Αφηρημένο

καρκίνωμα του ρινοφάρυγγα (NPC) είναι ένα μοναδικό EBV καθώς επιθηλιακά κακοήθεια, δείχνοντας ιδιαίτερα επεμβατική και μεταστατικό φαινότυπο. Παρά την αυξανόμενη στοιχεία που δείχνουν τον κρίσιμο ρόλο του καρκίνου βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν (ΚΕΠ) για τη διατήρηση και την εξέλιξη των όγκων σε μια ποικιλία κακοηθειών, η ύπαρξη και τις ιδιότητες του CSC σε συνδεδεμένης με ΕΒν NPC είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Η μελέτη μας έχει ως στόχο να μελετηθεί η παρουσία και ο ρόλος των ΚΕΠ στην παθογένεση αυτής της κακοήθους νόσου. κύτταρα σχηματισμού σφαίρας απομονώθηκαν από μία ΕΒν-θετική κυτταρική γραμμή NPC C666-1 και ιδιότητες ογκογενή του επιβεβαιώθηκαν με

in vitro

και

in vivo

δοκιμασίες. Σε αυτά τα σφαιροειδή, αυξητική ρύθμιση των πολλαπλών δεικτών βλαστικών κυττάρων βρέθηκαν. Με κυτταρομετρία ροής, αποδείξαμε ότι και οι δύο CD44 και SOX2 υπερεκφράστηκαν στην πλειονότητα των σχηματισμού σφαίρας κύτταρα C666-1. Τα κύτταρα CD44 + SOX2 + ανιχνεύθηκε σε ένα μικρό πληθυσμό ΕΒν-θετικών ξενομοσχευμάτων και πρωτογενείς όγκους και θεωρείται ως δυνητικός CSC στο NPC. Αξίζει να σημειωθεί ότι, το απομονωμένο CD44 + κύτταρα NPC ήταν ανθεκτικά στους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες και με υψηλότερη απόδοση σχηματισμό σφαιροειδές, δείχνει ιδιότητες CSC. Από την άλλη πλευρά, η ανάλυση μικροσυστοιχιών αποκάλυψε μια σειρά από διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων που εμπλέκονται στη ρύθμιση της μεταγραφής (π.χ.

FOXN4

,

GLI1

), ανοσολογική απόκριση (

CCR7

,

IL8

) και διαμεμβρανική μεταφορά (π.χ.

ABCC3

,

ABCC11

) στα σφαιροειδή. Μεταξύ αυτών των γονιδίων, αυξημένη έκφραση των CCR7 σε CD44 + ΚΕΠ επιβεβαιώθηκε σε ξενομοσχεύματα NPC και πρωτογενείς όγκους. Είναι σημαντικό, το κλείδωμα της CCR7 κατάργησε την ικανότητα σχηματισμού σφαίρας των C666-1

in vitro

. Έκφραση των CCR7 σχετίστηκε με υποτροπή της νόσου και μακρινή μετάσταση. Η παρούσα μελέτη προσδιόρισε τις συγκεκριμένες ιδιότητες ενός υποπληθυσμού CSC στην EBV που σχετίζεται με NPC. Τα ευρήματά μας παρέχονται νέες ιδέες για την ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπειών που στοχεύουν σε ΚΕΠ, ενισχύοντας έτσι την αποτελεσματικότητα της θεραπείας για τους ασθενείς NPC

Παράθεση:. Lun SW-Μ, Cheung ST, Cheung ΠΦΥ, να KF, Woo JK-S, Choy KW , et al. (2012) CD44 + καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν σε EBV-Associated ρινοφαρυγγικού καρκινώματος. PLoS ONE 7 (12): e52426. doi: 10.1371 /journal.pone.0052426

Επιμέλεια: David Loeb, του Πανεπιστημίου Johns Hopkins, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10 Ιουλίου, 2012? Αποδεκτές: 12 του Νοεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 21 Δεκ, 2012

Copyright: © 2012 Lun et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Συμβούλιο Κονδυλίων Έρευνας του Χονγκ Κονγκ (GRF: Grant Νο 470321, 471610, 471211, 471709? GRF: Επιχορήγηση Όχι CUHK8 /CRF /11R? AoE /M-6.8) και Grant Συμβουλίου Έρευνας (GRF776608M? GRF777809M). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Επί του παρόντος, συν-συγγραφείς Kwok-Wai Lo, Siu Tim Cheung, Pierre Busson και Sai Wah Τσάο είναι μέλη του PLoS ONE συντακτική. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Μη κερατινίωση καρκίνωμα του ρινοφάρυγγα (NPC) είναι μια ξεχωριστή επιθηλιακά κακοήθεια που προκύπτουν από το κεφάλι και την περιοχή του λαιμού. Είναι συνεργάτες με συνέπεια με τον ιό Epstein-Barr (EBV) και δείχνει μοναδική κλινική και παθολογική λειτουργία. Με την κλωνική επέκταση ενός μεμονωμένου προγονικών κυττάρων EBV-μολυσμένα, συστατική έκφραση ιικών γονιδίων λανθάνουσας και τη συσσώρευση πολλαπλών γενετικών αλλαγών συμβάλλουν στην έναρξη και την πρόοδο του καρκίνου αυτού [1], [2].

NPC καταδεικνύει ισχυρή γεωγραφική προτίμηση, που δείχνουν υψηλή επικράτηση στη Νοτιοανατολική Ασία, ειδικά στην Καντώνα περιοχή συμπεριλαμβανομένου του Χονγκ Κονγκ, με ετήσια επίπτωση των 25-50 ανά 100.000 άτομα [1]. Η θεραπεία στήριγμα για NPC είναι είτε ακτινοθεραπεία ή σε συνδυασμό χημειο-ακτινοθεραπεία η οποία δείχνει κατά ποσοστό ίασης 90% σε ασθενείς με πρώιμο στάδιο της νόσου [3]. Ωστόσο, η έκβαση για ασθενείς με προχωρημένη τοπική-περιφερειακή ασθένειες και απομακρυσμένων μεταστάσεων δεν είναι ικανοποιητικές. Σημαντικά ποσοστά των μακρινών υποτροπής και μετάσταση εξακολουθούν να συμβαίνουν σε αυτούς τους ασθενείς μετά από ακτινοθεραπεία ή χημειο-ακτινοθεραπεία. Ένας από τους σημαντικότερους μηχανισμούς για τέτοιες μετα-θεραπευτική επανεμφάνιση της NPC έχει προταθεί από την «βλαστικών κυττάρων, όπως ο καρκίνος» (CSC) πρόταση [4].

Σύμφωνα με το μοντέλο CSC, οι καρκίνοι είναι ιεραρχικά οργανωμένες παρόμοια για φυσιολογικούς ιστούς και την ανάπτυξη του καρκίνου και την πρόοδο οδηγούνται από ένα μικρό υποσύνολο των κυττάρων του όγκου με τις κυτταρικές ιδιότητες που μοιάζουν στέλεχος, τα ΚΕΠ. Αυτή η σπάνια κύτταρο υποπληθυσμός είναι υπεύθυνη για την έναρξη του όγκου, τη συντήρηση και την αναγέννηση [4], [5]. Οι CSCs έχουν εντοπιστεί σε διάφορα ανθρώπινα κακοήθειες όπως του μαστού, του προστάτη, των ωοθηκών, του πνεύμονα και της κεφαλής και του λαιμού καρκίνωμα [5], [6], [7], [8], [9]. Οι ικανότητες αυτών των κυττάρων να κινήσει την ανάπτυξη του όγκου, διατηρούν αυτο-ανανέωση και τη διευκόλυνση της αντίστασης στα φάρμακα έχουν εκτεταμένα αποδεδειγμένη. Λαμβάνοντας υπόψη τις μοναδικές ιδιότητες των ΚΕΠ, η υποτροπή των όγκων προτείνεται να οφείλεται στην αποτυχία για την εξάλειψη όλων των ΚΕΠ και επιβιώνουν ΚΕΠ, στη συνέχεια, την ανασύσταση του όγκου σε τοπικό και απομακρυσμένες περιοχές.

Παρά το γεγονός ότι έχουν ΚΕΠ έχει αποδειχθεί ότι είναι ζωτικής σημασίας στην ανάπτυξη των περισσότερων καρκίνων, πληροφορίες σχετικά με την ύπαρξή τους σε EBV καθώς NPC είναι ελάχιστες. Είτε έρευνα διεξήχθη χρησιμοποιώντας ΕΒν αρνητικές κυτταρικές γραμμές ή δεν ήταν σε θέση να διαφωτίσει τυχόν λειτουργικές ΚΕΠ [10], [11], [12]. Η ομάδα μας έχει δημιουργήσει στο παρελθόν αρκετές EBV θετικούς γραμμές όγκου από ασθενείς NPC σε ενδημικές περιοχές [13], [14], [15], [16] και τη χρήση αυτών των ιθαγενών EBV-θετικά καρκινικά κύτταρα, έχουμε ως στόχο να προσδιορίσει και να χαρακτηρίσει λειτουργικά NPC ΚΕΠ.

Σε αυτή τη μελέτη, τα κύτταρα σχηματισμού σφαίρας ( «σφαιροειδή») από EBV-θετική κυτταρική σειρά C666-1 απομονώθηκαν και βλαστικών κυττάρων ιδιότητες που μοιάζουν με τους επιβεβαιώθηκαν. Εμείς αποκάλυψε ότι CD44 και SOX2 εκφράστηκαν στην πλειονότητα αυτών των ΚΕΠ. Με ανάλυση μικροσυστοιχιών, ταυτοποιήθηκαν με παρεκκλίνοντα εκφράζεται σε κυτταρικά γονίδια ΚΕΠ. Είναι ενδιαφέρον, CCR7, ένα υποδοχέα χημειοκίνης κυτταρικής επιφάνειας, βρέθηκε να εκφράζεται με συνέπεια στις γραμμές NPC και πρωτογενείς όγκους. Συμπτωματικά, ήταν υπερεκφράζεται σε συγκεκριμένους NPC μας ΚΕΠ και η εξουδετέρωση αυτού του υποδοχέα κατάργησε την ικανότητα σχηματισμού σφαίρας των C666-1. τρέχουσα μελέτη μας παρέχονται πρώτα στοιχεία για την παρουσία ογκογόνων ΚΕΠ σε EBV-θετικά NPC και CCR7 θα μπορούσαν να παίξουν ένα ρόλο στην ογκογόνο λειτουργία τους. Τα παραπάνω ευρήματα θα ενισχύσουν την κατανόησή μας σχετικά με τη φύση των NPC ΚΕΠ, το οποίο είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών θεραπευτικών παρεμβάσεων κατά της ασθένειας αυτής.

Αποτελέσματα

Δυνατότητες CSC του EBV θετικούς NPC που προέρχονται από σφαιροειδή

ΚΕΠ διέθετε την ικανότητα να σχηματίζουν αγκύρωση ανεξάρτητη σφαίρες όγκου όταν καλλιεργούνται σε εξειδικευμένο μέσο χωρίς ορό. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, ελεύθερης διακύμανσης σφαίρες όγκου σχηματίστηκαν όταν τα διαχωρισμένα κύτταρα C666-1 καλλιεργήθηκαν σε μη επικαλυμμένα τρυβλία σε μέσο βλαστοκυττάρων χωρίς ορό. Τα μη προσκολλημένα σφαιροειδή ήταν παρατηρήσιμα στο 6-8 ημέρες και είχαν ενζυματικώς διαχωρίστηκαν σε μεμονωμένα κύτταρα για τη διέλευση εβδομαδιαίως. Ξεχωριστά πρωτότυπη σφαιροειδή σχηματίστηκαν 28 ημέρες μετά την επίστρωση. Αυτή η αυτο-ανανέωση κυμαινόμενο σφαίρες όγκου θα μπορούσε να μεταβιβάσθηκαν σειριακά και αναπτύχθηκαν για περισσότερο από 3 μήνες. Όταν μονά κύτταρα από σφαιροειδή καλλιεργήθηκε σε προσκολλητικά τρυβλία με πλήρες μέσο (RPMI-1640 με 10% FBS), επιπλέοντα κύτταρα προσκολλημένα στο πιάτο και σχηματίζεται συστηματική αποικίες, δείχνοντας επιθηλιακά κυτταρική μορφολογία παρόμοια με αυτή της γονικής μονοστοιβάδας κυττάρων C666-1 (Σχ . 1Α, δεξί πάνελ).

(Α) Ελεύθερη διακύμανση σφαίρες όγκου σχηματίστηκαν από κύτταρα C666-1 EBV-θετικό (αριστερό πάνελ) και κατέδειξε την ικανότητα να διαφοροποιούνται συγκριτικά μονοστοιβάδας κύτταρα κατά τη χορήγηση πλήρους μέσου ( δεξί πάνελ). (Β) Με qRT-PCR, πολλαπλά γονίδια των βλαστικών κυττάρων που σχετίζονται με (Oct4, Nanog, ΑΙ_ϋΗ1, ckit, CD44, CD133) εμπλουτίστηκαν σε σφαιροειδή, σε σύγκριση με τη γονική C666-1. Η μεταγραφή του SOX2 δεν αυξήθηκε στα σφαιροειδή. (C) πρωτεΐνη SOX2 ήταν συχνά εκφράζεται σε C666-1 κύτταρα σχηματισμού σφαίρας. Με κυτταρομετρία ροής, τα κύτταρα SOX2-θετικό (SOX2 +) βρέθηκαν να εμπλουτιστεί και να αποτελούσαν πάνω από το 60% του πληθυσμού των κυττάρων σχηματισμού σφαίρας. (Δ) Πάνω από το 80% των κυττάρων σχηματισμού σφαίρας εξέφρασε δείκτη κυτταρικής επιφάνειας CD44, ενώ CD44 + κύτταρα ανιχνεύονται σε γονική C666-1 και άλλα ξενομοσχεύματα NPC ήταν σημαντικά χαμηλότερα (όλα

P

& lt? 0.001). Ιστογράμματα που υποδηλώνει μέση τιμή ± SE (n≥3) με στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε με t-test (*

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt? 0.001)

η

Για να μετρηθεί η ογκογονική ικανότητα των σφαιροειδών, διάφορους αριθμούς κυττάρων σχηματισμού σφαίρας και μη επιλεγμένα γονικά κύτταρα C666-1 εγχύθηκαν υποδορίως σε λαγόνες γυμνών ποντικών.. Βρήκαμε ότι 10.000 κύτταρα σχηματισμού σφαίρας θα μπορούσε να σχηματίζουν όγκους σε όλες εμβολιασθέντες ποντικούς (Πίνακας 1). Ένεση του 1000 σφαιροειδούς κύτταρα που σχηματίζονται κατά καιρούς ένας όγκος από έξι ποντικούς. Ωστόσο, τουλάχιστον 500.000 μη επιλεγμένα κύτταρα C666-1 ήταν απαραίτητα για τον σχηματισμό όγκου. Τα κύτταρα σφαιροειδές έδειξαν τουλάχιστον 50 φορές υψηλότερη ογκογόνο δυναμικό από τα μη επιλεγμένα κύτταρα. Για να επαληθεύσετε την περαιτέρω εάν τα κύτταρα σχηματισμού σφαίρας είναι σε θέση σειριακά πολλαπλασιαστικού σε γυμνά ποντίκια, ξενομοσχεύματα αναπτύχθηκαν από σφαιροειδή σειριακά εμφυτεύτηκαν σε γυμνά ποντίκια. Όλοι τους έδειξαν επιτυχή serial μεταμοσχεύσεις και όγκοι ήταν παρατηρήσιμα στο 3-4 εβδομάδες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η

Στη συνέχεια εξετάστηκε το πρότυπο έκφρασης των πολλαπλών δεικτών των βλαστικών κυττάρων και επιφανειακά αντιγόνα σε αυτά τα σφαιροειδή. Με ανάλυση qRT-PCR, βρήκαμε ότι η έκφραση πολλαπλών δεικτών βλαστοκυττάρων (Oct4, Nanog, ΑΙ_ϋΗ1, CD44 και CD133) σε σφαιροειδή ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη των μονοστοιβάδας γονικών κυττάρων C666-1 (όλα

P

& lt? 0,05, Σχήμα 1Β).. Αυξημένη έκφραση του ckit, KLF4 και KLF5 στα σφαιροειδή Σημειώθηκε επίσης. Παρά το γεγονός ότι δεν είχαμε ανιχνεύσει τα πάνω ρύθμιση της μεταγραφής SOX2 στα κύτταρα σχηματισμού σφαίρας, SOX2 εκφράζουν (SOX2 +) κύτταρα φαίνεται να είναι ιδιαίτερα εμπλουτισμένο σε σφαιροειδή (70,8 ± 2,16%) με κυτταρομετρία ροής (όλα

P

& lt? 0.001, σχήμα 1Γ).. Διαπιστώσαμε επίσης έκφραση SOX2 σε 0,77 ± 0,13% των κυττάρων σε NPC ξενομοσχεύματα. Τα ευρήματα επιβεβαίωσαν ότι τα σφαιροειδή που προέρχονται από C666-1 κύτταρα EBV θετικούς εμφανίζουν CSC φαινοτύπων.

σχηματισμού σφαίρας ΚΕΠ Express κυττάρων επιφανειακής πρωτεΐνης CD44

Από την μεταγραφή του CD44 και CD133 ήταν σημαντικά αυξημένη σε σφαιροειδή, μπορούμε τότε επαληθεύεται εάν η έκφραση αυτών των δεικτών επιφανείας ΚΕΠ ήταν ειδική για NPC κύτταρα σχηματισμού σφαίρας. Με κυτταρομετρία ροής και χρώση ανοσοφθορισμού, έχουμε αποδείξει ότι η πλειονότητα των κυττάρων σε C666-1 σφαιροειδή (84,14 ± 1,12%) ήταν CD44 θετικά (Εικ. 1 D και το Σχ. S1). CD44 + κύτταρα βρέθηκαν επίσης ως υποπληθυσμό των γονικών κυττάρων C666-1 (5,28 ± 1,29%) και τρία ξενομοσχεύματα NPC, ξενο-666 (12,31 ± 1,97%), ξενο-2117 (9.58 ± 1.80%), και C17 (17,31 ± 1,76%) (Σχ. 1D). Ωστόσο, CD133 εκφράζουν κύτταρα ανιχνεύθηκαν μόνο σε 32.11 ± 2.35% των σφαιροειδών κυττάρων και 1.90 ± 0.84% ​​των γονικών κυττάρων C666-1. Περαιτέρω, τα κύτταρα CD133 + ήταν εντελώς απούσα σε 2 από τα ξενομοσχεύματα (ξενο-666 και ξενο-2117) (Εικ. S2). Έτσι, προτείναμε ότι CD44 είναι ένας κοινός υποψήφιος δείκτη επιφανείας CSC για EBV-θετικοί NPC.

CD44 + κύτταρα εκφράζουν SOX2 και παρουσιάζουν υψηλότερα Clone- και σχηματισμού σφαίρας Αποδοτικότητα

Η έκφραση της μεταγραφής βλαστικών κυττάρων παράγοντας SOX2 ανιχνεύθηκε με συνέπεια σε ένα κύτταρο όγκου υπο-πληθυσμός στην πρωτοβάθμια NPC και πιστεύεται ότι είναι ένας πιθανός δείκτης για NPC ΚΕΠ [12]. Κατά συνέπεια, εκτιμήσαμε την συν-έκφραση των CD44 και SOX2 σε σφαιροειδή και μη επιλεγμένα κύτταρα μονοστοιβάδας C666-1, καθώς και 3 ξενομοσχεύματα και 5 πρωτογενείς όγκους με κυτταρομετρία ροής. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, πάνω από το 60% των κυττάρων σφαιροειδούς (66,57 ± 2,72%) εξέφρασε τόσο CD44 και SOX2. Συμπτωματικά, η έκφραση SOX2 σπάνια ανιχνεύεται σε CD44- κλάσμα C666-1 κύτταρα σχηματισμού σφαίρας, γεγονός που υποδηλώνει μια προνομιακή έκφραση αυτού του στελέχους μεταγραφικού παράγοντα κυττάρων σε CD44 + κύτταρα. Συν-έκφραση των CD44 και SOX2 ανιχνεύθηκε επίσης σε 0,1 έως 9% των κυττάρων του NPC κυτταρική γραμμή, ξενομοσχεύματα και πρωτογενείς όγκους. Τα ευρήματα συνεπάγεται ότι τα κύτταρα CD44 + SOX2 + είναι εν δυνάμει ΚΕΠ στο NPC. Για να αποδειχθεί αυτή η υπόθεση, εκτελέσαμε λειτουργικές δοκιμασίες σε CD44 + και CD44- κύτταρα που απομονώνονται από γονικά κύτταρα C666-1. Τα αντιπροσωπευτικά στοιχεία της έκφρασης CD44 στα απομονωμένα κύτταρα CD44 + και CD44- φαίνεται στο Σχήμα S3. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, σημαντικά υψηλότερη αποδοτικότητα σχηματισμού κλώνος ανιχνεύτηκε στο CD44 + κυττάρων κλάσμα από εκείνο του κλάσματος CD44- (

P

& lt? 0,01). Επιπλέον, CD44 + κύτταρα θα μπορούσε να δημιουργήσει σημαντικά υψηλότερο αριθμό σφαιροειδών σε σύγκριση με τα κύτταρα CD44- (

P

& lt?. 0,001, Σχήμα 3Β).

με κυτταρομετρία ροής, SOX2 βρέθηκε να είναι κατά προτίμηση που εκφράζεται σε CD44 + κύτταρα και συμπτωματικά, η έκφραση SOX2 σπάνια ανιχνεύεται σε κύτταρα CD44-. Κύτταρα συνεκφράζουν τόσο CD44 και SOX2 βρέθηκαν να είναι εμπλουτισμένο σε σφαιροειδή. Ιστογράμματα που υποδηλώνει μέση τιμή ± SE (n≥3) με στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε με t-test (*

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt?. 0.001)

Η

CD44 + κλάσμα κυττάρων εμφάνισαν σημαντικά υψηλότερη (Α) απόδοση σχηματισμού κλώνο και (Β) σχηματισμού σφαίρας απόδοση σε σύγκριση με κλάσμα των κυττάρων CD44-. Επιπλέον, (Γ) CD44 + κύτταρα παρουσίασαν σημαντικά υψηλότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού από τα κύτταρα CD44-. (D) χαρακτηριστικό Αναπτυξιακή ιεραρχία των κυττάρων CD44 +. Ποσοστό CD44 + κύτταρα συνεχώς μειώνεται στο απομονωμένο CD44 + κυττάρων κλάσμα πάροδο του χρόνου. (Ε) CD44 + κύτταρα παρουσίασαν μεγαλύτερη αντίσταση στη θεραπεία 5-FU όταν συγκρίνεται με το CD44- και γονικά κύτταρα C666-1. Όλα τα γραφήματα που υποδηλώνει μέση ± SE (n≥3) με στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε με t-test (*

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, *** em

P

& lt?. 0.001)

η

Ο πολλαπλασιασμός των CD44 + κύτταρα

με τη δοκιμασία πολλαπλασιασμού WST1, CD44 + κυττάρων παρουσίασαν σημαντικά υψηλότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με το CD44- και τη γονική κύτταρα C666-1, ενώ τα κύτταρα CD44- παρουσίασαν σημαντικά χαμηλότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα C666-1. (όλα τα P & lt?. 0.01, Σχήμα 3C)

ιεραρχική σχέση των CD44 + και CD44- κύτταρα

Σύμφωνα με ιδιότητες CSC, έχουμε αποκάλυψε ότι τα ταξινομημένα CD44 + C666-1 κύτταρα διέθετε την ικανότητα να δημιουργούν τόσο CD44 + και τα κύτταρα CD44-. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3D, μια μείωση στο κλάσμα CD44 + κυττάρων στα ταξινομημένα CD44 + κυττάρων ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής συναρτήσει του χρόνου. Είναι πιθανό ότι διευθετηθεί CD44 + κύτταρα να οδηγήσουν σε ετερογενή πληθυσμό μέσω προς τα κάτω ρύθμιση του CD44 σε ένα υποσύνολο αυτών των κυττάρων μετά από καλλιέργεια

in vitro.

Ωστόσο, καμία σημαντική μεταβολή στο ποσοστό του κλάσματος CD44 + κυττάρων και στα δύο μη ταξινομημένα γονική και ταξινομημένο CD44- κύτταρα ανιχνεύθηκε μετά από 3-6 ημέρες διέλευσης. Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν μια ιεραρχική σχέση των κυττάρων CD44 + και CD44- σε συνδεδεμένης με ΕΒν NPC.

χημειοαντίσταση του CD44 + κύτταρα

Για να εξεταστεί η χημειοαντίσταση των CD44 + κυττάρων σε αντικαρκινικά χημειοθεραπευτικά μέσα, εκτελέσαμε δοκιμασίες κυτταρικής επιβίωσης για τα κλάσματα των κυττάρων CD44 + και CD44- επεξεργάστηκε με φθοριοουρακίλη (5-FU), σισπλατίνη ή δοξορουβικίνη. Το CD44 + κυττάρων κλάσμα C666-1 επέδειξαν ισχυρότερη χημειοαντίσταση στο 5-FU σε σχέση με τα πατρικά μη επιλεγέντα κύτταρα C666-1 και κλάσμα CD44- (όλα

P

& lt? 0,05) (Εικ. 3Ε). Η χημειοαντίσταση των CD44 + κυττάρων προς σισπλατίνη ή δοξορουβικίνη ήταν παρόμοια με CD44- και γονικά κύτταρα C666-1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε NPC προερχόμενα σφαιροειδή

Για να χαρακτηριστεί διεξοδικά τους ιδιότητες των NPC ΚΕΠ, εξετάσαμε την έκφραση κυτταρικών και EBV γονιδίων σε κύτταρα NPC σχηματισμού σφαίρας χρησιμοποιώντας olignonucleotide μικροσυστοιχιών και προσδιορισμούς qPCR. Πρώτον, αξιολογείται αριθμός αντιγραφής EBV και του επιπέδου έκφρασης των γονιδίων EBV συμπεριλαμβανομένων ΕΒΝΑ1, LMP1, LMP2A, BARF1, EBER1 και BZLF1 σε C666-1 σφαιροειδή. Τα κύτταρα σχηματισμού σφαίρας έδειξε υψηλότερο αριθμό αντιγράφων EBV και γονιδιακή έκφραση λανθάνουσες από τα γονικά κύτταρα C666-1 (Σχ. 4Α). Διαπιστώσαμε σημαντική αύξηση των EBER1, BARF1 και έκφραση LMP1 στα σφαιροειδή (όλα

P

& lt? 0,05). Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στην έκφραση του EBV άμεσο πρώιμο λυτικό γονίδιο BZLF1 παρατηρήθηκε μεταξύ των σφαιριδίων και των γονικών κυττάρων C666-1.

(Α) Με qRT-PCR, πολλαπλά γονίδια EBV (Έβερ, BARF1, LMP1, LMP2A, ΕΒΝΑ1 και BZLF1) βρέθηκαν να υπερεκφράζεται σε σφαιροειδή όταν συγκρίνονται με μονοστοιβάδα κυττάρων C666-1. αριθμό αντιγράφων EBV σε αυτά τα κύτταρα προσδιορίστηκε με qPCR. (Β) επιλεγμένα γονίδια εκφράζονται ανώμαλα σε σφαιροειδή επιβεβαιώθηκαν με qRT-PCR. Τα σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω γονίδια περιλαμβάνουν χημειοκίνες και οι υποδοχείς (CCR7, CCL4, CX3CL1 και IL-8), μόριο κυτταρικής προσκόλλησης Sele, μόρια σηματοδότησης (GLI1, FOXN4) και ABC μεταφορείς (ABCC3, ABCC11). (C) Cell εκφρασμένα στην επιφάνεια CCR7 βρέθηκε να εκφράζεται συχνά σε κύτταρα σχηματισμού σφαίρας (& gt? 60%) με κυτταρομετρία ροής. Το υποπληθυσμού κυττάρων CCR7 + ανιχνεύθηκε επίσης στις γραμμές NPC και πρωτογενείς όγκους (& lt? 5%). (D) CD44 + CCR7 + κύτταρα βρέθηκαν επίσης να είναι εμπλουτισμένα σε σφαιροειδή. Ιστογράμματα που υποδηλώνει μέση τιμή ± SE (n≥3) με στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε με t-test (*

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt?. 0.001)

η

Τα κυτταρικά γονίδια εκφράζονται διαφορικά σε σφαιροειδή και τα κύτταρα μονοστιβάδας C666-1 ταυτοποιήθηκαν με ανάλυση μικροσυστοιχιών. Έκφραση των 830 και 260 γονιδίων βρέθηκαν να δείχνουν περισσότερο από 5-πλάσια αύξηση και μείωση στα κύτταρα σχηματισμού σφαίρας αντίστοιχα. ανάλυση Gene οντολογία αποκάλυψε ότι οι 5 μεγαλύτερες καταλόγους μοριακό λειτουργία εμπλουτισμένο σε διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια περιλαμβάνουν: ρύθμιση της μεταγραφής, η ανοσολογική απόκριση, ρύθμιση της απόπτωσης, της κυτταρικής προσκόλλησης, και διαμεμβρανική μεταφορά, το καθένα με σημαντικές τιμές Ρ (Πίνακας 2 και Πίνακας S2). Μια επιλογή των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων που παρατίθενται στον Πίνακα 2. Κατά qRT-PCR, εμείς επικύρωσε την έκφραση των επιλεγμένων γονιδίων που εμπλέκονται στη διατήρηση της ιδιότητες βλαστικών κυττάρων στα σφαιροειδή και γονικής C666-1 (Εικ. 4Β). Σημαντικά αυξημένη έκφραση (

P

& lt? 0,05) των χημειοκινών και των υποδοχέων (IL8, CCL4, CX3CL1, CCR7), σηματοδοτώντας γονίδια μονοπάτι που σχετίζονται με (FOXN4 και GLI1), και μόρια κυτταρικής προσκόλλησης (Sele) επιβεβαιώθηκαν στη τα σφαιροειδή (Εικ. 4Β). Αξίζει να σημειωθεί ότι, δύο ATP-δεσμευτική κασέτα (ABC) γονίδια μεταφορέα (ABCC3 και ABCC11) είναι επίσης εξαιρετικά εκφράζονται στα σφαιροειδή (όλα

P

& lt? 0,01). Η υπερέκφραση των γονιδίων αυτών μπορεί να είναι υπεύθυνη για τη χημειοθεραπεία χαρακτηριστικό του NPC ΚΕΠ (Εικ. 4Β).

Η

Η έκφραση της CCR7 σε CD44 + ΚΕΠ του NPC

Μεταξύ των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων, CCR7, ένα υποδοχέα χημειοκίνης, έδειξε την υψηλότερη φορές αλλαγή στην έκφραση στα σφαιροειδή με ανάλυση μικροσυστοιχιών και ως εκ τούτου επιλέγονται για περαιτέρω έρευνα. Με κυτταρομετρία ροής, ένα σημαντικό εμπλουτισμό κυττάρων CCR7 + ανιχνεύθηκε σε σφαιροειδή σε σύγκριση με γονικά κύτταρα (όλα

P

& lt? 0.001, σχήμα 4Γ.). Διαπιστώσαμε επίσης έκφραση CCR7 σε 0,53 ± 0,14% και 2,87 ± 1,53% των κυττάρων σε ξενομοσχεύματα και πρωτογενείς όγκους αντίστοιχα. Πολύχρωμα ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι η πλειοψηφία των CCR7 + κύτταρα συν-εκφράζεται με CD44. κύτταρα CD44 + CCR7 + εμπλουτίστηκαν σε σφαιροειδή σε σύγκριση με τις ξενομοσχεύματα και πρωτογενείς όγκους (όλα

P

& lt? 0,001, σχ 4D.). Αυτό υποψήφιος CSC κλάσμα ανιχνεύθηκε επίσης σε γραμμές όγκου NPC και πρωτογενείς όγκους.

Από CCR7 ήταν εντόνως εκφρασμένο σε NPC κύτταρα σχηματισμού σφαίρας και συσχετίζεται με μετάσταση λεμφαδένα σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους, μπορούμε στη συνέχεια προσδιορίζεται με τη σύνδεση των CCR7 έκφρασης με τις κλινικές παραμέτρους σε 39 πρωτοβάθμια περιπτώσεις NPC. μοτίβα Αντιπροσωπευτικά έκφραση CCR7 σε πρωτογενείς όγκους φαίνεται στο Σχήμα 5. έκφραση CCR7 σημαντικά συσχετίζεται με την έκφραση CD44 σε αυτές τις περιπτώσεις (Εικ. S4). Μεταξύ των δειγμάτων NPC, 8 (20,5%) ήταν αρνητικά για χρώση CCR7. Ασθενής, μέσης και υψηλής έκφρασης CCR7 ανιχνεύθηκαν σε 13, 7 και 11 των πρωτογενών περιπτώσεων αντίστοιχα. Είναι σημαντικό, βρήκαμε ότι η έκφραση CCR7 συσχετίζεται με την παρουσία της υποτροπιάζουσας νόσου και μακρινή μετάσταση (Πίνακας 3). Το εύρημα άφησε να εννοηθεί ότι τα κύτταρα CCR7 εκφράζουν μπορεί να συμβάλει στην εξέλιξη της νόσου.

Εκπρόσωπος πρωτογενή κρούσματα NPC με υψηλή (Α), μέσο (Β), χαμηλή (C) έκφραση της CCR7. (D) Δημοτικό NPC με απουσία έκφρασης CCR7 φάνηκε. χρώση CCR7 ανιχνεύθηκαν σε λίγα λεμφοκύτταρα που διηθούν, αλλά όχι στα κύτταρα του όγκου. Πρωτογενής όγκους με υψηλή (Ε) και μέσης (F) έκφραση CD44 απεδείχθη. Στο (G) και (Η), ασθενής έκφραση CD44 ανιχνεύθηκε στα καρκινικά κύτταρα, ενώ ισχυρή χρώση CD44 σε διηθητικά λεμφοκύτταρα που βρίσκονται συνήθως.

Η

Για να διερευνήσουν το ρόλο της CCR7 στο NPC CSC , χρησιμοποιήσαμε ένα αντίσωμα CCR7 αποκλεισμού για να εξουδετερώσει τη λειτουργία της στις γονικών, κύτταρα CD44 + και CD44- C666-1. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με /αντίσωμα μπλοκαρίσματος mL CCR7 0-250 ng για 24 ώρες και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με προσδιορισμό WST1. Ο ορατός μείωση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων παρατηρήθηκε στο κλάσμα CD44 + κυττάρου, σε σύγκριση με CD44- και γονικά κύτταρα C666-1. (Σχ. 6Α). Μειωμένη ικανότητα σχηματισμού κλώνος βρέθηκε επίσης σε κύτταρα C666-1 αγωγή με αντίσωμα μπλοκαρίσματος CCR7 (

P

& lt? 0,05, Σχήμα 6Β).. Σημαντικά, ικανότητα σχηματισμού σφαίρας ανεστάλη σημαντικά μετά CCR7 αποκλεισμού θεραπεία αντισώματος (

P

& lt?. 0,001, σχ 6C). Τα αποτελέσματα παρέχονται αποδεικτικά στοιχεία για τη συμμετοχή των CCR7 στη διατήρηση της λειτουργίας CSC στο NPC.

Για να αξιολογηθεί η λειτουργία του CCR7 στο ΚΕΠ, C666-1 υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ανασταλτικό αντίσωμα CCR7 και τον πολλαπλασιασμό του, κλώνος σχηματίζουν και sphere- αποτελεσματικότητα σχηματισμού ερευνήθηκαν. (Α) τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CD44 + ανεστάλη μετά από θεραπεία με CCR7 ανασταλτικό αντίσωμα. (Β) Η αποτελεσματικότητα σχηματισμού κλώνο κυττάρων C666-1 ελαττώθηκε μετά το κλείδωμα CCR7 και (C) η ικανότητα σφαιροειδές σχηματισμού ήταν σημαντικά inihibited (

P

& lt? 0.001) σε σύγκριση με χωρίς θεραπεία ελέγχους. Ιστογράμματα που υποδηλώνει μέση τιμή ± SE (n≥3) με στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε με t-test (*

P

& lt? 0,05, ***

P

& lt? 0.001).

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη παρέχει την πρώτη απόδειξη για την ύπαρξη των πολύ ογκογόνων ΚΕΠ σε EBV θετικούς NPC. Έχουμε αναπτύξει ένα πρωτόκολλο για να ληφθεί EBV θετικούς ΚΕΠ NPC για περαιτέρω χαρακτηρισμό. Σχηματισμός σφαιροειδή είναι ένα σημαντικό λειτουργικό χαρακτηριστικό του ΚΕΠ σε ανθρώπινους καρκίνους [17]. Σε αυτή τη μελέτη, απομονώσαμε με επιτυχία ένα δυνητικό πληθυσμό CSC στο NPC κυτταρική γραμμή EBV-θετικό C666-1 μέσω σφαίρες συγκομιδή του όγκου. Τα κυτταρικά ιδιότητες παρόμοιες στέλεχος σε σχηματισμού σφαίρας C666-1 υποπληθυσμό που λαμβάνεται επιβεβαιώθηκαν με την απόδειξη της πάνω ρύθμιση των γονιδίων πολλαπλών βλαστικών κυττάρων που σχετίζονται και υψηλή ογκογονικότητα σε γυμνούς ποντικούς [9], [18], [19]. Μέσω της ολοκληρωμένης χαρακτηρισμός των σφαιριδίων NPC, γραμμές όγκου και πρωτοπαθούς όγκου, έχουμε αποκάλυψε ότι CD44 και SOX2 είναι πιθανοί δείκτες CSC για NPC. δείκτες κυτταρικής επιφάνειας είναι ζωτικής σημασίας για τον εντοπισμό ΚΕΠ μεταξύ των ετερογενών καρκινικά κύτταρα. CD44 είναι ένας υποδοχέας υαλουρονάνης και έχει αποδειχθεί ότι είναι δείκτης για ΚΕΠ στο κεφάλι και το καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων του λαιμού (HNSCC) [7]. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι η έκφραση CD44 εμπλουτίστηκε με NPC ΚΕΠ. Όπως αποδεικνύεται από την σημαντικά υψηλότερη σχηματισμού σφαίρας ικανότητα των κυττάρων CD44 + NPC, CSC υποπληθυσμός επιβεβαιώθηκε να εμπλουτιστεί σε αυτή την CD44 + κλάσμα. Η αντίσταση των CD44 + κυττάρων στη θεραπεία 5-FU είναι σε αντιστοιχία με τις προτεινόμενες ιδιότητες CSC. Εκτός από CD44, η μελέτη μας ανιχνεύθηκε επίσης τον εμπλουτισμό των κυττάρων SOX2 εκφράζουν στα σφαιροειδή, τη λειτουργική NPC ΚΕΠ. Είναι ενδιαφέρον ότι, παρόμοιο επίπεδο των μεταγραφών SOX2 βρέθηκε σε δύο σχηματισμού σφαίρας και της γονικής C666-1 κύτταρα. Σύμφωνα με αδημοσίευτες εύρημα μας, η αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης SOX2 μπορεί να οφείλεται στην απώλεια των miRNAs SOX2-καταστολή (MIR-183 και miR-203) στα σφαιροειδή. SOX2 είναι ένας παράγοντας μεταγραφής που ελέγχει pluripotency σε εμβρυϊκά και ενήλικα ιστού ειδικών βλαστοκυττάρων [20]. Ρυθμίζει βλαστικών κυττάρων αυτο-ανανέωση και διαφοροποίηση και συχνά βρέθηκε να είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε ανθρώπινους καρκίνους [21]. Zhang

et al

. (2010) πρότεινε ότι SOX2 + κύτταρα έχουν βλαστική ικανότητα ιδιότητες [12]. Απέδειξαν ότι SOX2 εκφράστηκε και συν-εντοπισμένη με Oct4 σε πρωτογενείς NPC. Σε συμφωνία με τα ευρήματα του Zhang, τα αποτελέσματά μας αποκάλυψε ότι οι + κύτταρα CD44 + SOX2 εμπλουτισμένο σε NPC ΚΕΠ.

Η απομόνωση των κυττάρων σχηματισμού σφαίρας στην EBV-θετική κυτταρική σειρά NPC μας έδωσε την ευκαιρία να αξιολογήσει την έκφραση του EBV λανθάνουσας και λυτική γονίδια σε CSC. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η αυξημένη έκφραση των προϊόντων γονιδίου λανθάνουσας EBV, EBER1, BARF1 και LMP1 ανιχνεύθηκαν στο υποπληθυσμό CSC. Έχουμε αποδείξει προηγουμένως ότι η έκφραση του Eber προσδίδει αντίσταση σε αποπτωτικό στρες [22]. Η υψηλή έκφραση Eber σε NPC ΚΕΠ υποδηλώνει ότι αυτή η κυτταρική υποπληθυσμός ίσως πιο ανθεκτικά σε απόπτωση. Από την άλλη πλευρά, LMP1 μπορεί να προκαλέσει EMT μέσω Twist ή σαλιγκάρι, το οποίο συμπίπτει με την απόκτηση των ιδιοτήτων CSC [23], [24], [25]. Επιπλέον, Kondo

et al

. έχουν επίσης δείξει πρόσφατα ότι LMP1 επάγει CD44 + CSC στην ρινοφαρυγγικής επιθηλιακά κύτταρα [26]. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η έκφραση LMP1 μπορεί να παίζει ένα κρίσιμο ρόλο στη διατήρηση CSC στην παρούσα συνδεδεμένης με ΕΒν κακοήθεια.

Εκτός από τις λανθάνουσες γονίδια EBV, η ανάλυση μικροσυστοιχιών μας αποκάλυψε μια υπερέκφραση του CCR7 στα NPC προερχόμενα σφαιροειδή. Ο εμπλουτισμός του πληθυσμού των κυττάρων CCR7 + στα κύτταρα σχηματισμού σφαίρας επιβεβαιώθηκε με κυτταρομετρία ροής. CCR7 είναι ένας υποδοχέας χημειοκίνης που μεσολαβεί κυτταρική μετανάστευση σε απόκριση CCL21 συνδετήρα αυτού [27]. Είναι πιθανό ότι η έκφραση υποδοχέα υψηλής CCR7 σε κύτταρα σχηματισμού σφαίρας θα ενισχύσει την ευαισθησία του προς τους συνδετήρες και ενεργοποιούν κατάντη σηματοδότηση της. Η παρεκκλίνουσα έκφραση CCR7 σε ανθρώπινες κακοήθειες έχει συνδεθεί με την κυτταρική επιβίωση και μεταστατικές μονοπάτια. Η οδός CCL21 /CCR7 μπορεί να παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην μετάσταση CCR7 + ΚΕΠ στους λεμφαδένες [28]. Η υπερέκφραση του CCR7 στο ΚΕΠ είναι πιθανό να συμβάλει με τις συχνές του τραχήλου της μήτρας μεταστάσεις λεμφαδένων σε ασθενείς NPC [29]. Η καταργηθεί σχηματισμού σφαίρας ικανότητα των κυττάρων NPC μετά CCR7 εξουδετέρωση πρότεινε CCR7 μπορεί επίσης να ρυθμίσει τις ιδιότητες CSC στο NPC.

αντίσταση των ναρκωτικών είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό των ΚΕΠ, η οποία αποτελεί τη βάση για την επανεμφάνιση του όγκου μετά από χημειοθεραπευτικές αγωγές [30 ]. Αυξημένη έκφραση του ΑΤΡ-σύνδεσης κασέτας (ABC) οικογένεια μεταφορέας είναι υπεύθυνος για την εκροή των θεραπευτικών φαρμάκων και είναι ένας κοινός μηχανισμός για τη διατήρηση της ανθεκτικότητας στα φάρμακα σε ΚΕΠ [31], [32]. Όπως φαίνεται στην μελέτη μικροσυστοιχίας μας, σημαντική υπερέκφραση ABCC3 και ABCC11 βρέθηκε στα κύτταρα σχηματισμού σφαίρας. ABCC3 είναι ένα μέλος της υπο-οικογένειας πρωτεΐνης αντοχής πολυφαρμάκου (MRP) και δείχθηκε ότι υπερ-εκφράζεται σε καρκίνωμα των ωοθηκών και τον καρκίνο του πνεύμονα κυτταρική γραμμή δοξορουβικίνη ανθεκτική [33], [34]. ABCC3 υπερέκφραση ενδέχεται να συμβάλλουν στη ανθεκτικά στα φάρμακα ιδιότητες στις /δοξορουβικίνη-ανθεκτικές κυτταρικές σειρές C666-1 σισπλατίνη (Εικ. S5). ABCC11 είναι ένα άλλο μέλος της οικογένειας MRP up-ρυθμίζονται σε NPC που προέρχονται από σφαιροειδή. Είναι το κύριο μεταφορέα για 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) [35] η οποία είναι μία από τις κύριες χημειοθεραπευτικών φαρμάκων για NPC [3]. Υπερέκφραση του ABCC11 σε κύτταρα σχηματισμού σφαίρας δείχνει ότι ο πληθυσμός CSC στο NPC είναι ανθεκτική σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα και να συμβάλει έτσι στην επανεμφάνιση του όγκου.

μονοπάτι Hedgehog σηματοδότησης είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της συντήρησης και της λειτουργίας CSC. Σε C666-1 σφαιροειδή, η μελέτη μικροσυστοιχίας εντόπισε επίσης την αυξημένη έκφραση του GLI1, μια σημαντική ενεργοποιητής μεταγραφής του hedgehog οδού σηματοδότησης. Στο καρκίνωμα των ωοθηκών, GLI1 αναφέρθηκε για τη ρύθμιση της ανάπτυξης των ΚΕΠ [36]. Για να διαλευκανθεί ο ρόλος των GLI1 και σκαντζόχοιρο μονοπάτι στο NPC ΚΕΠ, θα εξεταστούν τα αποτελέσματα της αποσιώπησης της έκφρασης GLI1 σχετικά με το σχηματισμό και την ογκογόνο ιδιότητες των κυττάρων σχηματισμού σφαίρας. Η διευκρίνιση σχετικά με τους μηχανισμούς που ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση των NPC ΚΕΠ θα επωφεληθούν θεραπειών που στοχεύουν σε αυτό υποπληθυσμό των ανθεκτικών στα φάρμακα κυττάρων σηματοδότησης.

Εν κατακλείδι, έχουμε εντοπίσει πολύ ογκογόνο ΚΕΠ σε EBV θετικούς NPC και αυτό θα μπορούσε να είναι υποπληθυσμό εμπλουτισμένη με επιφάνεια των κυττάρων CD44 και προσδιόρισε μαζί με SOX2. Η μελέτη μας έχει ανακαλύψει πολλά κρίσιμα μόρια συμπεριλαμβανομένων CCR7 και ABCC11 που εμπλέκονται στη διατήρηση των λειτουργιών NPC CSC. Τα παρόντα ευρήματα παρέχεται μια βάση για την ανάπτυξη νέων θεραπειών που στοχεύουν NPC CSC που μπορεί να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα των σημερινών θεραπειών.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων, Ξενομοσχεύματα και πρωτογενείς όγκους

Μια EBV-θετική κυτταρική σειρά NPC (C666-1) και 3 ξενομοσχεύματα (ξενο-666, ξενο-2117 και C17) συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη [13], [14], [15]. Η γονική C666-1 καλλιεργήθηκε σε RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) συμπληρωμένου με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (Invitrogen). Για όγκου καλλιέργειας σφαίρα, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM-F12 άνευ ορού (Invitrogen) σε πλάκες εξαιρετικά χαμηλή προσκόλληση. Τα σφαιροειδή διαχωρίστηκαν και περάστηκαν κάθε 6-8 ημέρες. Ένα σύνολο 1 × 10

6 C666-1 κύτταρα σπάρθηκαν ανά φρεάτιο και ο αριθμός των σφαιριδίων που σχηματίζονται μετρήθηκε.

Πέντε ενδοσκοπική βιοψίες όγκων για ανάλυση FACS ελήφθησαν από ασθενείς NPC με έγγραφη συγκατάθεση στην Τμήμα Ωτορινολαρυγγολογίας, Prince of Wales Hospital, CUHK. Όλες οι περιπτώσεις ήταν θετικές για

Έβερ

–

in situ υβριδισμού

και ιστολογικά διαγνωστεί ως αδιαφοροποίητα ή κακώς διαφοροποιημένο NPC. Έχουμε προσληφθεί επίσης 49 αρχειακό φορμόλη σταθερό παραφίνη-ενσωματωμένες πρωτοπαθείς όγκους από την τράπεζα ιστών του Τμήματος Ανατομική & amp? Κυτταρική Παθολογία, CUHK για ανοσοϊστοχημική χρώση (IHC). Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Κλινική Επιτροπή Ερευνητικής Δεοντολογίας του Κινεζικού Πανεπιστημίου του Χονγκ Κονγκ.

Ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qRT-PCR) Ανάλυση

Σύνολο RNAs εξήχθησαν χρησιμοποιώντας το κιτ Qiagen RNeasy (Qiagen) και αντίστροφη-μεταγραφή προς το cDNA χρησιμοποιώντας SuperScript cDNA Synthesis Kit (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ποσοτική RT-PCR κατόπιν εκτελείται με ειδικούς εκκινητές (Invitrogen, αλληλουχίες εκκινητών όπως απαριθμούνται στον Πίνακα S1) και μείγμα ρεύματος SYBR® Πράσινη PCR (Applied Biosystems). β-ακτίνη έκφραση χρησιμοποιήθηκε για ομαλοποίηση των δεδομένων. Όλα qRT-PCR διεξήχθησαν εις τριπλούν σε 7500 πραγματικού χρόνου PCR σύστημα ΑΒΙ (Applied Biosystems) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ενεργοποιημένων με φθορισμό κυττάρων (FACS) Ανάλυση

Ενιαία κελί εναιωρήματα που λαμβάνονται από κυτταρικές γραμμές και ιστούς όγκων ξεπλύθηκαν δύο φορές και επαναιωρήθηκαν σε PBS (10

5 έως 10

6 κύτταρα /100 μΙ). Για ενδοκυτταρική χρώση, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη για 24 ώρες στους -20 ° C πριν την επανυδάτωση με PBS.