Αφηρημένο

Το Minute 2 πρωτεΐνη ποντικού Δίκλινο (MDM2) είναι ένας βασικός ρυθμιστής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης που δρα κυρίως αναστέλλοντας την καταστολέα όγκου ρ53. Ομοίως, η ΡΙ3-κινάσης (ΡΙ3Κ) /μονοπατιού AKT είναι κρίσιμης σημασίας για την ανάπτυξη παράγοντας μεσολάβηση κυτταρικής επιβίωσης. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι η ΑΚΤ μπορεί άμεσα φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν MDM2. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι ο IGF-1-up ρυθμίζει τα επίπεδα πρωτεΐνης MDM2 σε ΡΙ3Κ /ΑΚΤ-εξαρτώμενο τρόπο. Αναστολή της mTOR με ραπαμυκίνη ή έκφραση μιας δεσπόζουσας αρνητικό παράγοντα ευκαρυωτικό έναρξης 4Ε δεσμευτική πρωτεΐνη 1 (4EBP1) μεταλλαγμένη πρωτεΐνη, καθώς και εκτομή των ευκαρυωτικών παράγοντα έναρξης 4Ε (eIF4E), καταργεί αποτελεσματικά IGF-1 με τη μεσολάβηση πάνω ρύθμιση MDM2. Επιπλέον, δείχνουμε ότι η ραπαμυκίνη αναστέλλει αποτελεσματικά την έκφραση MDM2 και ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα στη χημειοθεραπεία. Στο σύνολό τους, η μελέτη αυτή αποκαλύπτει ένα νέο μηχανισμό με τον οποίο IGF-1 ενεργοποιεί MDM2 μέσω της οδού mTOR, και ότι η φαρμακολογική αναστολή της mTOR σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία μπορεί να είναι πιο αποτελεσματική στη θεραπεία ενός υποσυνόλου των καρκίνων που φιλοξενούν αυξημένη ενεργοποίηση MDM2.

Παράθεση: Du W, Yi Υ, Zhang Η, Bergholz J, Wu J, Ying H, et al. (2013) Η ραπαμυκίνη Αναστέλλει IGF-1-Mediated ανοδική ρύθμιση του MDM2 και ευαισθητοποιεί καρκινικά κύτταρα σε χημειοθεραπεία. PLoS ONE 8 (4): e63179. doi: 10.1371 /journal.pone.0063179

Επιμέλεια: Zhi-Min Yuan, Πανεπιστήμιο του Τέξας Κέντρο Υγείας Επιστημών στο Σαν Αντόνιο /Greehey CCRI, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 Νοεμβρίου 2012? Αποδεκτές: 29, Μάρτη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 30 Απριλίου 2013

Copyright: © 2013 Du et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) επιχορηγήσεις (CA79804) και από το Εθνικό Key Πρόγραμμα βασικής Έρευνας (973 Program) της Κίνας (2012CB910700) σε ZX, Τμήμα Πολιτείες Ηνωμένο της επιχορήγησης άμυνας Congressionally Σκηνοθεσία Ιατρικής Έρευνας Προγράμματα (W81XWH-10 -1 έως 0.161) σε JB. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ανώμαλη ενεργοποίηση του ποντικού Δίκλινο Minute 2 (MDM2) έχει καθιερωθεί ως σημαντικός αιτιολογικός παράγοντας στην ανάπτυξη του ανθρώπινου καρκίνου. MDM2 λειτουργεί ως ουβικουϊτίνης Ε3 λιγάση για να διευκολύνει αποικοδόμηση της ρ53, ένα κλειδί ρυθμιστή για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση και γήρανση σε απόκριση σε κυτταρικές καταπονήσεις, όπως βλάβη του DNA και ογκογόνο στρες [1]. Ενίσχυση του

MDM2

γονίδιο έχει παρατηρηθεί σε μία ποικιλία ανθρώπινων όγκων και καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων των όγκων μαλακών ιστών, οστεοσάρκωμα, καρκίνωμα του οισοφάγου και [2]. Αξιοσημείωτα, MDM2 έχει αποδειχθεί ότι διαθέτει ανεξάρτητη της ρ53 ογκογόνο λειτουργίες [3], [4]. Εργασία από εμάς και άλλους έχουν δείξει ότι μπορούν να στοχεύσουν MDM2 και αναστέλλουν την πρωτεΐνη ρετινοβλαστώματος (Rb) μέσω πρωτεασώματος με τη μεσολάβηση της υποβάθμισης [5], [6], [7], [8], [9]. MDM2 έχει επίσης δειχθεί να συμπλόκου με και να ρυθμίζουν τη σταθερότητα της πρωτεΐνης ή /και της δραστηριότητας ενός υποσυνόλου των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και θάνατο των κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των ρ73 [10], [11], E2F1 [12], εξαρτώμενη από κυκλίνη ρ21 αναστολέα κινάσης [13], βήτα-αρρεστίνης, και G-πρωτεΐνη-συζευγμένο υποδοχέα κινάσης 2 (ΟΡΚ2) [14], [15].

έχει αποδειχθεί ότι MDM2 πρωτεΐνη υποκυτταρικό εντοπισμό και οι λειτουργίες ρυθμίζονται από την ΡΙ3 την κινάση (PI3K) /AKT οδό. ΑΚΤ να φωσφορυλιώνει άμεσα MDM2 σε Ser166 και Ser188, διευκολύνοντας έτσι την πυρηνική μετατόπιση [16] και η υποβάθμιση του p53, καθώς και την αλληλεπίδραση p300 [17], [18]. Επιπλέον, η υπερέκφραση του ΑΚΤ έχει δειχθεί να σταθεροποιήσει MDM2 πρωτεΐνη [19]. Πρόσφατα, η ΑΚΤ έχει αναδειχθεί ως κρίσιμο ρυθμιστή του στόχου θηλαστικών σύνθετων ραπαμυκίνης 1 (mTORC1). ΑΚΤ αναστέλλει την πολύπλοκη TSC2 /TSC1, οδηγώντας σε ενεργοποίηση της mTORC1 [20]. Είναι σημαντικό, οι αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι η δραστηριότητα mTORC1 είναι κρίσιμη για την ΑΚΤ ογκογόνο λειτουργία. Πράγματι, η επιτάχυνση της ανάπτυξης του όγκου κατά την συστατική ενεργοποίηση της ΑΚΤ αντιστρέφεται από την αναστολή της mTOR [21]. Παρομοίως, τα ποντίκια που εκφράζουν ανθρώπινο ΑΚΤ1 στον προστάτη αναπτύξει ένα νεοπλαστικό φαινότυπο, η οποία είναι πλήρως καταργηθεί από την αναστολή της mTOR [22]. Επιπλέον, η αδρανοποίηση του ΑΚΤ οδηγεί σε αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, η οποία εξαρτάται από mTORC1 [23]. Αυτές οι μελέτες υποδεικνύουν ότι η οδός mTOR ΑΚΤ είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου.

Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι η ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα 1 (IGF-1) up-ρυθμίζει την έκφραση MDM2 μέσω της ΑΚΤ mTOR μονοπάτι. Η αναστολή της mTOR από ραπαμυκίνη, την έκφραση της δεσπόζουσας αρνητικό παράγοντα ευκαρυωτικό έναρξη 4Ε δεσμευτική πρωτεΐνη 1 (4EBP1) μεταλλαγμένο ή αποσιώπηση των ευκαρυωτικών παράγοντα έναρξης 4E (eIF4E) αποτελεσματικά καταργεί IGF-1 με τη μεσολάβηση up-ρύθμιση του MDM2. Επιπλέον, δείχνουμε ότι η ραπαμυκίνη αναστέλλει αποτελεσματικά την έκφραση MDM2 και ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα να χημειοθεραπευτικό φάρμακο προκαλούμενη απόπτωση.

Αποτελέσματα

IGF-1 επάγει έκφραση MDM2 σε ΡΙ3Κ-εξαρτώμενο τρόπο και δεν ALTER MDM2 πρωτεΐνη Σταθερότητας ή σταθερά επίπεδα mRNA

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι η IGF-1 ρυθμίζει την εξαρτώμενη από κυκλίνη αναστολέα κινάσης p21 να επηρεάσουν την κυτταρική επιβίωση μετά γονοτοξικό στρες [24]. Από την IGF-1 είναι γνωστό ότι ενεργοποιεί το μονοπάτι ΡΙ3Κ /ΑΚΤ, ενδιαφερθήκαμε στην αποκρυπτογράφηση του ρόλου των ΡΙ3Κ /ΑΚΤ στην κυτταρική επιβίωση IGF-1 με τη μεσολάβηση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, IGF-1 θεραπεία του ανθρώπινου οστεοσαρκώματος κυττάρων U2-OS άνευ ορού (ρ53 άγριου τύπου) οδήγησε σαφώς σε ενεργοποίηση ΑΚΤ, όπως φαίνεται από την αύξηση της φωσφορυλίωσης ΑΚΤ. Αξιοσημείωτα, IGF-1 που προκαλείται από την έκφραση της πρωτεΐνης MDM2, όπως φαίνεται από την αύξηση και των δύο ζωνών πρωτεϊνών ΜΌΜ2 ανιχνεύεται από ένα MDM2-ειδικό αντίσωμα, SMP14, σύμφωνο με προηγούμενες αναφορές [6], [9], [25]. Αυτή η επίδραση του IGF-1 επί MDM2 ανεστάλη αποτελεσματικά με επεξεργασία με LY294002, ένας επιλεκτικός αναστολέας της ΡΙ3Κ [26], αλλά όχι από PD98059, ενός αναστολέα της κινάσης ΜΑΡ κινάσης (ΜΕΚ), ή με SB203580, ένας ειδικός αναστολέας της p38 άγχους ενεργοποιημένη πρωτεΐνη κινάση [27]. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο IGF-1-up ρυθμίζει την έκφραση της πρωτεΐνης MDM2 μέσω του καταρράκτη σηματοδότησης της ΡΙ3Κ-ΑΚΤ.

(Α) U2-OS κύτταρα τον ορό επί 24 ώρες και στη συνέχεια προ-αγωγή είτε με PI3- κινάσης (ΡΙ3Κ) LY294002 (20 μΜ), κινάση ΜΑΡ κινάσης (ΜΕΚ) ΡΟ98059 αναστολέα (25 μΜ), ή ρ38 στρες-ενεργοποιημένης πρωτεΐνης SB202190 αναστολέα κινάσης (10 μΜ) για τέσσερις ώρες, ακολουθούμενη από επεξεργασία με IGF-1 (50 ng /mL) για έξι ώρες. Τα κύτταρα λύθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. (Β) κύτταρα Η1299 ήταν άνευ ορού με επώαση σε απουσία FBS για 24 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με IGF-1 για έξι ώρες, όπως υποδεικνύεται. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. S: σύντομη έκθεση? L:. Μακρά έκθεση

Η

Από το έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι η IGF-1 μπορεί να ενεργοποιήσει p53, και MDM2 είναι μια άμεση κατάντη στόχος της ρ53 [24], ρωτήσαμε αν η επίδραση του IGF-1 για το έκφραση MDM2 εξαρτάται από ρ53. Εμείς αγωγή ρ53-ηυΙΙ ανθρώπινο μη-μικροκυτταρικό καρκίνωμα του πνεύμονα κυττάρων Η1299 με IGF-1. IGF-1 ήταν ακόμη σε θέση να επάγει την έκφραση της πρωτεΐνης MDM2 σε Η1299 κύτταρα σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 1Β), υποδηλώνοντας ότι ο IGF-1 με τη μεσολάβηση πάνω ρύθμιση του MDM2 είναι ανεξάρτητη της ρ53.

Στη συνέχεια, ερευνήσαμε αν IGF-1-up ρυθμίζει τα επίπεδα πρωτεΐνης MDM2 αυξάνοντας τη σταθερότητα της πρωτεΐνης της. Όπως αναμενόταν, ο IGF-1 αύξησε έκφραση της πρωτεΐνης MDM2 (Σχήμα 2Α). Ωστόσο, IGF-1 θεραπεία δεν μετέβαλε σημαντικά πρωτεΐνη MDM2 ημίσειας ζωής, όπως προσδιορίζεται με κατεργασία με το κυκλοεξιμίδιο αναστολέα βιοσύνθεσης πρωτεΐνης (Εικόνα 2Α και 2Β) και με πειράματα σήμανσης-εκδίωξης (εικόνα 2C και 2D). Στη συνέχεια εξετάστηκε κατά πόσον IGF-1 επάγει MDM2 με την αύξηση των επιπέδων του mRNA. Ωστόσο, η ανάλυση ποσοτικής PCR (Q-PCR) έδειξε ότι τα επίπεδα MDM2 mRNA δεν επηρεάστηκαν σημαντικά από IGF-1 θεραπεία (Σχήμα 2Ε), υποδεικνύοντας ότι ο IGF-1 δεν επηρεάζει τα επίπεδα σταθερής κατάστασης του mRNA.

( Α) κύτταρα U2-OS ήταν άνευ ορού για 24 ώρες πριν από την αγωγή με IGF-1 (50 ng /mL) για έξι ώρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 50 μg /mL κυκλοεξιμιδίου (ΟΗΧ) παρουσία ή απουσία του IGF-1 και συλλέχθηκαν στους χρόνους που υποδεικνύονται. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western για MDM2 και ακτίνη. (Β) Ποσοτική ανάλυση των επιπέδων της πρωτεΐνης MDM2 από κύτταρα επεξεργασμένα με CHX διεξήχθησαν με σάρωση πυκνομετρίας για κάθε μεμονωμένη ζώνη πρωτεΐνης MDM2 και την αντίστοιχη ταινία πρωτεΐνης ακτίνης. Η αναλογία του MDM2 πάνω ακτίνης στο χρονικό σημείο μηδέν αυθαίρετα οριστεί ως 100 τοις εκατό. Τρία ανεξάρτητα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν με παρόμοια αποτελέσματα. κύτταρα (C) U2-OS υποβλήθηκαν σε αγωγή με IGF-1 (50 ng /mL) για έξι ώρες και μεταβολικά σημάνθηκαν με

35S-μεθειονίνη για σαράντα λεπτά, και στη συνέχεια εκδιώχθηκε με κρύο μεθειονίνη. Τα κυτταρολύματα με ίσες ποσότητες ραδιενέργειας ανοσοκαταβυθίζονται με αντίσωμα έναντι SMP14 MDM2. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και κατέστησαν ορατά με αυτοραδιογραφία. (Δ) Η ποσοτική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με σάρωση πυκνομετρία χρησιμοποιώντας ImageQuant λογισμικού. κύτταρα (Ε) ορού-στέρηση U2-OS υποβλήθηκαν σε αγωγή με IGF-1 (50 ng /mL) για έξι ώρες. τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου ΜΌΜ2 προσδιορίσθηκαν με ποσοτική-PCR (Q-PCR) και ομαλοποιήθηκε ως προς την έκφραση GAPDH. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσα και SE δύο ανεξάρτητων πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν.

Η

Η αναστολή της mTOR από ραπαμυκίνη Μπλοκ IGF-1 και Ερεγκουλίνη μεσολάβηση Up-ρύθμιση της MDM2

ΑΚΤ έχει έχει αποδειχθεί ότι είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της δραστικότητας mTORC1. Έτσι, διερευνήσαμε κατά πόσον η οδός mTOR παίζει ρόλο στην IGF-1 με τη μεσολάβηση πάνω ρύθμιση MDM2. Για το σκοπό αυτό, μπορούμε άνευ ορού και στη συνέχεια προκατεργασία κυττάρων U2-OS με ραπαμυκίνη, ένα εκλεκτικός αναστολέας για mTOR [28], πριν από την IGF-1 θεραπεία. Όπως ήταν αναμενόμενο, η ραπαμυκίνη μπλοκάρει φωσφορυλίωση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης S6 (Σχήμα 3Α). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η ραπαμυκίνη μπλοκάρει επίσης IGF-1 που προκαλείται από MDM2 ανοδική ρύθμιση (Σχήμα 3Α). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε Η1299 κύτταρα, στα οποία η ραπαμυκίνη ακύρωσε IGF-1 που προκαλείται από MDM2 ανοδική ρύθμιση και φωσφορυλίωση 4EBP1 (Σχήμα 3Β). Επιπλέον, η έκφραση μόνιμα ενεργών ΑΚΤ (ΑΚΤ-μυριστικό) οδήγησε σε αύξηση των επιπέδων της πρωτεΐνης MDM2, η οποία ήταν εντελώς αποκλεισμένη παρουσία ραπαμυκίνης (Σχήμα 3C). Στο σύνολό τους, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν σθεναρά την ιδέα ότι μια ραπαμυκίνη ευαίσθητη οδός είναι κρίσιμη για τη ρύθμιση των MDM2 μέσω σηματοδότησης IGF-1 /PI3K /AKT.

U2-OS (Α) ή Η1299 (Β) κύτταρα στερούνται ορού και προ-αγωγή με ραπαμυκίνη (50 ηΜ) για τέσσερις ώρες, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με IGF-1 (50 ng /mL) για έξι ώρες. Τα κύτταρα λύθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. Ποσοτικές αναλύσεις των επιπέδων της πρωτεΐνης MDM2 διεξήχθησαν με σάρωση πυκνομετρίας για κάθε μεμονωμένη ζώνη πρωτεΐνης MDM2 και την αντίστοιχη ταινία πρωτεΐνης ακτίνης. Η αναλογία του MDM2 πάνω ακτίνης στο δείγμα ελέγχου αυθαίρετα ως 1.0. κύτταρα (C) U2-OS μολύνθηκαν με ανασυνδυασμένο αδενοϊό που κωδικοποιεί GFP ή μυριστικό-ΑΚΤ για 24 ώρες πριν από τη θεραπεία με ραπαμυκίνη (100 ηΜ) για τέσσερις ώρες. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western.

Η

Από Ερεγκουλίνη μπορεί να ενεργοποιήσει ΑΚΤ, αναρωτηθήκαμε εάν αυτό θα μπορούσε να συνδέτη πλειορύθμιση MDM2 σε mTOR-εξαρτώμενο τρόπο. MCF-7 κύτταρα ή Η1299 κύτταρα στερήθηκαν ορό πριν από τη θεραπεία με ραπαμυκίνη, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ερεγουλίνη-βήτα (HRG). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, η ενεργοποίηση της σηματοδότησης ΑΚΤ με HRG επαχθεί αποτελεσματικά την έκφραση της πρωτεΐνης MDM2, η οποία ήταν εντελώς αποκλεισμένη από ραπαμυκίνη σε αμφότερες-7 MCF και Η1299 κύτταρα (Σχήμα 4Α και 4Β). Επιπλέον, η LY294002 αναστολέα ΡΙ3Κ ανέστειλε αποτελεσματικά την επίδραση της HRG για την ρύθμιση προς τα πάνω του MDM2 (Σχήμα 4Β), δεικνύοντας ότι ερεγουλίνη μεσολάβηση πάνω ρύθμιση του MDM2 εξαρτάται ΡΙ3Κ. Μαζί, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η ραπαμυκίνη ευαίσθητη οδό απαιτείται για αυξητική ρύθμιση των MDM2 από τις οδούς σηματοδότησης IGF-1 ή Ερεγκουλίνη.

(Α) κύτταρα MCF-7 σε παντελή στέρηση ορού και προ-επεξεργασμένο με ραπαμυκίνη (50 ηΜ) για τέσσερις ώρες, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ερεγουλίνη βήτα (HRG? 25 ng /mL) για 24 ώρες. Τα κύτταρα λύθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. (Β) σε παντελή στέρηση ορού κύτταρα Η1299 προ-αγωγή με ραπαμυκίνη (50 ηΜ) ή LY294002 (20 μΜ) για τέσσερις ώρες, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ερεγουλίνη βήτα (25 ng /mL) για 24 ώρες. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western.

Η

έκφραση ενός μεταλλαγμένου 4EBP1 Ελαττωματική σε mTOR Φωσφορυλίωση εξασθενεί IGF-1 με τη μεσολάβηση Up-ρύθμιση του MDM2

επόμενο καθοριστεί αν eIF4E, μια σημαντική προς τα κάτω στόχος του mTOR, συμμετέχει σε IGF-1 με τη μεσολάβηση πάνω ρύθμιση MDM2. Από mTOR φωσφορυλιώνει 4EBP1, με αποτέλεσμα διαχωρισμό του από eIF4E και οδηγεί στο σχηματισμό του συμπλόκου έναρξης μετάφρασης [29], χρησιμοποιήσαμε μεταλλαγμένο 4EBP1-5A, το οποίο στερείται των πέντε θέσεις φωσφορυλίωσης Ser /Thr στοχεύονται από mTOR και έτσι δρα ως ένα κυρίαρχο αρνητικό αναστολέα με τη δέσμευση elF4E για την πρόληψη της έναρξης της μετάφρασης [30]. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα Η1299 επιμολύνθηκαν παροδικά είτε με άγριου τύπου 4EBP1 ή 4EBP1-5A, ακολουθούμενη από στέρηση ορού και IGF-1 θεραπεία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, IGF-1 θεραπεία οδήγησε σε απότομη αύξηση στη φωσφορυλίωση του ΑΚΤ, S6 και 4EBP1, συσχετίζεται με μία σημαντική αύξηση στην έκφραση MDM2. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η έκφραση του άγριου τύπου 4EBP1 δεν μετέβαλε σημαντικά τη δράση του IGF-1 επί της έκφρασης MDM2, πιθανόν να οφείλεται στην αποτελεσματική φωσφορυλίωση 4EBP1 σε Η1299 κύτταρα. Ωστόσο, IGF-1 με τη μεσολάβηση MDM2 πάνω ρύθμιση ανεστάλη σημαντικά με έκτοπη έκφραση της 4EBP1-5A. Στη συνέχεια, προκειμένου να διερευνηθεί ο ρόλος του eIF4E άμεσα, μπορούμε αποκοπεί ενδογενή eIF4E χρησιμοποιώντας μικρά RNA παρεμβολής (siRNA) σε κύτταρα U2-OS. Ενώ φίμωση eIF4E δεν επηρέασε σημαντικά βασική έκφραση ΜΌΜ2 (Σχήμα 5Β), knockdown του eIF4E κατήργησε εντελώς την επίδραση του IGF-1 στην αύξηση των επιπέδων MDM2, παρά προφανές 4EBP1 φωσφορυλίωση (Σχήμα 5C).

(Α) Η1299 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με άγριου τύπου 4EBP1, 4EBP1-5A, ή φορέα πλασμιδίου. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα χωρίστηκαν και διατηρήθηκε για επιπλέον 24 ώρες πριν από την ασιτία ορού για 24 ώρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με ή χωρίς IGF-1 (50 ng /mL) για έξι ώρες. Τα κύτταρα λύθηκαν και υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western. Ποσοτικές αναλύσεις των επιπέδων της πρωτεΐνης MDM2 διεξήχθησαν με σάρωση πυκνομετρίας για κάθε μεμονωμένη ζώνη πρωτεΐνης MDM2 και την αντίστοιχη ταινία πρωτεΐνης ακτίνης. Η αναλογία του MDM2 πάνω ακτίνης στο δείγμα ελέγχου (λωρίδα 1) αυθαίρετα οριστεί ως 1,0. (Β) κύτταρα U2-OS επιμολύνθηκαν παροδικά με siRNA ειδικό κατά eIF4E (si4E) ή με ένα ανακατωμένο έλεγχο (siScr). Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western, όπως φαίνεται. (C) κύτταρα U2-OS επιμολυσμένα με si4E ή siScr ήταν άνευ ορού για 24 ώρες πριν από τη θεραπεία με ή χωρίς 5 ng /mL IGF-1 επί έξι ώρες. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western, όπως φαίνεται. κύτταρα (D) U2-OS επιμολύνθηκαν παροδικά με siRNA ειδικό κατά S6K (siS6K) ή ένα κωδικοποιημένο siRNA (siScr). Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western, όπως φαίνεται. (Ε) κύτταρα U2-OS επιμολυσμένα με siS6K ή siScr ήταν άνευ ορού για 24 ώρες πριν από τη θεραπεία με ή χωρίς 5 ng /mL IGF-1 επί έξι ώρες. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western, όπως φαίνεται.

Η

Εκτός από φωσφορυλίωση και την αναστολή 4EBP1, mTOR φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί ριβοσωμικής πρωτεΐνης S6 κινάσης (S6K), η οποία με τη σειρά της φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί την πρωτεΐνη ριβοσωμική S6 σε Προκειμένου να ενισχυθεί η μετάφραση της πρωτεΐνης. Έτσι, αποκόπτεται S6K από siRNA στα κύτταρα U2-OS. Όπως φαίνεται στο σχήμα 5D και 5Ε, παρατηρήσαμε παρόμοια αποτελέσματα με eIF4E knockdown, υποδεικνύοντας IGF-1 με τη μεσολάβηση MDM2 πάνω ρύθμιση απαιτεί σηματοδότηση mTOR, η οποία περιλαμβάνει τόσο τα μονοπάτια eIF4E και S6K.

Η ραπαμυκίνη Θεραπεία μειώνει την έκφραση MDM2 και ευαισθητοποιεί καρκινικά κύτταρα να Doxorubicin- Induced απόπτωση

Δεδομένου ότι MDM2 είναι ένας βασικός αρνητικός ρυθμιστής της ρ53, η οποία είναι απαραίτητη για το DNA βλάβη επαγόμενη απόπτωση, διερευνήσαμε την επίδραση της ραπαμυκίνης επί δοξορουβικίνη επαγόμενη απόπτωση σε ρ53-θετικούς τα καρκινικά κύτταρα. Εμείς επιλέξαμε MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού επειδή φιλοξενούν μια σωματική μετάλλαξη στο γονίδιο PIK3CA που προσδίδει ένα ιδιοσυστατικά ενεργού οδού ΑΚΤ mTOR [31]. Τα κύτταρα MCF-7 προκατεργάστηκαν με ραπαμυκίνη, που ακολουθείται από κατεργασία με μια χαμηλή δόση της δοξορουβικίνης. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με trypan blue δοκιμασία αποκλεισμού και ανάλυση κηλίδος western για διάσπαση πολυ ΑϋΡ-ριβόζη πολυμεράση (PARP), ένα βιοχημικό δείκτη για την απόπτωση. Υπό αυτές τις συνθήκες, ούτε η ραπαμυκίνη ούτε ντοξορουμπικίνη μόνο επάγεται σημαντικά απόπτωση. Ωστόσο, με την παρουσία της ραπαμυκίνης, δοξορουβικίνη αποτελεσματικά επαγόμενο κυτταρικό θάνατο (Εικόνα 6Α). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η ραπαμυκίνη εντελώς αποκλεισμένη πάνω ρύθμιση του MDM2, αλλά όχι του ρ53 (Σχήμα 6Β). Παρόμοια φαινόμενα παρατηρήθηκαν σε ανθρώπινα κύτταρα οστεοσαρκώματος SJSA-1, που φιλοξενούν ενίσχυση MDM2 [25] (Σχήμα 6C και 6D). Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ραπαμυκίνη καταστέλλει την έκφραση της πρωτεΐνης MDM2, με αποτέλεσμα την ευαισθητοποίηση των καρκινικών κυττάρων στη δοξορουβικίνη-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο.

(Α-Β) κύτταρα MCF-7 διατηρήθηκαν σε κανονικό μέσο ανάπτυξης, προκατεργασμένο με ραπαμυκίνη (100 ηΜ) για 48 ώρες, και στη συνέχεια κατεργάζεται με δοξορουβικίνη (0,6 μg /mL) για 24 ώρες. Αμφότερα τα επιπλέοντα και τα προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν, και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία μπλε τρυπάνης αποκλεισμού (Α) και ανάλυση κηλίδος western (Β). Η βιωσιμότητα των κυττάρων παρουσιάζεται ως ποσοστό των ζωντανών κυττάρων επί του συνόλου των κυττάρων που μετρήθηκαν. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο και SE τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που εκτελούνται εις τριπλούν. (C) SJSA-1 κύτταρα διατηρήθηκαν σε κανονικό μέσο ανάπτυξης, προκατεργασμένο με ραπαμυκίνη (100 ηΜ) για 48 ώρες και στη συνέχεια κατεργάζεται με δοξορουβικίνη (1 μg /mL) για 36 ώρες. Αμφότερα τα επιπλέοντα και τα προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν, και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. (Δ) Μορφολογία των SJSA-1 κύτταρα καταγράφηκε με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης (100 Χ).

Η

επόμενο διερευνηθεί αν τα κάτω ρύθμιση MDM2 παίζει αιτιολογικό ρόλο στην ευαισθητοποίηση των κυττάρων στη δοξορουβικίνη με ραπαμυκίνη θεραπεία. Εμείς επεξεργασμένα κύτταρα U2-OS με ραπαμυκίνη και δοξορουβικίνη είτε παρουσία ή απουσία έκτοπη έκφραση της MDM2. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 7Α, η έκφραση ΜϋΜ2 επανήλθε δραματικά διασπάται επίπεδα PARP, σε σύγκριση με κύτταρα που εκφράζουν τον έλεγχο φορέα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η έκφραση ΜϋΜ2 μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης ρ53, όπως επίσης και την φωσφορυλίωση Ser15 σε ρ53. Επιπλέον, η έκφραση ΜϋΜ2 διασώθηκε αποτελεσματικά κυτταρικό θάνατο που επάγεται από ραπαμυκίνη συν θεραπεία συνδυασμού δοξορουβικίνη (Σχήμα 7Β και 7C). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η αναστολή της MDM2 πάνω ρύθμιση με ραπαμυκίνη είναι σε μεγάλο βαθμό υπεύθυνη για την ευαισθητοποίηση κυττάρων σε χημειοθεραπευτική αγωγή.

(Α-Β) κύτταρα U2-OS επιμολύνθηκαν παροδικά με ΜΌΜ2 ή ένα μάρτυρα φορέα. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά επιμολύνσεις, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με ραπαμυκίνη (100 ηΜ) για 48 ώρες και στη συνέχεια κατεργάζεται με δοξορουβικίνη (1 μg /mL) για 36 ώρες. Αμφότερα τα επιπλέοντα και τα προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν, και υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western (Α) ή ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (Β). (C) Μορφολογία των κυττάρων U2-OS καταγράφηκε με μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (100 ×).

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι η IGF-1 up-ρυθμίζει MDM2 επίπεδα πρωτεΐνης μέσω της οδού mTOR, προσθέτοντας έτσι ένα άλλο στρώμα της λεπτής ρύθμισης στο μονοπάτι MDM2-p53 με καταρράκτη /ΑΚΤ σηματοδότησης IGF-1. ΑΚΤ έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι αλληλεπιδρά φυσικά με και φωσφορυλιώνουν MDM2, η οποία διευκολύνει MDM2 πυρηνική μετατόπιση [16]. Η φωσφορυλίωση του MDM2 ενισχύει την αλληλεπίδραση MDM2 με p300, αυξάνοντας έτσι ουμπικουϊτίνης δραστηριότητα λιγάσης Ε3 προς ρ53 και ρ53 διευκόλυνση ουβικιτινίωση και την υποβάθμιση [17]. Επιπλέον, η φωσφορυλίωση του MDM2 σε Ser166 και Ser188 από ΑΚΤ έχει δειχθεί να σταθεροποιήσει MDM2 πρωτεΐνη με αναστολή αυτο-ουβικουϊτινίωση του [19]. Ωστόσο, αναφέρθηκε επίσης ότι μεσολαβεί η ΑΚΤ φωσφορυλίωση της MDM2 δεν φαίνεται να επηρεάζει δραματικά MDM2 υποκυτταρική εντόπιση [18]. Έτσι, αν και είναι σαφές ότι η ΑΚΤ ρυθμίζει θετικά MDM2, οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί φαίνεται να είναι κύτταρο χορηγηθείσης και το πλαίσιο-εξαρτώμενη.

Προηγούμενες μελέτες δείχνουν ότι MDM2 μπορεί να ρυθμιστεί στο μεταφραστικό επίπεδο. Ενισχυμένη μετάφραση του MDM2 έχει παρατηρηθεί σε χοριοκαρκινώματος ανθρώπινες κυτταρικές σειρές [32]. Το mRNA MDM2 περιέχει ένα διακριτό 5 ‘αμετάφραστη περιοχή (UTR), που παίζει ρόλο στην μεταφραστική αποτελεσματικότητα [33]. Επιπλέον, αυξημένη έκφραση ΜΌΜ2 που προκαλείται από την έκφραση του BCR /ABL σχετίζεται με αυξημένη μετάφραση MDM2 λόγω ρύθμιση στο 5 ‘UTR του MDM2 mRNA [34]. Επιπλέον, η αναστολή της IGF-1 σηματοδότηση, είτε με νοκ-άουτ του IGF-1 υποδοχέα (IGF-1 R) ή με έναν αναστολέα της κινάσης IGF-1 R, έχει δειχθεί ότι μειώνουν μετάφραση MDM2 μέσω των 5 ‘UTR του [35]. Ειδικότερα, έχει αναφερθεί ότι αυξητικού παράγοντα ηπατοκυττάρων (HGF) διευκολύνει μετάφραση MDM2 μέσω mTOR σε εμβρυϊκά ηπατοκύτταρα [36].

Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι και οι δύο IGF-1 και ερεγουλίνη σηματοδότηση ενεργοποιούν MDM2 μέσω της ΑΚΤ -mTOR μονοπάτι. Η μελέτη αυτή έχει δύο σημαντικές συνέπειες. Πρώτον, κυτταρικές αποκρίσεις σε μία ποικιλία τάσεων συγκλίνουν στο ρ53-MDM2 μονοπάτι, το οποίο χρησιμεύει ως το κεντρικό αισθητήρα για το άγχος. Δεύτερον, υπάρχουν δύο σημαντικές ρυθμιστικούς μηχανισμούς για να ρυθμίζει τα επίπεδα πρωτεΐνης MDM2: ρύθμιση μεταγραφικής p53-εξαρτώμενη και mTOR εξαρτώμενη μεταφραστικού ελέγχου. σήματα στρες, συμπεριλαμβανομένης της βλάβης του DNA, υποξία, θρεπτικό στέρηση και το οξειδωτικό στρες, ενεργοποιούν ρ53, το οποίο με τη σειρά του μεταγραφικά up-ρυθμίζει την έκφραση MDM2. σηματοδότηση αυξητικού παράγοντα, από την άλλη πλευρά, ενεργοποιεί το μονοπάτι ΑΚΤ mTOR να ενισχύσουν την μετάφραση πρωτεΐνης MDM2. Αυτή η λεπτή ρύθμιση της MDM2 εξασφαλίζει ότι ρ53 είναι υπό αυστηρό έλεγχο. Επιπλέον, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι eIF4E ή S6K κατάλυσης δεν επηρεάζουν σημαντικά τα βασικά επίπεδα MDM2. Ωστόσο, αποσιώπηση είτε eIF4E ή S6K καταργηθεί τελείως IGF-1 που προκαλείται από MDM2 up-ρύθμιση. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η οδός mTOR απαιτείται για αυξητικό παράγοντα μεσολάβηση MDM2 πάνω ρύθμιση.

Αναστολή της mTOR χρησιμοποιώντας ειδικές φαρμακολογικές αναστολέων καταλήγει σε G1 /S διακοπή του κυτταρικού κύκλου, η εξασθένηση της κυτταρικής ανάπτυξης, και την απόπτωση [37 ]. Προ-κλινικές μελέτες δείχνουν ότι η ραπαμυκίνη και τα παράγωγά του αναστέλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό, το οποίο έχει αποδειχθεί τόσο

in vitro

και σε μια ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων χρησιμοποιώντας μοντέλα ζώων [38]. Επιπλέον, αναφέρθηκε ότι η αναστολή του mTOR προάγει απόπτωση μέσω μεταφραστικό έλεγχο των Mcl-1, ένα bcl-2 σαν μέλος της οικογένειας [39]. Ωστόσο, στις περισσότερες περιπτώσεις, η αναστολή της mTOR μόνη δεν επάγει αποτελεσματικά απόπτωση? μάλλον, ευαισθητοποιεί τα κύτταρα σε αποπτωτικά ερεθίσματα. Για παράδειγμα, η ραπαμυκίνη αυξάνει την ικανότητα της σισπλατίνης να επάγει απόπτωση σε ανθρώπινη προμυελοκυτταρική λευχαιμία κυτταρικές γραμμές και κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών [40]. RAD001, μια ραπαμυκίνη παράγωγο, έχει αποδειχθεί ότι ευαισθητοποιεί έναν αριθμό ρ53-θετικών καρκινικών κυττάρων σε σισπλατίνη απόπτωση που επάγεται με αναστολή της έκφρασης της πρωτεΐνης ρ21 μέσω της καταστολής του γενικού μετάφρασης [41]. Επιπλέον, η ραπαμυκίνη ευαισθητοποιημένα πολλαπλές κυτταρικές γραμμές μυελώματος να δεξαμεθαζόνη απόπτωση, που σχετίζεται με μειωμένη έκφραση της κυκλίνης D2 και survivin [42]. Έχει επίσης αναφερθεί ότι η έκφραση του μεταλλαγμένου ιδιοσυστατικά ενεργό μιμείται 4Ε-ΒΡ1 η επίδραση της ραπαμυκίνης στην ενίσχυση της απόπτωσης σε πολλαπλά κύτταρα μυελώματος, προτείνοντας ότι οι αναστολείς mTOR ευαισθητοποιήσει κύτταρα με αναστολή πώμα εξαρτώμενη μετάφραση [43]. Σύμφωνα με αυτή την αντίληψη, τα μικρά μόρια που στοχεύουν καπάκι που εξαρτώνται από την έναρξη της μετάφρασης από την αναστολή της eIF4A μπορεί να αποκαταστήσει την ευαισθησία των ναρκωτικών σε ένα μοντέλο λεμφώματος ποντικού [44].

Σε αυτή τη μελέτη, παρατηρήσαμε ότι η αγωγή ραπαμυκίνης και δοξορουβικίνη συνδυασμός οδήγησε σε μειωμένη έκφραση MDM2, η οποία οδήγησε σε αυξημένη απόπτωση, εμπλέκοντας ότι η ρ53 μπορεί να εμπλέκεται στη διαδικασία αυτή. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι η δοξορουβικίνη πάνω ρυθμισμένα ρ53, όπως αναμενόταν. Ωστόσο, ενώ θεραπεία συνδυασμού ραπαμυκίνης /doxorubicin δεν επηρέασε σημαντικά τα επίπεδα της πρωτεΐνης ρ53, η φωσφορυλίωση σε σερίνη 15 σχετικά με ρ53 αυξήθηκε, γεγονός που υποδηλώνει ότι η δραστηριότητα της ρ53 προκλήθηκε. Είναι σημαντικό ότι, έκτοπη έκφραση MDM2 αντιστραφεί απόπτωσης, η ταυτόχρονη με μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης ρ53 και σερίνη 15 φωσφορυλίωση. Παρ ‘όλα αυτά, MDM2 μπορεί επίσης να έχει ρ53-ανεξάρτητη λειτουργίες να αναστέλλουν την απόπτωση με την παρουσία της θεραπείας συνδυασμού δοξορουβικίνης /ραπαμυκίνη.

Εν περιλήψει, η μελέτη μας δείχνει ότι η ραπαμυκίνη ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα να χημειοθεραπευτικό φάρμακο προκαλούμενη απόπτωση και δείχνει ότι mTOR -targeted αντικαρκινική-θεραπεία σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία μπορεί να είναι πιο αποτελεσματική στη θεραπεία των καρκίνων του p53-θετικά.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture, φαρμακευτικές αγωγές και πλασμίδια

Ανθρώπινο μαστού καρκίνωμα MCF-7 κύτταρα, κύτταρα οστεοσαρκώματος U2-OS και μη μικροκυτταρικό κύτταρα Η1299 καρκινώματος πνεύμονα διατηρήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (ϋΜΕΜ) που περιέχει 4.5 g /L γλυκόζη συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS? πιστοποιηθεί, GIBCO) , 100 μονάδες /ml πενικιλίνη (Gibco), 100 μg /mL στρεπτομυκίνη (GIBCO), και 2 mM Ε-γλουταμίνη (GIBCO). Όλες οι κυτταρικές σειρές ανακαλλιεργήθηκαν χρησιμοποιώντας 0,05% διάλυμα θρυψίνης-ΕϋΤΑ (GIBCO). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε υγροποιημένο επωαστή 37 ° C κάτω από 5%

2 ατμόσφαιρα CO. Τα κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC). MCF-7, U2-OS ή Η1299 κύτταρα σε 60-70% συρροή στερήθηκαν ορού για 24 ώρες σε ϋΜΕΜ χωρίς ορό πριν από την IGF-1 θεραπεία. IGF-1 (Sigma) παρασκευάστηκε ως ένα διάλυμα στοκ /mL 100 μg σε νερό. Χημικοί αναστολείς LY294002, PD98059, SB202190 (Calbiochem), και ραπαμυκίνη (Sigma) παρασκευάσθηκαν ως 1.000 × διαλύματα. Η δοξορουβικίνη (Sigma) παρασκευάστηκε ως ένα διάλυμα στοκ 2 mg /mL. Ερεγουλίνη βήτα (Upstate) παρασκευάστηκε ως ένα διάλυμα 20 μg /ml σε PBS. Για τη θεραπεία UV, μέσα απομακρύνθηκαν και τα κύτταρα ακτινοβολούνται με καπάκια απομακρύνθηκαν σε ένα Spectrolinker XL-1000 UV Crosslinker (Spectronics Corporation). Μετά την ακτινοβολία, μέσα προστέθηκαν στα πιάτα και τα κύτταρα αναπτύχθηκαν όπως αναφέρεται για κάθε πείραμα πριν από τη συλλογή των δύο επιπλέοντα και τα προσκολλημένα κύτταρα.

αδενοϊική μόλυνση, παροδική επιμόλυνση και παρεμβολή RNA

Τα κύτταρα σε 60% συρροή μολύνθηκαν με αδενοϊό που κωδικοποιεί ΑΚΤ ή φορέα ελέγχου, και επωάστηκαν για δύο ώρες στους 37 ° C με ήπια ανάδευση κατά διαστήματα είκοσι λεπτά, ακολουθούμενο από την προσθήκη του μέσου καλλιέργειας και επωάζονται στους 37 ° C με 5% CO

2 για 24 ώρες. Η1299 κύτταρα σε 80% συρροή ή U2-OS κύτταρα σε 50% συρροή επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο διαμόλυνσης Lipofectamine 2000 (Invitrogen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Media αντικαταστάθηκαν οκτώ (Η1299) ή έξι (U2-OS) ώρες μετά την επιμόλυνση. Μικρό παρεμβαλλόμενο RNA κατά eIF4E (AAGCAAACCUGCGGCUGAUCU), S6K (GGACATGGCAGGAGTGTTT) και κωδικοποιημένα siRNA ελέγχει ειδική για κάθε ολιγονουκλεοτίδιο siRNA αγοράστηκαν από τη Σαγκάη GenePharma Co., Ltd. και επιμολύνονται χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen).

Ανάλυση Western Blot

τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS, και επαναιωρήθηκαν σε EBC

250 ρυθμιστικού λύσης (250 mM NaCl, 50 mM Tris ρΗ 8,0, 0,5% Nonidet Ρ-40, 50 mM NaF, 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο , 2 μg /mL απροτινίνη, και 2 μg /mL λευπεπτίνη). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με τη χρήση της πρωτεΐνης Bio-Rad Αντιδραστήριο Assay (Bio-Rad). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης φορτώθηκαν, διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Millipore), και υβριδοποιήθηκε με ένα κατάλληλο πρωτογενές αντίσωμα και συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα για επακόλουθη ανίχνευση με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια. Το μονοκλωνικό αντίσωμα ειδικό για SMP14 MDM2 (Santa Cruz) χρησιμοποιήθηκε σε 1:200 αραιώσεις. Το μονοκλωνικό αντίσωμα DO-1 ειδικό για ρ53 (Santa Cruz) χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:250. Πολυκλωνικό αντίσωμα C-11 ειδικό για ακτίνη (Santa Cruz) χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:1000. Αντισώματα ειδικά για PARP (# 9542), φωσφο-ΑΚΤ (Ser473? # 9271), η συνολική ΑΚΤ (# 9272), φωσφο-S6 Ριβοσωματιακής Πρωτεΐνης (σερίνη 235/236? # 2211), S6 Ριβοσωματιακής Πρωτεΐνης (# 2217), S6 κινάσης (# 9202), eIF4E, Phospho-4EBP1 (Ser65? # 9456) ή 4EBP1 (# 9452) αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology και χρησιμοποιήθηκε σε 1:1000 αραιώσεις

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν με ψυχρό PBS, και στερεώνονται σε 70% αιθανόλη στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) συμπληρωμένο με 80 μg /mL RNase Α στους 37 ° C στο σκοτάδι για μία ώρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής με FACScan κυτόμετρο ροής (Becton Dickson), και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Cell Quest (Becton Dickson).

ποσοτική PCR

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα χρησιμοποιώντας Tryzol σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Gibco). Το RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας iScript cDNA Synthesis Kit (BioRad). Η αντίδραση επίσης διεξάγεται με την απουσία της αντίστροφης μεταγραφάσης για να χρησιμεύσει ως αρνητικός μάρτυρας. Q-PCR πραγματοποιήθηκε σε 25 μί όγκους αντίδρασης (8 cDNA ng, 12.5 μι Taqman καθολική PCR Master Mix, Αντιδραστήριο 1.25 μL Demand Gene Expression? Applied Biosystems) τόσο για MDM2 και GAPDH. Η αντίδραση Q-PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα σύστημα ανίχνευσης 7000 Sequence ΑΒΙ Prism (Applied Biosystems). Οι συνθήκες Q-PCR ήταν ως εξής: 10 λεπτά στους 95 ° C ακολουθούμενη από 40 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα και ανόπτηση /επέκτασης στους 60 ° C για ένα λεπτό. Οι σχετικές τιμές ποσοτικοποίηση υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας την μέθοδο ΔΔCt.

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία

Τόσο επιπλέοντα και προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε PBS. Ίσοι όγκοι trypan blue διάλυμα χρώσης (0.4%? Gibco) και κυτταρικό εναιώρημα αναμίχθηκαν και χρωματίστηκαν για πέντε λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι αριθμοί των χρωματίζονται και μη χρωματισμένα κύτταρα μετρήθηκαν με ένα αιματοκυτταρόμετρο. Τουλάχιστον 500 κύτταρα ανά δείγμα μετρήθηκαν. Το ποσοστό της βιωσιμότητας αντιπροσωπεύει την αναλογία των μη χρωματισμένων κυττάρων σε συνολικά κύτταρα. Μαθητή

t-

δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών μεταξύ των ομάδων.

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ J Lawrence (Πανεπιστήμιο της Βιρτζίνια, Charlottesville, Βιρτζίνια) για pCMV4-4EBP1 και pCMV4-4EBP1-5A πλασμίδια.