Αφηρημένο

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) αντιπροσωπεύουν ένα μοναδικό υπο-πληθυσμού των καρκινικών κυττάρων με τη δυνατότητα να ξεκινήσει την ανάπτυξη του όγκου και να διατηρήσουν αυτο-ανανέωση. Παρά το γεγονός ότι η CSC βιοδείκτες έχουν περιγραφεί για διάφορους όγκους, έχουν μόνο λίγα δείκτες έχουν εντοπιστεί για το καρκίνωμα του ρινοφάρυγγα (NPC). Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι CD24

+ κύτταρα που απομονώνονται από ανθρώπινες κυτταρικές σειρές NPC εκφράζουν βλαστικά γονίδια των κυττάρων (

Sox2

,

Oct4

,

Nanog

,

Bmi-1

, και

Rex-1

), και να δείξει ενεργοποίηση του /της β-κατενίνης μονοπάτι σηματοδότησης Wnt. CD24

+ κύτταρα έχουν τα τυπικά χαρακτηριστικά CSC που περιλαμβάνουν ενισχυμένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αυξημένη σχηματισμό αποικίας και σφαίρα, συντήρηση των πιθανών διαφοροποίησης κυττάρου σε παρατεταμένη καλλιέργεια, και βελτιωμένη αντίσταση σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα. Αξιοσημείωτα, CD24

+ κύτταρα παράγουν όγκους μετά τον εμβολιασμό του τόσο λίγα όσο 500 κύτταρα σε ανοσοανεπαρκείς NOD /SCID ποντίκια. CD24

+ κύτταρα περαιτέρω δείχνουν αυξημένη ικανότητα εισβολής

in vitro

, η οποία συσχετίζεται με αυξημένη έκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας 2 και 9. Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η CD24 αντιπροσωπεύει μια νέα CSC βιοδείκτη στο NPC.

Παράθεση: Yang CH, Wang HL, Lin YS, Kumar KPS, Lin HC, Chang CJ, et al. (2014) Προσδιορισμός των CD24 ως Καρκίνου Βλαστικών Κυττάρων Marker Ανθρώπων ρινοφαρυγγικού καρκινώματος. PLoS ONE 9 (6): e99412. doi: 10.1371 /journal.pone.0099412

Επιμέλεια: Masaharu Seno, Πανεπιστήμιο Okayama, Japan

Ελήφθη: 4 του Ιούλη, 2013? Αποδεκτές: 14 Μαΐου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 23 Ιούνη του 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις NSC101-2325-B-182-005 και NSC101-2320-Β-030-011 από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο της Ταϊβάν, και να χορηγήσει CMRPD1B0052 από Chang Gung Memorial Hospital (Linkou, Ταϊβάν). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή τα ποσοστά εμφάνισης

NPC ποικίλλουν σε όλο τον κόσμο, αλλά είναι υψηλότερα στη Νοτιοανατολική Ασία, κυρίως στην κινεζική επαρχία Γκουανγκντόνγκ, καθώς και στο Χονγκ Κονγκ και την Ταϊβάν [1]. Ενδιάμεσο NPC συχνότητα παρατηρείται σε χώρες της λεκάνης της Μεσογείου, μαζί με τη Γροιλανδία και την Αλάσκα, ενώ μια χαμηλή συχνότητα εμφάνισης βρεθεί στις περισσότερες δυτικές χώρες [2]. Στην Ταϊβάν, η επίπτωση για τις γυναίκες και τους άνδρες το 2007 ήταν 2,93 και 8,41 περιπτώσεις ανά 100.000 άτομα, αντίστοιχα [3]. NPC συνήθως δείχνει σχετικώς υψηλή ευαισθησία σε ακτινοβολία, και ως εκ τούτου παραμένει η ακτινοθεραπεία σημαντική θεραπεία για πρώιμου σταδίου NPC [4], [5]. Αν και ο συνδυασμός της ακτινοθεραπείας και χημειοθεραπείας βελτίωσε τα αποτελέσματα της θεραπείας για ασθενείς με προχωρημένο στάδιο NPC, υποτροπή του καρκίνου εξακολουθεί να εμφανίζεται συχνά [6].

Ταυτοποίηση και χαρακτηρισμός των καρκινικών κυττάρων-κίνηση, που ονομάζεται επίσης καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ ), έχει αποκαλύψει κυτταρικοί μηχανισμοί που θα μπορούσαν να ευθύνονται για την ανθεκτικότητα στη θεραπεία και αδρανών συμπεριφορά πολλών όγκων [7]. Η προγονικών κυττάρων υπόθεση της ανάπτυξης του καρκίνου υποδεικνύει ότι μόνο ένα μικρό υπο-πληθυσμό κυττάρων εντός ενός όγκου (το ΚΕΠ) έχει προέλθει-όπως ιδιότητες και την ικανότητα να κινήσει νέων όγκων [8]. ΚΕΠ δεν μπορεί να κινήσει μόνο πρωτογενείς όγκους, αλλά μπορεί επίσης να είναι υπεύθυνος για την επανεμφάνιση μετά από τη θεραπεία, ένα φαινόμενο που μπορεί να οφείλεται στην ικανότητα αυτο-ανανέωσης και εγγενείς χημείο- και ραδιο-αντίσταση αυτών [9] κύτταρα. Οι ΚΕΠ έχουν ταυτοποιηθεί και απομονωθεί από διάφορους όγκους χρησιμοποιώντας ειδικούς δείκτες κυτταρικής επιφάνειας, συμπεριλαμβανομένων των CD44 για καρκίνο κεφαλής και τραχήλου [10], CD133 για τον καρκίνο του προστάτη [11], CD90 για το ήπαρ του όγκου [12], CD24 για καρκίνο των ωοθηκών [13], CD133 για όγκο του εγκεφάλου [14], CD44

+ CD24

-. /χαμηλή για τον καρκίνο του μαστού [15], και CD133 για τον καρκίνο του πνεύμονα [16]

Αν και οι συγκεκριμένες βιοδείκτες έχουν χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση ΚΕΠ, κάθε τύπος όγκου δείχνει ειδικών δεικτών κυτταρικής επιφάνειας [17]. Για να απομονωθεί το δυναμικό υπο-πληθυσμούς των ΚΕΠ από όγκους στα οποία δεν έχουν ακόμη προσδιοριστεί CSC βιοδείκτες, οι ερευνητές έχουν κάνει χρήση της ικανότητας των ΚΕΠ να αποκλείσει τις χρωστικές ουσίες, Hoechst 33342 ή ΡΚΗ26 [18] – [20]. Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο, μια υπο-πληθυσμός των κυττάρων που εμφανίζουν τα χαρακτηριστικά CSC έχει ταυτοποιηθεί σε NPC [21], [22]. Ωστόσο, η απομόνωση του NPC ΚΕΠ χρησιμοποιώντας διαμορφωτές κυτταρική επιφάνεια δεν έχει καταστεί δυνατό μέχρι τώρα, με την εξαίρεση του CD44, η οποία ταυτοποιήθηκε σε προηγούμενη έκθεση [23]. Στην παρούσα μελέτη, περιγράφουμε την απομόνωση ενός υπο-πληθυσμός των κυττάρων CD24 +

από δύο κυτταρικές σειρές NPC, και δείχνουν ότι τα απομονωμένα κύτταρα εκφράζουν βλαστικών γονιδιακοί δείκτες κυττάρου. Το απομονωμένο CD24

+ κύτταρα εμφανίζουν τυπικά χαρακτηριστικά CSC, και να ξεκινήσει την ανάπτυξη του όγκου σε μη-παχύσαρκους διαβητικούς /σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (NOD /SCID) σε χαμηλή αριθμό κυττάρων. Παρατηρήθηκαν επίσης μεγαλύτερη ικανότητα εισβολής και αυξημένη έκφραση μεταλλοπρωτεϊνάσης 2 και 9 (ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9). Οι παρατηρήσεις μας δείχνουν ότι η CD24

+ κύτταρα αποτελούν ένα βιοδείκτη CSC στην ανθρώπινη NPC. Αυτά τα ευρήματα μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών για τη στόχευση NPC CSCs σε ανθρώπους ασθενείς.

Αποτελέσματα

Απομόνωση ενός υπο-πληθυσμό CD24

+ κυττάρων από κυτταρικές γραμμές NPC

Για να χαρακτηριστεί κύτταρα με ειδικούς δείκτες κυτταρικής επιφάνειας, αναλύσαμε αρκετές κυτταρικές σειρές NPC χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής και μονοκλωνικά αντισώματα που αναγνωρίζουν βιοδείκτες κυτταρικής επιφάνειας. Προσδιορίσαμε το ποσοστό των κυττάρων που φιλοξενούν ένα από τους δείκτες 12 επιφάνειας ειδικό για βλαστικά κύτταρα [24], [25] ή τα καρκινικά κύτταρα [26] (Πίνακας 1). CD24 βρέθηκε σε 12,03% των καλλιεργημένων κυττάρων TW02 και 5,45% των TW04 κύτταρα, ενώ διαπιστώθηκε σε χαμηλότερο ποσοστό των κυττάρων για τις άλλες κυτταρικές σειρές NPC που δοκιμάστηκαν (Πίνακας 1 και Σχήμα 1). Το ποσοστό των κυττάρων που φιλοξενούν τα άλλα 12 δείκτες ήταν ιδιαίτερα άνιση, με τιμές κυμαίνονται από 0 έως 99,99% (Πίνακας 1). Συνεπής με μια προηγούμενη μελέτη στην οποία ταυτοποιήθηκε CD44 ως βιοδείκτη CSC στο NPC [23], τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η συντριπτική πλειοψηφία των CD24

+ κύτταρα ήταν επίσης CD44 + (Σχήμα 1). Ως εκ τούτου, εστίασε την προσοχή μας σε CD24

+ κύτταρα ως πιθανοί υποψήφιοι CSC.

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των CD24

+ και CD44

+ υπο-πληθυσμούς TW02 και TW04 κύτταρα. 1 × 10

6 καρκινικά κύτταρα συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με αντι-ανθρώπινο CD24-ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) και /ή αντι-ανθρώπινο CD44-φυκοερυθρίνη (ΡΕ) αντισώματα. Ισότυπο ανθρώπινα αντισώματα χρησίμευσε ως έλεγχος.

Η

Η έκφραση των γονιδίων των βλαστικών κυττάρων και την ενεργοποίηση του μονοπατιού Wnt /β-κατενίνης σε CD24

+ κύτταρα

Για να εξετάζει αν CD24

+ κύτταρα έχουν εγγενείς ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων, αναλύσαμε την έκφραση των γονιδίων πέντε εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων (

Sox2

[27],

Oct4

[28] – [30] ,

Nanog

[31],

Bmi-1

[32], και

Rex-1

[33]) σε TW02 και TW04 κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν ως εκπρόσωπος κύτταρα NPC. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, CD24

+ κύτταρα εκφράζουν σταθερά υψηλότερα επίπεδα από τα πέντε γονίδια βλαστικών κυττάρων από τη γονική ή CD24

-. Κύτταρα

τα επίπεδα έκφρασης του mRNA (Α) του

Sox2

,

Oct4

,

Nanog

,

Bmi-1

και

Rex-1

στη γονική, CD24

+ και CD24

– κυττάρων από τις κυτταρικές γραμμές NPC, TW02 (αριστερά) και TW04 (δεξιά), αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ποσοτική ανάλυση RT-PCR. Τα αποτελέσματα φαίνονται αντιπροσώπευε τον μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *:

σ

& lt? 0,05, **:

σ

& lt? 0,01. (Β) κηλίδες Western ανάλυση φωσφορυλιωμένων-GSK, GSK, φωσφορυλιωμένη-β-κατενίνης, β-κατενίνης και β-ακτίνης σε προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου, και της β-κατενίνης και λαμίνη Β1 στην πυρηνική κλάσματα της γονικής, CD24

+ και CD24

– κύτταρα που απομονώθηκαν από τις κυτταρικές σειρές TW02 και TW04. Ποσοτικό αποτέλεσμα υπολογίστηκε από το λογισμικό ImageJ. *:

σ

& lt? 0,05, **:

σ

& lt? 0,01, ***:.

σ

& lt? 0.001

Η

Προηγούμενες αναφορές έχουν δείξει ότι η ενεργοποίηση του /β-κατενίνης μονοπάτι σηματοδότησης Wnt είναι ζωτικής σημασίας για τη διατήρηση της ΚΕΠ σε λευχαιμία [34], του καρκίνου του μαστού [35], το μελάνωμα [36], ορθοκολικού αδενώματος [37], και καρκίνο του ήπατος [ ,,,0],38]. Αυτό το κυτταρικό μονοπάτι ρυθμίζει επίσης αυτο-ανανέωση, τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των βλαστικών καρκίνο κύτταρα που μοιάζουν σε γαστρικό καρκίνο [39]. Επιπλέον, στο μονοπάτι Wnt, β-κατενίνης διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση εισβολή και τη μετάσταση των πολυάριθμων όγκων [40]. Εξετάσαμε έτσι την κατάσταση του /της β-κατενίνης μονοπάτι Wnt στην απομονωμένη CD24

+ κύτταρα. Επίπεδα φωσφορυλιωμένου β-κατενίνης ήταν σημαντικά μειωμένες στο κυτταρόπλασμα του CD24

+ κύτταρα, σε σύγκριση με τη γονική ή CD24

– κύτταρα (Σχήμα 2Β). Επιπλέον, τα επίπεδα φωσφορυλιωμένης συνθάσης γλυκογόνου 3β κινάσης (ρ-GSK-3β), το οποίο δρα ως αρνητικός ρυθμιστής της β-κατενίνης, ήταν υψηλότερα σε CD24

+ κύτταρα. Ταυτόχρονα, παρατηρήθηκαν αυξημένα επίπεδα β-κατενίνης στην πυρηνική κλάσματα CD24

+ κύτταρα (Σχήμα 2Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι ο /β-κατενίνης μονοπάτι σηματοδότησης Wnt ενεργοποιείται σε αυτά τα κύτταρα.

Ενισχυμένη πολλαπλασιασμό και σχηματισμό κλώνος /σφαίρα στο CD24

+ κύτταρα

Μετρήσαμε το ρυθμό πολλαπλασιασμού των CD24

+ κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες DMEM. Σε σύγκριση με τη γονική και CD24

– κυττάρων, CD24

+ κύτταρα έδειξαν αυξημένη διάδοση, αρχής γενομένης από την 5

ης ημέρας του πολιτισμού για TW02 κύτταρα και το 7

ου ημέρα για TW04 κύτταρα, με χρόνους διπλασιασμού περίπου 42 ώρες, 42 ώρες, και 30 ώρες για τη γονική TW02, CD24- και CD24 + κύτταρα, αντίστοιχα, και από 40 ώρες, 40 ώρες και 28 ώρες για τη γονική TW04, CD24- και CD24 + κύτταρα (Σχήμα 3Α). Η απόδοση σχηματισμού κλώνος (CFE) του CD24

+ κύτταρα προσδιορίζεται επίσης. Μετά από 10 ημέρες καλλιέργειας, όταν οι περισσότεροι κλώνοι ήταν πιθανό να περιέχουν πάνω από 50 κύτταρα, οι υπολογιζόμενες CFE τιμές των TW02 κυττάρων ήταν 15,1%, 80,8% και 12,2% για τη γονική, CD24

+, και CD24

– κύτταρα, αντίστοιχα. Για TW04 κύτταρα, τιμές CFE 20,2%, 90,3% και 13,0% ελήφθησαν για τη γονική, CD24

+, και CD24

– κύτταρα, αντίστοιχα (Σχήμα 3Β). Ο σχηματισμός του σφαιροειδούς κυτταρικών συσσωματωμάτων (ή απλά σφαίρες), η οποία είναι ενδεικτική της ικανότητας αυτο-ανανέωση, αναλύθηκε περαιτέρω με καλλιέργεια των κυττάρων σε μη-προσκολλητικά συνθήκες που αποτελείται από DMEM χωρίς ορό που περιέχει μόνο τα επιθηλιακά αυξητικός παράγοντας (EGF) και βασικού ινοβλάστη αυξητικός παράγοντας (bFGF). Μετά από 30 ημέρες καλλιέργειας, CD24

+ κύτταρα παρουσίασαν τον υψηλότερο αριθμό σφαιρών, φθάνοντας διάμετρο μεταξύ 100 και 200 ​​μm, ενώ γονικών κυττάρων και CD24

– κύτταρα που σχηματίζονται σημαντικά λιγότερα σφαίρες, με διάμετρο κάτω των 100 μm (Σχήμα 3C ). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι

+ κύτταρα CD24 εμφανίζουν ενισχυμένη πολλαπλασιασμό και την ικανότητα να σχηματίζουν κλώνους /σφαίρες

(Α) καμπύλες πολλαπλασιασμός των κυττάρων της γονικής, CD24

+ και CD24

-. Κύτταρα από το TW02 (αριστερά) και TW04 (δεξιά) NPC κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε πλήρες DMEM για 9 ημέρες. Τα αποτελέσματα που δείχνονται αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *:

σ

& lt? 0,05, **:

σ

& lt? 0,01, ***:

σ

& lt? 0.001. αποδοτικότητας (B) Κλώνος σχηματισμό της γονικής, CD24

+, και CD24

– κύτταρα, και η ποσοτική ανάλυση. *:

σ

& lt? 0,05. (Γ) ικανότητα σχηματισμού Σφαίρα της γονικής, CD24

+ και CD24

– κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 20 ng /ml bFGF και 20 ng /ml EGF επί 30 ημέρες. (D) Επίδραση του αναστολέα Wnt στο σχηματισμό σφαίρα από CD24

+ κυττάρων σε TW02 και TW04 κύτταρα. + Κύτταρα CD24

υποβλήθηκαν σε θεραπεία ή όχι με την Wnt αναστολέα ICG-001 (10 μΜ) για επτά ημέρες πριν από την σφαίρα ανάλυση του σχηματισμού. Ράβδοι κλίμακας:. 100 μm

Η

Εμείς εξέτασε επίσης τις επιπτώσεις του αναστολέα Wnt ICG-001 στην ικανότητα σχηματισμού σφαίρα της CD24

+ κύτταρα. Μετά τη θεραπεία με τον αναστολέα Wnt για 7 ημέρες (10 μΜ), το μέγεθος σφαίρας μειώθηκε σημαντικά κατά μέσο όρο 20% και 45% σε TW02 και TW04 κύτταρα, αντίστοιχα (Σχήμα 3D), γεγονός που υποδηλώνει ότι η οδός Wnt μπορεί να συνεισφέρει στη CSC φαινότυπο CD24

+ κύτταρα.

δυναμικό

μακροχρόνια διαφοροποίηση των CD24

+ κύτταρα

Μια μακροπρόθεσμη καλλιέργεια των ΚΕΠ μπορεί να αυξήσει την κυτταρική μάζα της, αλλά και να υποβληθούν ασύμμετρη διαίρεση για να δημιουργήσει ένα χαμηλό πληθυσμό ογκογόνο κύτταρο με ετερογενείς φαινοτύπους [9]. Για την παρακολούθηση του δυναμικού της κυτταρικής διαφοροποίησης των CD24

+ κύτταρα, αναλύσαμε 10 ημερών καλλιέργειες των CD24

+ και CD24

– κυττάρων με κυτταρομετρία ροής. Μετά την καλλιέργεια TW02 κυττάρων για 10 ημέρες, 11,56% των CD24

+ κύτταρα παρέμειναν CD24

+, ενώ το 0,14% των κυττάρων που ήταν αρχικά CD24

– εξέφρασε CD24 μετά από καλλιέργεια (Εικόνα 4Α). Ομοίως, μετά από καλλιέργεια των TW04 κυττάρων, 5,64% των CD24

+ κύτταρα παρέμειναν CD24

+, ενώ το 0,03% των κυττάρων που ήταν CD24

– αρχικά ήταν CD24

+ μετά από καλλιέργεια (Σχήμα 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η CD24

+ κυττάρων δείχνουν τις δυνατότητες διαφοροποίησης των κυττάρων μετά από παρατεταμένη καλλιέργεια, αν και η διαδικασία διαφοροποίησης μπορεί να είναι μερική μόνο υπό αυτές τις συνθήκες.

(Α) Δέκα ημερών μάζες κυττάρων αρχικά καλλιεργήθηκε από CD24

+ και CD24

– κυτταρικές καλλιέργειες σε μέσο ϋΜΕΜ συλλέχθηκαν, και χρωματίστηκαν με αντίσωμα αντι-ανθρώπινο CD24-ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) που ακολουθείται από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Τα ποσοστά που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν κυττάρων με CD24

+ δείκτες επιφάνειας είτε από (Α) TW02 ή (Β) κυτταρικές γραμμές TW04. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των TW02 και TW04 κύτταρα αμέσως μετά υπο-κλασμάτωση (δεξιά πάνελ).

Η

CD24

+ κύτταρα εμφανίζουν αυξημένη αντίσταση σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα

Ανώτατη αντίσταση σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα αντιπροσωπεύει ένα κρίσιμο χαρακτηριστικό των ΚΕΠ [9]. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι τα ΚΕΠ μπορούν να αποκλείουν τη χρωστική δέσμευσης DNA, Hoechst 33342, λόγω της ενισχυμένης έκφρασης του μεταφορέα ABC, ABCG2 [41], [42]. Για να προσδιορίσετε αν CD24

+ κυττάρων αποκλείουν Hoechst 33342 καλύτερη από τη γονική ή CD24

– κυττάρων, εκτελέσαμε την δοκιμασία αποκλεισμού χρωστικής μετά τη θεραπεία TW02 κυττάρων με τον αναστολέα μεταφορέα ABC, βεραπαμίλη [43]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, ένα μεγαλύτερο πληθυσμό Hoechst 33342-αρνητικά κύτταρα παρατηρήθηκε για CD24

+ κύτταρα (12,9%) σε σύγκριση με CD24

– κύτταρα (7,99%). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η θεραπεία βεραπαμίλη αντιστραφεί το φαινότυπο αποκλεισμού χρώσης που παρατηρείται σε CD24

+ κύτταρα, ενώ η θεραπεία αυτή δεν είχε σημαντική επίδραση στην CD24

– κύτταρα (Εικόνα 5Α). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν για την κυτταρική γραμμή TW04 (βεραπαμίλη παρήγαγε καμία σημαντική επίδραση σε αυτή την περίπτωση, δεδομένου ότι σχεδόν καμία TW04 CD24

– κύτταρα Hoechst 33342-αρνητικά). Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι το CD24

+ κύτταρα έχουν μια ενισχυμένη ικανότητα να αποκλείσει βαφής

(Α) Κατάταξη σύμφωνα CD24

+ και CD24

-. Κύτταρα από τις κυτταρικές σειρές TW02 και TW04 NPC υποβλήθηκαν σε θεραπεία ή όχι με 50 μΜ βεραπαμίλη για 30 λεπτά πριν από την επεξεργασία για την δοκιμασία αποκλεισμού 33.342 χρωστικής Hoechst, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. (Β) Η γονική, CD24

+, και CD24

– κυττάρων από τα TW02 ή TW04 κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις σισπλατίνης και docetaxel για 24 ώρες, και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. CD24

+ κύτταρα έδειξαν υψηλότερη βιωσιμότητα των γονικών και CD24

– κυττάρων μετά από θεραπεία με σισπλατίνη ή docetaxel. Τα αποτελέσματα φαίνονται αντιπροσώπευε τον μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *:

σ

& lt? 0,05, **:

σ

& lt? 0,01, ***:

σ

& lt? 0.001. IC

50 αξίες της σισπλατίνης ή docetaxel θεραπεία κατά των γονέων, CD24

+, και CD24

-. Κύτταρα παρουσιάζονται για (C) TW02 και TW04 κυτταρικές σειρές (D)

Η

για να εξεταστεί εάν CD24

+ κύτταρα εμφανίζουν μεγαλύτερη αντίσταση σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα, υποβάλλαμε σε αγωγή τα κύτταρα με είτε cisplatin ή ντοσεταξέλη, και η κυτταρική βιωσιμότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Σισπλατίνη και docetaxel παράγεται υψηλότερη κυτταροτοξική δράση έναντι των γονέων ή CD24

– κυττάρων σε σύγκριση με το CD24

+ κυττάρων (Σχήμα 5Β,

σ

& lt? 0,01). Για την κυτταρική γραμμή TW02, το ήμισυ της μέγιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (IC

50) της cisplatin κατά γονικής, CD24

+, και CD24

– κυττάρων ήταν 1,84, 3,32, και 1,66 μg /ml, αντίστοιχα, ενώ το IC

50 αξίες της docetaxel έναντι των γονέων, CD24

+, και CD24

– κυττάρων ήταν 4,23, 7,45 και 3,53 μg /ml, αντίστοιχα (Σχήμα 5C). Για την κυτταρική σειρά TW04, σισπλατίνη παράγεται IC

50 τιμές 0,70, 2,45 και 0,46 μg /ml κατά τη γονική, CD24

+, και CD24

– κύτταρα, αντίστοιχα, ενώ η IC

50 της docetaxel ήταν 1,50, 3,93 και 1,41 μg /ml κατά τη γονική, CD24

+, και CD24

-. κύτταρα, αντίστοιχα (Σχήμα 5D)

Παρατηρήσαμε επίσης ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης του ABC μεταφορέα ABCG2 ήταν 1,42 και 2,12 φορές υψηλότερη σε CD24

+ κύτταρα σε σχέση με τη γονική και CD24

– κύτταρα, αντίστοιχα (Σχήμα 6Α). Ομοίως, στην TW04 κύτταρα, τα επίπεδα πρωτεΐνης του ABCG2 σε CD24

+ κυττάρων ήταν 1,85 και 3,56 φορές υψηλότερη από ό, τι σε γονικά και CD24

– κύτταρα, αντίστοιχα (Σχήμα 6Α). Συνεπής με αυτά τα αποτελέσματα, το επίπεδο έκφρασης του mRNA της

ABCG2

ήταν υψηλότερη σε CD24

+ κυττάρων σε σχέση με τη γονική ή CD24

– κύτταρα (Εικόνα 6Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι CD24

+ κύτταρα παρουσιάζουν βελτιωμένη χημειοαντίσταση, και ότι αυτός ο φαινότυπος μπορεί να αποδοθεί, τουλάχιστον εν μέρει, να ενισχυθεί η έκφραση του ABCG2 μεταφορέα.

(α) Επίπεδα κυτταρική πρωτεΐνη ABCG2 σε γονική, CD24

+, και CD24

– TW02 και TW04 κύτταρα προσδιορίστηκε με ανάλυση κηλίδας Western. Ποσοτικό αποτέλεσμα υπολογίστηκε από το λογισμικό ImageJ. *:

σ

& lt? 0,05, **:

σ

& lt? 0,01. (Β) Το επίπεδο έκφρασης του mRNA της ABCG2 σε γονική, CD24

+, και CD24

– TW02 και TW04 κυττάρων προσδιορίστηκε με ποσοτική RT-PCR. Τα αποτελέσματα που δείχνονται αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *:

σ

& lt? 0,05, **:.

σ

& lt? 0,01

Η

Ένας μικρός αριθμός των CD24

+ κύτταρα είναι αρκετή για την παραγωγή όγκους σε ποντίκια NOD /SCID

Ελέγξαμε την ογκογόνο δυναμικό του CD24

+ κυττάρων μετά την έγχυση στη μασχαλιαία βόθρο ανοσοανεπαρκών NOD /SCID ποντίκια. Δώδεκα εβδομάδες μετά την ένεση, οι όγκοι ανιχνεύθηκαν σε ποντικούς εμβολιασμένους είτε με 500 ή 1.000 CD24

+ κύτταρα, αλλά όχι σε ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με 100 CD24

+ κύτταρα (Σχήμα 7Α). Σε αντίθεση, δεν παρατηρήθηκαν όγκοι ανιχνεύθηκαν σε ποντικούς εμβολιασμένους με ≤1,000 κύτταρα στο γονικό ή CD24

– ομάδα (Σχήμα 7Α και 7Β). Παρομοίως, δεν παρατηρήθηκαν όγκοι ανιχνεύθηκαν σε ποντίκια που έλαβαν PBS ως αρνητικός έλεγχος (Σχήμα 7Α). Περαιτέρω ιστολογική ανάλυση τομών ιστού χρώση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) επιβεβαίωσε την παρουσία του ρινοφαρυγγικού καρκινώματος πλακωδών κυττάρων και καλά διαφοροποιημένο κερατινοποιημένα πλακώδη καρκίνωμα στο σημείο όπου CD24

+ κύτταρα αρχικά εγχύθηκαν (Σχήμα 7C). Ένεση ένα μικρό αριθμό CD24

+ κύτταρα είναι συνεπώς επαρκής για να προκαλέσει σχηματισμό όγκων σε ανοσοανεπαρκείς ποντικούς.

(Α) Σχηματισμός όγκων μετά την ένεση του CD24

+ κύτταρα. Ομάδες έξι NOD /SCID ποντικοί εγχύθηκαν με 100, 500, ή 1000 προσφάτως ταξινομημένο CD24

+ ή CD24

– κύτταρα από το TW02 (αριστερά) ή TW04 (δεξιά) κυτταρική γραμμή. Ποντικοί ενέθηκαν με PBS χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος. σχηματισμός όγκου αξιολογήθηκε 12 εβδομάδες μετά τον ενοφθαλμισμό των κυττάρων. (Β) Ποντίκια ενέθηκαν με TW02 (αριστερά) ή (δεξιά) κύτταρα TW04 θυσιάστηκαν για την αξιολόγηση του σχηματισμού όγκων δώδεκα εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό. Τα βέλη υποδεικνύουν την παρουσία όγκων σε ποντικούς που ενέθηκαν με 500 ή 1.000 CD24

+ κύτταρα. (Γ) Tissue Η &? Ε αποτελέσματα χρώσης του TW02 (αριστερά) και TW04 (δεξιά) ποντίκια που εμβολιάστηκαν με 500 κύτταρα. Εμβολιασμός του τόσο λίγα όσο 500 + κύτταρα CD24

παράγεται ιστολογικά σημεία των όγκων στο σημείο της ένεσης.

Η

Ενισχυμένη δυναμικό εισβολή και την παραγωγή μεταλλοπρωτεϊνασών σε CD24

+ κύτταρα

Σε προηγούμενες μελέτες, πολλοί πληθυσμοί CSC έδειξε αυξημένη ικανότητα εισβολής σε σύγκριση με μη-ΚΕΠ [44], [45]. Χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία εισβολής in vitro, παρατηρήσαμε ότι CD24

+ κύτταρα ήταν πιο επεμβατική από τη γονική ή CD24

– κυττάρων (Σχήμα 8Α). Δεδομένου ότι οι μεταλλοπρωτεϊνάσες παίζουν σημαντικό ρόλο στην κυτταρική εισβολή [46], εξετάσαμε το επίπεδο των πρωτεϊνών ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 σε αυτά τα κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 8Β, CD24

+ κυτταρικών πληθυσμών έδειξαν αυξημένα επίπεδα ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 πρωτεΐνης σε σύγκριση με γονική ή CD24

– κύτταρα. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα αυτά, παρατηρήσαμε ότι CD24

+ κύτταρα απομονώθηκαν από τις κυτταρικές σειρές TW02 ή TW04 εξέφραζαν υψηλότερα επίπεδα του ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 mRNA από τη γονική ή CD24

– κύτταρα (Σχήμα 8C). CD24

+ κυττάρων εξέφρασαν επίσης χαμηλότερα επίπεδα E-cadherin mRNA από τη γονική ή CD24

– κυττάρων (Σχήμα 8C). έτσι CD24

+ κύτταρα δείχνουν ενισχυμένη εισβολή και αυξημένη έκφραση του ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 αλλά μειωμένη έκφραση της Ε-καδερίνης.

(Α) Η δοκιμασία των κυττάρων εισβολή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία θαλάμου Transwell, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. μεμβράνες Matrigel περιέχουν εισβάλλοντα κύτταρα παρατηρήθηκαν με οπτική μικροσκοπία, και τα κύτταρα μετρήθηκαν. Ο αριθμός των εισβάλλοντα κύτταρα από κάθε πληθυσμό κυττάρου ποσοτικοποιήθηκε. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται ελήφθησαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα. **:

σ

& lt? 0,01, ***:

σ

& lt? 0.001 (Β) Τα επίπεδα της ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 πρωτεΐνη που παράγεται από τη γονική, CD24

+ ή CD24

– κυττάρων από τις κυτταρικές σειρές TW02 και TW04 ποσοτικοποιήθηκαν με ανάλυση Western blotting. Ποσοτικό αποτέλεσμα υπολογίστηκε από το λογισμικό ImageJ. *:

σ

& lt? 0,05. (C) Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 σε γονική, CD24

+, και CD24

– κύτταρα καθορίστηκε με ποσοτική RT-PCR από τις κυτταρικές γραμμές TW02 και TW04. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν ένα μέσο όρο από τρία ανεξάρτητα πειράματα. *:

σ

& lt? 0,05, **:.

σ

& lt? 0,01

Η

Συζήτηση

Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης δείχνουν ότι CD24 αποτελεί ένα νέο δείκτη επιφανείας CSC στο NPC. Τα χαρακτηριστικά του CD24

+ κυττάρων υποπληθυσμούς που απομονώθηκε από τις κυτταρικές γραμμές TW02 και TW04 NPC είναι παρόμοιες με εκείνες που αναφέρθηκαν προηγουμένως για τα ΚΕΠ που προέρχονται από NPC [21] – [23]. Αυτά τα χαρακτηριστικά περιλαμβάνουν αυξημένη έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και τη συντήρηση των βλαστικών κυττάρων, αυξημένη αυτο-ανανέωση και διατήρηση της ικανότητας διαφοροποίησης των κυττάρων μετά από παρατεταμένη καλλιέργεια, ικανότητα σχηματισμού αυξήθηκε σφαίρα (παρατηρήθηκε επίσης σε CD24

+ κύτταρα απομονώθηκαν από τις κυτταρικές σειρές NPC ΚΘ1 και TW076? βλέπε Εικόνα S1), αυξημένη χρωστική Hoechst 33342 αποκλεισμού και χημειοαντίσταση, αυξημένη ικανότητα να κινήσει όγκων σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς, και ενισχυμένη κυτταρική εισβολή

Η πρωτεΐνη επιφανείας κυττάρου, CD24, εκφράζεται έντονα σε πολλά ανθρώπινα. καρκίνων [13], [48], [49]. CD24 εκφράζεται επί καρκινικών κυττάρων αλληλεπιδρά με Ρ-σελεκτίνη που βρέθηκαν σε ενδοθηλιακά κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι μπορεί να δεσμεύσει CD24 προς Ρ-σελεκτίνη και την κίνηση κύλισης των καρκινικών κυττάρων στο ενδοθήλιο, το οποίο μπορεί να ακολουθείται από την έναρξη της μετάστασης [47]. Εκτός από τα κύτταρα NPC, CD24 συνδέεται με ΚΕΠ άλλων όγκων, όπως των ωοθηκών [13] και τον καρκίνο του παγκρέατος [48]. Για παράδειγμα, CD24

+ CD44

+ ESA

+ παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα διαθέτουν ιδιότητες CSC [48]. Πρόσφατα, ένα παρόμοιο εύρημα αναφέρθηκε για τα ΚΕΠ των ωοθηκών? Δηλαδή, μια ένεση ξενομόσχευμα 5.000 CD24

+ κυττάρων που παράγονται όγκων σε γυμνά ποντίκια, ενώ η έγχυση ίσο αριθμό CD24

– κύτταρα απέτυχαν να το κάνουν [49]. Επιπλέον, CD24

+ καρκινικές κυτταρικές αποικίες που απομονώθηκαν από όγκους των ωοθηκών, έναν ασθενή άνθρωπο έδειξαν ετερογένεια του ρυθμού πολλαπλασιασμού, της διανομής του κυτταρικού κύκλου, και το προφίλ έκφρασης γονιδίων και πρωτεϊνών, και επέδειξε ιδιότητες βλαστοκυττάρων [49]. Επιπλέον, CD24

+ βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν ανιχνευθεί στον καρκίνο των ωοθηκών εμφάνισε επίσης βελτιωμένη χημειοαντίσταση [50]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, στον καρκίνο του μαστού, η απουσία του CD24 σε συνδυασμό με την παρουσία του CD44 και EpCAM (CD24

-CD44

+ EpCAM

+) φαίνεται να είναι κρίσιμη για την αναγνώριση των ΚΕΠ του μαστού [15]. Μία προηγούμενη μελέτη έχει αναφερθεί ότι CD44 αποτελεί ένα βιολογικό δείκτη CSC στο NPC [23]. Σε συμφωνία με αυτό το εύρημα, ο CD24

+ κύτταρα που απομονώνονται από TW02 και κυτταρικές σειρές TW04 NPC ήταν ως επί το πλείστον CD44

+ (Σχήμα 1Β). Εκτός αυτού, η μεγάλη πλειονότητα των

+ κύτταρα CD24 στην ΚΘ1 και κυτταρικές σειρές TW076 ήταν επίσης CD44

+ (Εικόνα S2). Τόσο CD24 και CD44 μπορεί έτσι να εμπλέκεται στο σχηματισμό του ΚΕΠ στο NPC, και η λειτουργία αυτών των πρωτεϊνών για την ανάπτυξη και τη συντήρηση των ΚΕΠ warrants περαιτέρω έρευνα.

Παρατηρήσαμε ότι CD24

+ κύτταρα που απομονώνονται από οι κυτταρικές σειρές TW02 και TW04 NPC εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα mRNA της

Sox2

,

Oct-4

,

Nanog

,

Bmi-1

, και

Rex-1

, σε σύγκριση με γονική ή CD24

– κύτταρα. Ένα παρόμοιο φαινόμενο παρατηρήθηκε επίσης σε ΚΘ1 και κυτταρικές γραμμές TW076 (Σχήμα S3). Αυτά τα χαρακτηριστικά είναι παρόμοια με εκείνα που αναφέρθηκαν για τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα [27] – [33] και των ωοθηκών καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν [51]. Αυτό το μοτίβο της έκφρασης του γονιδίου εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων σε CD24

+ NPC ΚΕΠ υποδεικνύει την παρουσία ενός διατηρημένο πρότυπο γονιδιακής έκφρασης βλαστικών κυττάρων σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα και ΚΕΠ. Σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα, συν-έκφραση του

Sox2

,

Oct-4

,

Nanog

, και

Rex-1

είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της πλειοδυναμία και αυτο-ανανέωση, και εμποδίζει τη διαφοροποίηση των κυττάρων κατά μήκος του τροφοβλάστη κυτταρικής γραμμής [30], [33].

Sox2

και

Oct-4 παραγόντων μεταγραφής

κωδικοποιούν που διατηρούν αυτο-ανανέωση και πλειοδυναμία στην αδιαφοροποίητη κατάσταση εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων από γονίδια διαμόρφωσης που διατηρούν ανεκτική δομής της χρωματίνης και επιδιόρθωση του DNA, και να αποτρέψει την απόπτωση [ ,,,0],52]. Από την άλλη πλευρά, η έκφραση του

Nanog

, η οποία είναι επίσης ένας παράγοντας μεταγραφής που εμπλέκονται κριτικά στην αυτο-ανανέωση, ρυθμίζεται θετικά από

Sox2

και

Oct-4

[53]. Αυτοί οι παράγοντες μεταγραφής σχηματίσουν ένα λειτουργικό μεταγραφικό δίκτυο ρύθμιση που είναι κρίσιμη για τη διατήρηση της πλειοδυναμίας σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα [53]. Επιπλέον, η ομάδα Polycomb (PCG) γονίδιο

Bmi-1

σιωπές

Hox

γονιδίων μέσω της διαμόρφωσης της δομής της χρωματίνης κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του εμβρύου σε μύγες των φρούτων, και μπορεί ενδεχομένως να ενισχύσει την πολλαπλασιαστική δραστηριότητα τόσο φυσιολογικό και λευχαιμικά βλαστικά κύτταρα [32]. Δεδομένου ότι η έκφραση του

Bmi-1

ρυθμίζεται αρνητικά από

ΡΤΕΝ

, η οποία δρα ως καταστολέας όγκου γονίδιο [54], η αυξημένη έκφραση του

Bmi-1

μπορεί να συσχετίζεται με καταστολή του

ΡΤΕΝ

έκφραση και επαγωγή των επιθηλιακών-μεσεγχυματικών μετάβασης, καθώς και η αυξημένη κινητικότητα και διεισδυτικότητα των ανθρώπινων ρινοφαρυγγικής επιθηλιακών κυττάρων [54]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η CD24

+ υπο-πληθυσμός των κυττάρων NPC εκφράζει επίσης βλαστικά γονίδια των κυττάρων και παρουσιάζει τα χαρακτηριστικά των βλαστικών κυττάρων αυτο-ανανέωση και την ενίσχυση της ικανότητας πολλαπλασιασμού.

Η /β-κατενίνης σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt, η οποία έχει αναφερθεί ότι ρυθμίζουν τη λειτουργία των βλαστικών κυττάρων και των αλληλεπιδράσεων των κυττάρων εξειδικευμένες-στέλεχος [56], ενισχύει την έκφραση

Sox2

και

Oct-4

[55]. Επιπλέον, η μειωμένη έκφραση του mRNA Ε-καδερίνης παρατηρήθηκε με Gao et al. σε CD24

+ ωοθηκών καρκινικά βλαστικά κύτταρα [49]. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι η απώλεια της έκφρασης Ε-καδερίνης μπορεί να επιτρέψει β-κατενίνης για την εκ νέου εντοπισμό στον πυρήνα και να ενεργοποιήσει μεταγραφική δραστηριότητα [57]. Σε αυτή τη μελέτη, η αυξημένη φωσφορυλίωση της GSK-3β, μειωμένη φωσφορυλίωση της β-κατενίνης, καθώς και πυρηνική μετατόπιση του β-κατενίνης παρατηρήθηκαν σε CD24

+ κύτταρα, σε σύγκριση με τη γονική ή CD24

– κύτταρα (Σχήμα 2). Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι ο /β-κατενίνης σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt είναι ενεργοποιημένη στο CD24

+ κύτταρα

Τα ευρήματά μας ότι CD24

+ κυττάρων NPC είναι πιο επεμβατική από τη γονική ή CD24

-. NPC κύτταρα είναι συνεπή με τα αποτελέσματα από προηγούμενες μελέτες στις CSCs σε παγκρεατικά [58], του πνεύμονα [19], και του καρκίνου του προστάτη [59]. Μαζί με την αυξημένη ικανότητα εισβολής, κυτταρικούς δείκτες που χαρακτηρίζουν κύτταρο εισβολή, όπως ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9, αυξήθηκαν επίσης σε υψηλότερα επίπεδα στο CD24

+ κύτταρα. ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 εμπλέκονται στην αποικοδόμηση της εξωκυτταρικής μήτρας, και μία αύξηση στην έκφραση και των δύο ενζύμων επάγει ικανότητα κυτταρικής εισβολής [60]. Zhou et al. πρότεινε ότι γενετικός πολυμορφισμός στον υποκινητή ΜΜΡ2 μπορεί να εξηγήσει την αυξημένη ευαισθησία των κινεζικών ατόμων για την ανάπτυξη NPC [61]. ανάλυση μικροσυστοιχιών αποκαλύπτει ότι ΜΜΡ1 και ΜΜΡ2 είναι τα πιο σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω γονίδια σε NPC βιοψίες, σε σύγκριση με lymphohyperplasia, αδενοειδείς ιστούς, και καρκίνο κεφαλής και τραχήλου. [62] Επιπλέον, μελέτες που έχουν διεξαχθεί σε βιοψίες όγκων NPC ή κυτταρικές σειρές με ενισχυμένη διεισδυτικότητα ή επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μεταβάσεις αποκάλυψε επίσης ενισχυμένη έκφραση του

Sox2

,

Oct-4

, και

Nanog

[63] – [66], παρόμοια με τα ευρήματα που αναφέρονται εδώ στο CD24

+ κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το CD24

+ NPC ΚΕΠ μπορεί να προωθήσει ογκογένεση και να ξεκινήσει και την εισβολή και τη μετάσταση, και δείχνουν ότι η περαιτέρω πειράματα για να επιβεβαιωθεί η παρουσία του CD24

+ ΚΕΠ σε ανθρώπινο βιοψίες NPC είναι δικαιολογημένη. Επιπλέον, αν η έκφραση του κυττάρου και εισβολής γονιδίων στέλεχος είναι υπό τον έλεγχο ενός κοινού μονοπατιού σηματοδότησης, όπως το μονοπάτι /β-κατενίνης Wnt, απομένει να διερευνηθεί.

Συνοπτικά, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η CD24

+ κύτταρα εμφανίζουν χαρακτηριστικά CSC σε κυτταρικές σειρές NPC. Στρατηγικών που στοχεύουν στην εξάλειψη των CD24

+ κύτταρα NPC μπορεί να παρέχει νέες και πιο αποτελεσματικές στρατηγικές θεραπείας ενάντια NPC.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

κυτταρικές σειρές NPC (ο κερατινοποιημένα πλακώδη κυτταρική γραμμή TW02? το αδιαφοροποίητο κυτταρική γραμμή TW04? διαφοροποιημένα κύτταρα πλακώδους ΚΘ1? κακώς-διαφοροποιημένα πλακώδη κύτταρα CG1? και ο κερατινοποιημένα πλακώδη TW039 και κυτταρικές γραμμές TW076) δόθηκαν από τον Dr. Yu-Sun Chang (Chang Gung Πανεπιστήμιο) και διατηρήθηκαν σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (ϋΜΕΜ? Invitrogen, Grand Island, ΝΥ) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη και 25 μg /ml αμφοτερικίνη Β (Invitrogen). Μετά τη διαλογή, όπως περιγράφεται παρακάτω, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 20 ng /ml bFGF (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ), 20 ng /ml EGF (Sigma-Aldrich), 200 μονάδες /ml πενικιλίνη, 200 μg /ml στρεπτομυκίνη, και 50 μg /ml αμφοτερικίνη Β (Invitrogen). Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε υγροποιημένο 5% CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C.

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής και τη διαλογή των κυττάρων NPC

Τα κύτταρα αναλύθηκαν με ενεργοποιούμενη με φθορισμό διαλογή κυττάρων (FACS) μετά την επίτευξη της λογαριθμικής φάσης πολλαπλασιασμού. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε πέψη με 0,25% θρυψίνη-0.02% EDTA (Invitrogen), πλύθηκε δύο φορές με ασβέστιο /PBS ελεύθερο μαγνησίου, και επαναιωρήθηκαν σε μια συγκέντρωση 1 × 10

6 κύτταρα /ml σε παγωμένο PBS συμπληρωμένο με 2% FBS. FITC-συζευγμένο αντι-ανθρώπινο CD15, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD45, CD54, CD59, CD90, CD117 ή CD133 αντισώματος (BD Pharmingen, Becton Dickinson, Mountain View, CA) στη συνέχεια προστέθηκε σε μια τελική συγκέντρωση 1 μg /ml, και επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 4 ° C στο σκοτάδι με ανάμιξη. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS συμπληρωμένο με 2% FBS, και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το FACS Aria κυτταρόμετρο ροής (Becton, Dickinson & amp? Company, Mountain View, CA). Ισότυπου-συμφωνημένα ανθρώπινα αντισώματα (Becton, Dickinson & amp? Company) χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ΡΙΤΟ-συζευγμένο αντι-ανθρώπινο CD24 ήταν επίσης ταξινομούνται χρησιμοποιώντας το ίδιο κυτταρομετρητή ροής.

σφαίρα Tumor δοκιμασία σχηματισμού

Έξι φρεατίων δίσκους καλλιέργειας επικαλύφθηκαν με 1,2% μαλακό άγαρ [22] . Η γονική και ταξινομημένα κύτταρα ήταν από μετρήθηκαν και ενοφθαλμίστηκαν εις τριπλούν σε πυκνότητα 500 κύτταρα /φρεάτιο σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 20 ng /ml bFGF και 20 ng /ml EGF. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν για το σχηματισμό σφαίρα κάθε μέρα.