Αφηρημένο

Το μεγάλο μέγεθος του χοίρου και της ομοιότητας του στην ανατομία, τη φυσιολογία, το μεταβολισμό, και τη γενετική του ανθρώπου αποτελούν την ιδανική πλατφόρμα για την ανάπτυξη ενός γενετικά καθορισμένη, μεγάλο ζωικό μοντέλο του καρκίνου κάνουν. Για το σκοπό αυτό, έχουμε δημιουργήσει ένα διαγονιδιακό «oncopig» γραμμή κωδικοποίηση ανασυνδυάσης Cre επαγώγιμων διαγονιδίων χοίρου που κωδικοποιεί το γονίδιο KRAS

G12D και TP53

R167H, οι οποίες αντιπροσωπεύουν μια κοινώς μεταλλαγμένο ογκογονίδιο και ογκοκατασταλτικό σε ανθρώπινους καρκίνους, αντίστοιχα. Θεραπεία των κυττάρων που προέρχονται από αυτές τις oncopigs με τον αδενοϊό που κωδικοποιεί Cre (AdCre) οδήγησε σε KRAS

G12D και TP53

έκφραση R167H, οι οποίες καθιστούν τα κύτταρα που μετασχηματίζονται στον πολιτισμό και ογκογόνο όταν μεταμοσχεύονται σε ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια. Τέλος, η έγχυση AdCre απευθείας στις εν λόγω oncopigs οδήγησε στην ταχεία και επαναλήψιμη ανάπτυξη όγκων μεσεγχυματικής προέλευσης. Τα διαγονιδιακά ζώα που έλαβαν AdGFP (πρωτεΐνη πράσινου φθορισμού) δεν είχε κανένα σχηματισμό μάζας όγκου ή να τροποποιηθούν ιστοπαθολογία. Αυτό oncopig γραμμή θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως γενετικά εύπλαστη μοντέλο για δυνητικά ένα ευρύ φάσμα καρκίνων, ενώ τον έλεγχο για χρονική ή χωρική γένεση, η οποία θα πρέπει να αποδειχθεί πολύτιμη για μελέτες στο παρελθόν παρεμποδίζεται από την έλλειψη ενός μεγάλου ζωικό μοντέλο του καρκίνου.

Παράθεση: Σουκ LB, Collares τηλεόραση, Χου W, Liang Υ, Rodrigues FM, Rund LA, et al. (2015) ένα γενετικό μοντέλο χοίρου του Καρκίνου. PLoS ONE 10 (7): e0128864. doi: 10.1371 /journal.pone.0128864

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Wilfried Α Kues, Friedrich-Loeffler-Institute, Γερμανία

Ελήφθη: 15η Δεκεμβρίου 2014? Αποδεκτές: 3 Μάη, 2015? Δημοσιεύθηκε: 1 Ιούλη 2015

Copyright: © 2015 Σουκ et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα τα μέσα στα δεδομένα RNA-επόμενα χαρτί και πλήρης είναι διαθέσιμα στη βάση δεδομένων ArrayExpress (www.ebi.ac.uk/arrayexpress) υπό τον αριθμό πρόσβασης E-mtab-3382

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή υποστηρίχθηκε από το ακόλουθες: Κίνα Υποτροφιών του Συμβουλίου (CSC): WH? Βραζιλίας Υποτροφιών Πρόγραμμα «Επιστήμη Χωρίς Σύνορα» που προωθείται από την Εθνική Σύμβουλος της Τεχνολογικής και Επιστημονικής Ανάπτυξης (https://www.iie.org/Programs/Brazil-Scientific-Mobility): FMR, TVC και FKS? Αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία (https://www.cancer.org/research/applyforaresearchgrant/) (ACS178898): YL? Αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία (https://www.cancer.org/research/applyforaresearchgrant/) (ACS178898): CMC? ΗΠΑ Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας (https://grants.nih.gov/grants/oer.htm) (CA123031) και του Edward Spiegel Ταμείο του Ιδρύματος Λεμφώματος (https://www.lymphomafoundation.org/): CMC? Ηνωμένες Πολιτείες Υπουργείο Γεωργίας (USDA) (https://www.csrees.usda.gov/) (AG 58-5438-2-307), Οι ΗΠΑ Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (https://grants.nih.gov/επιχορηγήσεις /oer.htm) (CA 153132), ο Edward William & amp? Jane Marr Gutgsell Ίδρυμα (https://provost.illinois.edu/about/chairs.html), και το Ερευνητικό Πρόγραμμα Συνεταιρισμός για την Γεωργία Επιστήμη & amp? Τεχνολογικής Ανάπτυξης (https://www.csrees.usda.gov/)(PJ009103)? Ανάπτυξη Διοίκηση της Υπαίθρου, Δημοκρατία της Κορέας (https://www.rda.go.kr/foreign/eng/): LBS? και US National Institutes of Health (U42 OD011140): ΕΠΣ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ένα μεγάλο ζωικό μοντέλο καρκίνου θα είναι ευεργετική στις ρυθμίσεις που απαιτούν μέγεθος, ανατομία, το μεταβολισμό, ή τη γενετική αντανακλαστική του ανθρώπου, όπως για τη μελέτη των μη επεμβατική τεχνολογιών απεικονιστικά καθοδηγούμενη, ογκολογία ακτινοβολία, ο μεταβολισμός του φαρμάκου, χειρουργική εκπαίδευση, την ανάπτυξη της τεχνολογίας (π.χ., έγκαιρης εξέτασης ανίχνευσης), για να αναφέρουμε μόνο μερικά μόνο [1,2]. Από αυτή την άποψη, ο χοίρος είναι ένα ιδανικό μεγάλη πλατφόρμα ζώο να αναπτύξει ένα τέτοιο μοντέλο. Αυτά είναι τα μεγάλα θηλαστικά με παρόμοια ανατομία στους ανθρώπους [1,2]. Τόσο βασικό μεταβολικό ρυθμό τους και των υποδοχέων τους Χ xenosensor πρεγνανίου που ρυθμίζει

CYP3A

έκφρασης, το οποίο είναι υπεύθυνο για το μεταβολισμό της ήμισυ του συνόλου των συνταγογραφούμενων φαρμάκων [3], είναι επίσης πολύ παρόμοια με τους ανθρώπους [4,5]. Όπως τους ανθρώπους, οι χοίροι απαιτούν επίσης πολλαπλές γενετικές αλλαγές για την ανάπτυξη του καρκίνου [6].

Για να αναπτύξει ένα μοντέλο χοίρου με τον καρκίνο, επιλέξαμε να ανακεφαλαιώσουμε αυτές τις μεταλλάξεις που βρέθηκαν πιο συχνά στον ανθρώπινο καρκίνο. Προηγουμένως, είχε αποδείξει ότι τα ανθρώπινα μεταλλάξεις όταν παρέχονται σε μελέτες γονιδιακής έκφρασης χρησιμοποιώντας αυτόλογα ινοβλάστες χοίρου οδήγησε σε ογκογονίδια μοριακά παρόμοια με αυτή που παρατηρείται σε ανθρώπους και με παρόμοια παθολογία [6]. Σε αυτή τη μελέτη, έχουν βάλει στο στόχαστρο το

RAS

γονίδιο το οποίο μεταλλάσσεται σε ένα τέταρτο όλων των ανθρώπινων καρκίνων, με το

KRAS

ισομορφή είναι η πιο συχνά μεταλλαγμένο [7] αποδίδοντας μία ουσιαστικά δραστική, ογκογόνο πρωτεΐνη [7] που διεγείρει πειραματικά καρκίνου σε ποντίκια [8] και ανθρώπινα κύτταρα [9], εκτός από έναν αριθμό υποκειμένων κληρονομικών συνδρόμων του καρκίνου [10]. Το γονίδιο

ΤΡ53

μεταλλάσσεται σε ένα τρίτο των ανθρώπινων καρκίνων [11] για να σταματήσει ο κατασταλτικός όγκου μονοπάτι, το οποίο παρομοίως είναι γνωστό ότι προάγει καρκίνο σε τόσο ποντικού [12] και [13] γενετικά μοντέλα χοίρου, καθώς και σε ανθρώπινα κύτταρα [9], και συνδέεται με την προδιάθεση καρκίνου του Συνδρόμου Li-Fraumeni [14]. Μεταλλάξεις σε αυτά τα δύο γονίδια εμφανίζονται σε συναυλία σε ανθρώπινους καρκίνους (COSMIC) [15]. Επιπλέον, τα ποντίκια γενετικά τροποποιημένα να υποβληθούν σε ανασυνδυασμό να μετατρέψετε άγριου τύπου τους

Kras

και

TP53

αλληλόμορφα σε ογκογόνους και κυρίαρχη-αρνητική ή μηδενική εκδόσεις, αντίστοιχα, να αναπτύξουν γρήγορα επιθετικών καρκίνων στις θέσεις του ανασυνδυασμός [16,17]. Όσον αφορά τους χοίρους, δύο ογκογόνους

Kras

και κυρίαρχο-αρνητικό

p53

βοηθήσει στην προώθηση της ογκογόνο μετατροπή φυσιολογικών κυττάρων χοίρου σε ένα ογκογόνο κατάσταση [6], και χοίρους μηχανικής με ένα μεταλλαγμένο αλληλόμορφο TP53 είναι επιρρεπείς στην ανάπτυξη λεμφωμάτων και οστεογονικές όγκους [13]. Πιο πρόσφατα, ένα υπό όρους ενεργοποιημένο ογκογόνο μετάλλαξη KRAS σε χοίρους έχει αναφερθεί [18]. Ως εκ τούτου, επιλέξαμε να κατασκευάσει χοίρους με επαγόμενη έκφραση αυτών των συχνά μεταλλάσσεται και ισχυρό ογκογονίδιο και ογκοκατασταλτικά γονίδια.

Αποτελέσματα

Δημιουργία oncopigs κωδικοποιεί επαγώγιμων ογκογόνο KRAS και κυρίαρχο-αρνητικό TP53

Για να δημιουργήσετε έναν επαγόμενο μοντέλο χοίρου με τον καρκίνο, την οποία όρος «oncopig», θα κλωνοποιηθεί πρώτα το χοίρειο

KRAS

και

TP53

cDNA από το χοίρο Duroc (2-14, TJ Tabasco) που χρησιμοποιήθηκε για την αλληλουχία του γονιδιώματος χοίρου [19]. Κατευθυνόμενη σε θέση μεταλλαξιγένεση στη συνέχεια χρησιμοποιείται για να εισαγάγει το ογκογόνο μετάλλαξη G12D στο χοίρειο

KRAS

cDNA. Αυτή η μετάλλαξη επελέγη ως ασπαρτικό οξύ λογαριασμούς υποκατάσταση για πάνω από το ένα τρίτο των μεταλλάξεων στη θέση G12 σε ανθρώπινους καρκίνους [7] και εισαγωγή αυτής της μετάλλαξης στο ενδογενές μυοειδούς

Kras

γονίδιο προάγει την ογκογένεση [8,20] . Ομοίως, η μετάλλαξη R167H επιλέχθηκε ως ανθρώπινο ισοδύναμο του (R175H) βρίσκεται συνήθως σε ανθρώπινους καρκίνους [11], καθώς και την προδιάθεση του καρκίνου σύνδρομο Li-Fraumeni [14], και όταν εισάγεται εντός του ενδογενούς ποντικού [12] ή των χοίρων [ ,,,0],13]

TP53

γονιδίου, προκαλεί όγκους. Αυτά τα δύο cDNAs ακολούθως εισάγεται σε ένα Cre-επαγώγιμο φορέα, αποδίδοντας ένα κατασκεύασμα έκφρασης που περιέχει τον υποκινητή CAG, που ακολουθείται από την προαναφερθείσα αλληλουχία LSL,

KRAS

G12D

, μία αλληλουχία IRES να καταστεί δυνατή η δισιστρονική έκφραση,

TP53

R167H

και πολυ α ακολουθία (Σχήμα 1α). Αυτός ο σχεδιασμός επιτρέπει την ταυτόχρονη έκφραση και των δύο

KRAS

G12D

και

TP53

R167H

σε φαινομενικά κάθε κύτταρα του χοίρων με παροδική μόλυνση με AdCre, η οποία κατ ‘αρχήν θα πρέπει να επιτρέψει την επαγωγή της ένα ευρύ φάσμα των καρκίνων σε συγκεκριμένες τοποθεσίες ιστού και σε οποιοδήποτε χρονικό σημείο επιλέγετε.

(

a

) Σχηματικό διάγραμμα του φορέα που κωδικοποιεί Cre επαγόμενο

KRAS

G12D

και

TP53

R167H

. (

β

) την ανάλυση PCR για την παρουσία του

KRAS

G12D

και

TP53

R167H

σε γονιδιωματικό DNA που απομονώθηκε από την υποδεικνυόμενη κλωνοποιημένο απογόνων.

η

Κανονικό εμβρυϊκούς ινοβλάστες χοίρου [21] επιμολύνθηκαν με το ανωτέρω πλασμίδιο και σταθερά επιμολυσμένων κλώνων κυττάρου επιλέχθηκαν σε G418-συμπληρωμένο μέσο. Γονιδιακού DNA από τις αποικίες των κυττάρων χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιωθεί η παρουσία και των δύο διαγονιδίων (

KRAS

G12D

και

TP53

R167H

) με PCR αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικούς για αυτά τα μεταγραφήματα, και στη συνέχεια επεκτάθηκαν για την πηγή πυρήνων για πυρηνική μεταφορά. Πυρήνες από αυτά τα κύτταρα στη συνέχεια απομονώθηκαν και μεταφέρθηκαν σε εκπυρηνισμένο ωοκύτταρα και ενεργοποιημένα εμβρυογένεση χοίρου, μια διαδικασία που ονομάζεται πυρηνική μεταφορά σωματικών κυττάρων (SCNT) [21]. Συνολικά & gt? 100 έμβρυα μεταφέρθηκαν σε ένα υποκατάστατο γουρούνα, η οποία απέδωσε τέσσερις άνδρες oncopig απογόνους (63-1, 63-2, 63-3, 63-4). PCR ανάλυση του απομονωμένου γενωμικού DNA χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικούς για αυτά τα διαγονίδια επιβεβαίωσε τη σταθερή ενσωμάτωση του

KRAS

G12D

και

TP53

R167H

cDNAs (σχήμα 1β).

ενεργοποίηση Cre του

KRAS

G12D

και

TP53R167H

διαγονιδίων σε ινοβλάστες που προέρχονται από τις oncopigs μεταμορφώνει

Για να εκτιμηθεί κατά πόσον η

KRAS

G12D

και

TP53

R167H

διαγονίδια θα μπορούσαν να είναι ενεργοποιείται για την προώθηση της ογκογένεσης, βιοψίες δέρματος απομονώθηκαν από την προαναφερθείσα τέσσερα oncopig απογόνους, και χρησιμοποιήθηκαν για τον καθορισμό γραμμών ινοβλαστών. Αυτές οι μεμονωμένες κυτταρικές σειρές από διαγονιδιακά oncopigs μολύνθηκαν είτε με αδενοϊό που κωδικοποιεί την πράσινη πρωτεΐνη δείκτη φθορισμού (AdGFP) ή αδενοϊό που κωδικοποιεί Cre ανασυνδυάση (AdCre), και το προκύπτον ζεύγη των μολυσμένων καλλιεργειών αναλύθηκαν για μετασχηματίζονται και ογκογόνο φαινοτύπους. Όπως ήταν αναμενόμενο, μόνο η AdCre εκτίθενται τα κύτταρα παρουσίασαν ανιχνεύσιμα επίπεδα του

KRAS

G12D

και

TP53

R167H

mRNA, όπως αξιολογούνται με RT-PCR (Σχήμα 2α). Επιπλέον, υπήρχε μια σαφής διαφορά στην μορφολογία των κυττάρων AdCre σε σύγκριση με τα κύτταρα AdGFP ελέγχου. Συγκεκριμένα, ο πρώην έχασε τη χαρακτηριστική ατράκτου μορφολογία του είτε τα ίδια κύτταρα προ AdCre μόλυνση ή όταν μολυνθεί με τον ιό ελέγχου AdGFP, και αντ ‘αυτού ήταν μικρότερες, πιο στρογγυλεμένο πολύ πιο χαλαρά συνδεδεμένα στην πλάκα και θα σχηματίζουν αυθόρμητα εστίες (Σχήμα 2

Β

). Αυτή η διαφορά προανήγγειλε άλλα μεταμορφωθεί φαινοτύπους. Συγκεκριμένα, ανάλυση FACS revealed μέσο μήκος του κυτταρικού κύκλου και των τεσσάρων γραμμών μειωθεί από 22 ώρες στη πληθυσμό ελέγχου AdGFP 13 ώρες στον πληθυσμό AdCre (Σχήμα 2c). AdCre κύτταρα παρουσίασαν επίσης μια μέση 2,8 φορές αύξηση σε κυτταρική μετανάστευση των τεσσάρων γραμμών καθ ‘όλη τη χρονική πορεία της παρατήρησης (Εικ 2d), όπως αξιολογείται με μία ανίχνευση μηδέν, και παρήγαγε κατά μέσο όρο 143 αποικίες όταν καλλιεργήθηκαν σε μαλακό άγαρ σε σύγκριση με όχι αποικίες ανιχνεύθηκαν στα κύτταρα AdGFP ελέγχου (Εικόνα 2e). Καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι οι γραμμές ινοβλαστών αναπτύχθηκε από ανεξάρτητα προέρχονται

KRAS

G12D

/

TP53

R167H

oncopig κλώνοι διεγείρονται για να είναι μετασχηματίζονται κατά την ενεργοποίηση της έκφρασης αυτών των διαγονιδίων από Cre ανασυνδυάση. AdGFP αντιμετωπίζονται διαγονιδιακά κύτταρα διατηρούνται φαινοτύπους παρόμοιες με εκείνες που παρατηρήθηκαν για μη διαγονιδιακά κυτταρικές σειρές.

(

α

) RT-PCR ανάλυση των

KRAS

G12D

και

ΤΡ53

R167H

έκφραση mRNA στα ινοβλαστών κυτταρικές γραμμές από κάθε έναν από τους 4 κλώνους διαγονιδιακών κατεργάζεται με AdCre ή AdGFP. (

b

) Σύγκριση της μορφολογίας των κυττάρων μεταξύ AdCre και μη-κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου σε καλλιέργεια, χρωματίστηκαν με Η &? Ε. (

γ

) Κανονικοποιημένη φωτοαντιγραφικά μετράται με FACS σε χρονικά σημεία μετά από καρβοζυφθορεσκεϊνη ηλεκτριμιδύλ εστέρα (CFSE) χρωστική φόρτωση των κυττάρων. (

δ

) Γραφική ανάλυση του μέσου αριθμού των μεταναστευτικών κυττάρων από τριπλή επίστρωση από κάθε μία από τις κυτταρικές σειρές 4. (

ε

) Γραφική ανάλυση του μέσου αριθμού των αποικιών που αναπτύσσονται σε μαλακό άγαρ για κάθε κυτταρική γραμμή από τριπλή επίστρωση. (

ce

: όλα τα σημεία των δεδομένων είναι ο μέσος όρος από τις κυτταρικές γραμμές 4 που προέρχεται από χοίρους 63-1, 63-2, 63-3, 63-4? Μπάρες σφάλματος = SD? * P-value ≤ 0,05 ? ** p-value ≤ 0,01)

η

Cre ενεργοποίηση του

KRAS

G12D

και

TP53

R167H

διαγονιδίων σε ινοβλάστες που προέρχονται από τις oncopigs είναι ογκογόνο

Ενθαρρυμένος από την ανάπτυξη των μετασχηματισμένων φαινοτύπων, είμαστε δίπλα αξιολογηθεί κατά πόσο AdCre θα μπορούσε να προκαλέσει τα παραπάνω ινοβλάστες να αναπτυχθούν σε ένα ογκογόνο μόδας. Έτσι, τα κύτταρα σε επεξεργασία AdCre που προέρχονται από τέσσερα ανεξάρτητα προερχόμενα διαγονιδιακά oncopigs ενέθηκαν σε θηλυκούς ποντικούς ανοσοκατασταλμένοι και στην θέση της ένεσης παρακολουθούνται για την ανάπτυξη των όγκων. Ψηλαφητών όγκων φθάσει 2000 χιλιοστά

3 (η μέγιστη επιτρεπόμενο μέγεθος) μεταξύ 32 και 63 ημέρες μετά την ένεση, με πλήρεις ημέρες διεισδυτικότητα (Πίνακας 1). Σε αντίθεση, δεν παρατηρήθηκαν όγκοι ανιχνεύθηκαν στις θέσεις εγχύθηκαν με κύτταρα από τα διαγονιδιακά oncopig κύτταρα κατεργασμένα με AdGFP επί μία περίοδο 130 ημερών παρατήρησης (Πίνακας 1). Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι οι ινοβλάστες που απομονώθηκαν από ανεξάρτητους

KRAS

G12D

/

TP53

R167H

oncopigs παρακινήθηκαν να είναι ογκογόνο με την ενεργοποίηση της έκφρασης αυτών των διαγονιδίων από Cre ανασυνδυάση. Οι μάζες των όγκων που προκύπτουν από την ενεργοποίηση AdCre κυττάρων από διαγονιδιακά oncopigs (Σχήμα 3) αποκάλυψε στο πλαίσιο τόσο υψηλή και χαμηλή μεγέθυνση αποδείξεις των στερεών όγκων (Σχήμα 3β) και δεν ήταν το αποτέλεσμα της φλεγμονής ή συσσώρευση υγρού.

Η

Παρόμοια όγκων (α) που αναπτύχθηκε από όλες τις AdCre κυτταρικές σειρές και χωρίς όγκοι αναπτύσσονται από ενέσεις κυττάρων AdGFP? Ιστολογική ανάλυση (β) αποκάλυψε οι όγκοι να είναι πυκνά κυτταρικά έγκλειστα μη και διηθητική νεόπλασμα. 10x και τοποθετήστε 40Χ H & amp?. Ε Stain

Η

Ο ιστός του όγκου περιλαμβάνονται χωρίς εγκλεισμό, πυκνά κυτταρικά και τοπικά διηθητική νεοπλασία. Νεοπλασματικά κύτταρα τοποθετημένα σε φύλλα και τα δέματα που υποστηρίζονται από πολύ λεπτό στρώμα fibrovascular. Μεμονωμένα νεοπλασματικά κύτταρα γύρο για να spindeloid με ήπια έως άφθονη ινώδους να ηωσινοφιλική κυτταρόπλασμα. Πυρήνες ήταν μόνο σε πολλαπλές, με στρογγυλό με οβάλ σχήμα και να περιέχει μόνο εξέχοντες πυρηνίσκος και διάσπαρτα χρωματίνης. Νεοπλασματικά κύτταρα παρουσίασαν μέτρια έως σημειώνονται ανισοκυττάρωση και anisokaryosis. Μιτωτική ποσοστά κυμαίνονται 3-8 ανά 10 πεδία υψηλής ισχύος (HPF). Περιοχές νέκρωσης διασκορπίστηκαν εντός του όγκου. Τα νεοπλασματικά κύτταρα είχαν εισβάλει περιβάλλοντες ιστούς, συμπεριλαμβανομένων των σκελετικών μυών, της επιδερμίδας, των νεφρών και των ωοθηκών. Μικροί αριθμοί των λεμφοκυττάρων και σπάνια ουδετερόφιλα διάσπαρτα εντός των όγκων.

ένεση ενδομυϊκή της AdCre σε oncopigs προκαλεί επαναλήψιμα όγκους στο σημείο της ένεσης

Με δεδομένες τις παραπάνω παρατηρήσεις, είμαστε δίπλα ελεγχθεί αν η έκθεση της AdCre

in vivo

θα προκαλέσουν όγκους στο σημείο της ένεσης σε διαγονιδιακά oncopigs. Για το σκοπό αυτό, χοίρος 63-3 χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή ενός κοόρτη διαγονιδιακών oncopigs γέννας για την ανάλυση αυτή. επιλέχθηκε Pig 63-3 ακόλουθη ανάλυση αλληλουχίας DNA δείχνει ότι το διαγονιδιακό κατασκεύασμα εισήχθη σε μια συγκεκριμένη τοποθεσία μέσα ιντρόνιο 4 του γονιδίου χοίρου CCDC-129 (περιοχή συσπειρωμένης σπείρας που περιέχει 129) που βρίσκεται στο SSC18. Επιπλέον, η εισαγωγή προσανατολίστηκε σε μια 3 ‘προς 5’ κατεύθυνση σε σχέση με το χρωμόσωμα και δεν υπήρχε απόδειξη μιας concactomer. Ετσι, το κατασκεύασμα ογκογονίδιο (σχήμα 1α) από τη μπάλα 63-3 θα κληρονομήσει ως ένα μοναδικό γονίδιο αυτοσωματικό.

Το πρώτο από αυτά, oncopig-1, χορηγήθηκε ενδομυϊκά AdCre στο αριστερό πίσω πόδι. Μια μάζα του όγκου ανιχνεύθηκε κατά την ημέρα 10 μετά την ένεση, το οποίο ήταν σαφώς ορατές με τη βοήθεια υπερήχων (Πίνακας 2 και το σχήμα 4

ένα

και 4

δ

). Δεν ήταν μόνο αυτός ο όγκος γρήγορα ιδρύθηκε, αλλά μεγάλωσε και γρήγορα, φθάνοντας σε όγκο 8 cm

2 εντός 20 ημερών. Παθολογική ανάλυση του Η &? Ε τομές του όγκου αποκάλυψε όγκου να είναι μεσεγχυματικής προέλευσης (Σχ 4g και Πίνακας 2). Συγκεκριμένα, ο όγκος μικροσκοπικά χαρακτηρίστηκε ως πυκνά κυτταρικά, μη ενθυλακωμένο και τοπικά διηθητική νεόπλασμα. Τα κύτταρα διατάσσονται σε δέσμες, ρέματα και μικρά φύλλα υποστηρίζεται από ένα ινώδες στρώμα. Μεμονωμένα νεοπλασματικά κύτταρα ήταν πλειομορφικές στρογγυλό έως ωοειδές με πολυγωνική με ενιαία σε πολλαπλούς πυρήνες. Περιοχές νέκρωσης και χρόνιας φλεγμονής ήταν διάσπαρτα εντός του όγκου (Σχήμα 4

g

). Τα νεοπλασματικά κύτταρα χρωματίστηκαν θετικά με βιμεντίνη και δείκτες λείου μυός (μυός ειδικών ακτίνη λείων μυών και ακτίνη). Αυτό ήταν ένα αναπαραγώγιμο αποτέλεσμα, όπως η ενδομυϊκή ένεση AdCre στο άλλο οπίσθιο πόδι απέδωσε παρομοίως έναν όγκο μεσεγχυματικής προέλευσης στο σημείο της ένεσης (Πίνακας 2). Επιπλέον, ογκογένεση προκλήθηκε σε άλλα της ίδιας γέννας απογόνους, δείχνοντας ότι αυτό δεν ήταν μοναδικό σε ένα μόνο ζώο που δοκιμάστηκαν. Συγκεκριμένα, AdCre εγχύθηκε ενδομυϊκά σε δύο πόδια και ο λαιμός του oncopig-2, με αποτέλεσμα μάζες όγκου και στα τρία σημεία της ένεσης, με παθολογική ανάλυση του Η &? Ε τομές που υποστηρίζουν πάλι διάγνωση μεσεγχυματικά όγκου (Πίνακας 2). Απομόνωση του RNA από τις μάζες του όγκου χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση της έκφρασης του μεταλλαγμένου διαγονιδιακών μεταγραφών (Πίνακας 2). Τόσο

KRAS

G12D

και

TP53

R167H

διαγονίδια εκφράστηκαν σε όγκων που αποκόπτονται κατά την αυτοψία. Η έκφραση του μεταλλαγμένου πάνω μεταγραφημάτων άγριου τύπου ανυψώθηκε σε κάθε μία από τις θέσεις παρακολουθούνται. Τον έλεγχο μη διαγονιδιακά ζώα που εκτέθηκαν σε AdCre και διαγονιδιακών χοίρων που εκτίθενται σε AdGFP δεν αποκάλυψε μάζες όγκου, ούτε παθολογικές αλλαγές (Σχήμα 5).

(

α-γ

) Υπερηχογράφημα εικόνες των όγκων ανάπτυξη 10 ημέρες μετά από, και (

d-f

) εικόνες αυτών των όγκων κατά τη νεκροψία 20 ημέρες μετά την ενδομυϊκή (ΙΜ, Pig 1), υποδόρια (SQ, Pig 3), ή ενδο-όρχεων (IT, Pig 1 ) ένεση AdCre σε διαγονιδιακά oncopigs περιέχει ένα Cre επαγόμενο φορέα που κωδικοποιεί

KRAS

G12D

και

TP53

R167H

? (Ζ-i) H & amp?. Ε τομές δείχνουν τον όγκο και το παρακείμενο φυσιολογικό ιστό (2x) με μία ένθετη φωτογραφία υψηλής μεγέθυνσης (20x)

Η

Η έλλειψη οποιωνδήποτε ανιχνεύσιμες αλλαγές στο σημείο της ένεσης για ένεση d20 μετά εμφανίζεται στην επιφάνεια (a-c)? σε υποκείμενους ιστούς (d-f)? ή μετά από ιστολογική εξέταση (g-i).

Η

Διαφορετικοί τύποι όγκων μπορεί να προκληθεί στο oncopig βασίζεται στο σημείο της ένεσης του AdCre

Για να διερευνήσουν κατά πόσον ένεση AdCre σε άλλους ιστούς μπορεί να οδηγήσει σε όγκους, ένας όρχεις oncopig-1 εγχύθηκε με AdCre. Και πάλι, μια ψηλαφητή μάζα ανιχνεύθηκε 10 ημέρες μετά την ένεση, που γρήγορα εξελίχθηκε σε έναν όγκο (Σχήμα 4

γ

, 4

f

, 4

i

και Πίνακας 2) . Ιστοπαθολογική εξέταση αυτού του όγκου αποκάλυψε ένα καλά διαφοροποιημένο όγκου πιθανό στρωματικών καλώδιο σεξ προέλευσης. Ομοίως, το αυτί, στην κοιλιά και το λαιμό του oncopig-3 ενέθηκαν υποδορίως με AdCre, η οποία και πάλι οδήγησε σε μάζες όγκου και στις τρεις τοποθεσίες με την παθολογία του σαρκώματος με περιφερειακή διαφοροποίηση λείων μυών (λειομυοσάρκωμα) (Σχ 4

b

4

e

, 4

h

και Πίνακας 2). Έτσι, η χορήγηση του AdCre αναπαραγώγιμα επάγεται ογκογένεσης σε διαγονιδιακά oncopigs σε κάθε σημείο της ένεσης. Η διοίκηση της AdGFP σε επιπλέον oncopigs δεν είχε ως αποτέλεσμα την παραγωγή της μάζας του όγκου ή παθολογίας (Σχήμα 5).

Συζήτηση

Ο χοίρος έχει πολλά χαρακτηριστικά που το καθιστούν ιδανική πλατφόρμα για την ανάπτυξη μιας κάνει γενετικά καθορισμένη, μεγάλο ζωικό μοντέλο καρκίνου. Μπορούμε τώρα να αναφέρουν την δημιουργία ενός διαγονιδιακών oncopig γραμμή που κωδικοποιεί μια Cre ανασυνδυάση επαγώγιμων διαγονιδίου που κωδικοποιεί

KRAS

G12D

και

TP53

R167H

, ένα ευρέως μεταλλαγμένο ογκογονίδιο [7] και ογκοκατασταλτικά [11], αντίστοιχα, σε καρκίνους του ανθρώπου. Αυτή η μελέτη είναι μια επέκταση για το προηγούμενο έργο μας [6], όπου δείξαμε ότι οι μεταλλάξεις σε γονίδια που εντοπίστηκαν σε ανθρώπινες μελέτες, όταν εισάγεται χοίρων γονιδίων οδήγησε σε ογκογένεση και την παθολογία που αναπαράγονται όγκοι που παρατηρήθηκαν κλινικά.

Κατά την επικύρωση του χοίρου καρκίνο ζωικό μοντέλο είναι επιτακτική ανάγκη ότι οι μάζες του όγκου επικυρωθεί με ό, τι παρατηρείται στην ιατρική. Η ανάγκη αυτή έχει σαφώς διατυπωθεί από Cardiff [22-24], όπου η νεοπλαστική εξέλιξη χρησιμοποιώντας το ποντίκι για τον καρκίνο του μαστού με χρήση ανθρώπινων μεταλλάξεων απέτυχαν να αναπαράγουν όγκων παρατηρήθηκε στην κλινική. Έτσι, αυτή η μελέτη επικεντρώθηκε σε αποδεικνύοντας ότι γενετικά όγκοι των χοίρων οδηγήσει σε ιστοπαθολογικές φαινοτύπους που εκτείνονται από φαινοτύπων υπογραφή για να μιμούνται την ανθρώπινη καρκίνων [24].

Έτσι, το μοντέλο χοίρου επικυρώθηκε από τη διαδήλωση που προέρχεται ινοβλαστών από διαγονιδιακά oncopigs κατεργάζεται με AdCre απέδειξαν την ενεργοποίηση του διαγονιδίου, οδηγώντας σε όλα τα

in vitro

χαρακτηριστικά των όγκων, συμπεριλαμβανομένου ενός μετασχηματισμένου κυττάρου μορφολογία, αυξημένο πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση, και την ικανότητα της ανάπτυξης σε ένα ανεξάρτητο από αγκύρωση τρόπο. Σε συμφωνία, αυτά τα κύτταρα ήταν ιδιαίτερα ογκογόνα όταν εκφυτευτεί σε ποντικούς ανοσοκατασταλμένους. Αυτό το αποτέλεσμα ήταν πολύ επαναλήψιμα, υποστηρίζοντας κατά την απόκτηση μιας μοναδικής γενετικό υπόβαθρο που προδιαθέτουν μία κυτταρική γραμμή για να γίνει μεταμορφώνεται, καθώς παρατηρήθηκαν τα ίδια φαινοτύπων σε ινοβλάστες που προέρχονται από ένα σύνολο τεσσάρων ατομικών oncopigs. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν το συμπέρασμα ότι η παράγωγη oncopig ινοβλάστες είναι διεγέρσιμα ογκογονικά.

Σύμφωνα με την ικανότητα των παραγώγων oncopig ινοβλαστών να είναι ογκογόνα, μία ενδομυϊκή ένεση AdCre σε διαγονιδιακά oncopigs είχε ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη μιας μεσεγχυματικά όγκου υποδηλώνουν λειομυοσάρκωμα στο σημείο της ένεσης. Και πάλι, το αποτέλεσμα αυτό ήταν ιδιαίτερα αναπαραγώγιμη, ενώ παρατηρήθηκαν και όχι μόνο σε μία διαφορετική θέση εντός του ίδιου χοίρο, αλλά επίσης και σε διαφορετικές oncopigs της ίδιας γέννας. Ως λειομυοσάρκωμα είναι λείων μυών καταγωγής, πιθανώς αυτοί οι όγκοι προέκυψαν από τη μόλυνση αυτού του τύπου των μυών, ίσως στο αγγειακό σύστημα ή τους μύες piloerector. AdCre ένεση μέσα στους όρχεις οδήγησε σε διαφοροποιημένο όγκου πιθανό στρωματικών κορδόνι φύλο προέλευσης. Επιπλέον, ούτε ο έλεγχος μη διαγονιδιακών χοίρων ένεση με AdCre ούτε οι oncopigs έλεγχο ένεση με AdGFP αναπτύξει καμία μάζα του όγκου ή παθολογικές αλλαγές. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν το συμπέρασμα ότι η ενεργοποίηση των κυττάρων in vivo με AdCre προκαλεί ογκογένεση. Επιπλέον, τα στοιχεία αυτά δείχνουν επίσης ότι η επαγωγή του ανασυνδυασμού σε άλλους ιστούς,

έναντι των αναληφθεισών

παράδοση AdCre με διάφορους τρόπους από ό, τι έχουν αναληφθεί εδώ ή στο μέλλον από τον ιστό-περιορισμένη έκφραση ενός διαγονιδίου Cre, μπορεί να οδηγήσει σε μια σειρά από άλλες μορφές καρκίνου. Ως εκ τούτου, αυτή η «oncopig« γραμμή παρέχει ένα γενετικά εύπλαστο μοντέλο για δυνητικά ένα ευρύ φάσμα καρκίνων, η οποία θα πρέπει να αποδειχθεί πολύτιμη για μελέτες στο παρελθόν παρεμποδίζεται από την έλλειψη ενός μεγάλου ζωικό μοντέλο του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Όλες οι εργασίες των ζώων έγινε σύμφωνα με τις σχετικές εθνικές και διεθνείς κατευθυντήριες οδηγίες. Όλες οι μελέτες και οι διαδικασίες σε ζώα εγκρίθηκαν από το Πανεπιστήμιο του Illinois Θεσμικών φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήση (IACUC? Πρωτόκολλο αριθμούς 11221 για το χοιρινό και 12.170 για τις μελέτες του ποντικιού).

Η κλωνοποίηση και αλληλούχιση των χοίρων

KRAS

και

TP53

γονίδια σε λεωφορείο TOPO φορέα

TJ Tabasco κύτταρα του μυελού των οστών χοίρου απομονώθηκαν και καταψύχονται στους -80 ° C. Ολικό RNA εκχυλίστηκε από τα κύτταρα αυτά με RNeasy μίνι κιτ (Qiagen, CA), 1 ug από τα οποία μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA με την αντίστροφη QuantiTect Transcription Kit (QIAGEN, CA). Ensembl πρόγραμμα περιήγησης γονιδιώματος χρησιμοποιήθηκε για να σχεδιάσει τις αλληλουχίες των εκκινητών PCR για την ενίσχυση του

TP53

γονίδια χοίρων ειδικές

KRAS

(ENSSSCG00000000561) και (ENSSSCT00000019534). Τα εμπρός και όπισθεν αλληλουχίες εκκινητή για

KRAS

ήταν 5′-CTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT-3 ‘και 5′-TTACATAATTATACACTTTGTCTTTGA-3’, αντίστοιχα. Οι συνθήκες θερμικής κυκλοποίησης της PCR για

KRAS

ενίσχυσης ήταν 94 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 30 κύκλους των 94 ° C για 30 sec, 55 ° C για 3 λεπτά, και 65 ° C για 1 λεπτό με μια τελικό στάδιο C 72 ° για 10 λεπτά. Οι προς τα εμπρός και αντίστροφο εκκινητή αλληλουχίες να χρησιμοποιηθούν για

ΤΡ53

ήταν 5′-TGCAATGGCGGAGTCGCAG-3 ‘και 5′-TCAGTCTGAGTCAGGTCCTTC-3’, αντίστοιχα. Οι συνθήκες PCR θερμικής ανακύκλωσης ήταν 94 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 30 κύκλους των 94 ° C για 30 sec, 55 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και 68 ° C για 1 λεπτό με ένα τελικό στάδιο στους 72 ° C για 10 λεπτά.

ACTB

χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενή έλεγχο. Οι προς τα εμπρός και ανάστροφου εναρκτήρα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 5′-GACATCCGCAAGGACCTCTA-3 ‘και 5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3’, αντίστοιχα. Οι PCR συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι ίδιες όπως για το

ΤΡ53

. PCR ενισχυμένο

KRAS

και

ΤΡ53

cDNAs κλωνοποιήθηκαν κατόπιν σε φορείς ρΟΚ2.1-ΤΟΡΟ χρησιμοποιώντας το κιτ κλωνοποίησης ΤΟΡΟ ΤΑ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen, CA) και τα cDNA επιβεβαιώθηκε ότι έχει 100% ταυτότητα νουκλεοτιδίων με χοίρου

KRAS

και

TP53

(https://useast.ensembl.org/index.html).

τοπο-κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση του

KRAS

και

TP53

cDNA

QuikChange ιστοσελίδας-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, CA) χρησιμοποιήθηκε για την εισαγωγή αλλαγών στην αλληλουχία νουκλεοτιδίων που αντιστοιχεί στην μετάλλαξη G12D στο κλωνοποιημένο χοίρων

KRAS

cDNA και η μετάλλαξη R167H στο κλωνοποιημένο χοίρων

TP53

cDNA. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία της μετάλλαξης G12D σε

KRAS

ήταν 5′-TGGTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAG-3 ‘και 5′-CTCTTGCCTACGCCATCAGCTCCAACTACCA-3’. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία της μετάλλαξης R167H σε

ΤΡ53

ήταν 5′-GAGGTGGTGAGGCACTGTCCCCACCAT-3 ‘και 5′-ATGGTGGGGACAGTGCCTCACCACCTC-3’. Οι μεταλλάξεις επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση.

Κλωνοποίηση

KRAS

G12D

και

TP53

R167H

cDNAs στο ρΙΚΕδ φορέα

Η προαναφερθείσα

KRAS

G12D

cDNA ενισχύθηκε με PCR με εκκινητές 5′-CTAGCTAGCTAGCTGCTGAAAATGACTGAATAT-3 ‘και 5′-CCGCTCGAGCGGTTACATAATTATACAC-3’ για 30 κύκλους των 94 ° C για 1 λεπτό, 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 60 ° C για 1 λεπτό, και 68 ° C για 1 λεπτό, και το προκύπτον θραύσμα κλωνοποιήθηκε εντός των θέσεων NheI και ΧΗοΙ του pIRES (Clontech, CA ). Η προαναφερθείσα

ΤΡ53

R167H

cDNA ενισχύθηκε με PCR με εκκινητές 5′-ACGCGTGGACGTCTTGGCCATATGCAATGGAGGA3 ‘και 5′-ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATTCAGTCTGAGTCAGGTCC-3’ για 30 κύκλους των 94 ° C για 1 λεπτό, 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 65 ° C για 1 λεπτό, και 68 ° C για 1 λεπτό, και το προκύπτον θραύσμα κλωνοποιήθηκε εντός του

Sal

Ι και

Δεν

Ι θέσεις του pIRES περιέχει την

KRAS

G12D

cDNA. cDNA αλληλουχίες του

KRAS

G12D

και

TP53

R167H

επιβεβαιώθηκαν σωστή στο προκύπτον φορέας με προσδιορισμό της αλληλουχίας.

Κλωνοποίηση CAG υποκινητή σε ένα ΙοχΡ-STOP (ροΙγΑ) -loxP φορέα που περιέχει

το πλασμίδιο pkw15 περιέχει τον υποκινητή CAG και το πλασμίδιο που περιέχει pkw13 ΙοχΡ-STOP (ροΙγΑ) -loxP χρησιμοποιήθηκαν για τον φορέα κατασκευή. Ένας υποκινητής CAG απομονώθηκε με πέψη SpeI /MfeI και κλωνοποιήθηκε στο πλασμίδιο pkw13 σε θέσεις κλωνοποίησης SpeI /EcoRI.

Κατασκευή τον επαγόμενο

KRAS

G12D

και

TP53

R167H

oncopig φορέα έκφρασης

Το

KRAS

G12D

–

TP53

R167H

-pIRES φορέας υπέστη πέψη με ΡνυΙ και NheI, και το προκύπτον

KRAS

G12D

-IRES-

TP53

R167H

-polyA θραύσματα καθαρίστηκαν σε γέλη και κλωνοποιήθηκε σε φορείς CAG-LSL-pkw13 σε θέσεις PacI /NheI. cDNA αλληλουχίες του

KRAS

G12D

και

TP53

R167H

στον τελικό φορέα επιβεβαιώθηκαν σωστή στο προκύπτον φορέας από αλληλουχίας

Δημιουργία στελεχών του εμβρύου ινοβλαστών

Άντρας ινοβλάστες κύτταρα εμβρύου (FFCs) από χοίρους μικροσκοπικά Μινεσότα (NSRRC: 0005). συλλέχθηκαν όπως περιγράφεται [25] με ορισμένες τροποποιήσεις. Εν συντομία, μετά την αφαίρεση της κεφαλής και των εσωτερικών οργάνων, το έμβρυο ήταν κιμάς και χωνεύεται μεμονωμένα σε 20 ml μέσου χώνευσης (κατά Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) συμπληρωμένο με 15% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS), 200 μονάδες /ml κολλαγενάση και 25 μονάδες /ml ϋΝάση Ι) για 4-5 ώρες στους 38,5 ° C και

2 στον αέρα 5% CO. Υποστεί πέψη κύτταρα πλύθηκαν με DMEM συμπληρωμένο με 15% FBS (Hyclone, Logan, UT) και 10 μg /ml γενταμυκίνη, καλλιεργήθηκαν επί μία νύκτα, και στη συνέχεια συλλέγεται και καταψύχεται στους -80 ° C σε FBS συμπληρωμένο με 10% διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) ( ν /ν) και αποθηκεύτηκε σε υγρό άζωτο.

Παραγωγή διαγονιδιακών κυττάρων

Early πέρασμα αριθμός FFCs (Ρ1-2) καλλιεργήθηκαν σε μέσο κυτταρικής καλλιέργειας (ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 15% (ν /ν) FBS, 2,5 ng /ml βασικό αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών και 10 μg /ml γενταμυκίνη) όλη τη νύχτα και αναπτύχθηκαν σε 75-85% συρροή. Το μέσο αντικαταστάθηκε 4 ώρες πριν από την επιμόλυνση. FFCs πλύθηκαν επί 1-2 λεπτά με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS? Invitrogen) και συλλέχθηκαν με 0.05% θρυψίνη-ΕϋΤΑ (Invitrogen? 1 ml ανά 75 εκατοστά

2 φιάλη). Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας κυττάρων, σφαιροποιούνται στα 600 χ g για 10 λεπτά, επαναιωρήθηκαν σε 10 ml Ορίί-ΜΕΜ (Invitrogen), και στη συνέχεια ποσοτικοποιούνται χρησιμοποιώντας αιμοκυτταρόμετρο και δισκιοποιείται. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μέσο διαμόλυνσης (75% cytosalts [120 mMKCl, 0.15 mM ΟαΟ

2, 10 mM Κ

2ΗΡΟ4? ΡΗ 7,6, 5 mM MgCl

2] [26] και 25% Opti-ΜΕΜ [Gibco BRL, Grand Island, Νέα Υόρκη]). Η συγκέντρωση των κυττάρων ρυθμίσθηκε σε 1 χ 10

6 κύτταρα /ml και 200 ​​μΙ κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με ηλεκτροδιάτρηση με γραμμικοποιημένο μεταλλαγμένο

KRAS

και

ΤΡ53

κατασκευάσει περιέχει ένα Neo επιλέξιμου casette (2 μg). Η ηλεκτροδιάτρηση χρησιμοποιείται τρεις διαδοχικές 250 V, 1-ms τετραγωνικών παλμών κύμα χορηγούνται μέσω ECM ΒΤΧ 2001 (ΒΤΧ, San Diego, CA) σε κυψελίδα διάκενο 2 mm. Μετά την ηλεκτροδιάτρηση, τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε ένα τρυβλίο 100 mm σε 3000 κύτταρα ανά δίσκο σε μέσο κυτταρικής καλλιέργειας. Μετά από 36 ώρες, τα κύτταρα επιλέγονται δια της προσθήκης geneticin (G418? 400 μg /ml) για 10-14 ημέρες μέχρι το σχηματισμό αποικιών κυττάρων. Γονιδιωματικό DNA από τις κυτταρικές αποικίες χρησιμοποιήθηκε για να επαληθευθεί η παρουσία και των δύο διαγονιδίων με PCR. Αυτά τα κύτταρα στη συνέχεια αποθηκεύεται σε υγρό άζωτο μέχρι να χρησιμοποιηθούν ως κύτταρα δότη για SCNT.

ωρίμανση ωαρίων, SCNT, και την ανοικοδόμηση του εμβρύου

κύτταρα ινοβλαστών εντοπίστηκαν να έχουν ενσωμάτωσης των διαγονιδίων (

KRAS

και

ΤΡ53

) χρησιμοποιήθηκαν ως κύτταρα-δότες για SCNT σε enucleated ωοκύτταρα που ακολουθείται από ηλεκτρική σύντηξη και ενεργοποίηση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Εν συντομία, τα σύμπλοκα κυττάρων Cumulus-ωαρίου (COCs) ελήφθησαν στη φάση Ι ωρίμανση μέσο από ART Inc. (Madison, WI) περίπου 24 ώρες μετά τη συγκομιδή. COCs στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο ωρίμανσης Φάση ΙΙ για συνολικά 40 ώρες σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στις 38,5 ° C. Φάση Ι και ΙΙ μέσο παρασχέθηκαν από ART Inc. Expanded αντισυλληπτικά συνέχεια στροβιλίστηκε σε 0.1% υαλουρονιδάση σε μέσο Hepes ρυθμιστικό Tyrode που περιέχει 0,01% PVA για 4 λεπτά για να απομακρυνθούν τα κύτταρα ωοφόρου δίσκου.