Αφηρημένο

Η επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) είναι μια διαδικασία απο-διαφοροποίηση που έχει εμπλέκονται στην μετάσταση και την παραγωγή των καρκινικών κυττάρων για την έναρξη (CICs) σε συμπαγείς όγκους. Για να εξεταστεί EMT σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), χρησιμοποιήσαμε ένα σύστημα τριών διαστάσεων (3D) κυτταρικής καλλιέργειας στο οποίο τα κύτταρα συν-διεγείρονται με παράγοντα νέκρωσης όγκων άλφα (TNF) και αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού βήτα (ΤΟΡβ). πολιτισμών NSCLC σφαιροειδές εμφανίζει αυξημένη έκφραση του EMT παραγόντων μεταγραφής master-διακόπτη,

TWIST1

,

SNAI1 /Snail1

,

SNAI2 /Slug

και

ZEB2 /Sip1

, και είναι ιδιαίτερα επεμβατική. Μεσεγχυματικά NSCLC καλλιέργειες παρουσιάζουν χαρακτηριστικά CIC, εμφανίζοντας αυξημένη έκφραση των παραγόντων μεταγραφής

KLF4

,

SOX2

,

POU5F1 /Oct4

,

MYCN

, και

KIT

. Ως αποτέλεσμα, αυτοί υποθετικό CIC εμφανίσει καρκίνο «στέλεχος-όπως το» φαινότυπο με σχηματισμό πνευμονικών μεταστάσεων υπό περιοριστική αραίωση κυττάρων. Η πλειοτροπική παράγοντα μεταγραφής, ΝΡ-κΒ, έχει ενοχοποιηθεί σε ΕΜΤ και μετάσταση. Έτσι, έθεσε ως στόχο να αναπτύξει ένα μοντέλο NSCLC τον περαιτέρω χαρακτηρισμό του ρόλου της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ στην ανάπτυξη της CICs. Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι η επαγωγή της EMT σε 3D πολιτισμούς οδηγεί σε συστατική δραστηριότητα NF-κΒ. Επιπλέον, η αναστολή του NF-κΒ ως αποτέλεσμα την απώλεια του

TWIST1

,

SNAI2

, και

ZEB2

επαγωγή, και μια αποτυχία των κυττάρων να εισβάλουν και να κάνουν μετάσταση. Η εργασία μας δείχνει ότι NF-κΒ απαιτείται για NSCLC μετάσταση, εν μέρει, από μεταγραφικά προς τα πάνω ρύθμιση μεταγραφικών παραγόντων κύριου διακόπτη που απαιτούνται για την EMT

Παράθεση:. Kumar M, Allison DF, Baranova NN, Wamsley JJ, Katz AJ , Bekiranov S, et al. (2013) NF-κΒ ρυθμίζει μεσεγχυματικά μετάβαση για την πρόκληση μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα Έναρξη κύτταρα. PLoS ONE 8 (7): e68597. doi: 10.1371 /journal.pone.0068597

Επιμέλεια: Srikumar Π Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 14 Ιανουαρίου 2013? Αποδεκτές: 30 Μάη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 30, Ιούλ 2013

Copyright: © 2013 Kumar et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Εργασίας ήταν υποστηρίζεται από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγεί R01CA132580, R01CA104397 (σε MWM), και R01CA136705 (σε DRJ). Όλες οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ανάπτυξη καρκίνου από νωρίς προ-κακόηθες νεόπλασμα στην πλήρη μεταστατική νόσο είναι μια διαδικασία πολλών σταδίων που περιλαμβάνει καρκινικά επιθηλιακά-στρωματικά αλληλεπιδράσεις, αγγειογένεση, και διείσδυση των προ-φλεγμονωδών κυττάρων που σχετίζονται με όγκους [1], [2]. Μια αναδυόμενη υπόθεση προτείνει ότι αυτό το περιβάλλον του κυττάρου-κυττάρου αλληλεπιδράσεις, αυξητικούς παράγοντες, και κυτοκίνες γνωστές ως μικροπεριβάλλον του όγκου, διεγείρει τη μορφογένεση εντός κυττάρων όγκου αναφέρεται ως μετάβαση επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά (ΕΜΤ) [3] – [5]. EMT επάγει μία ανακατανομή της ενδοκυτταρικής αρχιτεκτονική, μειωμένη προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου, και η απώλεια της κυτταρικής πόλωσης. Καρκίνωμα των κυττάρων που έχουν υποστεί EMT είναι χαρακτηριστικά κινητικά, επεμβατική και εξαιρετικά μεταστατικό. Κατά τα τελευταία αρκετά χρόνια, ΕΜΤ έχει επίσης αναγνωριστεί ως ένα πρόγραμμα απο-διαφοροποίηση αποδίδεται σε γενιά ογκογενή ή καρκίνο κύτταρα έναρξης (CICs) που είναι σημαντικές για τη διατήρηση του καρκίνου «βλαστική ικανότητα» [6] – [9] .

Αν και πολλαπλές κυτοκίνες και αυξητικούς παράγοντες επάγουν EMT, ένα από τα καλύτερα μελετημένα παραγόντων αυξητικού παράγοντα μεταμόρφωσης βήτα (ΤΟΡβ) [2], [3], [10] – [13]. Η διέγερση των κυττάρων με TGFβ αποτελέσματα στην έκφραση των παραγόντων μεταγραφής EMT master-διακόπτη, TWIST1, SNAI1 /σαλιγκάρι, SNAI2 /γυμνοσάλιαγκας, και ZEB2 /Sip1 που μαζί διαφορικά ρυθμίζουν τα γονίδια για την προώθηση του φαινοτύπου μεσεγχυματικών [10], [12]. Ενώ εκτενής έρευνα περιγράφει λεπτομερώς τη δυνατότητα για τον ΤΟΡβ να επάγουν EMT, στοιχεία δείχνουν ότι ο παράγοντας νέκρωσης όγκου (TNF) ενισχύει περαιτέρω την μετάβαση [14], [15]. Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου, η έκκριση του ΤΟΡβ εντός μικροπεριβάλλον του όγκου λαμβάνει χώρα μέσω πολλών διαφορετικών τύπων κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των ινοβλαστών που σχετίζονται με όγκους, ενώ η έκκριση του TNF προέρχεται από σχετιζόμενο με τον όγκο μακροφάγων M2 [3], [16], [17]. Μια επικρατούσα υπόθεση στο πεδίο είναι ότι η έκθεση των καρκινικών κυττάρων σε αυτές τις κυτοκίνες εντός μικροπεριβάλλον του όγκου προάγει EMT, de-διαφοροποίηση, και το σχηματισμό CICs [2], [5], [17].

TNF είναι ένα ισχυρό προ-φλεγμονώδη κυτοκίνη που διεγείρει καταρράκτες σηματοδότησης για την ενεργοποίηση του πυρηνικού παράγοντα κάππα Β (NF-κΒ). Ως παράγοντα μεταγραφής, ΝΡ-κΒ παίζει ένα ρόλο κλειδί στην έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην έναρξη και την εξέλιξη του καρκίνου. Προς τα πάνω ρύθμιση της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ εμφανίζεται συχνά σε πρωτοπαθείς στερεές και αιματολογικούς όγκους, απ ‘ευθείας συσχέτιση με de διαχωριζόμενες μορφολογία, προχωρημένο στάδιο του όγκου, και την κακή κλινική πρόγνωση [18]. Σημαντικά, NF-κΒ έχει συνδεθεί με μαστικούς CICs [19], [20]. NF-κΒ επάγει και διατηρεί EMT σε συστήματα μοντέλο μέσω δύο μηχανισμών, προς τα πάνω ρύθμιση της EMT μεταγραφικών παραγόντων κύριου διακόπτη [21] – [24] και τη σταθεροποίηση της Σαλιγκάρι [25]. NF-κΒ αποτελείται από πέντε μέλη της οικογένειας Rel: ΚεΙΑ /p65, RelB, CreL, p50 και P52. Σε μη διεγερμένα κύτταρα, ανασταλτική υπομονάδες ΙκΒ συνδέσει με διμερή ΝΡ-κΒ και θέτω τους στο κυτταρόπλασμα. Μετά την κυτταρική διέγερση από προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες, ΙκΒα φωσφορυλιώνεται από το συγκρότημα ΙκΒ κινάσης (ΙΚΚ), ουβικουιτινωμένης από την ΕΕΤ τύπου Ε3 λιγάση, E3RS

ΙκΒ /β-TrCP και αποικοδομείται από το πρωτεάσωμα 26S [26]. Η απελευθερωμένη ΝΡ-κΒ στη συνέχεια μετατοπίζεται στον πυρήνα για την ενεργοποίηση έκφρασης γονιδίου με την πρόσληψη της μεταγραφής συνενεργοποιητές [27]. Το εργαστήριο μας έχει δείξει ότι οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις σε ΚεΙΑ που απαιτούνται για την πλήρη μεταγραφική δραστικότητα NF-κΒ [27] – [30]

Αν και EMT σε μοντέλα καρκίνου του μαστού απαιτεί δράση του NF-κΒ [31], το ρόλο της. αυτός ο παράγοντας μεταγραφής για την τόνωση της EMT και την ανάπτυξη CICs σε NCSLC δεν έχει εξετασθεί διεξοδικά. Ωστόσο, υπάρχουν ισχυρές ενδείξεις για την παρουσία του NSCLC βλαστικών /προγονικών κυττάρων σε πρωτογενή αδενοκαρκινώματα και καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές [32] – [35]. Εδώ, αποδεικνύουμε ότι η συντονισμένη ενεργοποίηση του TNF και ΤΟΡβ καταρράκτες σηματοδότησης επάγει αποτελεσματικά ΕΜΤ και την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την απο-διαφοροποίηση και βλαστική ικανότητα. Περαιτέρω, δείχνουμε ότι μεσεγχυματικά κύτταρα NSCLC έχουν ουσιαστικώς δραστικής ΝΡ-κΒ, και ότι η αναστολή του NF-κΒ μειώνεται EMT, σχηματισμός CIC, και μεταστατικό δυναμικό.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και αντιδραστήρια

NSCLC γραμμές Α549, H359, Η1299, Η157 και ελήφθησαν από την ATCC και διατηρήθηκαν ως 2D καλλιέργειες σε DMEM (Cellgro), 10% FBS (Invitrogen) και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Invitrogen). Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται περιλαμβάνουν: E-cadherin (BD Pharmingen- 610.404), Ν-cadherin (BD Pharmingen- 610920), βιμεντίνη (V6630), Φιμπρονεκτίνης (BD Pharmingen- 610078), α-τουμπουλίνης (Sigma T6793), HMGA2 (Biocheck 59170AP ), Twist1 (Cell Signaling 4119), Snail1 (Cell Signaling 4719), Sip1 (SCBT SC-48789), Slug (Abcam ab27568), ΙκΒα (pS32, Cell Signaling 2859), ΙκΒα (SCBT sc-371), ΚεΙΑ (pS536 , Cell Signaling 3031), ΚεΙΑ (SCBT sc-372), και Μ2-Flag (Sigma F1804). Baculogold αναστολείς πρωτεάσης ελήφθησαν από BD Biosciences. ΤΟΡβ (PHG 9204) και TNF (PHG 3015) αγοράστηκαν από την Invitrogen τεχνολογιών /Life. Όλα τα άλλα χημικά ήταν από τη Sigma.

Τρισδιάστατο καλλιέργειες πολυκύτταρους σφαιροειδές

Τρισδιάστατο πολυκύτταρους καλλιέργειες σφαιροειδείς δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας μια τροποποιημένη μέθοδο κρέμεται σταγονιδίου [36]. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε περίπου 80% συρροή σε τυποποιημένες πλάκες ιστοκαλλιέργειας. Τα κύτταρα στη συνέχεια σε επεξεργασία με θρυψίνη, επαναιωρήθηκαν σε ϋΜΕΜ /10% FBS, και μετρήθηκαν. Για τη δημιουργία 25.000 κύτταρο σφαιροειδή, το κυτταρικό εναιώρημα αραιώθηκε σε συγκέντρωση 1000000 κυττάρων /ml, και 25 μΐ του κυτταρικού εναιωρήματος προστέθηκαν με πιπέτα πάνω στην κάτω πλευρά ενός αποστειρωμένου 10 cm καπάκι πλάκα ιστοκαλλιέργειας. Κάθε καπάκι κατέχει περίπου πενήντα σταγονίδια. Μετά τη φόρτωση των σταγονιδίων, το καπάκι τοποθετήθηκε πάνω σε μία πλάκα καλλιέργειας ιστού που περιέχει 6 ml στείρου PBS και επωάστηκαν για 48 ώρες για να διευκολύνει την κυτταρική συσσωμάτωση και το σχηματισμό σφαιροειδών. Τα πρόσφατα σχηματίζονται σφαιροειδή μεταφέρθηκαν έπειτα σε πλάκες εναιώρημα 10 cm που περιέχει ϋΜΕΜ και 2% FBS για την πρόληψη της προσκόλλησης των κυττάρων στο τρυβλίο. πλάκες Αναστολή έγιναν με την προσθήκη 8 ml του διαλύματος πολυ-ΗΕΜΑ (Sigma-Aldrich P3932, 10 mg /ml) σε 95% αιθανόλη σε αποστειρωμένα τρυβλία petri πολυστυρενίου πιάτο (Fisher Scientific). Οι πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν για 24 ώρες σε ένα αποστειρωμένο περιβάλλον για να επιτραπεί η αιθανόλη να εξατμιστεί. Πριν από τη χρήση, οι πλάκες πλύθηκαν με στείρο PBS για να απομακρυνθεί οποιοδήποτε απομένον αιθανόλη ή άλλες μολυσματικές ουσίες. Κάθε πλάκα ανάρτησης χωράει μέχρι 100 σφαιρίδια. Μετά τη μεταφορά, τα σφαιροειδή υπέστησαν επεξεργασία με όχημα ή με 10 ng /ml TNF και 2 ng /ml ΤΟΡβ, και επωάστηκαν για 48 ώρες. Μετά την επώαση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε μία δεύτερη αγωγή του οχήματος ή TNF και ΤΟΡβ, και επωάστηκαν για 48 επιπλέον ώρες. Τα σφαιροειδή στη συνέχεια συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με διάφορες δοκιμασίες.

μικροσκοπία ανοσοφθορισμού

Α549 κύτταρα σπάρθηκαν επί γυάλινων καλυπτρίδων και υποβλήθηκε σε EMT επαγωγή ή αφεθεί χωρίς θεραπεία. Μετά την επαγωγή, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 100% μεθανόλη και στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα προς τον εξωκυτταρικό τομέα του Ε-καδερίνης (SCBT, sc-7870). Ένα AlexaFlour-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε ως δευτερεύον αντίσωμα και έμμεσος ανοσοφθορισμός Ε-καδερίνης απεικονίστηκε χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού Nikon E3800.

Μετανάστευση και εισβολή

In vitro δοκιμασίες

μετανάστευση και εισβολή διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (BD Biosciences). 2D και 3D καλλιέργειες διαχωρίζονται με θρυψίνη και στη συνέχεια μετρήθηκαν. 1 × 10

5 κύτταρα (μετανάστευση) ή 1 × 10

4 κύτταρα (εισβολή) σπάρθηκαν σε απλό DMEM στην κορυφή φρεάτιο μιας πλάκας ελέγχου φρεατίων (BD 354578) ή πλάκα εισβολή Matrigel (BD 354.480). Το κάτω καλά φορτώθηκε με ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS ως χημειοελκυστικό, και οι πλάκες επωάστηκαν για οκτώ ώρες (μετανάστευση) ή είκοσι-τέσσερις ώρες (για εισβολή) στους 37 ° C και 5% CO

2. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επί της άνω πλευράς της μεμβράνης απομακρύνθηκαν και τα υπόλοιπα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 100% μεθανόλη και χρωματίσθηκαν με 0,1% κρυσταλλικό ιώδες. Τα βαμμένα κύτταρα απεικονίστηκαν και ποσοτικοποιούνται χρησιμοποιώντας Adobe® Photoshop.

Tumor μοντέλο

μονόφυλλο (2D) και 3D καλλιέργειες Α549 που είχε μείνει χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με TNF και ΤΟΡβ τρυψινοποιήθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε DMEM /0.5% FBS, και προσεκτικά μετρώνται και αραιώνονται στον κατάλληλο όγκο για έγχυση. Τα κύτταρα υποδορίως (SC) ένεση σε θηλυκά ετερόμικτα Crl: NU /NU γυμνά ποντίκια (Charles River). Πέντε ποντικοί εγχύθηκαν ανά πειραματική κατάσταση. Όλες οι μελέτες σε ζώα διεξήχθησαν όπως τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν σαράντα ημέρες μετά την ένεση. Οι πρωτογενείς όγκοι SC αφαιρέθηκαν και ζυγίστηκαν. Επιπλέον, οι πνεύμονες αφαιρέθηκαν, μονιμοποιήθηκαν σε φορμαλίνη, και μεταστάσεις επιφάνειας πνεύμονα μετρήθηκαν. Για να ποσοτικοποιηθεί η ποσότητα της συνολικής επιβάρυνσης του όγκου στον ιστό φορμαλίνη πνεύμονα, γενωμικό DNA εκχυλίστηκε [37] και αναλύθηκε για την παρουσία του ανθρώπινου γενωμικού υλικού όπως περιγράφηκε με τη χρήση ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης σε πραγματικό χρόνο-πολυμεράσης (QRT-PCR) ειδικών για την ανθρώπινη ενδογενή ρετροϊό-3 (ERV3, Πίνακας S1) [38], [39].

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρή συμφωνία με τη σύσταση της Επιτροπής των ζώων Φροντίδα και Χρήση (ACUC) του Πανεπιστημίου της Βιρτζίνια. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από ACUC Αριθμός 3914. τερματίστηκαν Όλα τα πειράματα μετά από 40 ημέρες χρόνος κατά τον οποίο οι όγκοι SC ήταν λιγότερο από 1,0 εκατοστά

3 σε μέγεθος? ως εκ τούτου, περιορίζοντας το φορτίο του όγκου. Όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιηθεί ο πόνος και τα βάσανα.

QRT-PCR, ανοσοστυπώματα, και προσδιορισμούς μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (EMSAs)

QRT-PCR και ανοσοαποτύπωση πειράματα πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28 ]. Οι εκκινητές PCR φαίνονται στον Πίνακα S1. Πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας σφαιροειδή από A549.V και A549.I κυτταρικές σειρές σε επεξεργασία με ή χωρίς TNF και ΤΟΡβ. δοκιμασίες EMSAs και υπερμετατόπισης έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [40].

Στατιστικά

Όπου ενδείκνυται, οι συγκρίσεις μεταξύ των πειραματικών ομάδων διεξήχθησαν εκτελώντας ένα μονόπλευρο Μαθητή

t

δοκιμή στο Microsoft Excel. Τα δεδομένα για όλα τα πειράματα θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική όταν ρ & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Ένα μοντέλο για τη μελέτη EMT στον NSCLC

TNF έχει αποδειχθεί ότι ενισχύει TGFβ-μεσολάβηση EMT μέσω η ενεργοποίηση του συν-διεγερτικών οδών [15]. Για να επιβεβαιωθεί αυτή η παρατήρηση στον τρισδιάστατο μοντέλο μας (3D), μια χρονική πορεία διεξήχθη χρησιμοποιώντας και τις δύο κυτοκίνες παράλληλα και μόνο. Πολυκύτταρων καλλιέργειες σφαιροειδές δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας μια τροποποιημένη μέθοδο κρέμεται σταγονίδια [36]. Μετά από δύο ημέρες, σφαιροειδή εναιωρήθηκαν σε πλάκες επιστρωμένες με πολυ-ΗΕΜΑ και θεραπεία κάθε δύο ημέρες με τις υποδεικνυόμενες κυτοκίνες να επάγουν EMT (Σχήμα 1Α). Τα δείγματα συλλέχθηκαν από μη επεξεργασμένα (0 ημέρες) και σε καλλιέργειες με κυτοκίνη αγωγή (1-8 ημέρες). Επιθηλιακά (Ε-καδερίνης) και μεσεγχυματικά (Ν-cadherin, βιμεντίνη και ινωδονεκτίνης) δείκτες μετρήθηκαν με ανοσοστύπωμα. Η θεραπεία με TNF οδήγησε σε μέτρια αύξηση σε Ν-καδερίνης και ινονεκτίνη, αλλά απέτυχε να δείξει διαφορές σε άλλους δείκτες (Σχήμα 1Β). Σε συνέπεια με την επαγωγή του ΕΜΤ, η θεραπεία ΤΟΡβ ως αποτέλεσμα την απώλεια της έκφρασης Ε-καδερίνης και αύξηση των Ν-καδερίνης, βιμεντίνη, και ινονεκτίνη. Επιπλέον, η συν-διέγερση με TNF και ΤΟΡβ απέδωσε ένα πιο μεσεγχυματικά φαινότυπο και συνεχίστηκε καθ ‘όλη τη διάρκεια τον καιρό οκτώ ημερών (Σχήμα 1Β). Είναι σημαντικό ότι, η διέγερση με TNF και ΤΟΡβ επαχθεί αποτελεσματικά ΕΜΤ και στις δύο γραμμές Α549 και Η358 κυττάρων εντός τεσσάρων ημερών της θεραπείας, σε σύγκριση με Η1299, το οποίο δείχνει ήδη αλλαγές στην Ε-καδερίνης και βιμεντίνης (Σχήμα 1 C). Με βάση τα αποτελέσματα στην Εικόνα 1, χρησιμοποιήσαμε τα τέσσερα ημέρα χρονικού πλαισίου σε ολόκληρη υπόλοιπα πειράματα μας.

(α) ένα χρονοδιάγραμμα απεικονίζει τη διαδικασία που χρησιμοποιείται για να δημιουργήσει ένα τρισδιάστατο πληθυσμού μεσεγχυματικών κυττάρων από συρρέουσες μονοστιβάδες. καλλιέργειες (Β) σφαιροειδές κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία, με TNF, ΤΟΡβ, ή και των δύο κυτοκινών κάθε σαράντα-οκτώ ωρών για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Η ανάλυση ανοσοστυπώματος μετρώνται μεταβολές στα επιθηλιακά (Ε-καδερίνης) και μεσεγχυματικά (Ν-cadherin, βιμεντίνη και ινωδονεκτίνης) δείκτες πάνω από ένα οκταήμερο χρονικής πορείας. (Γ) 3D καλλιέργειες πολλαπλές NSCLC κυτταρικών σειρών (Α549, Η358, Η1299) επωάστηκαν για ενενήντα-έξι ώρες απουσία ή παρουσία του TNF και ΤΟΡβ. Τα επιθηλιακά και μεσεγχυματικά δείκτες στη συνέχεια μετρήθηκε με ανοσοστύπωμα. Τα αποτελέσματα από το Σχήμα 1Β και 1Γ είναι αντιπροσωπευτικά παραδείγματα από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα? α-τουμπουλίνης δρα ως μάρτυρας πρωτεΐνη φόρτωσης.

Η

3D καλλιέργειες υποβάλλονται EMT πιο αποτελεσματικά από ό, τι 2D καλλιέργειες

Για να προσδιορίσετε αν 3D καλλιέργειες Α549 υποβάλλονται EMT πιο αποτελεσματικά από ό, τι δύο διαστάσεων (2D ) μονοστρωματικές καλλιέργειες, μετρήσαμε την έκφραση των δεικτών των επιθηλιακών και μεσεγχυματικών σε απόκριση προς διέγερση με TNF και ΤΟΡβ, όπως περιγράφεται στο Σχήμα 1. Μετά τη θεραπεία κυτοκίνης, 3D καλλιέργειες δείχνουν σημαντική απώλεια του

Cdh1 /Ε-καδερίνης

έκφραση όταν συγκρίθηκαν σε 2D καλλιέργειες (Σχήμα 2Α). Επιπλέον, τα σφαιροειδή και διαθέτουν αυξημένη έκφραση των δεικτών μεσεγχυματικών

VIM

,

HMGA2

, και η EMT κεντρικός διακόπτης παράγοντες μεταγραφής,

TWIST1

,

SNAI1 /Snail1

,

SNAI2 /Slug

και

ZEB2 /Sip1

(Εικόνες 2Α και 2Β). Η ανάλυση ανοσοστυπώματος των σφαιροειδούς καλλιεργειών επιβεβαιώνουν ότι η έκφραση του mRNA διαφορική είχε ως αποτέλεσμα μια αντίστοιχη αλλαγή στα επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχήμα 2C). Επιπλέον, εξετάσαμε αλλαγές στην κυτταρική μορφολογία και Ε-καδερίνης εντοπισμός με μικροσκοπία. Και οι δύο 2D και 3D καλλιέργειες υπέστησαν κατεργασία με κυτοκίνες, όπως περιγράφεται, σε επεξεργασία με θρυψίνη, επανα-επιστρώθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες, και χρώση έμμεσου ανοσοφθορισμού εκτελέστηκε δεκαοχτώ ώρες αργότερα. Όπως ήταν αναμενόμενο, ακατέργαστα μονοστιβάδα και σφαιροειδή δείγματα Α549 έδειξαν εύρωστη έκφραση Ε-καδερίνης, αν και η συνδετική εντοπισμός εμφανίστηκε μειωθεί σε κύτταρα από τις καλλιέργειες 3D (Σχήμα S1). Επιπλέον, κύτταρα που προέρχονται από σφαιροειδή κυτοκίνη επεξεργασμένο εμφανίζεται ενισχυμένη απώλεια Ε-καδερίνης σε σύγκριση με 2D επεξεργασμένα δείγματα, γεγονός που υποδηλώνει ότι 3D καλλιέργειες υπέστησαν πιο αποτελεσματική EMT. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στο Σχήμα 2 και το Σχήμα S1 απεικονίζουν σημαντική επαγωγή ΕΜΤ σε 3D καλλιέργειες όπως μετρήθηκε με μεταβολές στους δείκτες μεσεγχυματικά, master-διακόπτης έκφραση παράγοντα μεταγραφής EMT, και η κυτταρική μορφολογία.

(Α και Β) μονόφυλλο (2D) και 3D καλλιέργειες κυττάρων Α549 αφέθηκαν μόνο (αριθ ADD) ή υποβάλλεται σε επεξεργασία με TNF και ΤΟΡβ (TNF /TGF) για ενενήντα-έξι ώρες. Έκφραση των επιθηλιακών δεικτών (

Cdh1

), δείκτες μεσεγχυματικών (

VIM, HMGA2

), και παράγοντες μεταγραφής master-διακόπτης EMT (

TWIST1, SNAI1, ZEB2, SNAI2

) μετρήθηκαν με QRT-PCR. (C) Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης των καλλιεργειών Α549 3D, άφησε μόνο (αριθ ADD) ή υποβάλλεται σε επεξεργασία με TNF και ΤΟΡβ (TNF /TGF), διεξήχθη επί Ε-καδερίνης, βιμεντίνη, HMGA2, Twist1, Snail1, Sip1, Slug, και α- τουμπουλίνης. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 2Α και 2Β ομαλοποιήθηκαν στο

GAPDH

, και υπολογίζονται μέσες ± SD, * ρ & lt? 0,05, Ν = 3. Τα ανοσοστυπώματα στο Σχήμα 2C είναι αντιπροσωπευτικό παράδειγμα από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα

.

τα μεσεγχυματικά κύτταρα NSCLC είναι επεμβατική και ενδογενώς εκφράζουν γονίδια που είναι γνωστό για την προώθηση του στελέχους-όπως ιδιότητες

Φαινοτυπικά, μεσεγχυματικά κύτταρα έχουν υψηλά ποσοστά μετανάστευσης και να εκκρίνουν ένζυμα που αποδομούν εξωκυττάριας μήτρας για να διευκολύνει την κυτταρική εισβολή. Χρησιμοποιώντας

in vitro

φρεατίων δοκιμασίες, μετρήσαμε τις μετανάστευση και την εισβολή χαρακτηριστικά των κυττάρων Α549 που καλλιεργούνται είτε ως 2D ή 3D πολιτισμών. Είναι ενδιαφέρον, μη επεξεργασμένες καλλιέργειες 3D σφαιροειδές έδειξαν υψηλότερους ρυθμούς μετανάστευσης από καλλιέργειες μονοστοιβάδας 2D (Σχήμα 3Α, αριστερά). Ωστόσο, η θεραπεία του 3D καλλιεργειών με TNF και ΤΟΡβ ενίσχυσε περαιτέρω μετανάστευση σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα 3D καλλιέργειες. Τα σφαιροειδή που έλαβαν θεραπεία με κυτοκίνες εισέβαλαν μέσω Matrigel πιο αποτελεσματικά από οποιαδήποτε άλλη πάθηση (Σχήμα 3Α, δεξιά). Επιπροσθέτως, αντιμετωπίζεται κυτοκίνης σφαιροειδή Α549 εμφανίζεται υπερέκφραση του

ΜΜΡ9

,

LOX

, και

COL22A1

(Σχήμα 3Β), γονίδια που είναι γνωστό ότι ενισχύει εισβολή [41], [42 ]. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι η καλλιέργεια 3D σφαιροειδή με την παρουσία του TNF και ΤΟΡβ καθιερώνει μια ιδιαίτερα επεμβατική πληθυσμό μεσεγχυματικών. Τέλος, κυτοκίνη επεξεργασμένο σφαιροειδή έδειξαν ενδογενή αυξητική ρύθμιση των δεικτών που σχετίζονται με de-διαφοροποίηση και τη συντήρηση των CICs [43] – [48], συμπεριλαμβανομένων

KLF4, SOX2, POU5F1 /Oct4, MYCN

, και

KIT

(Σχήμα 3C). Τα δεδομένα που δείχνονται στο Σχήμα 3 υποδεικνύουν ότι συν-διέγερση των σφαιροειδών με TNF και ΤΟΡβ προωθεί φαινοτυπικές αλλαγές στα Α549 κύτταρα που οδηγούν σε αυξημένη εισβολή και την έκφραση του γονιδίου προϊόντα που σχετίζονται με τις ιδιότητες των βλαστικών παρόμοια.

μονόφυλλο και 3D καλλιέργειες Α549 έμειναν μόνοι (αριθ ADD) ή υποβάλλεται σε επεξεργασία με TNF και ΤΟΡβ (TNF /TGF) για ενενήντα-έξι ώρες. (Α) Τα κύτταρα αναλυτικά και στη συνέχεια υποβάλλεται σε προσδιορισμούς μετανάστευσης και της εισβολής. (Β και Γ) Έκφραση της εισβολής (

MMP-9, LOX, COL22A1

) και βλαστικών κυττάρων δείκτες (

KLF4, Sox2, POU5F1, MYCN και KIT

) μετρήθηκε με QRT- PCR. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 3 υπολογίζεται μέση τιμή ± SD, * ρ & lt?. 0.05, Ν = 3. Τα αποτελέσματα από 3Β και 3C ομαλοποιήθηκαν σε

GAPDH

Η

Τα μεσεγχυματικά κύτταρα είναι πολύ μεταστατικός και καρκίνο οθόνη έναρξη φαινοτύπων

Για να εξεταστεί αν η επαγωγή της EMT προωθεί την ανάπτυξη της CICs

in vivo

, θα χρησιμοποιηθεί ένα μοντέλο όγκου ξενομοσχεύματος σε γυμνά ποντίκια. TNF και ΤΟΡβ επεξεργασία 2D και 3D καλλιέργειες ήταν αναλυτικά και εναιωρήματα κυττάρων SC εγχέεται στο δεξί πλευρό γυμνών ποντικών. Σαράντα ημέρες αργότερα, τα ζώα θανατώθηκαν και οι όγκοι εκτομήθηκαν SC και ζυγίστηκαν, ενώ οι πνεύμονες αποκόπηκαν και βαθμολογήθηκαν για μεταστάσεις επιφάνειας. Προς έκπληξή μας, TNF και ΤGFβ-επεξεργασμένα κύτταρα δεν σχημάτισαν όγκους SC στην ίδια έκταση όπως κυτοκίνη επεξεργασμένου 2D καλλιέργειες (Σχήμα 4Α, αριστερά). Ωστόσο, η εξέταση της επιφάνειας των πνευμόνων σε αυτά τα ποντίκια αποκάλυψε εκτεταμένη μετάσταση (Σχήμα 4Α, δεξιά). Η μόνη πιθανή εξήγηση για τα αποτελέσματα αυτά είναι ότι τα μεσεγχυματικά κύτταρα από καλλιέργειες 3D εισβολή και μετάσταση στον πνεύμονα χωρίς την ανάπτυξη όγκων SC.

(Α) μονόφυλλο και 3D καλλιέργειες Α549 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με TNF και TGFβ για ενενήντα έξι ώρες . Τα κύτταρα αναλυτικά και SC ένεση σε γυμνά ποντίκια (1 × 10

6 κύτταρα /ζώο). Σαράντα ημέρες αργότερα, οι πρωτογενείς όγκοι SC εκτομήθηκαν και ζυγίστηκαν. Επιπλέον, οι πνεύμονες αποκόπηκαν και ο αριθμός των μεταστάσεων επιφάνεια ήταν προσδιορισμό. (Β) μονόφυλλο και 3D καλλιέργειες Α549 είτε αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με TNF και ΤΟΡβ και περιορίζοντας αριθμούς κυττάρων (1 χ 10

3 /ζώο) ήσαν SC ένεση σε γυμνά ποντίκια για να αξιολογηθεί η παρουσία του CICs. Η μετάσταση αξιολογήθηκε με μέτρηση του όγκου επιφάνεια των πνευμόνων και φορτίο όγκου πνεύμονα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας γονιδιωματικό QRT-PCR για την ανίχνευση ανθρώπινου DNA σε συνολικό πνευμονικό ιστό. Το βάρος και μεταστάσεις πνεύμονα δεδομένα από το Σχήμα 4 είναι μέσες ± S.D. πέντε ποντίκια ανά συνθήκη, * ρ & lt? 0,05, Ν = 3 ανεξάρτητα πειράματα. δεδομένα Genomic QRT-PCR από το Σχήμα 4Β, ομαλοποιούνται στη συνολική πνευμονικό ιστό (mg).

Η

μέτρηση της έκτασης της μετάστασης υπό περιοριστική αραίωση κυττάρων αποδεικνύει μια αξιόπιστη δοκιμή για την παρουσία του εμπλουτισμένου CICs σε επιθηλιακά προερχόμενα όγκους [49]. Ως εκ τούτου, τα πειράματα επαναλήφθηκαν με τη χρήση ενός χιλιάδες κύτταρα ανά έγχυση SC. Κυτταρικά εναιωρήματα, που προέρχεται από τον TNF και ΤΟΡβ σφαιροειδή αντιμετωπίζεται, παρήγαγε περισσότερο μεταστάσεις επιφάνειας πνεύμονα υπό περιοριστική αραίωση κυττάρων απ μονοστιβάδες κυτοκίνη επεξεργασμένο ή 3D καλλιέργειες (Σχήμα 4Β αριστερά). Ο περιορισμός δοκιμασίες αραίωση των κυττάρων δείχνουν ότι η επαγωγή της EMT σε 3D πολιτισμούς παράγει έναν πληθυσμό CIC που μεθίσταται αποτελεσματικά στον πνεύμονα. Όπως ήταν αναμενόμενο, η ανάλυση του DNA που απομονώθηκε από τους πνεύμονες ποντικού επιβεβαίωσε την παρουσία μεταστατικής βάρος και επαλήθευσε ότι οι αλλοιώσεις ήταν ανθρώπινης προέλευσης (Σχήμα 4Β δεξιά). Συμπεραίνουμε από τα πειράματα στο Σχήμα 4 που απο-διαφοροποίηση, σχηματισμό CIC, και μεταστατικό δυναμικό είναι όλα σημαντικά αυξημένη σε EMT που προκαλείται πολιτισμούς σφαιροειδές.

NF-κΒ είναι ουσιαστικά δραστική σε 3D πολιτισμούς και απαιτείται για την επαγωγή του ΕΜΤ

TNF, ένα ισχυρός ενεργοποιητής ΝΡ-κΒ, ενισχύει επαγωγή ΕΜΤ σε κυτταρικές γραμμές NSCLC. Ως εκ τούτου, αξιολογήσαμε εάν η επαγωγή EMT αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση με ανοσοστύπωμα. Είναι ενδιαφέρον, μεσεγχυματικά σφαιροειδή Α549 εμφανίζεται συστατική δραστικότητα ΙΚΚ όπως μετράται με φωσφο-ειδικά αντισώματα τα οποία ανιχνεύουν ΙκΒα pS32 και ΚεΙΑ pS536 (Σχήμα 5Α και Σχήμα S2A). Αλλαγή στο E-cadherin και τα επίπεδα βιμεντίνης επιβεβαίωσε αποτελεσματική EMT στα σφαιροειδή κυτοκίνη θεραπεία. Επιπλέον, τα πειράματα QRT-PCR έδειξαν αυξημένη έκφραση του ΝΡ-κΒ-ρυθμιζόμενα γονίδια

IL8

και

BIRC3 /cIAP2

σε μεσεγχυματικά 3D καλλιέργειες (Σχήμα 5Β). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η κυτοκίνη θεραπεία του 3D καλλιέργειες Α549 ως αποτέλεσμα την αυξημένη φωσφορυλίωση του ΙΚΚ-ρυθμιζόμενων υποστρώματα και συστατική ενεργοποίηση της μεταγραφής ΝΡ-κΒ.

μονόφυλλο και 3D καλλιέργειες κυττάρων Α549 επωάστηκαν με κυτοκίνες για ενενήντα -έξι ώρες. (Α) Τα μεσεγχυματικά κύτταρα Α549 εμφανίζουν συστατική ΝΡ-κΒ ενεργοποιείται οδούς, όπως προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας φωσφο-εξειδικευμένα αντισώματα να ΙκΒα και ΚεΙΑ. (Β) Τα μη επεξεργασμένα και TNF και ΤΟΡβ διεγερμένα 2D και 3D καλλιέργειες κυττάρων Α549 συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για την έκφραση του NF-κΒ ρυθμιζόμενων γονιδίων με QRT-PCR. (Γ και Δ) Τρισδιάστατο καλλιέργειες A549.V (έλεγχος φορέα) και A549.I (SR-ΙκΒ) επωάστηκαν για ενενήντα-έξι ώρες απουσία ή παρουσία του TNF και ΤΟΡβ. (Γ) Τα ανοσοστυπώματα επιβεβαιώνουν την έκφραση του Flag-tagged SR-ΙκΒα στη γραμμή A549.I, η οποία εμπόδισε επιτυχώς πυρηνική μετατόπιση και σύνδεσης DNA, όπως μετράται με EMSA. (D) QRT-PCR επιβεβαίωσε την ανικανότητα του κυττάρου A549.I να ρυθμίζει αυξητικά ΝΡ-κΒ-ρυθμιζόμενα γονίδια εξής TNF και ΤΟΡβ θεραπεία. Ανοσοστυπώματα στο Σχήμα 5Α είναι ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα αποτελέσματα στην Εικόνα 5Β και 5D υπολογίζεται μέση τιμή ± SD, * ρ & lt? 0,05, Ν = 3. αξίες RNA ομαλοποιήθηκαν στο

GAPDH

Η

Για να προσδιοριστεί η σημασία της ΝΡ. κΒ κατά την επαγωγή της EMT σε κυτταρικές σειρές NSCLC, παρήχθησαν σταθερή κλωνική πισίνες που εκφράζουν την υπερ-καταστολέα ΙκΒα (SR-ΙκΒα). Το SR-ΙκΒα είναι ανθεκτική σε αποικοδόμηση πρωτεασωμική, και συνεπώς απομονώνει ΝΡ-κΒ στο κυτοσόλιο. Κύτταρα που εκφράζουν την πρωτεΐνη SR-ΙκΒα επομένως εμφανίζουν αναστολή του NF-κΒ διαμεσολαβούμενη μεταγραφή [50]. Σχήμα 5C (κορυφή) επιβεβαιώνει την έκφραση της Flag-tagged SR-ΙκΒα σε Α549 σταθερά κύτταρα (A549.I) σε σύγκριση με τα κενά κελιά φορέα ελέγχου (A549.V). Επιπλέον, εκχυλίσματα πυρηνικής πρωτεΐνης από A549.I καλλιέργειες σφαιροειδές, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με TNF και ΤΟΡβ, στερούνταν δραστικότητα δέσμευσης του ΝΡ-κΒ DNA σε σύγκριση με εκχυλίσματα A549.V (Σχήμα 5C, κάτω). Υπερμετατόπισης πειράματα επιβεβαιώνουν ότι η δραστικότητα του ΝΡ-κΒ αποτελείται κυρίως από ένα σύμπλοκο ΚεΙΑ-ρ50 ετεροδιμερούς (Σχήμα S2B). δοκιμασίες QRT-PCR δείχνουν καταπιεσμένη κυτοκίνη με τη μεσολάβηση επαγωγή

IL8

και

BIRC3 /cIAP2

στα κύτταρα A549.I σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου A549.V (Σχήμα 5D). Σε αντίθεση με υψηλές δόσεις TNF (100 ng /ml), χαμηλές δόσεις (10 ng /ml) δεν είχε ως αποτέλεσμα την απώλεια της βιωσιμότητας των κυττάρων στις γραμμές A549.I, αφού η έκφραση του σπιτιού κρατώντας γονίδιο, HPRT δεν μετέβαλε και χρησιμοποιήθηκε για ομαλοποίηση στο σχήμα 5D. Αυτά τα δεδομένα επαληθεύουν ότι η έκφραση SR-ΙκΒα στην κυτταρική σειρά A549.I αναστέλλει αποτελεσματικά την δραστικότητα της μεταγραφής NF-κΒ.

Χαρακτηρισμός του NF-κΒ στην ενδυνάμωση του φαινοτύπου μεσεγχυματικών

NF-κΒ έχει φαίνεται να ρυθμίζει την έκφραση του ΕΜΤ παραγόντων μεταγραφής master-διακόπτης σε πολλαπλά συστήματα μοντέλων [21] – [24]. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι αναστολή της δραστικότητας ΝΡ-κΒ στην κυτταρική γραμμή A549.I θα αμβλύνουν EMT επαγωγή. Η ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως επιβεβαίωσε ότι A549.I κύτταρα αποτυγχάνουν να ρυθμίσουν προς τα κάτω την έκφραση Ε-καδερίνης ή ρυθμίζουν προς τα πάνω δείκτες μεσεγχυματικών (βιμεντίνης, Ν-καδερίνης και ινονεκτίνη) σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 6Α). Επιπλέον, κυτοκίνη κύτταρα κατεργασμένα A549.I έδειξαν μόνο ελάχιστη αυξητική ρύθμιση του

TWIST1

,

ZEB2

και

SNAI2

γονίδιο έκφρασης μετά TNF και θεραπεία ΤΟΡβ (Σχήμα 6Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η NF-κΒ είναι υποχρεωμένη να ρυθμίζουν προς τα πάνω

TWIST1

,

ZEB2

και

SNAI2

, ενώ η έκφραση του

SNAI1

εμφανίζεται ανεξάρτητα από ΝΡ κΒ-εξαρτώμενης μεταγραφής στο A549.I κυτταρική γραμμή. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκφραση των κρίσιμων EMT μεταγραφικών παραγόντων κεντρικός διακόπτης απαιτεί δράση του NF-κΒ. Κύτταρα

(Α) A549.I αποτυγχάνουν να δείξουν μεταβολές στους δείκτες μεσεγχυματικά, όπως προσδιορίστηκε με ανάλυση ανοσοαποτύπωσης. (Β) ΝΡ-κΒ είναι υποχρεωμένη να ρυθμίζουν προς τα πάνω έκφραση του mRNA των παραγόντων μεταγραφής master-διακόπτη. (Γ) σφαιροειδές καλλιέργειες Α549 και κυτταρικών σειρών Η157, που εκφράζουν κενό φορέα ή το Flag-ΙκΒ υπερ-καταστολέα, έμειναν μόνο (αριθ ADD) ή υποβάλλεται σε επεξεργασία με TNF και ΤΟΡβ (TNF /TGF) για ενενήντα-έξι ώρες. Τα κύτταρα αναλύονται και υποβάλλονται σε δοκιμασίες εισβολή. (D) A549.V και A549.I 3D καλλιέργειες αφέθηκαν μόνα (αριθ ADD) ή υποβάλλεται σε επεξεργασία με TNF και ΤΟΡβ (TNF /TGF) για ενενήντα-έξι ώρες. Τα κύτταρα αναλυτικά και SC ένεση σε γυμνά ποντίκια (1 × 10

6 /ζώο). Σαράντα ημέρες αργότερα, τα ζώα θανατώθηκαν και ο αριθμός των μεταστάσεων πνεύμονα επιφάνειας προσδιορίστηκαν. Επιπλέον, οι όγκοι SC αποκόπηκαν και προσδιορίστηκε υγρό βάρος του όγκου. Το βάρος και μεταστάσεις πνεύμονα δεδομένα από το Σχήμα 6 είναι μέσες ± S.D. πέντε ποντίκια ανά συνθήκη, * ρ & lt? 0,05, Ν = 3 ανεξάρτητα πειράματα. Οι γραφικές παραστάσεις στο Σχήμα 6 είναι οι μέσες ± S.D., * ρ & lt? 0,05, τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Δεδομένα με

P

τιμές μεγαλύτερες από 0,05 θεωρήθηκαν μη σημαντική (

ns

). πειράματα QRT-PCR κανονικοποιούνται στο

GAPDH

έκφρασης.

Η

Στη συνέχεια, θα αξιολογηθεί κατά πόσον NSCLC απαιτείται NF-κΒ για την εισβολή χρησιμοποιώντας Transwell προσδιορισμούς. Σαθεροποιημένο δραστικότητα ΝΡ-κΒ σε κύτταρα A549.I καταργηθεί εισβολή μέσω Matrigel σε σύγκριση με τις γραμμές ελέγχου (Σχήμα 6C). Αυτό το αποτέλεσμα δεν ήταν κυτταρική γραμμή ειδική καθώς μία άλλη γραμμή NSCLC που εκφράζει το SR-ΙκΒ (H157.I) έδειξε παρόμοια αποτελέσματα με τα κύτταρα A549.I. Επειδή τα δεδομένα δείχνονται στο Σχήμα 6 δείχνουν ότι ο ΝΡ-κΒ είναι απαραίτητη για να υποβληθεί σε NSCLC EMT, ελέγξαμε την A549.V και A549.I κυττάρων για την ικανότητά τους να υφίστανται μετάσταση σε πνεύμονες χρησιμοποιώντας ένα γυμνό μοντέλο ποντικού. Όπως αναμενόταν, κυτοκίνη κατεργασμένα κύτταρα A549.I απέτυχαν να σχηματίσουν μεταστάσεις πνεύμονα (Σχήμα 6D, αριστερά). Η ανικανότητα αυτών των κυττάρων να υφίστανται μετάσταση στον πνεύμονα δεν οφειλόταν σε απώλεια της βιωσιμότητας των κυττάρων ή την αδυναμία να σχηματίσουν πρωτογενείς όγκους, αφού ανεπεξέργαστα A549.I σχηματίζονται όγκοι SC με παρόμοιους ρυθμούς ανάπτυξης όπως κύτταρα A549.V (Σχήμα 6D, δεξιά). Έτσι, τα στοιχεία που φαίνεται στο σχήμα 6 δείχνει ότι TNF και ΤΟΡβ επεξεργασμένες καλλιέργειες 3D NSCLC απαιτούν NF-κΒ να ρυθμίζει αυξητικά παράγοντες μεταγραφής master-διακόπτης, επάγουν ΕΜΤ, και να προωθήσει επεμβατική ιδιότητες. Επιπλέον, χωρίς να μεταγραφική δραστηριότητα του NF-κΒ κύτταρα Α549 χάνουν την ικανότητά τους να κάνουν μετάσταση σε πνεύμονες χωρίς να επηρεάζεται πρωτογενή ανάπτυξη του όγκου.

Discusson

NF-κΒ ρυθμίζει την EMT να ενισχύσει τη μεταστατική εξέλιξη του NSCLC

Έχουμε εφαρμόσει ένα απλό και σχετικά γρήγορο σύστημα 3D πολιτισμού για να εξετάσει τη σημασία της NF-κΒ σηματοδότηση κατά την επαγωγή EMT και διάδοσης CIC εντός κυτταρικές σειρές NSCLC. Σε απάντηση του TNF και ΤΟΡβ έκθεση, καλλιέργειες Α549 σφαιροειδές εμφανίζεται απώλεια Ε-καδερίνης και αυξημένη έκφραση των δεικτών μεσεγχυματικών, Ν-καδερίνη, βιμεντίνη, και ινονεκτίνη. Η αυξημένη έκφραση των δεικτών μεσεγχυματικών πρωτεΐνης πιθανόν συμβαίνει λόγω της επαγωγής των παραγόντων μεταγραφής EMT master-διακόπτη,

TWIST1

,

SNAI1

,

SNAI2

και

ZEB2

. Επιπλέον, σφαιροειδές πληθυσμούς κυττάρων Α549 μεσεγχυματικών δείχνουν αυξημένη έκφραση των ενδογενών παραγόντων μεταγραφής που είναι γνωστό ότι ενισχύουν αποδιαφοροποίηση, συμπεριλαμβανομένων των

KLF4

,

SOX2

,

POU5F1

,

MYCN

και

KIT

. Είναι ενδιαφέρον, μεσεγχυματικά κύτταρα Α549 από σφαιροειδές πολιτισμούς απέτυχαν να παράγουν μεγάλους όγκους SC, σε σύγκριση με 2D καλλιέργειες. Παρά το σκοπό αυτό, κυτοκίνη επεξεργασία 3D Α549 κύτταρα εμφανίζονται αυξημένα πνευμονικών βλαβών επιφάνεια μεταστατικό. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι CICs εξαγγείωση μέσα στο κυκλοφορικό σύστημα και μεταστάσεις στον πνεύμονα χωρίς σχηματισμό όγκων SC. Δείξαμε επίσης ότι ΕΜΤ-επαγόμενη 3D καλλιέργειες Α549 μεταστάσεις αποτελεσματικά στον πνεύμονα υπό περιοριστικές αραιώσεις κυττάρων, επιβεβαιώνοντας την παρουσία ενός εμπλουτισμένου «στέλεχος-όπως το» πληθυσμός CIC.