Αφηρημένο

Πλαίσιο

καρκινωμάτων του φλοιού (ACC) είναι ένας σπάνιος τύπος όγκου με ένα φτωχό ποσοστό πενταετούς επιβίωσης και της περιορισμένης θεραπείας επιλογές.

Στόχος

η κατανόηση της μοριακής παθογένεσης της νόσου έχει βοηθηθεί από γονιδιωματική αναλύσεις τονίζοντας αλλαγές σε μονοπάτια σηματοδότησης TP53, WNT, και IGF. Περαιτέρω διευκρίνιση είναι απαραίτητη για να αποκαλύψει θεραπευτικά προσφυγής στόχους στην ACC.

Σχεδιασμός

Σε αυτή τη μελέτη, τα επίπεδα μεθυλίωσης του DNA παγκόσμια αξιολογήθηκαν από την Array Infinium HumanMethylation450 BeadChip στις 18 όγκους ACC και 6 κανονική επινεφριδίων ιστούς . Μια νέα, μη γραμμική προσέγγιση συσχέτισης,

η μέθοδος διακριτοποίησης

, αξιολόγησε τη σχέση μεταξύ της έκφρασης μεθυλίωσης του DNA /γονιδίων σε όλη όγκους ACC.

Αποτελέσματα

Αυτή η ανάλυση συσχέτισης αποκάλυψε επιγενετικές ρύθμιση των γονιδίων που είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν TP53, WNT και σηματοδότηση του IGF, καθώς και αποσιώπηση της ογκοκατασταλτικό MARCKS, είχαν προηγουμένως αναφερθεί σε ACC.

Συμπεράσματα

μεθυλίωσης του DNA μπορούν να ρυθμίζουν τα γονίδια είναι γνωστό ότι παίζουν ένα ρόλο στην παθογένεση ACC, καθώς όπως είναι γνωστό καταστολείς των όγκων

Παράθεση:. Legendre CR, Demeure MJ, Whitsett TG, Gooden GC, Bussey KJ, Jung S, et al. Συνέπειες (2016) Μονοπάτι της παρεκκλίνουσα Παγκόσμια μεθυλίωση στον Καρκίνο του φλοιού. PLoS ONE 11 (3): e0150629. doi: 10.1371 /journal.pone.0150629

Επιμέλεια: Jorg Tost, CEA – Institut de Genomique, Γαλλία

Ελήφθη: May 28, 2015? Αποδεκτές: 17 Φλεβάρη του 2016? Δημοσιεύθηκε: 10, Μαρτίου, 2016

Copyright: © 2016 Legendre et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η έκφραση έχουν τα δεδομένα που συζητούνται στην παρούσα έκδοση έχουν κατατεθεί στη γονιδιακή έκφραση Omnibus NCBI και είναι προσβάσιμη μέσω του αριθμού ένταξη GEO σειρά GSE19776 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE19776). Τα στοιχεία μεθυλίωση που συζητήθηκαν στην παρούσα έκδοση έχουν κατατεθεί στη γονιδιακή έκφραση Omnibus NCBI και είναι προσβάσιμη μέσω του αριθμού ένταξη GEO Σειρά GSE77871 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE77871 )

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς θα ήθελαν να αναγνωρίσουμε την υποστήριξη που παρέχεται από το Ταμείο ATAC Έρευνας και το Ταμείο Legacy της Kirsten του. Έρευνα που αναφέρονται σε αυτή τη δημοσίευση υποστηρίχθηκε από μια γενναιόδωρη φιλανθρωπική συνεισφορά από τον κ Ray Thurston. χρηματοδοτική στήριξη αυτή παρέχεται επίσης από τη Βιρτζίνια Γ Piper Φιλανθρωπικό Ταμείο (TGW και BS). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκινωμάτων του φλοιού (ACC) είναι σπάνια νεοπλάσματα που αντιπροσωπεύουν έως και το 0,2% των θανάτων από καρκίνο. Η εκτιμώμενη συχνότητα εμφάνισης της νόσου είναι 0,7 να 2,0 περιπτώσεις ανά εκατομμύριο άτομα ανά έτος [1, 2]. Αυτή η ασθένεια πλήττει συνήθως ενήλικες σε 40-50s τους, αλλά μπορεί επίσης να δει σε παιδιά, τυπικά με μία ρ53 Tumor Πρωτεΐνη (

ΤΡ53

) μετάλλαξη βλαστικής σειράς [3]. Η μόνη θεραπευτική αγωγή είναι η χειρουργική αφαίρεση ενός όγκου εντοπισμένη? πολλοί ασθενείς έχουν μεταστατική νόσο κατά τον χρόνο της διάγνωσης, η οποία περιορίζει περαιτέρω θεραπευτικές επιλογές τους [4, 5]. Σε μια μελέτη εξετάζοντας σχεδόν 4.000 περιπτώσεις ACC μεταξύ του 1985 και του 2005, Bilimoria

et al

. αναφερθεί 26,5% παρουσιάζονται με κομβικά μετάσταση και 11,3% παρουσιάζονται με μακρινή μετάσταση, οδηγώντας σε ποσοστό πενταετούς επιβίωσης 11,5% σε σύγκριση με 55,1% χωρίς μακρινή μετάσταση [4]. Το ποσοστό ανταπόκρισης στο γενικώς αποδεκτό σχήμα χημειοθεραπείας πρώτης γραμμής που αποτελείται από ετοποσίδη, doxibucin, σισπλατίνη και μιτοτάνη είναι μόνο 23% [6], καθιστώντας σαφές ότι υπάρχει επείγουσα ανάγκη για νέες θεραπείες.

Γονιδιωματική αναλύσεις οι διαλεύκανση της μοριακής παθογένεσης της ACC και εκθέτοντας πιθανούς θεραπευτικούς στόχους. Τα πιο καλά μελετημένα και με συνέπεια παρατηρείται γονιδιωματικής εκτροπές αφορούν το

TP53

ογκοκατασταλτικό γονίδιο, ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα τύπου 2 (

IGF2

) σηματοδότησης, και το Απτέρου-Type MMTV Ολοκλήρωση Ιστοσελίδας Οικογένειας (

WNT

) οδού. Αρκετές μελέτες έχουν αποδείξει σαφώς ένα ρόλο για την παρεκκλίνουσα λειτουργία TP53, ακόμη και αν το αναφερόμενο ποσοστό μετάλλαξης για το

TP53

σε σποραδικές ενηλίκων ACC είναι μόνο περίπου το 16-27% [7-9]. Η υπερέκφραση του

IGF2

παρατηρείται σε τουλάχιστον 95% των δειγμάτων όγκου ACC μελετηθεί [10], προτρέποντας τις κλινικές δοκιμές που χρησιμοποιούν ινσουλίνη αυξητικός παράγοντας 1 Receptor (IGF1R) αναστολείς [11]. Σηματοδότηση Wnt οδός είναι επίσης παρεκκλίνουσα, με ενεργοποίηση σωματικές μεταλλάξεις του γονιδίου της β-κατενίνης παρατηρηθεί με παρόμοια συχνότητα περίπου 30% σε καλοήθεις και κακοήθεις όγκους των επινεφριδίων φλοιό [12]. Ενώ γονιδιωματικής αναλύσεις έχουν αποκαλύψει διαταραχές οδού στη θέση ACC, κλινικά προσφυγής στόχοι παραμένουν ασαφείς, οδηγούν στο συμπέρασμα ότι υπάρχει ανάγκη για μια βαθύτερη κατανόηση της ACC ογκογένεσης.

Διερεύνηση των επιγενετικών αλλαγών στο ACC είναι συγκεντρώνει το ενδιαφέρον. Παγκόσμια αναλύσεις μεθυλίωσης απέδειξαν ότι υπάρχουν διαφορετικά πρότυπα μεθυλίωσης να διακρίνει ACC από καλοήθεις όγκους ή /και φυσιολογικό ιστό επινεφριδίων [13, 14]. Rechache

et al

. έχουν αποδείξει ότι μεταστατικούς όγκους ACC έδειξε ένα σαφές σχέδιο μεθυλίωσης σε σύγκριση με την κανονική τους όγκους των επινεφριδίων και πρωτογενείς ACC, και κακοήθη δείγματα απέδειξαν παγκόσμια υπομεθυλίωση [14]. Barreau

et al

. εντόπισε CpG νησί methylator φαινότυπο (CIMP) στη θέση ACC που σχετίζονται με κακή επιβίωση των ασθενών [15]. Οι αναλύσεις αυτές παγκόσμιο μεθυλίωση πρότεινε υπερμεθυλίωση καταστολείς των όγκων, όπως η εξαρτώμενη από κυκλίνη αναστολέα κινάσης 2Α (

CDKN2A

), Διαγράφεται πνεύμονα και καρκίνο του οισοφάγου 1 (

DLEC1

), ή

Ν- myc

μεταγενέστεροι-ρυθμιζόμενο γονίδιο μέλος της οικογένειας 2 (

NDRG2

) ως μηχανισμό για μειωμένη έκφραση του mRNA που παρατηρείται σε όγκους ACC σε σύγκριση με αδενώματα ή φυσιολογικό επινεφριδίων ιστού. Πιο πρόσφατα, μια ολοκληρωμένη γονιδιωματική χαρακτηρισμό προσδιόρισε δύο διακριτές μοριακές υποομάδες σε ACC: C1A και C1B [7]. Η υποομάδα C1A συσχετίζεται με κακή πρόγνωση των ασθενών, η αύξηση της συχνότητας των γενετικών μεταλλάξεων οδηγού, ξεχωριστή mRNA και συμπλέγματα miRNA, και είχε μια σαφή συσχέτιση με CIMP. Έτσι, αναλύσεις μεθυλίωση έχουν εντοπίσει υποομάδες των όγκων ACC με διαφορικό πρόγνωση και πρότεινε μοριακές αλλαγές που θα μπορούσαν να συμβάλουν στην ACC παθογένεση? αν και η πλήρης έκταση των γονιδίων και μονοπατιών διαμορφώνεται από μεθυλίωση στο ACC παραμένει άγνωστη.

Σε αυτό το έργο, επιδιώξαμε να συσχετίσει τις αλλαγές μεθυλίωσης του DNA με προφίλ έκφρασης σε ένα σύνολο ACC (n = 18 [17 όγκους , 1 μετάσταση στο ήπαρ ACC_150]) και κανονική επινεφριδίων (n = 6) δείγματα, προκειμένου να κατανοήσουν καλύτερα πώς μεθυλίωση μπορεί να οδηγήσει σε μη φυσιολογική γονιδιακή έκφραση και πορεία που παρατηρείται στην ACC. Η μελέτη μας χρησιμοποιεί μια μη γραμμική προσέγγιση συσχέτιση αναφέρεται ως

η μέθοδος διακριτοποίησης

[16] για την αξιολόγηση των σχέσεων έκφραση μεθυλίωση /γονιδίου DNA μέσα σε μονοπάτια, και αποκαλύπτει το δυναμικό επιγενετική ρύθμιση των γονιδίων που εμπλέκονται στην TP53, WNT, IGF2, και σηματοδότηση ογκοκατασταλτικό γονίδιο ή /και τη σταθερότητα. Ενώ άλλες μελέτες έχουν αναφέρει αλλαγές μεθυλίωσης του DNA σε ACC και στο παρελθόν, η μελέτη μας είναι διακριτή με τον τρόπο με τον οποίο περιγράφουμε ενώσεις έκφραση μεθυλίωση /γονιδίου DNA για την αναγνώριση επιγενετικώς ρυθμιζόμενη οδών γνωστής σημασίας για ACC.

Υλικά και Μέθοδοι

κλινικά δείγματα

Τα κλινικά δείγματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή την ανάλυση αντιπροσωπεύουν ένα υποσύνολο των δειγμάτων που περιγράφηκε προηγουμένως [8]. Εν συντομία, ένα σύνολο ACC flash κατεψυγμένα όγκων και των φυσιολογικών επινεφριδίων συλλέχθηκαν στη Mayo Clinic (Rochester, Minnesota), το Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο του Έσσεν (Essen, Γερμανία), το Πανεπιστήμιο του Κάλγκαρι (Αλμπέρτα, Καναδάς), και Scottsdale Υγείας (Scottsdale Αριζόνα), καθώς και δώρισε απευθείας από τους ασθενείς μέσω των ρυθμίσεων της κοινότητας φροντίδα τους? Όλα τα δείγματα που λαμβάνονται σύμφωνα με τις κατάλληλες ηθικές διαδικασίες και γραπτή συγκατάθεση του ασθενούς στα αντίστοιχα όργανα. Κανονική επινεφρίδια συλλέχθηκαν κατά το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης για άλλη ένδειξη, τυπικά εκτομή ενός όγκου του νεφρού. Η επινεφριδίων λήφθηκε en bloc, και ο φλοιός είχε macrodissected από το μυελό όσο το δυνατόν καλύτερα. Έρευνα υλικών για τη μελέτη αυτή ελήφθησαν υπό πρωτόκολλα έχουν εγκριθεί από το Διοικητικό Συμβούλιο αναθεώρηση Δυτική Θεσμική (WIRB # 20051769). Η διάγνωση της ACC επιβεβαιώθηκε από επανεξέταση της έκθεσης παθολογίας, και στις περισσότερες περιπτώσεις, από επανεξέταση των διαφανειών ιστοπαθολογική εξέταση από έναν έμπειρο ενδοκρινικό παθολόγος.

Gene Expression Profiling

Η έκφραση mRNA και στατιστική ανάλυση του ACC και φυσιολογικούς ιστούς περιγράφηκε προηγουμένως [8]. Εν συντομία, το RNA εκχυλίζεται από δείγματα 100 mg όγκων ACC και φυσιολογικό ιστό επινεφριδίων, ενισχύεται και αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας την MessageAmp II Βιοτίνη Enhanced Kit (Ambion Life Technologies Corp, Carlsbad, CA). Βιοτίνη σημασμένο cRNA συντέθηκε σύμφωνα με πρότυπο πρωτόκολλο τους, ακολουθούμενη από καθαρισμό μέσω προβλέπεται Φυσίγγια cRNA Filter. Σημασμένο cRNA ήταν κατακερματισμένη και υβριδοποιήθηκε σε Affymetrix U133 Plus 2 συστοιχίες ανθρώπινο γονιδίωμα σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο Affymetrix (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA). Σάρωσης και το πλύσιμο ολοκληρώθηκε στο ρευστού Σταθμοί FS450 και το GeneChip

® Scanner 3000 με Workstation.

ποιότητα γεννήτριας για ACC και των κανονικών δειγμάτων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας το πακέτο Affy QCReport στην Bioconductor και το R στατιστική γλώσσα ? όλες οι συστοιχίες περάσει τις μετρήσεις ελέγχου ποιότητας. Όλα τα μετέπειτα κανονικοποίηση των δεδομένων και στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση GenePattern (Ινστιτούτο Broad, www.broadinstitute.org) [17]. δεδομένων συστοιχία έκφρασης ομαλοποιήθηκε με gcRMA με ποσοστημόριο εξομάλυνση, και αφαίρεση φόντου μετά τη χρήση του Δημιουργού έκφραση File [18]. Τα δεδομένα στη συνέχεια δάπεδο στο 5,5 χρησιμοποιώντας preprocess συνόλου δεδομένων, και διηθείται για την απομάκρυνση 1) ανιχνευτών με περισσότερα από 35 floored τιμές και /ή 2) ανιχνευτές όπου δάπεδο όλες οι τιμές από τη μια παρτίδα ενώ τιμές από την άλλη παρτίδα δεν ήταν. Περαιτέρω αποτελέσματα παρτίδα ελαχιστοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας την καταπολέμηση της παραμετρικής επιλογής [19]. Τα στοιχεία έκφρασης που συζητήθηκαν στην παρούσα έκδοση έχουν κατατεθεί στη γονιδιακή έκφραση Omnibus NCBI και είναι προσβάσιμη μέσω του αριθμού ένταξη GEO Σειρά GSE19776 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE19776 ).

μεθυλίωσης του DNA Ανάλυση

Παγκόσμια μεθυλίωσης του DNA αξιολογήθηκε με τη χρήση του Infinium

® HumanMethylation450

® BeadChip Array. (Illumina, San Diego, CA). Εν συντομία, 1 μg από κάθε δείγμα DNA υποβλήθηκε σε μετατροπή διθειώδους χρησιμοποιώντας το EZ μεθυλίωσης του DNA Kit (Zymo Research, Irvine, CA) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή για τη Δοκιμασία Illumina Infinium. Κατεργασμένου με όξινο θειώδες ϋΝΑ στη συνέχεια υβριδοποιήθηκε συστοιχίες σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Χρησιμοποιήσαμε GenomeStudio V2011.1 (Illumina) για τη συναρμολόγηση των δεδομένων μεθυλίωση και εξαγορών. Τα επίπεδα μεθυλίωσης για κάθε κατάλοιπο CpG παρουσιάζονται ως τιμές SS, την εκτίμηση της αναλογίας του μεθυλιωμένου ένταση του σήματος πάνω από το άθροισμα των μεθυλιωμένων και μη-μεθυλιωμένων εντάσεις σε κάθε γενετικό τόπο. Η μέση τιμή των SS αναφέρει ένα σήμα μεθυλίωσης που κυμαίνεται από 0 έως 1, που αντιπροσωπεύουν εντελώς μη μεθυλιωμένα σε εντελώς μεθυλιωμένη αξιών, αντίστοιχα. δεδομένων μεθυλίωση ήταν έτοιμη τροφή στο R χρησιμοποιώντας το πακέτο Illumina μεθυλίωση Analyzer (IMA) [20]. προεπεξεργασία των δεδομένων που περιλαμβάνονται διόρθωση υποβάθρου, μετρήστε την κλιμάκωση να ισορροπήσει Infinium Ι και ΙΙ ανιχνευτές, ποσοστημόριο κανονικοποίηση και μετατροπή logit. Μια μετατροπή logit μετατρέπει διαφορετικά ετεροσκεδαστική τιμές βήτα (που οριοθετείται από 0 και 1) σε τιμές M μετά από μια Gaussian κατανομή. Επιπλέον, η ανίχνευση τιμές ρ & gt? 0,05 στο 25% των δειγμάτων, οι ανιχνευτές για χρωμοσώματα Χ και Υ, και ανιχνευτές που βρίσκονται μέσα σε 10 bp υποθετικών SNPs απομακρύνθηκαν. Διαφορική ανάλυση μεθυλίωσης σε αξίες logit-μετασχηματισμένα εκτελέστηκε για σύγκριση 18 ACC όγκους έως 6 κανονική επινεφριδίων δείγματα σε ΙΜΑ. τεστ rank Wilcox διεξήχθη μεταξύ ACC και φυσιολογικά δείγματα και p-τιμές διορθώθηκαν από τον υπολογισμό του ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη με τη μέθοδο Benjamini-Hochberg. Ανιχνευτές με προσαρμοσμένο

p-τιμές

& lt? 0,05, και δέλτα β αξίες ≥0.2 ή ≤-0,2 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές και διαφορικά μεθυλιωμένα. Τα στοιχεία μεθυλίωση που συζητήθηκαν στην παρούσα έκδοση έχουν κατατεθεί στη γονιδιακή έκφραση Omnibus NCBI και είναι προσβάσιμη μέσω του αριθμού ένταξη GEO Σειρά GSE77871 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE77871 ).

η συσχέτιση της μεθυλίωσης του DNA με γονιδιακής έκφρασης με τη μέθοδο διακριτοποίησης

Χρησιμοποιήσαμε μας πρόσφατα αναφερθεί μη-γραμμικό

μέθοδο διακριτοποίησης

κατηγοριοποιώντας τα δείγματα σε διαφορετικές ομάδες με βάση την μεθυλίωση καθετήρα τα επίπεδα για τον εντοπισμό συσχετισμών μεθυλίωση /έκφραση του DNA [16]. δεδομένα γονιδιακής έκφρασης ήταν διαθέσιμη για 14 από τα 18 δείγματα που αναλύθηκαν για τις αλλαγές μεθυλίωσης. Για κάθε ανιχνευτή μεθυλίωσης, τα δείγματα 14 ACC διαχωρίστηκαν σε

υπερμεθυλιωμένο

(Μ) ή

μεθυλιωμένος

(U) ομάδες με βάση τον βαθμό της μεθυλίωσης διαφέρουν από τα μέσα επίπεδα μεθυλίωσης της 6ης κανονικής επινεφριδίων δείγματα. Δείγματα με επίπεδα μεθυλίωσης & gt?

μ

(μέσο επίπεδο μεθυλίωσης των κανονικών δειγμάτων) ταξινομήθηκαν σε Μ

ομάδα και τα δείγματα με επίπεδα μεθυλίωσης & lt?

μ

ταξινομήθηκαν ως U για τη συγκεκριμένη CpG θέση ανακρίνεται από τον ανιχνευτή. Κάθε ανιχνευτής στη συστοιχία μεθυλίωση με έναν ανιχνευτή γονιδιακή έκφραση στο Affymetrix U133 Plus 2 συστοιχίας ανθρώπινου γονιδιώματος αναλύθηκε. Διαφορική ανάλυση γονιδιακής έκφρασης, συγκρίνοντας τα δείγματα που είχαν χαρακτηριστεί ως Μ και U, διεξήχθη με ένα

t-test

χωρίς να αναλαμβάνει ίση διακύμανση (λογισμικό Matlab, www.mathworks.com). Εάν ένα γονίδιο διαφορικά εκφραζόμενο (FDR-διορθωμένη

p-value

& lt? 0,05) μεταξύ των δειγμάτων στις ομάδες Μ και U, CpG μεθυλίωση θεωρήθηκε συσχετίζεται με την έκφραση του εν λόγω γονιδίου. Μια αρνητική συσχέτιση ορίστηκε ως η κατευθυντικότητα της αλλαγής για έκφραση και μεθυλίωση σε αντίθετες κατευθύνσεις (π.χ. υπερμεθυλίωση και η απώλεια της έκφρασης, ή το αντίστροφο). Μια θετική συσχέτιση εμφανίστηκε όταν η κατευθυντικότητα της αλλαγής ήταν η ίδια μεταξύ μεθυλίωσης και της έκφρασης (π.χ. υπερμεθυλίωση και θετική έκφραση, ή υπομεθυλίωση και μειωμένη έκφραση).

Για να επικυρώσετε τα ευρήματά μας αναφέρονται στον Πίνακα S2 που χρησιμοποιούνται RNAseq και τα δεδομένα μεθυλίωσης από 78 ACC δείγματα που παράγονται από TCGA. 3 στοιχεία σε επίπεδο RNAseq (τιμές TPM) και οι τιμές βήτα μεθυλίωση είχαν κατεβάσει από TCGA Πύλη δεδομένων (https://tcga-data.nci.nih.gov). δεδομένα RNAseq ήταν log2 μεταμορφωθεί: log2 (TPM + 1), πριν από την περαιτέρω ανάλυση. Στο επίπεδο 3 TCGA δεδομένων μεθυλίωση, ορισμένες τιμές μετρήθηκαν ως «NA» και οι τιμές αφαιρέθηκαν κατά τη διάρκεια διαφορική ανάλυση. Επίσης, δεν περιλαμβάνουν αυτά τα ανιχνευτές μεθυλίωση με & lt? 2 δείγματα είτε υπο- ή υπερ-ομάδα στην ανάλυση. Η ανάλυση επικύρωση διεξήχθη από τις δοκιμές εάν οι ίδιοι ανιχνευτές μεθυλίωση αναφέρονται στον Πίνακα S2 είχε επίσης συσχέτιση με την έκφραση του γονιδίου στο σύνολο δεδομένων TCGA ACC, όταν χρησιμοποιείτε τη μέθοδο διακριτοποίησης. Στο σημερινό χειρόγραφο, τροποποιήσαμε την μέθοδο διακριτοποίησης περιγράφηκε για πρώτη φορά στην Jung

et al

. [16] για να αντικατοπτρίζουν το μικρό αριθμό δειγμάτων. Σε αυτή την τροποποιημένη μέθοδο, μπορούμε διακριτοποιούνται δείγματα με βάση το αν ένα δείγμα ήταν υπογλυκαιμία ή υπερμεθυλίωση σε σύγκριση με μη νεοπλαστικά επινεφριδίων ιστού. Για αυτό, μια τιμή βήτα δέλτα για κάθε ανιχνευτή υπολογίστηκε για δεδομένα μεθυλίωση κάθε όγκου όταν συγκρίνεται με το μέσο όρο των δεδομένων μεθυλίωσης από την μη νεοπλασματικών επινεφριδίων ιστού. Σε αυτό το δυαδικό διακριτοποίησης, ένα δείγμα όγκου κρίθηκε μεθυλιωμένος ή υπερμεθυλίωση όταν δέλτα-βήτα του αξία ήταν αρνητική ή θετική, αντίστοιχα, σε σύγκριση με το φυσιολογικό ιστό. Δεδομένου ότι υπήρχαν επαρκή δείγματα στο σύνολο δεδομένων TCGA, μπορούμε επίσης να πραγματοποιηθεί διακριτοποίηση σύμφωνα με την αρχική μέθοδο που περιγράφεται (που αναφέρεται εδώ ως τριαδικό διακριτοποίηση) από Jung

et al

. [16]. Μόλις τα δείγματα ομαδοποιήθηκαν σε U και M ομάδες είτε δυαδικά ή τριαδικά διακριτοποίηση, οι τιμές έκφραση γονιδίων με τα αντίστοιχα ανιχνευτές μεθυλίωση ελέγχθηκαν για διαφορική έκφραση χρησιμοποιώντας t-test του Welch.

Pathway Analysis

Ο κατάλογος γονίδιο που ενδιαφέρει αναρτήθηκε σε ΙΡΑ (Ingenuity

® Systems, Redwood City, CA) και της ροής εργασίας Ανάλυση πυρήνα τρέχει με τις προεπιλεγμένες παραμέτρους. Η ανάλυση πυρήνα παρέχει μια εκτίμηση της σημαντικά μεταβληθεί οδών, μοριακής δικτύων και βιολογικών διεργασιών εκπροσωπούνται στη λίστα γονιδίων των δειγμάτων ».

Αποτελέσματα

Παγκόσμια μεθυλίωση Μοτίβα στο ACC έναντι Κανονική επινεφριδίων

για την εκτίμηση παγκόσμια πρότυπα μεθυλίωσης του DNA στο ACC όγκους, χρησιμοποιήσαμε την πλατφόρμα 450K-μεθυλίωση για να συγκρίνετε 18 όγκους ACC με 6 κανονικές επινεφριδίων δείγματα. Συνολικά, η ανάλυση αποκάλυψε 1291 διαφορικά μετουσιωμένο τόπους CpG (DML) περιλαμβάνει 629 μοναδικά γονίδια (S1 πίνακα). Beta τιμές χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία οικοπέδων πλαίσιο για να αντιπροσωπεύουν συνολικά επίπεδα μεθυλίωσης σε όλη ΟΘΔ για ACC και φυσιολογικό. Διάμεση συνολική μεθυλίωση ήταν ελαφρά χαμηλότερη σε ACC (β = 0.51) σε σχέση με την κανονική επινεφριδίων (β = 0,67) (Εικ 1Α), υποδεικνύοντας υπομεθυλίωση σε ACC (τιμή-ρ & lt? 0,0001). Μεμονωμένα οικόπεδα κουτί δείγμα του DML έδειξε μια πιο ομοιογενή κατανομή των τιμών μεθυλίωσης σε φυσιολογικά δείγματα των επινεφριδίων σε σύγκριση με ACC που εμφανίζονται ποικίλους βαθμούς μεθυλίωσης μεταξύ των δειγμάτων (Σχήμα 1Β). Όλων των DML, 475 είχαν υπερμεθυλίωση και 816 ήσαν υπο-μεθυλιωμένα. Στη συνέχεια εξετάστηκε η κατανομή των ΟΘΔ σε όλη χρωμοσωμάτων, σχεδιάζοντας την κατανομή των υπο- και υπερ-DML μετά από κανονικοποίηση με το μήκος του χρωμοσώματος (Πίνακας 1). Σύμφωνα με τα χρωμοσώματα ανάλυση 5, 7, 12, και 19 είχε την πιο μεθυλιωμένος τόπους και τα χρωμοσώματα 11, 17, και 19 είχε την πιο υπερμεθυλιωμένων τόπους, με χρωμοσώματα 7, 12, και 19 που έχουν την πλέον γενική DML.

Α) Box οικόπεδο αποδεικνύοντας συνολική χαμηλότερη διάμεση β επίπεδα μεθυλίωσης αξία για τα 1291 διαφορετικά μεθυλιωμένα ανιχνευτές. Β) οικόπεδα ασφαλείας δείχνει β αξίες του 1291 διαφορικά μετουσιωμένο τόποι για κάθε δείγμα (6 κανονικό και 18 δείγματα ACC).

Η

Στη συνέχεια εξετάσαμε την περιφερειακή και λειτουργική κατανομή CpG του DML στην ACC . Λειτουργική διανομή σχετίζεται θέση CpG σε: μεταγραφή θέσεις έναρξης (TSS -200 έως -1500 bp), 5 ‘αμετάφραστη περιοχή (UTR), το εξώνιο 1 για την κωδικοποίηση των γονιδίων, καθώς και φορείς γονιδίων. Συνολικά, η πλειονότητα των ανιχνευτών (& gt? 50%) βρίσκονταν στα όργανα γονίδιο, ακολουθούμενη από ~ 15% των ανιχνευτών που βρίσκονται εντός 1500 bp ανοδικά του TSS, με ένα πολύ παρόμοιο κατανομή μεταξύ υπερ και υπο DML (Σχήμα 2Α)

Α) διαγράμματα πίτας αποδεικνύουν τη συχνότητα με την οποία υπερ ή υπο-μεθυλιωμένα τόπους διανέμονται ανάλογα με τη λειτουργική θέση τους, συμπεριλαμβανομένης της απόστασης από θέση έναρξης μεταγραφής (TSS). Β) Συχνότητα DML να βρίσκεται σε νησίδες CpG, ακτές, ράφια, ή ανοιχτή θάλασσα. πλαίσιο της γειτονιάς αποτελεί ένδειξη της εγγύτητας σε ένα νησί CpG.

Η

Περιφερειακή κατανομή των ΟΘΔ αξιολογήθηκε με βάση την εγγύτητά τους προς το πλησιέστερο νησί CpG. Εκτός από τα νησιά, τις ακτές είναι 0-2 kb από CpG νησιά, τα ράφια είναι 2-4 kb μακριά, και οι ανοικτές θαλάσσιες περιοχές απομονωμένες τόπους χωρίς ονομασία. Κατά τη σύγκριση των δειγμάτων ACC σε φυσιολογικά δείγματα, εντοπίσαμε την πλειοψηφία των DML (55,7%) ήταν σε ανοιχτή θάλασσα, που ακολουθείται από τα νησιά (21%), στις ακτές (15,8%), και τα ράφια (7,5%). Επιπλέον, σημειώνουμε ότι η πλειοψηφία των υπερμεθυλιωμένων loci (50,3%) βρίσκονταν σε νησίδες CpG σε σύγκριση με την πλειονότητα των μεθυλιωμένος τόπους που βρίσκονται σε ανοιχτή θάλασσα (77%) (Σχήμα 2Β). Σε αντίθεση, όλων των μεθυλιωμένος τόπων, το μικρότερο ποσοστό (3,92%) βρέθηκε στα νησιά και το μικρότερο ποσοστό των υπερμεθυλιωμένων ανιχνευτές (4,42%) βρέθηκαν στα ράφια.

επόμενο εκτελείται χωρίς επίβλεψη ανάλυση ομαδοποίησης (Ευκλείδεια απόσταση , Πλήρης ιεραρχικές μέθοδοι ομαδοποίησης) της DML και κατέδειξε μια ξεχωριστή διαχωρισμό των φυσιολογικών και ACC δείγματα με ενδείξεις συστάδες γονιδίων που είναι κατά προτίμηση υπερ ή υπο-μεθυλιώνεται στη θέση ACC (Σχήμα 3). Μεταξύ των γονιδίων πιο υπερμεθυλίωση στο ACC ήταν η

EPHX3

και

MEIS

γονίδια, με 20% και το 9,2% των πιθανών ανιχνευτές γονιδίων επηρεάζεται (Σχήμα 4). Εκπρόσωπος γονίδια στα μεθυλιωμένος σμήνη είναι η

ADCY2

και

TMEM132D

γονίδια, τα οποία επηρεάζονται 16,2% και το 18,5% των ανιχνευτών (Σχήμα 4).

ανάλυση Ομαδοποίηση αποκάλυψε το διαχωρισμό της ACC και φυσιολογικά δείγματα. Δείγματα είναι στον οριζόντιο άξονα: Τα φυσιολογικά δείγματα εμφανίζονται με κίτρινο μπαρ και τα δείγματα ACC εμφανίζονται με μπλε γραμμή

Η

EPHX3

και

MEIS

γονίδια. οι υπερμεθυλίωση σημαντικά το ACC σε σύγκριση με το

TMEM132D

και

ADCY2

τα οποία μεθυλιωμένος σημαντικά.

η

Αναγνώριση συσχετίσεις μεθυλίωση-έκφρασης χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Διακριτοποίηση

σε μια ξεχωριστή ανάλυση, εξετάσαμε συσχετίσεις μεθυλίωση έκφραση χρησιμοποιώντας μια μη γραμμική προσέγγιση: αναφέρεται ως

μέθοδος διακριτοποίησης

. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στο γεγονός ότι τα δείγματα καρκίνος μπορεί να ταξινομηθούν σε δύο ομάδες σύμφωνα με τα σχετικά επίπεδα μεθυλίωσης τους για κάθε ανιχνευτή στη συστοιχία μεθυλίωση, επιτρέποντας μια αύξηση του αριθμού των συσχετίσεων που θα ανιχνευθεί από τις συγκρίσεις με τη χρήση γραμμικών μεθόδων. Τα δείγματα είτε θεωρούνται

υπερμεθυλιωμένο

(Μ) ή

μεθυλιωμένος

(U) σε σύγκριση με μια αναφορά (μέσα επίπεδα μεθυλίωσης από φυσιολογικά δείγματα σε αυτή τη μελέτη) και στατιστικώς σημαντικές διαφορές έκφρασης γονιδίου μεταξύ των δειγμάτων στο

Μ

και

U

ομάδες θα προτείνουν έναν συσχετισμό μεθυλίωσης-έκφραση σε ένα συγκεκριμένο τόπο. Με την εφαρμογή αυτή δυαδική μέθοδο διακριτοποίησης, εντοπίσαμε 763 μοναδικές θέσεις CpG (550 μοναδικά γονίδια) με συσχετίσεις μεθυλίωση-έκφραση. Κατά μέσο όρο, υπήρχαν 9 δείγματα στο

Μ

ομάδα και 5 δείγματα στην ομάδα

U

. Υπήρχαν 319 θέσεις με θετικές συσχετίσεις και 444 θέσεις με αρνητικές συσχετίσεις. Όλες οι συσχετισμοί μεθυλίωση /έκφραση CpG από αυτή την ανακάλυψη ομάδα παρουσιάζονται στον Πίνακα S2.

Για να επικυρώσετε τα ευρήματα της παρούσας μελέτης σε ανεξάρτητη ομάδα των δειγμάτων, έχουμε κατεβάσει τα δεδομένα έκφρασης RNA-επόμενα και ταιριάζουν μεθυλίωσης του DNA δεδομένα από TCGA πύλη για 78 δείγματα ACC. Αυτό το μέγεθος του δείγματος, όχι μόνο μας επέτρεψε να δοκιμάσει συσχετίσεις χρησιμοποιώντας τροποποιημένη μέθοδο δυαδικό διακριτοποίησης μας, αλλά έδωσε επίσης την ευκαιρία να χρησιμοποιήσει το τριαδικό μέθοδο, καθώς και. Λόγω της απουσίας /ελλείποντα στοιχεία στο σύνολο TCGA, 468 ανιχνευτές ήταν διαθέσιμα για δυαδικό έλεγχο της συντονισμένης έκφρασης. Επιπλέον, κάποιοι ανιχνευτές δεν είχε επαρκή μέγεθος της τάξης (Μ και U), αφήνοντας έτσι 433 ανιχνευτές για τριμερή ομαδοποίηση από 763 μοναδικά ανιχνευτές αναφέρονται στον Πίνακα S2. Στο δυαδικό ομαδοποίηση, 164/468 (35%) ανιχνευτές (S3 Πίνακας) έδειξε σημαντική συσχέτιση (p-value & lt? 0,05) με αντίστοιχες τιμές γονιδιακή έκφραση, και τριαδικό ομαδοποίηση 154/433 (35,6%) ανιχνευτές (S4 Πίνακας) έδειξε σημαντική συσχέτιση (p-value & lt? 0,05)

Αλλαγές στην TP53 και σηματοδότηση Wnt Μονοπάτια

για τον εντοπισμό βιολογικών εννοιών εμπλουτισμένο σε S2 πίνακα, εμείς οι δύο επιθεωρείται οπτικά τη λίστα για να εντοπίσει προφανή. πρότυπα και υπέβαλε τη λίστα γονίδιο για την ροή εργασίας Πυρήνας Ανάλυση σε ΙΡΑ (Ingenuity

® Systems). Σημαντικά ευρήματα κατατάσσονται με βάση την p-τιμές για τον εντοπισμό των πιο διακριτικά κατηγορίες που αντιπροσωπεύουν επιγενετικώς ρυθμίζονται τα γονίδια στην ACC. Σε σύντομη περίληψη, οι πιο σημαντικές Ασθένειες και διαταραχές που συνδέονται με τα γονίδια στο S2 πίνακα ήταν ο καρκίνος με 471 γονίδια που αντιπροσωπεύεται από τον κατάλογο μας (S5 Πίνακας). Τα 5 κορυφαία Μοριακής και Κυτταρικής Λειτουργίες ήταν κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό, Cell Μορφολογία, Κυτταρικής Συνέλευση και Οργάνωσης, της κυτταρικής λειτουργίας και συντήρησης, καθώς και κυτταρικού θανάτου και επιβίωσης (S6 Πίνακας).

Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο διακριτοποίησης, εντοπίσαμε ένα αριθμός γονιδίων με συσχετισμούς μεθυλίωση έκφραση είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στον καρκίνο, ή ειδικά ACC παθογένεση. Όλα τα γονίδια που επισημαίνουμε παρακάτω εμπλουτίστηκαν στην οδό Ανάλυση Ingenuity σε μία από τις κατηγορίες που αναφέρονται παραπάνω. ένωση διαδρομής τους και το κατά πόσον ή όχι επικυρώθηκαν σημειώνεται σε καθένα από τα παρακάτω πίνακες. Μεταξύ αυτόν τον κατάλογο των συσχετιζόμενων γονιδίων είναι ρυθμιστές της οδού TP53, όπως:

SETD7

,

DYRK2

,

CCDC8

,

UBE2D1

,

RBM5

,

NDRG1

και

DUSP7

(Πίνακας 2, Σχήματα 5 και 6, S2-S4 πίνακες). Σε κάθε παράδειγμα, δείγματα με χαμηλή μεθυλίωση είχαν στατιστικά σημαντικά υψηλότερα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης και δείγματα με υψηλή μεθυλίωση είχαν χαμηλότερα επίπεδα της γονιδιακής έκφρασης.

DUSP7

,

NDRG1

,

SETD7

, και

UBE2D1

παρατηρήθηκαν να είναι υπο-εκφράζεται σε ένα ανεξάρτητο σύνολο δεδομένων που συγκρίνει έκφραση ACC mRNA στο κανονικό επινεφριδίων, με την υπο-έκφραση συμφωνεί με την παρατηρούμενη υπερμεθυλίωση /υπο-έκφραση συσχέτισης [21].

για κάθε γονίδιο, το ανώτερο heatmap αντιπροσωπεύει τις τιμές της μεθυλίωσης log2 για 14 δείγματα ACC κάθε κανονικοποιημένης ως προς το μέσο όρο των 6 κανονική επινεφριδίων δείγματα. Log2 αναλογίες μεθυλίωση & gt? 0 αντιπροσωπεύουν υπερμεθυλίωση και & lt? 0 αντιπροσωπεύουν υπομεθυλίωση. Το κατώτερο θερμότητα χάρτης δείχνει έκφραση των επιπέδων έκφρασης z-μετασχηματισμένα, όπου η τιμή 0 δείχνει ότι δεν υπάρχει μεταβολή της έκφρασης σε σύγκριση με το μέσο επίπεδο έκφρασης 14 δείγματα ACC. επελέγησαν τρία γονίδια με αρνητικές συσχετίσεις για την οπτικοποίηση:

CCDC8

(οδός TP53),

TBX3

(WNT οδός), και

PAX8

(άλλο γνωστό γονίδιο του καρκίνου, που εμπλέκονται στην εισβολή και τη μετανάστευση). Δείγματα με υψηλότερες μεθυλίωση (ροδάκινο-καφέ) είχαν χαμηλότερη έκφραση (πράσινο). Δείγματα με χαμηλότερο μεθυλίωσης (μπλε) είχαν υψηλότερη έκφραση (κόκκινο). Μόνο οι συσχετισμένες ανιχνευτές μεθυλίωση τόπους και έκφρασης φαίνονται και τα δείγματα που διοργανώθηκε από διακριτοποίηση τους κατάταξη του Μ ή U για κάθε γονίδιο.

Η

Για κάθε γονίδιο, το ανώτερο χάρτη θερμότητας αντιπροσωπεύει τις τιμές log2 μεθυλίωσης ( β) για τα 78 δείγματα TCGA ACC κάθε κανονικοποιημένης ως προς το μέσο όρο των 6 ΓΤΕ κανονική επινεφριδίων δείγματα. Log2 αναλογίες μεθυλίωση & gt? 0 (κόκκινο) αντιπροσωπεύουν υπερμεθυλίωση και & lt? 0 (μπλε) αντιπροσωπεύουν υπομεθυλίωση. Το κάτω θερμικός χάρτης δείχνει γονιδιακή έκφραση των αντίστοιχων δειγμάτων TCGA ACC, log2 (TPM + 1). Τα ίδια τρία γονίδια που χρησιμοποιούνται για τη μελέτη ACC ΓΤΕ (ανακάλυψη) χρησιμοποιήθηκαν για την απεικόνιση:

CCDC8

(TP53 οδός),

TBX3

(WNT οδός), και

PAX8

( άλλους γνωστούς γονίδιο του καρκίνου, που εμπλέκονται στην εισβολή και τη μετανάστευση). Δείγματα με υψηλότερες μεθυλίωσης (κόκκινο) είχαν χαμηλότερη έκφραση (πράσινο). Δείγματα με χαμηλότερο μεθυλίωσης (μπλε) είχαν υψηλότερη έκφραση (κόκκινο). Μόνο οι συσχετισμένες ανιχνευτές μεθυλίωση loci και έκφραση δείχνεται, και τα δείγματα οργανώνονται από ομοιότητα των προτύπων μεθυλίωσης μεταξύ των δειγμάτων για κάθε γονίδιο. Όπως φαίνεται, οι τρεις γονίδια δείχνουν την ίδια αρνητική συσχέτιση μεταξύ της κατάστασης μεθυλίωσης και της έκφρασης του γονιδίου ως δείγματα ΓΤΕ ACC

Η

Επίσης, εντοπίστηκαν συσχετισμοί /έκφραση μεθυλίωσης σε γονίδια που σχετίζονται με σηματοδότηση 4 WNT.? αυτό είναι μια άλλη οδός είναι γνωστό ότι σχετίζονται με ογκογένεση ACC (Πίνακας 3, S2-S4 Πίνακες). Τα δείγματα που εμφανίζουν υψηλότερα μεθυλίωση του

PRDM5

και

DKK3

, οι οποίες είναι και οι δύο ανταγωνιστές της σηματοδότηση Wnt, συνοδεύονταν από την απώλεια της έκφρασης του mRNA και το αντίστροφο. Αντίθετα,

TBX3

(ένα γονίδιο στόχος WNT) ήταν μεθυλιωμένος και υπερεκφράζεται? Αυτές οι συσχετίσεις παρατηρήθηκαν σε αμφότερα τα αρχικά και TCGA σύνολα δεδομένων (Σχήματα 5 και 6).

WNT3

(συνδέτη WNT) ήταν μεθυλιωμένα και υποεκφράζονται σε 11 δείγματα και μη μεθυλιωμένες και υπερεκφράζεται σε 3 δείγματα. Η απώλεια της έκφρασης

DKK3

mRNA ελέγχθηκε σε ένα ανεξάρτητο, διαθέσιμες στο κοινό σύνολο δεδομένων συγκρίνοντας ACC στην κανονική επινεφριδίων ιστού [21].

Η

Άλλα σχετίζονται με τον καρκίνο Gene Αλλαγές

Ο παράγοντας μεταγραφής

PAX8

, φαίνεται να υπερμεθυλίωση σε άλλους τύπους όγκων, αποδεικνύεται σε μεγάλο βαθμό μια αρνητική συσχέτιση με την έκφραση του γονιδίου, όπου υπερμεθυλίωση συσχετίζεται με μειωμένη έκφραση (Πίνακας 4, τα Σχήματα 5 και 6, S2-S4 πίνακες ). Αρνητική μεθυλίωση /συσχετίσεις έκφραση βρέθηκαν επίσης για

HDAC4

(α τροποποιητής χρωματίνης),

ErbB3

(ένα γνωστό ογκογονίδιο), καθώς και

MARCKS

και

CXCR4

? γονίδια που είναι γνωστό ότι επάγει κυττάρου όγκου εισβολή και τη θεραπευτική αντίσταση σε άλλους τύπους όγκων (Πίνακας 4, S2-S4 Πίνακες). Ο ρόλος των IGF2 και IGF σηματοδότηση ως ογκογόνο οδηγός σε ACC είναι επίσης καλά περιγραφεί. Τα στοιχεία μας δείχνουν μια σημαντική συσχέτιση της μεθυλίωσης /έκφραση για το

IGF2

γονίδιο. Ένας ανιχνευτής (cg04057455) που βρίσκεται στο σώμα γονίδιο συσχετίζεται θετικά με δύο καθετήρες γονιδιακή έκφραση (S2 πίνακα). Το άλλο ανιχνευτή (cg08986368) που βρίσκεται σε ένα νησί CpG συσχετίζεται αρνητικά με έναν ανιχνευτή γονιδιακής έκφρασης. Το τελικό αποτέλεσμα ήταν αυξημένη έκφραση για δείγματα με CpG νησί υπομεθυλίωση ή γονίδιο υπερμεθυλίωση σώμα, το οποίο είναι σύμφωνο με τις αναμενόμενες επιπτώσεις της μεθυλίωσης στη γονιδιακή έκφραση.

Η

Συζήτηση

Ο σκοπός της τρέχουσα μελέτη ήταν η ανάλυση παγκόσμια πρότυπα μεθυλίωσης του DNA σε ACC όγκους σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό επινεφριδίων και να συσχετίσει τις αλλαγές μεθυλίωσης του DNA με την έκφραση mRNA. Η μελέτη μας κατέδειξε την παγκόσμια υπομεθυλίωση στην ACC σε σύγκριση με το φυσιολογικό επινεφριδίων ιστού. Παγκόσμια γονιδιωματικό υπομεθυλίωση έχει παρατηρηθεί σε πολυάριθμους τύπους καρκινικών κυττάρων [22, 23], συμπεριλαμβανομένων κακοήθους όγκους των επινεφριδίων, σε σύγκριση με καλοήθη ή φυσιολογικό ιστό επινεφριδίων [14]. Συνεπής με τα προηγούμενα παγκόσμια μεθυλίωση αναλύσεις, συμπεριλαμβανομένων των ACC, υπομεθυλίωση ήταν πιο συχνές σε «ανοικτές θάλασσες», μακριά από τα νησιά CpG, και τα γεγονότα υπερμεθυλίωση εμφανίστηκαν πιο συχνά σε νησίδες CpG [15].

Για να εντοπίζουν τις σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ μεθυλίωση και γονιδιακή έκφραση σε ACC, μια μέθοδος διακριτοποίησης εργαζόταν. Αυτή η μη γραμμική μέθοδο για την ταυτοποίηση των συσχετίσεων είναι πιο ευαίσθητη από γραμμικές μεθόδους επειδή βασίζεται σε υποσύνολα των δειγμάτων που έχουν αντίθετες τάσεις μεθυλίωση [16]. Με τη μέθοδο αυτή εντοπίσαμε 550 γονίδια με σημαντική αρνητική ή θετική συσχέτιση της έκφρασης μεθυλίωσης και γονιδίων. Τα γονίδια που εντοπίστηκαν με τη μέθοδο αυτή εμπλέκει μονοπάτια που είναι γνωστό ότι ενόχλησή στη θέση ACC, όπως TP53, WNT, και σηματοδότηση IGF2. Επιπλέον, κλασική ογκοκατασταλτικών, άλλες σχετίζονται με τον καρκίνο, και ταυτοποιήθηκαν επίσης νέα γονίδια δεν έχουν προηγουμένως εμπλακεί σε ACC. Η

ΤΡ53

ογκοκατασταλτικό μεταλλάσσεται σε περισσότερο από το 50% όλων των όγκων. Γενετικές αλλοιώσεις στο

TP53

, συμπεριλαμβανομένων των μεταλλάξεων (16%) [7] και επιγενετική αποσιώπηση (σπάνια) [24], εμφανίζονται σε ένα χαμηλότερο ποσοστό των όγκων ACC. πρόσφατες εργασίες μας στην ACC παρουσίασαν σημαντική διαφορική έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην TP53 κανονική σηματοδότηση [8].