP έχουν υψηλή πιθανότητα καρκινογένεσης, μακρινή μετάσταση [3], και χημειοαντίσταση [2]. Αυτό υποδηλώνει ότι SP κύτταρα του γαστρικού καρκίνου έχουν ιδιότητες βλαστικών κυττάρων του καρκίνου-όπως. Ως εκ τούτου, ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να ανιχνεύσει ένα νέο δείκτη (ες) CSC του γαστρικού καρκίνου με τη σύγκριση των των πρωτεϊνών μεταξύ μητρικής κυττάρων και βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με κύτταρα SP που είναι γνωστό ότι έχουν μια πλούσια πληθυσμός CSC [15].

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιεργειών

Δύο κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου, OCUM-2MD3 [16] και OCUM-12 [17], χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές προήλθαν από διάχυτου τύπου γαστρικό καρκίνο. Η συνθήκη καλλιέργειας καλλιεργήθηκε σε τροποποιημένο μέσο Eagle Dulbecco (DMEM? Nikken, Kyoto, Japan) με 10% ορό εμβρύου θερμο-απενεργοποιημένο ορό (FCS? Ϋίβ Technologies, Grand Island, ΝΥ), πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη, και 0,5 mM πυροσταφυλικό νάτριο, και επωάστηκαν στους 37 ° C. OCUM-12 /SP και OCUM-2MD3 κυτταρικές γραμμές /SP ήταν κύτταρα SP που αξιολογήθηκαν από μια ανάλυση κυτταρομετρίας ροής χρησιμοποιώντας Hoechst 33342 από κυτταρικές γραμμές γονέα τους, OCUM-2MD3 και OCUM-12, αντίστοιχα. Διαλογή διεξήχθη τρεις φορές για τη δημιουργία ενός σταθερού πληθυσμού κυττάρων SP-εμπλουτίζεται. Μετά από μια τρίμηνη περίοδο επώασης μετά την διαλογή, OCUM-12 /κυττάρων SP (6,5%) και τα κύτταρα /SP OCUM-2MD3 (12,2%) εξακολουθεί να εκπροσωπείται ένα υψηλό ποσοστό του κλάσματος SP, σε σύγκριση με το μητρικό OCUM-12 (3,2% ) και OCUM-2MD3 (6,3%) κύτταρα (Σχήμα S1). Στη συνέχεια, αυτά τα SP-εμπλουτισμένα κύτταρα με ένα σταθερό πληθυσμό ήταν οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [18].

Ανθρώπινα δείγματα ιστών και Πληροφορίες ασθενούς

δείγματα ιστού ελήφθησαν από 300 ασθενείς που διαγνώστηκαν με καρκίνο του στομάχου επιτρεπόμενες λειτουργίες σε Osaka City University. Ο Πίνακας 1 δείχνει τις κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά των ασθενών 300 γαστρικό καρκίνο. Υπήρχαν 208 άνδρες και 92 γυναίκες ασθενείς, με τη μέση ηλικία 64 ετών (εύρος, 28-85 ετών) κατά το χρόνο λειτουργίας. Οι διαγνώσεις επιβεβαιώθηκαν με τουλάχιστον δύο άτομα. Σταδιοποίηση προσδιορίστηκε σύμφωνα με την ιαπωνική ταξινόμηση του γαστρικού καρκινώματος (14

η έκδοση) [19]. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από το City University επιτροπή δεοντολογίας Οσάκα (Osaka, Japan). Γραπτή συγκατάθεση από τον δότη λήφθηκε για τη χρήση αυτού του δείγματος της έρευνας.

Η

Πρωτεΐνη ταυτοποίησης και ποσοτικοποίησης από QSTAR Elite LC-MS /MS

Τα καρκινικά κύτταρα (60 μg κάθε ) ομογενοποιήθηκαν και στη συνέχεια υποβάλλονται σε λύση με τη χρήση είτε 100 μL του Τ-PER ρυθμιστικού λύσης (Thermo Scientific) ή 500 μΙ 9 Μ ουρία, και 2% ρυθμιστικό διάλυμα λύσης CHAPS με έναν αναστολέα πρωτεάσης. Στη συνέχεια, το προϊόν λύσης κυττάρου στη συνέχεια υπέστη επεξεργασία με υπερήχους. Μετά την καταβύθιση ακετόνης, οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης μετρήθηκαν με BCA Protein Assay (Pierce, IL, USA). Αναγωγή, αλκυλίωση, την πέψη και την επακόλουθη επισήμανση πεπτιδίου των 50 μg πρωτεΐνης για κάθε δείγμα πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση της ΑΒ Sciex iTRAQ Αντιδραστήριο Multi-Plex Κιτ (ΑΒ Sciex, Concord, ΟΝ, Canada) [20]. Οι iTRAQ-σημασμένα δείγματα φορτώθηκαν σε ένα φυσίγγιο ICAT ανταλλαγής κατιόντων (ΑΒ Sciex). Τα πεπτίδια εκλούστηκαν ως έξι κλάσματα (1 mL KCL διάλυμα 10, 50, 70, 100, 200, και 350 mM), και το υπερκείμενο του κάθε εξατμίστηκε σε ένα φυγόκεντρο κενού. Τα δείγματα στη συνέχεια αφαλατώνεται και συμπυκνώνεται με χρήση κασετών Sep-Pak Light C18 (Waters Corporation, Milford, ΜΑ), εξατμίστηκαν σε μια φυγόκεντρο κενού, επαναιωρήθηκε σε 20 μΐ 0,1% (ν /ν) μυρμηκικό οξύ, και ακολούθως εφαρμόστηκε επί QSTAR Elite LC -MS /MS. Κάθε δείγμα τρέξει για 150 λεπτά. δεδομένων MS /MS αναζητήθηκε έναντι του ελβετικού βάση δεδομένων Protein (ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ) χρησιμοποιώντας το λογισμικό ProteinPilot (έκδοση 2.0, AB Sciex) με θρυψίνη οριστεί ως το ένζυμο πέψη και μεθυλο methanethiosulfinate ως τροποποίηση κυστεΐνη. Για να καταργήσετε τα περιττά χτυπήματα και συγκριτική ποσοτικοποίηση, τα αποτελέσματα αναζήτησης που ελήφθησαν περαιτέρω επεξεργασία από το λογισμικό ProteinPilot χρησιμοποιώντας το Paragon αλγόριθμο. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα το ελάχιστο σύνολο δικαιολογημένη προσδιορίζονται πρωτεϊνών. Όλα τα αναφερόμενα στοιχεία χρησιμοποιήθηκαν με ένα cut-off όριο εμπιστοσύνης 95%. Σχετική ποσοτικοποίηση των πεπτιδίων υπολογίστηκε ως λόγος με τη διαίρεση της έντασης ρεπόρτερ iTRAQ. Οι αναλογίες των πεπτιδίων που υποστηρίζουν την ύπαρξη μίας πρωτεΐνης ελήφθη ο μέσος όρος για τη σχετική πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν η ανάλυση ανάλυση ProteinPilot και την εφευρετικότητα οδού (IPA) (Ingenuity Σύστημα, Mountain View, CA). Μετά την εκτέλεση ενός απλού t-test σε έναν από τους υπολογίζεται κατά μέσο όρο αναλογίες πρωτεΐνης έναντι 1 να αξιολογήσει την εγκυρότητα των αλλαγών πρωτεϊνικής έκφρασης, μια τιμή p αναφέρθηκε. αναλογίες πρωτεΐνη με τιμή p μικρότερη του 0,05 θεωρήθηκαν αξιόπιστα. Θα πρέπει να είναι γνωστό ότι στο 90% των πειραματικών δοκιμών iTRAQ γίνει προηγουμένως, οι τυπικές αποκλίσεις των αναλογιών πρωτεϊνών, οι οποίες απορρέουν από την τεχνική παραλλαγές, έχουν αναφερθεί να είναι μικρότερη από 0,3. Ως εκ τούτου, η έκφραση αλλάζει μεγαλύτερη από 1,2 φορές ή μικρότερη από 0,8 φορές την εξομάλυνση των επιπέδων έκφρασης θεωρείται ότι είναι εκτός του εύρους των τεχνικών μεταβλητότητας. Πραγματοποιήσαμε επίσης ένα μη-επισημασμένο ανάλυση, και ανιχνεύεται η παρουσία των πρωτεϊνών μόνο εντός OCUM-12 κύτταρα /SP και κύτταρα /SP OCUM-2MD3, αλλά όχι εντός πατρικά κύτταρα [21]. Κάθε δείγμα τρέξει δύο φορές. Η εφαρμοζόμενη LC-MS /MS εξέταση σε συνδυασμό με την τεχνολογία iTRAQ έχουν αναφερθεί ως μια αξιόπιστη ποσοτική μέθοδο για την έκφραση της πρωτεΐνης, που είναι ακόμη πιο ευαίσθητη από τη κηλίδα western που εξαρτάται από τον τύπο της εφαρμοζόμενης αντισωμάτων [22].

IPA και επιλογή των υποψήφιων πρωτεΐνες

Η βάση δεδομένων IPA χρησιμοποιείται κυρίως στον τομέα των ιδιόκτητων οντολογίας, που περιέχουν μέχρι 300.000 βιολογικά είδη συμπεριλαμβανομένων των γονιδίων, πρωτεϊνών, μοριακών και κυτταρικών διαδικασιών. Ως εκ τούτου, ΙΡΑ χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των πρωτεϊνών μοριακού λειτουργίες, εντοπισμού. Επιπλέον, ελήφθησαν λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με τις λειτουργίες και τον κυτταρικό θέσεις των αναγνωρισμένων πρωτεϊνών. Με βάση τα αποτελέσματα της LC MS /MS και ΙΡΑ αναλύσεις, πρωτεΐνες που παρατηρήθηκαν να είναι υπερ-εκφράζεται σε κυτταρικές σειρές SP, όταν συγκρίνεται με τους αντίστοιχους συχνότητα της έκφρασης σε κυτταρικές γραμμές γονέα, επιλέχθηκαν ως υποψήφια βιοδείκτες για τα κύτταρα SP του καρκίνου του στομάχου. Η ταυτοποίηση των δικτύων πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν, καθώς και λειτουργικές ομάδες και πορείες παρήχθη με ΙΡΑ, και η ανάλυση εξαρτάται από τις προηγουμένως χαρακτηριζόμενη ενώσεων.

ποσοτική πραγματικού χρόνου Reverse Transcription-αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR )

Η γαστρική καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν. Και το ολικό κυτταρικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Carlsbad, CA). cDNA παρασκευάστηκε από 2 μg RNA χρησιμοποιώντας τυχαίους εκκινητές (Invitrogen). Για τον προσδιορισμό φορές αλλαγών σε κάθε γονίδιο, RT-PCR πραγματοποιήθηκε στο ΑΒΙ Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA), με δοκιμασίες έκφρασης εμπορικώς διαθέσιμα γονιδίου (Applied Biosystems) για

RBBP6

(

ρετινοβλάστωμα δεσμευτική πρωτεΐνη 6

? Hs00544663),

HSPA4

(

θερμικού σοκ 70kDa πρωτεΐνη 4

? Hs00382884),

HSPA9

(

θερμικού σοκ 70 kDa πρωτεΐνη 9

? Hs00269818),

GLG1

(Golgi γλυκοπρωτεΐνη 1? Hs00939452),

DCTPP1

(

dCTP πυροφωσφατάση 1

? Hs00225433),

VPS13A

(

πρωτεΐνη κενοτοπικής διαλογής 13 ομόλογο Α

? Hs00362891),

CK18 (κερατίνη 18

? Hs028277483),

ALDOA (αλδολάσης Α

? Hs00605108),

CD44

(Hs01075862),

CD133

(Hs01009250) και

Nanog

(Hs02387400). GAPDH (SIGMA) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο για την ομαλοποίηση των επιπέδων mRNA. Οι κύκλος κατωφλίου (Ct) τιμές χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό των σχετικών αναλογιών έκφραση μεταξύ ελέγχου και επεξεργασμένα κύτταρα.

Western ανάλυση κηλίδος

επίπεδο έκφρασης του RBBP6 και ALDOA σε καρκινικά κύτταρα εξετάσθηκε ως ακολούθως. Κυτταρολύματα συλλέχθηκαν μετά από διαφορετικές επεξεργασίες. Αφού η συγκέντρωση πρωτεΐνης κάθε δείγματος ρυθμίστηκε, διεξήχθη ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιώντας 10% πηκτώματα Τπδ /Gly (Life Technologies, Carlsbad, CA). Οι ζώνες πρωτεΐνης που λαμβάνεται μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη Immobilon-P Transfer (Amersham, Aylesbury, UK). Στη συνέχεια, η μεμβράνη τοποθετήθηκε σε διάλυμα PBS-T που περιέχει αντι-RBBP6 (WH0005930M1, Sigma-Aldrich, ΜΟ, USA), αντι-ALDOA (HPA004177, ATLAS), και αντι-β-ακτίνης (αραίωση 1:300? Sigma- Aldrich), και αφέθηκε να αντιδράσει σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Τα επίπεδα των ειδικών πρωτεϊνών σε κάθε προϊόν λύσης ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια χρησιμοποιώντας ECL plus (Amersham) που ακολουθήθηκε από αυτοραδιογραφία.

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA Σχεδιασμός

Οι αλληλουχίες για

RBBP6

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) είναι σχεδιασμένα ως εξής: SI

RBBP6

sense, 5′-GAAAGAAGAAUAUACUGAUtt-3 ‘? αντινόημα, 5’- AUCAGUAUAUUCUUCUUUCgt-3 ‘, και nontargeting siRNA (αρνητικός-siRNA) αγοράστηκε από την Ambion (Life Technologies, Carlsbad, CA) .OCUM-12 /SP και κύτταρα /SP OCUM-2MD3 παρασκευάστηκαν σε 60% συρροή σε πιάτα έξι φρεατίων. Το μείγμα επιμόλυνσης παρασκευάστηκε με την προσθήκη 150 μL Ορίί-ΜΕΜ συμπεριλαμβανομένων 9 μί Λιποφεκταμίνης RNA Imax Regant (ϋίβ Technologies) και 150 μL του Opti-ΜΕΜ συμπεριλαμβανομένων 90 pmol του siRNA και επώαση για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, το παραπάνω μίγμα διαμόλυνσης προστέθηκε σε έτοιμο πιάτο έξι φρεατίων. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, RT-PCR πραγματοποιήθηκε.

Δοκιμασία

Τα καρκινικά κύτταρα επούλωση πληγών καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 96 φρεατίων (Essen Instruments, Birmingham, UK). Αφού τα κύτταρα έφθασαν ημι-συρροή, μια πληγή δημιουργήθηκε κυτταρικής μονοστιβάδας με το 96 φρεατίων με WoundMaker (Essen Bioscience, ΜΙ, USA). Γδαρμένο πεδία ελήφθησαν απεικονίζεται κάθε 3 ώρες και παρακολουθήθηκε με το σύστημα Incucyte Ζωντανή-Cell απεικόνισης και λογισμικού (Έσσεν Instruments). Ο βαθμός της κυτταρικής μεταναστεύσεων αναλύθηκε 24 ώρες μετά τη θεραπεία πληγών ως ποσοστό της συμβολής του τραύματος. Η μέση τιμή των 4 πεδίων υπολογίστηκε ως η τιμή του δείγματος.

Εισβολή Δοκιμασία

Χρησιμοποιήσαμε τους θαλάμους chemotaxicell (Kubota, Osaka, Japan) με ένα φίλτρο μεμβράνης πόρων 12 μm επικαλυμμένο με 50- μg Matrigel (Collaborative Research Co., Bedford, μΑ). Ο θάλαμος (άνω συστατικό) τοποθετήθηκε σε μια πλάκα καλλιέργειας 24 φρεατίων (κατώτερο συστατικό). Γαστρικό καρκινικά κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μία τελική συγκέντρωση 5 × 10

3 κύτταρα /mL. Στη συνέχεια, 500 μλ κάτω συστατικά. Μετά από επώαση για 48 ώρες, τα καρκινικά κύτταρα επί της άνω επιφάνειας της μεμβράνης απομακρύνθηκαν με σκούπισμα και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη. Τα καρκινικά κύτταρα που εισέβαλαν μέσω ενός φίλτρου επικαλυμμένο με Matrigel στο κατώτερο μεμβράνης με το χέρι μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο σε μεγέθυνση × 200. Έξι τυχαία επιλεγμένα πεδία μετρήθηκαν για κάθε δοκιμασία. Η μέση τιμή τεσσάρων πεδίων υπολογίστηκε ως η τιμή του δείγματος. Για κάθε ομάδα, η καλλιέργεια έγινε εις τριπλούν.

Επικύρωση της πρωτεϊνικής έκφρασης με ανοσοϊστοχημεία

Η ανοσοϊστοχημεία πραγματοποιήθηκε σε δείγματα ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη σταθεροποιημένα με φορμαλίνη που αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο και αφυδατώθηκαν μέσω διαβαθμισμένη αιθανόλη. Οι τομές θερμάνθηκαν για 10 λεπτά στους 105 ° C με αυτόκλειστο Target Ανάκτηση Solution (ϋΑΚΟ). Τα δείγματα στη συνέχεια επωάστηκαν με 3% υπεροξείδιο υδρογόνου για να εμποδίσει την ενδογενή δραστηριότητα υπεροξειδάσης. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν στην ανοσοϊστοχημική μέθοδο: anti-RBBP6 (ρετινοβλάστωμα δέσμευσης πρωτεΐνης 6? WH0005930M1, 6:1000? Sigma-Aldrich), αντι-GLG1 (Golgi γλυκοπρωτεΐνης 1? HPA010815, 1:80? ATLAS), αντι-VPS13A (κενοτοπικής πρωτεΐνη διαλογής 13 ομόλογο Α? NBP1-85642, 1:500? Novus Biologicals), αντι-ALDOA (αλδολάσης Α, φρουκτόζη-διφωσφορικής? HPA004177, 1:400? ATLAS), αντι-DCTPP1 (dCTP πυροφωσφατάση 1? HPA002832, 1:200? ATLAS), αντι-HSPA9 (θερμικού σοκ 70 kDa πρωτεΐνη 9? HPA000898, 1:200? ATLAS), αντι-HSPA4 (θερμικού σοκ 70kDa πρωτεΐνη 4? HPA010023, 1:200? ATLAS), και αντι-KRT18 (κερατίνη 18? ab668, 1:500? Abcam). Τα δείγματα επωάστηκαν με κάθε αντίσωμα όλη τη νύκτα στους περίπου 4 ° C. Στη συνέχεια, τα δείγματα επωάστηκαν σε διατεθεί ανοσοσφαιρίνης G για 10 λεπτά, ακολουθούμενο από τρεις πλύσεις με PBS. Όλα τα δείγματα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με στρεπταβιδίνης-υπεροξειδάσης αντιδραστήριο, και επωάστηκαν σε PBS διαμινοβενζιδίνη και 1% υπεροξείδιο του υδρογόνου (νοί /νοί), ακολουθούμενο από αντικηλίδωση με αιματοξυλίνη Mayer του.

Ανοσοϊστοχημική αξιολόγηση

RBBP6, επίπεδα έκφρασης GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA και KRT18 αξιολογήθηκαν τόσο από την ένταση της χρώσης και το ποσοστό των χρωματισμένο καρκινικών κυττάρων. Η ένταση χρώσης βαθμολογήθηκε σε μία κλίμακα από 0-3 (0 = όχι, 1 = ήπιο, 2 = μέτρια, 3 = έντονη). Χρώση αναλογίες βαθμολογήθηκαν σε μια κλίμακα από 0-4 (το ποσοστό ήταν διαφορετική με κάθε αντίσωμα) με βάση το ποσοστό των θετικώς χρωματισμένων κυττάρων. Ως εκ τούτου, το τελικό σκορ χρώση, η οποία υπολογίστηκε ως πολλαπλάσιο της βαθμολογίας ένταση χρώσης και το σκορ χρώση ποσοστό, θα είναι με κλίμακα από το 0-12. επίπεδα έκφρασης της DCTPP1 θεωρήθηκαν θετικά όταν έλαβε ένα σκορ 3 επίπεδα έκφρασης της HSPA4 θεωρήθηκαν θετικά όταν έλαβε ένα σκορ 6. επίπεδα έκφρασης της ALDOA, KRT18, VPS13A και GLG1 θεωρήθηκαν θετικά όταν κάθε έλαβε βαθμολογία 8. RBBP6, η αξιολόγηση των οποίων μόνο το σκορ χρώση ποσοστό χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό, θεωρήθηκε θετική όταν έλαβε ένα σκορ 3. HSPA9, η αξιολόγηση των οποίων μόνο η βαθμολογία ένταση χρώσης χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό, θεωρήθηκε θετική όταν έλαβε βαθμολογία 3. Όλες οι αξιολογήσεις έγιναν από δύο παρατηρητές που δεν γνώριζαν των κλινικών δεδομένων και της έκβασης. Όταν βρέθηκε μια αντιφατικά αξιολόγηση μεταξύ των δύο ανεξάρτητους παρατηρητές, οι πλάκες επανελέγχεται και επαναξιολογούνται μετά από συζήτηση.

Στατιστική Ανάλυση

Το λογισμικό πρόγραμμα SPSS (SPSS Ιαπωνία, Tokyo, Japan) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση δεδομένων. Η στατιστική σημαντικότητα των ενώσεων μεταξύ της έκφρασης των πρωτεϊνών και των διαφόρων κλινικοπαθολογικών μεταβλητές, όπως η ηλικία, το φύλο, μακροσκοπική τύπος, διαφοροποίηση του όγκου, ο συνολικός αριθμός των εκτομή λεμφαδένα, και το είδος της χειρουργικής επέμβασης (D1 ή D2 γαστρεκτομή) αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας Fisher και Chi -squared δοκιμές. Οι καμπύλες επιβίωσης υπολογίστηκαν από την ημέρα της χειρουργικής επέμβασης για την ημέρα του θανάτου ή έως την τελευταία παρατήρηση συνέχεια με τη μέθοδο Kaplan-Meier. Επιπλέον, τυχόν διαφορές μεταξύ των καμπυλών επιβίωσης αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την δοκιμασία log-rank. Πολυπαραγοντικές αναλύσεις διεξήχθησαν σύμφωνα με την Cox Μοντέλο Παλινδρόμησης για τον προσδιορισμό των ενώσεων μεταξύ κλινικοπαθολογοανατομικών μεταβλητών και θνησιμότητα. P-τιμές των & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Η βλαστική ικανότητα των κυτταρικών σειρών καρκίνου του στομάχου

Τα ποσοστά των κυττάρων SP ήταν υψηλότερα στην OCUM-12. /SP και OCUM-2MD3 /SP κύτταρα σε σχέση με τις μητρικές τους OCUM-12 και κύτταρα OCUM-2MD3 (Σχήμα S1). σημειωτές Καρκίνος βλαστικών κυττάρων των κυττάρων SP, OCUM-12 /SP και OCUM-2MD3 /SP, όπως CD44, CD133, και Nanog, αναλύθηκαν με RT-PCR. Το επίπεδο έκφρασης αυτών των δεικτών ήταν σημαντικά αυξημένη στις δύο κυτταρικές σειρές SP, σε σύγκριση με κυτταρικές σειρές μητρικές τους (Σχήμα S2). Ο αριθμός των αποικιών σφαιροειδή ήταν σημαντικά υψηλότερη στα δύο κύτταρα OCUM-12 /SP και OCUM-2MD3 /SP από OCUM-12 και OCUM-2MD3 κύτταρα μητρικές τους (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Ανίχνευση των υποψήφιων Πρωτεΐνες

Ερευνήσαμε αν οι πρωτεΐνες διαφορικά ή ανεξάρτητα εκφράζονται σε κύτταρα SP, και σε σύγκριση με τα ευρήματά μας με εκείνα των γονικών κυττάρων τους χρησιμοποιώντας QSTAR Elite LC-MS /MS. Κατά την ανάλυση βιολογικών διεργασιών, και με ένα cut-off όριο εμπιστοσύνης 95% και p & lt? 0,05, εντοπίσαμε ότι οι πρωτεΐνες ήταν πράγματι διαφορικά εκφρασμένων. Τα αποτελέσματα αυτών των ευρημάτων που παρουσιάζονται στο Σχήμα 1. Οι περισσότερες από τις πρωτεΐνες υπερ-εκφράζονται στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 1Α). Η τιμή Ρ που περιλαμβάνονται στην ανάλυση εφευρετικότητα αναφέρεται στον Πίνακα S1. Αυτές οι πρωτεΐνες προσδιορίστηκαν να σχετίζονται με κυτταρικές διεργασίες, όπως ο κυτταρικός θάνατος, το μεταβολισμό, κυτταρική οργάνωση, το μεταβολισμό του DNA, την υποβάθμιση πρωτεΐνη, και την επεξεργασία του RNA (Εικόνα 1Β). . Τα κορυφαία κανονικά μονοπάτια που σχετίζονται με αυτούς τους στόχους και προσδιορίζονται από το IPA παρουσιάζονται στον Πίνακα S2

(Α) Εντοπισμός? (Β) Οι βιολογικές διαδικασίες των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών. Έχουμε κατηγοριοποιούνται οι πρωτεΐνες με βάση λειτουργικές εργασίες τους, χρησιμοποιώντας Ingenuity Pathway Analysis. Τα μοριακά λειτουργίες που αναφέρθηκαν περιλαμβάνουν κυτταρικό θάνατο, το μεταβολισμό, κυτταρική οργάνωση, ο μεταβολισμός του DNA, την υποβάθμιση πρωτεΐνη, την επεξεργασία του RNA, την παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου, το μονοξείδιο του αζώτου, μοριακή μεταφορά, του κυτταρικού κύκλου, αναδίπλωση πρωτεϊνών και κυτταρικών κίνηση. Αριθμός% = 100 Χ των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών /όλα τα 932 πρωτεΐνες που αναλύθηκαν. (C), Ένα διάγραμμα Venn προσδίδουν στον Πίνακα 2. Σαράντα πρωτεΐνες ήταν σημαντικά αυξημένη στα κύτταρα OCUM-12 /SP σχέση με το μητρικό τους OCUM-12 κύτταρα. Τριάντα-πέντε πρωτεΐνες ήταν σημαντικά αυξημένη στα κύτταρα OCUM-2MD3 /SP σχέση με το μητρικό τους OCUM-2MD3cells. Οκτώ υποψήφιες πρωτεΐνες, RBBP6, HSPA4, HSPA9, GLG1, DCTPP1, VPS13A, CK18 και ALDOA, επικάλυψη και στις δύο OCUM-12 /SP και κύτταρα /SP OCUM-2MD3. (D), η έκφραση mRNA. RT-PCR ανάλυση έδειξε ότι το επίπεδο έκφρασης του

RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1

, και

CK18

ήταν υψηλή σε OCUM-12 /SP (9,15 φορές, 9,36 φορές, 4,14 φορές, 7,80 φορές, 2,08 φορές, 1,46 φορές, 3,44 φορές, και 1.99 φορές, αντίστοιχα) και OCUM-2MD3 /SP (6,15 φορές, 1,71 φορές, 2,33 φορές, 2,30 φορές, 2,03 φορές, 1,32 φορές, 1,35 φορές και 1,31 φορές αντίστοιχα), σε σύγκριση με τον έλεγχο της μητρικής OCUM-12 και OCUM-2MD3. (Ε), Συσχετισμός μονοπάτια σηματοδότησης μεταξύ RBBP6 και διαφορικά-εκφρασμένων πρωτεϊνών σε CSC-όπως κύτταρα SP. RBBP6 υπερεκφράζεται (κόκκινο) σε CSC-όπως κύτταρα SP (OCUM-12 κύτταρα /SP και κύτταρα /SP OCUM-2MD3). Hsp90, HSPA4, και TAGLN2 (ροζ) πάνω ρυθμισμένα σε CSC κύτταρα που μοιάζουν SP συνδέθηκαν με το μονοπάτι σηματοδότησης RBBP6.

Η

Σε σύγκριση με το αντίστοιχο πατρικό κελιά τους, 40 πρωτεΐνες ήταν πάνω ρυθμισμένα σε OCUM-12 /SP, και 35 πρωτεΐνες ήταν πάνω ρυθμισμένα σε OCUM-2MD3 /SP. Μεταξύ αυτών των πρωτεϊνών, οκτώ ήταν πάνω ρυθμισμένα σε αμφότερες OCUM-12 κύτταρα /SP και κυττάρων OCUM-2MD3 /SP, ενώ δεν παρατηρήθηκε καμία τέτοια σύνδεση μεταξύ αντίστοιχων μητρικών κυττάρων τους (Πίνακας 2 και Σχήμα 1 C). Από αυτές τις οκτώ πρωτεΐνες, οι τρεις πρωτεΐνες, RBBP6, GLG1, και VPS13A, έγιναν ανεξάρτητα ανιχνεύθηκαν σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές SP, αλλά όχι σε αντίστοιχο πατρικό κελιά τους. Οι πέντε πρωτεΐνες, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA και KRT18, ήταν σημαντικά υπερεκφράζεται τουλάχιστον κατά 1,2 φορές και στα δύο κύτταρα SP σε σύγκριση με το αντίστοιχο πατρικό τους κύτταρα.

Η

Η έκφραση του mRNA επίπεδο αυτών των 8 υποψηφίων μορίων,

RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1

, και

CK18

αυξήθηκε σε OCUM-12 /SP (9,15 φορές, 9,36 φορές, 4,14 φορές, 7,80 φορές, 2,08 φορές, 1,46 φορές, 3,44 φορές, και 1.99 φορές, αντίστοιχα) και OCUM-2MD3 /SP (6,15 φορές, 1,71 φορές, 2,33 φορές, 2,30 φορές, 2,03 φορές, 1,32 φορές, 1,35 φορές, και 1.31 φορές, αντίστοιχα) κύτταρα, σε σύγκριση με εκείνες του ελέγχου του γονέα OCUM-12 και κύτταρα OCUM-2MD3 (Εικόνα 1D). Ανάλυση κηλίδας Western έδειξε ότι το επίπεδο έκφρασης των RBBP6 και ALDOA ήταν υψηλή σε CUM-12 /SP και OCUM-2MD3 /SP κύτταρα, σε σύγκριση με εκείνη OCUM-12 και OCUM-2MD3 κύτταρα (Σχήμα S3).

το δίκτυο παρουσιάζεται στο Σχήμα 1Ε παρήχθη με ΙΡΑ, και η ανάλυση εξαρτάται από τις προηγουμένως χαρακτηριστεί και αναφερθεί αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών. Έτσι, RBBP6, η οποία παρατηρήθηκε ότι υπερ-εκφράζεται σε CSC-όπως κύτταρα SP, κύτταρα OCUM-12 /SP και κύτταρα /SP OCUM-2MD3, είχε άμεση σχέση με HSPA4 και Rb, και έμμεσα με Hsp90 και TAGLN2. HSPA4, Hsp90 και TAGLN2 βρέθηκαν επίσης να είναι up-ρυθμίζονται σε CSC-όπως τα κύτταρα SP.

Επίδραση των siRBBP6 επιμόλυνσης για τη μετανάστευση και την επεμβατική ικανότητες του γαστρικού καρκίνου κυττάρων

Σχήμα 2Α δείχνει ότι si

RBBP6

επιμόλυνση μειώθηκαν σημαντικά το επίπεδο έκφρασης του mRNA των δύο SP κυτταρικές σειρές (OCUM-12 /SP ήταν 12%, p & lt? 0,01, OCUM-2MD3 /SP ήταν 2,5% p & lt?. 0,01), σε σύγκριση με εκείνη του αρνητικού-siRNA διαμόλυνση.

RBBP6

siRNA νοκ ντάουν μείωσε σημαντικά την εισβολή (Εικόνα 2Β) και τη δραστηριότητα της μετανάστευσης (Σχήμα 2C) και των δύο κυττάρων SP.

(Α), OCUM-12 /SP και OCUM-2MD3 /SP έδειξαν υψηλότερο επίπεδο

RBBP6

έκφραση του mRNA από τις μητρικές τους κύτταρα, OCUM-12 και OCUM-2MD3. RBBP6 έκφραση σε OCUM-12 /SP και OCUM-2MD3 κύτταρα /SP ήταν αποτελεσματικά μειωτικά από si

RBBP6

επιμόλυνση. (Β), Εκπρόσωπος εικόνες της εισβολής OCUM-12 κύτταρα /SP έδειξε τον αριθμό των καρκινικών κυττάρων εισβολής το φίλτρο μεμβράνης πόρων μειώθηκε κατά

RBBP6

siRNA θεραπεία. si

RBBP6

επιμόλυνσης για κύτταρα /SP OCUM12 ανέστειλε σημαντικά τις ικανότητες εισβολής. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ο μέσος όρος και SD (ράβδοι σφάλματος) τεσσάρων πειραμάτων. *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt? 0,01. (C), si

RBBP6

θεραπεία για OCUM12 /SP και κύτταρα /SP OCUM-2MD3 ανέστειλε σημαντικά τις δυνατότητες της μετανάστευσης, σε σύγκριση με εκείνη του ελέγχου του

αρνητικές-siRNA

θεραπεία. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ο μέσος όρος και SD (ράβδοι σφάλματος) τεσσάρων πειραμάτων. *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt?. 0.01

Η

Ανοσοϊστοχημική αξιολόγηση των υποψήφιων Πρωτεΐνες και σύνδεσης τους με κλινικοπαθολογοανατομικές Χαρακτηριστικά

RBBP6, DCTPP1, και HSPA9 παρατηρήθηκαν να εκφράζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα και πυρήνες του γαστρικού καρκινικών κυττάρων. GLG1, VPS13A, HSPA9, HSPA4, ALDOA, και KRT18 παρατηρήθηκαν να εκφράζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα (Σχήμα 3Α). Σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, και έκφραση HSPA9 βρέθηκαν μερικά κύτταρα στην επιθηλιακή αδένα. KRT18 εκφράστηκαν στα περισσότερα επιθηλιακά κύτταρα. HSPA4 και έκφραση ALDOA δεν βρέθηκε σε φυσιολογικά κύτταρα. BBP6, DCTPP1, και HSPA9 εκφράστηκαν στο κυτόπλασμα και οι πυρήνες των φυσιολογικών επιθηλιακών κυττάρων. GLG1, VPS13A, HSPA9, και KRT18 παρατηρήθηκαν στο κυτταρόπλασμα των επιθηλιακών κυττάρων (Σχήμα 3Β).

(α) Εκφραση σε καρκινικά κύτταρα. RBBP6, DCTPP1, και έκφραση HSPA9 παρατηρήθηκαν κυρίως στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα. GLG1, VPS13A, HSPA4, ALDOA, και KRT18 εκφράστηκαν στο κυτόπλασμα. (Β), η έκφραση σε επιθηλιακά κύτταρα. RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, και την έκφραση HSPA9 βρέθηκαν μερικά κύτταρα του επιθηλιακού αδένα. KRT18 εκφράστηκαν στα περισσότερα επιθηλιακά κύτταρα. HSPA4 και η έκφραση ALDOA δεν βρέθηκε σε φυσιολογικά κύτταρα.

Η

Εμείς διερευνηθεί η συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου έκφρασης των οκτώ υποψήφιες πρωτεΐνες και τα κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά. Αριθμός των υποθέσεων σε κάθε σκορ για τους οκτώ στόχους ήταν φαίνονται στον Πίνακα S3. Αυτές οι οκτώ πρωτεΐνες προσδιορίστηκαν να συνδέονται με δυνητικά κακοήθεις διεργασίες, όπως μακρινή μετάσταση, λεμφαδένα (LN) μετάσταση, εισβολή βάθος, ή το στάδιο εξέλιξης (Πίνακας 3). Οι υπολογισθείσες τιμές ρ ήταν ως ακολούθως: RBBP6 συσχετίστηκε σημαντικά με το βάθος εισβολή (ρ & lt? 0.001), LN μετάσταση (ρ & lt? 0.001), μακρινή μετάσταση (p = 0.013), και το κλινικό στάδιο (ρ & lt? 0.001)? GLG1 συσχετίστηκε σημαντικά με μόνο μακρινή μετάσταση (p = 0,045). VPS13A συσχετίστηκε σημαντικά με το βάθος εισβολή (p = 0,005), LN μετάσταση (p & lt? 0.001), και το στάδιο εξέλιξης (p = 0,005)? DCTPP1 συσχετίστηκε σημαντικά με το βάθος εισβολή (p & lt? 0.001), LN μετάσταση (p & lt? 0.001), μακρινή μετάσταση (p & lt? 0.001), και το στάδιο εξέλιξης (p & lt? 0.001)? HSPA9 συσχετίστηκε σημαντικά με το βάθος εισβολή (p & lt? 0.001), LN μετάσταση (p & lt? 0.001), και το στάδιο εξέλιξης (p & lt? 0.001)? HSPA4 συσχετίστηκε σημαντικά με το βάθος εισβολή (p & lt? 0.001), LN μετάσταση (p & lt? 0.001), μακρινή μετάσταση (p = 0,007), και το στάδιο εξέλιξης (p & lt? 0.001)? ALDOA συσχετίστηκε σημαντικά με το βάθος εισβολή (p = 0,034), LN μετάσταση (p = 0.004), και το στάδιο εξέλιξης (p = 0,029)? και KRT18 συσχετίστηκε σημαντικά με το βάθος εισβολή (p = 0,001), LN μετάσταση (p = 0,001), μακρινή μετάσταση (p = 0,034), και το στάδιο εξέλιξης (p = 0,004).

Η

Πρόγνωση

τα οικόπεδα Kaplan-Meier πρότεινε ότι από τους οκτώ υπερ-εκφρασμένων πρωτεϊνών, RBBP6, DCTPP1, HSPA4, και ALDOA, ήταν σημαντικά σχετίζονται με την κακή επιβίωση σε όλους τους ασθενείς (Σχήμα 4). Η αθροιστική πέντε χρόνια συνολικό ποσοστό επιβίωσης των RBBP6-θετικών περιπτώσεων (61%) ήταν σημαντικά μικρότερη (p = 0,002) από ό, τι εκείνη του RBBP6 αρνητικών περιπτώσεων (78%). Επιπλέον, στους ασθενείς στο στάδιο ΙΙΙ, το συνολικό ποσοστό επιβίωσης των RBBP6-θετικών περιπτώσεων ήταν σημαντικά μικρότερη (p = 0,034) σε σχέση με εκείνη των RBBP6-αρνητικών περιπτώσεων. Η πρόγνωση των ασθενών με DCTPP1-θετικούς όγκους (63%) ήταν σημαντικά φτωχότερη (p = 0,016) από εκείνη του DCTPP1-αρνητικούς όγκους (75%). Το συνολικό ποσοστό πενταετούς επιβίωσης των HSPA4-θετικών περιπτώσεων (66%) ήταν σημαντικά μικρότερη (p = 0,047) σε σχέση με εκείνη των HSPA4-αρνητικών περιπτώσεων (75%). Το συνολικό ποσοστό πενταετούς επιβίωσης των ALDOA-θετικών όγκων που παρουσιάζουν υπερ-έκφραση (61%) ήταν σημαντικά φτωχότερη (p = 0,043) από εκείνη του ALDOA-αρνητικούς όγκους (72%). Αντιθέτως, καμία σημαντική συσχετίσεις παρατηρήθηκαν μεταξύ άλλων πρωτεϊνών και την επιβίωση των ασθενών. Μετά μονοπαραγοντική ανάλυση, τα επίπεδα έκφρασης RBBP6, DCTPP1, HSPA4 και ALDOA ήταν σημαντικά σχετίζεται με κακή πρόγνωση σε 300 ασθενείς με καρκίνο του στομάχου (Πίνακας 4). Επιπλέον, μακροσκοπικά τύπου (τύπος 4), ιστολογικός τύπος (διάχυτη), κατηγορία T (T2-4), εισβολή σκάφος, πρότυπο διήθηση (INF b, c), περιτοναϊκή μετάσταση, και LN μετάσταση προσδιορίστηκαν ότι σχετίζονται σημαντικά με μια κακή πρόγνωση. Η πολυπαραγοντική ανάλυση έγινε με τη χρήση του Cox μοντέλο αναλογικού κινδύνου για όλες τις σημαντικές μεταβλητές στην μονοπαραγοντική ανάλυση. Μετά την ολοκλήρωση της ανάλυσης, η έκφραση RBBP6 (p = 0,023), Borrmann τύπου 4 (ρ & lt? 0.001), περιτόναιο θετικά (ρ = 0,001), LN μετάσταση (p = 0,003), και ηπατική μετάσταση (p = 0.001) επιβεβαιώθηκαν ως ανεξάρτητους παράγοντες συσχετίζεται με την επιβίωση (Πίνακας 3).