Αφηρημένο

p53 και ασβέστιο σηματοδότησης είναι αλληλένδετα και είναι γνωστό για να δείξει τόσο συνεργιστικές και ανταγωνιστικές επιδράσεις σε κάθε άλλη στο κυτταρικό περιβάλλον. Ωστόσο, δεν μοριακός μηχανισμός ή κυτταρικό μονοπάτι είναι γνωστή η οποία παρουσιάζει άμεση ρύθμιση μεταξύ αυτών των σημαντικών μορίων κυτταρικής σηματοδότησης. Εδώ έχουμε δείξει ότι στα καρκινικά κύτταρα κατεργασμένα με αντι-νεοπλασματική φάρμακο GaQ

3, ρ53, υπάρχει μια αύξηση στα επίπεδα ενδοκυτταρικού ασβεστίου με μεταγραφική ρύθμιση ενός νέου TRPC6 γονίδιο διαύλου ασβεστίου. p53 συνδέεται απευθείας σε ένα στοιχείο απόκρισης 22 bp στον προαγωγέα του γονιδίου TRPC6 και να αυξήσει mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης. Υπερ-έκφραση των TRPC6 οδηγεί σε αποπτωτικό θάνατο εξαρτώμενη από ασβέστιο και ενεργοποίηση των αποπτωτικών γονιδίων σε μία ποικιλία καρκινικών κυττάρων. Αυτή η ερευνητική εργασία δείχνει ότι η p53 και μεταγραφική δραστηριότητα της είναι κρίσιμη στη ρύθμιση της σηματοδότησης ασβεστίου και αύξηση του ενδοκυτταρικού επιπέδου του ασβεστίου μπορεί να είναι μια από τις στρατηγικές κατά του καρκίνου για να επάγει απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα

Παράθεση:. Μαντάν Ε, Gogna R, Keppler Β, Pati U (2013) p53 Αυξάνει την ενδο-κυτταρική απελευθέρωση ασβεστίου από μεταγραφική ρύθμιση του ασβεστίου κανάλι TRPC6 στο GaQ

3-επεξεργασμένα κύτταρα του καρκίνου. PLoS ONE 8 (8): e71016. doi: 10.1371 /journal.pone.0071016

Επιμέλεια: Sumitra Deb, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15η Απριλίου του 2013? Αποδεκτές: 30 Ιουν 2013? Δημοσιεύθηκε: 16 Αυγ, 2013

Copyright: © 2013 Μαντάν et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Ελβετικά Καρκίνος πρωτάθλημα, Josheph Steiner βραβείο επιχορηγήσεις και του Ινδικού Συμβουλίου της Mecical Ερευνών (ICMR). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

γάλλιο και οργανικά παράγωγα του έχουν δείξει υψηλή συνέπεια και αποτελεσματικότητα ως αντικαρκινικά φάρμακα [1] – [5]. Έχουμε αναπτύξει πρόσφατα μια νέα οργανική παράγωγο του γαλλίου «GaQ

3″ [τρις (8-κινολινολικού) γάλλιο (III)] (KP46) ως ένα αποτελεσματικό φάρμακο κατά του καρκίνου στα καρκινικά κύτταρα με Wt-p53 ή Mt-p53 πρωτεΐνη [6]. Παρατηρήσαμε ότι GaQ

3 επάγει σηματοδότηση ασβεστίου στα καρκινικά κύτταρα με την αύξηση των ενδοκυτταρικών επιπέδων ασβεστίου. Αύξηση των κυτταρικών Ca

2 + ενεργοποιεί την πρωτεΐνη p53 και αυξάνει p53 κυτταρικό επίπεδο. GaQ

3 επαγόμενη ενδοκυτταρική απελευθέρωση ασβεστίου ήταν σημαντικά υψηλότερη σε καρκινικά κύτταρα με άγριου τύπου ρ53 σε σύγκριση με τα καρκινικά κύτταρα με μεταλλαγμένη ρ53 ή με διαγραφή του γονιδίου p53 [6]. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήθηκε ότι η αύξηση του ενδοκυτταρικού Ca

2+ απελευθέρωση ήταν p53-εξαρτώμενη και αναστολή της δραστηριότητας της μεταγραφής ρ53 χρησιμοποιώντας pifithrin-α καταργηθεί το ενδοκυττάριο Ca

απελευθέρωση 2+. Αυτή η παρατήρηση προτείνει ότι p53 μπορεί να μεταγραφικά ρυθμίζουν ενδοκυτταρικού Ca

2+ απελευθέρωση και Ca

2 + σηματοδότησης σε GaQ

3-θεραπεία καρκινικών κυττάρων. ρ53 και ασβέστιο είναι γνωστό ότι λειτουργούν σε συνέργεια, αλλά καμία άμεση σχέση έχει καθιερωθεί μεταξύ της ενεργοποίησης ρ53 και ρ53-εξαρτώμενη ρύθμιση της σηματοδότησης ασβεστίου στο κυτταρικό, βιοχημικές ή μοριακό επίπεδο. Σε ορισμένες εκθέσεις Ca

2 + επαγόμενη σήματα όπως Ca

2 πορείες + -ενεργοποιημένου RAF /MEK /ERK μεσολάβηση ρ53-ανεξάρτητη απόπτωση [7]. Επίσης προβλέπεται ότι η ρ53 λειτουργεί σε στενή σχέση με την κυτταρική σηματοδότηση ασβέστιο, αφού ενδοκυτταρική απελευθέρωση ασβεστίου παίζει σημαντικό ρόλο στην επαγωγή Bcl-2, ROS και μιτοχονδριακή μονοπάτι της απόπτωσης [8]. Ωστόσο, δεν μοριακός μηχανισμός ή παθολογική οδό ρ53-medited ρύθμιση της ενδοκυτταρικής απελευθέρωσης ασβεστίου είναι γνωστή.

Σε αυτή τη μελέτη έχουμε δείξει ότι η κυτταρική σηματοδότηση ασβέστιο και ενδοκυτταρική απελευθέρωση ασβεστίου είναι υπό μεταγραφικό έλεγχο της ρ53 πρωτεΐνης. ρ53 ρυθμίζει μεταγραφικά μία νέα TRPC6 διαύλων ασβεστίου με απ ‘ευθείας σύνδεση με ένα 22 ζευγών βάσεων p53-RE παρούσα 400 ζεύγη βάσεων ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής 1 (TSS) στο προωθητή TRPC6. Παρατηρήσαμε ότι GaQ

3 επάγει την απόπτωση μέσω p53-εξαρτώμενη αυξητική ρύθμιση του γονιδίου TRPC6 σε καρκινικά κύτταρα με wt ρ53. Υπερ-έκφραση των TRPC6 αποτέλεσμα σημαντική απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα. Περαιτέρω έκφραση TRPC6 ξεκινά μια ασβέστιο-εξαρτώμενη ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων που εμπλέκονται στην απόπτωση.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

MCF-7, U2OS, HCT, A -431, PC3 και Η1299 κύτταρα ελήφθησαν από το Εθνικό Κέντρο για Cell Science, Pune (Ινδία) και διατηρήθηκαν σε μέσο DMEM. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν ως μονοστοιβάδες σε μέσο DMEM συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό και αντιβιοτικά, και επωάζονται στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO

2 Όλα οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Effectene αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για την ώρα ανάλυση πορεία 5 τρυβλία Petri για κάθε χρονικό σημείο χρησιμοποιήθηκαν.

Πλασμίδια και αντιδραστήρια

p53-TRPC6 υποκινητή πλήρους μήκους, ρ53-TRPC6 ελάχιστου υποκινητή και p53-TRPC6 μεταλλαγμένο ελάχιστο υποκινητή κλωνοποιήθηκε στον φορέα λουσιφεράσης pGL3. p53 si-RNA χρησιμοποιήθηκε επίσης όπως περιγράφηκε προηγουμένως από [9] – [11].

Δοκιμασία για Ca

2 + κινητοποίηση

Ca

2 + μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κυττάρων διαπερατό Ca

2 + ευαίσθητη φθορίζουσα χρωστική Fluo- 3 ακετοξυμεθυλ εστέρα. Όπου ενδείκνυται, ΒΑΡΤΑ ακετοξυμεθυλ εστέρα (10 μΜ) προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας των κυττάρων σε τρυβλία καλλιέργειας ιστών πλαστικό των 10 cm για μία έκθεση 1 ώρα πριν από τη διαδικασία φόρτωσης με Fluo-3 ακετοξυμεθυλ εστέρα. Το μέσο απομακρύνθηκε από τις πλάκες καλλιέργειας ιστού και αντικαταστάθηκαν με 4 μΜ Fluo-3 ακετοξυμεθυλ εστέρα αραιωμένο σε ρυθμιστικό διάλυμα Krebs-Ringer (ΚΚΒ) (10 mM ϋ-γλυκόζη, 120 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 0,7 mM Να2ΗΡΟ4, 1.5 mM ΝαΗ2ΡΟ4 , και 0.5 mM MgCl2 (ρΗ 7.4 στους 37 ° C)) (Sigma) για 20 λεπτά. Τα πιάτα πλένονται μια φορά με 5 ml KRB για την απομάκρυνση του υπολειμματικού χρώματος. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, πλύθηκαν σε 5 ml Ca

2+ δωρεάν PBS στους 37 ° C, σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση, επανα-εναιωρήθηκαν σε 1 ml από Ca

2+ δωρεάν PBS στους 37 ° C, και αναλύονται αμέσως για Fluo-3 ένταση φθορισμού με κυτταρομετρία ροής.

Παρακαλούμε ανατρέξτε στο αρχείο S1 για την πλήρη περιγραφή των υλικών και μεθόδων.

Αποτελέσματα

GaQ

3 επάγει την έκφραση του γονιδίου TRPC6 σε καρκινικά κύτταρα με άγριου-τύπου ρ53

Είχαμε παρατηρήσει ότι νωρίτερα GaQ

3 επάγει υψηλά ενδοκυτταρικά απελευθέρωση ασβεστίου επιλεκτικά σε καρκινικά κύτταρα με πρωτεΐνη ρ53 άγριου τύπου [6]. Αποσιώπηση του γονιδίου ρ53 με χρήση ρ53 siRNA και αναστολή της δραστικότητας μεταγραφικής ρ53 χρησιμοποιώντας pifithrin-α κατήργησε τόσο την GaQ

3-επαγόμενη αύξηση του ενδοκυτταρικού απελευθέρωση ασβεστίου [6]. Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι η ενδοκυτταρική αύξηση των επιπέδων ασβεστίου στα κύτταρα του καρκίνου ρυθμιζόταν από ρ53 και εξαρτιόταν από δραστικότητα ρ53 μεταγραφικής. Ωστόσο ο μηχανισμός εμπλέκεται στη ρύθμιση αυτού του φαινομένου που παρατηρείται είναι άγνωστος [6]. Από GaQ

3 προκαλούμενη σημαντική αύξηση στην πρόσληψη ασβεστίου, χρησιμοποιώντας qPCR αναλύσαμε την έκφραση ενός μεγάλου αριθμού γνωστών διαύλων ασβεστίου σε GaQ

3-κατεργασμένα κύτταρα MCF-7. Παρατηρήσαμε σημαντικά υψηλή έκφραση του γονιδίου TRPC6 σε GaQ

κύτταρα 3-θεραπεία. Δεδομένου ότι η έκφραση του TRPC6 διαύλων ασβεστίου ήταν υψηλό, ρωτήσαμε αν TRPC6 μπορεί να εμπλέκονται στην αύξηση στα κυτταρικά επίπεδα ασβεστίου στο GaQ

3-αγωγή καρκινικών κυττάρων. Η έκφραση του TRPC6 mRNA και της πρωτεΐνης παρατηρήθηκε σε GaQ

3-αγωγή MCF-7, Η1299 και τα κύτταρα PC3 (Εικόνα 1 Α). Η ανάλυση δείχνει ότι qPCR TRPC6 mRNA ήταν σημαντικά αυξημένη σε GaQ

3-αγωγή MCF-7 (ρ53 Wt) κύτταρα (Σχήμα 1Α). Η αύξηση του επιπέδου του mRNA p53 δεν παρατηρήθηκε σε Η1299 (ρ53 null) και PC3 (ρ53 mut) κύτταρα (Bars 3-6? Σχήμα 1Α). Ομοίως p53 επίπεδο πρωτεΐνης αναλύθηκε στις προαναφερθείσες καρκινικά κύτταρα και μόνο MCF-7 έδειξαν σημαντική αύξηση στο επίπεδο της πρωτεΐνης ρ53 μετά GaQ

3 θεραπεία (Σχήμα 1Α). Αυτό δεδομένα υποδηλώνουν ότι η p53 έπαιξε σημαντικό ρόλο στην GaQ

3 μεσολάβηση προς τα πάνω ρύθμιση TRPC6. Περαιτέρω παρατηρείται η σχέση μεταξύ της έκφρασης p53 και της έκφρασης TRPC6. Η ανάλυση χρονικής πορείας του επιπέδου TRPC6 mRNA (real-time PCR) σε GaQ

3-αγωγή MCF-7, Η1299 και PC3 κύτταρα δείχνουν ότι TRPC6 mRNA ήταν σημαντικά υψηλή σε p53 (+ /+) MCF-7 κύτταρα ( Σχήμα 1Β? μαύρη γραμμή). Ανάλυση χρονική πορεία δείχνει ότι GaQ

3 επάγει την έκφραση της TRPC6 μέσα σε 6 ώρες επώασης της και τις αυξήσεις της έκφρασης TRPC6 από 6

ου και 24

ου ώρα σε ένα παρόμοιο μοτίβο στο οποίο αύξηση στην έκφραση p53 GaQ

3-κατεργασμένων κυττάρων [6] διαιτητής τώρα τοποθετείται. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η p53 και TRPC6 δείχνουν χρονική συσχέτιση σε προφίλ έκφρασης του mRNA τους. Ο άμεσος ρόλος της ρ53 στην έκφραση των TRPC6 σε GaQ

3-αγωγή MCF-7 κύτταρα παρατηρείται με φίμωση γονίδιο ρ53 σε GaQ

3-κατεργασμένα κύτταρα MCF-7 (Σχήμα 1 C). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκφραση της πρωτεΐνης TRPC6 ήταν σημαντικά υψηλό κατά GaQ

3 θεραπεία (λωρίδα 2)? ωστόσο αυτό GaQ

3-επαγόμενη αύξηση της TRPC6 αντιστράφηκε πλήρως με ρ53 σίγηση (λωρίδα 3). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ρ53 παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του γονιδίου TRPC6. Εμείς αναλύεται περαιτέρω την αποδοτικότητα της TRPC6 siRNA και cDNA TRPC6 (2 μΜ) σε κύτταρα MCF-7.

Α) Η επίδραση των GaQ

3 κατά την έκφραση του TRPC6 mRNA σε p53 (+ /+) MCF-7, p53 (- /-) Η1299 και ρ53 (mt /mt) κύτταρα PC3 παρατηρείται χρησιμοποιώντας qPCR. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι GaQ

3 μπορεί να προκαλέσει ανιούσα ρύθμιση των TRPC6 μόνο σε κύτταρα MCF-7 με Wt ρ53 (λωρίδα 2). Ομοίως GaQ

3 μπορεί να επάγει την έκφραση της πρωτεΐνης TRPC6 μόνο σε κύτταρα MCF-7 (η = 5). Β) σε πραγματικό χρόνο PCR παρουσιάζει την ανάλυση χρονική πορεία της έκφρασης TRPC6 mRNA σε GaQ3 επεξεργασμένο MCF-7 (μαύρη γραμμή), Η1299 (πράσινη γραμμή) και PC3 (κύτταρα κόκκινη γραμμή). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι TRPC6 mRNA ρυθμίζεται αυξητικά μόνο σε κύτταρα MCF-7 και όχι σε Η1299 και PC3 κύτταρα. Περαιτέρω, η αύξηση TRPC6 mRNA παρατηρείται εις την 6

ου hr του GaQ3 επώασης. Η αύξηση των TRPC6 mRNA είναι χρονικά σχετίζεται με την αύξηση του mRNA p53 σε GaQ3 επεξεργασμένα κύτταρα MCF-7 (* (κόκκινο) αντιπροσωπεύει σημαντική διαφορά στα αποτελέσματα μεταξύ κόκκινου, πράσινου και μαύρη γραμμή στο 9

ου χρονικό σημείο hr , ρ & lt? 0.028), η = 5, ANOVA, μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SD). Γ) Ο ρόλος της ρ53 σε GaQ

3 επαγόμενη προς τα πάνω ρύθμιση του TRPC6 παρατηρείται. αποσιώπηση του γονιδίου p53 με χρήση p53 siRNA σε GaQ

3-επεξεργασμένα κύτταρα αντιστραφεί η αύξηση του επιπέδου της πρωτεΐνης TRPC6 (λωρίδα 3) (* (κόκκινο) αντιπροσωπεύει σημαντική διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων λωρίδα 1 & amp? 2, σ & lt? 0.036 και λωρίδα 2 & amp? 3, σ & lt? 0.042). Η αποτελεσματικότητα των TRPC6 siRNA και TRPC6 cDNA φαίνονται στη λωρίδα 4 και 5.

Η

p53 ενεργοποιεί μεταγραφικά TRPC6 υποστηρικτής

TRPC6 (χρωμόσωμα 11q22.1, αντίστροφη σκέλος) και p53 έδειξε χρονική σχέσεων στο προφίλ έκφρασή τους σε GaQ

3-θεραπεία καρκινικών κυττάρων, ως εκ τούτου, ήταν ενδιαφέρον να καθοριστεί ο ρόλος της p53 στη ρύθμιση της TRPC6. Η περιοχή TRPC6 υποκινητή προσδιορίστηκε ως αλληλουχία DNA 650 bp ανοδικά του 1 σημείο έναρξης της μεταγραφής, χρησιμοποιώντας αγώνες μήτρας καθορίζεται από Mat Επιθεωρητής (Genomatix). υποστηρικτής TRPC6 δόθηκε την ενεργητική ID GXP_193240 από τον Mat Επιθεωρητή. Αυτή η περιοχή βρίσκεται μεταξύ των περιφερειών 101,374,672-101,375,321 (σημείο διαιτητή TSS αντιπροσωπεύεται από Mat Επιθεωρητής είναι 101.374.772) και εκπροσωπείται από ENST00000527240 και AK027769. Βιοπληροφορική ανάλυση του υποκινητή TRPC6 χρησιμοποιώντας Mat Επιθεωρητή μονάδα της βάσης δεδομένων genomatix έδειξε θέση σύνδεσης υποθετικού ρ53 DNA (sim μήτρα? Σκορ & gt? 0,9) (Σχήμα 2Α), υποδεικνύοντας ότι η ρ53 μπορεί να είναι ένας πιθανός ρυθμιστής TRPC6. Για να διαπιστωθεί αυτό, κλωνοποίησαν ένα 0,65 kb υποθετική TRPC6 υποκινητή που φέρει το στοιχείο απόκρισης p53 (p53RE) σε ένα βασικό φορέα pGL3 να δημιουργήσει pTRPC6p-luc1. Η pTRPC6p-luc1 επιμολύνθηκε σε μη επεξεργασμένα και GaQ

3-αγωγή MCF-7, Η1299 και τα κύτταρα PC3. GaQ

3 θεραπεία επαγόμενης 5-πλάσια αύξηση στην δραστικότητα προαγωγέα TRPC6 σε κύτταρα MCF-7 σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 2Β? Ράβδου 2 και 3). Η αύξηση της δραστηριότητας TRPC6 υποστηρικτής ήταν p53-εξαρτώμενη από το γονίδιο p53 αποσιώπηση χρησιμοποιώντας p53 siRNA ανέτρεψε την GaQ

3 που προκαλείται από αύξηση της δραστηριότητας TRPC6 υποκινητή. GaQ

3 θεραπεία δεν ήταν σε θέση να επάγουν τη δράση του υποκινητή TRPC6 στην Η1299 και τα κύτταρα PC3 (γραμμή 5, 6, 8 & amp? 9). υποστηρικτής TRPC6 ενεργοποιήθηκε σε GaQ

3-θεραπεία Η1299 κύτταρα τα οποία είχαν επιμολυνθεί με cDNA ρ53 (bar 7). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι TRPC6 διέπονταν από την p53 σε GaQ

3-επεξεργασμένα κύτταρα. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ο ρόλος του p53RE σε ρ53-μεσολαβούμενη ρύθμιση του υποκινητή TRPC6, η περιοχή μεταξύ των ζευγών βάσεων -74 έως -99 (με αναφορά στην ΑΚΟΛ TSS (101,374,772) του υποκινητή TRPC6 φέρει το p53RE κλωνοποιήθηκαν σε φορέα pGL3 να δημιουργούν την ελάχιστη pTRPC6p-luc2. Αυτή η ελάχιστη υποστηρικτής TRPC6 προκλήθηκε κατά GaQ3-θεραπεία σε MCF-7 κύτταρα και p53 σίγηση καταργηθεί αυτή η αύξηση στη δραστηριότητα υποκινητή (Σχήμα 2C, μπαρ 2-4). προκειμένου να καθοριστεί ο ρόλος του πρόσφατα ταυτοποιημένα p53RE σε ρ53-διαμεσολαβούμενη ρύθμιση του γονιδίου TRPC6, η αλληλουχία p53RE μεταλλάχθηκε και κλωνοποιήθηκε σε φορέα pGL3 για να δημιουργηθεί το μεταλλαγμένο ελάχιστη mmpTRPC63p-luc2. Επιμόλυνση mmpTRPC63p-luc2 σε GaQ

3-αγωγή MCF-7, PC3 και κύτταρα Η1299 έδειξε καμία αύξηση στην δραστικότητα TRPC6 προαγωγό (Σχήμα 2D). Αυτά τα δεδομένα ορίζει ότι η ρ53 ρυθμίζει μεταγραφικά TRPC6 σε GaQ

3-αγωγή καρκινικών κυττάρων.

Α) Μία υποθετική θέση δέσμευσης ρ53 παρατηρείται σε ο υποκινητής TRPC6 χρήση της ενότητας Genomatix, MatInspector. TRPC6-p53RE βρίσκεται μεταξύ -422 έως -400 bp για τον υποκινητή TRPC6 0,6 kb. Το DNA και επόμενα του υποκινητή TRPC6 μαζί με την τοποθεσία του ρ53 RE (φαίνεται σε κόκκινο) παριστάνεται διαγραμματικά. Β) pTRPC6p-luc1 (TRPC6 0,6 kb κατασκεύασμα λουσιφεράσης προαγωγός) επιμολύνεται σε GaQ

3-αγωγή MCF-7 κύτταρα και το αποτέλεσμα της ρ53 επί της δραστικότητας της λουσιφεράσης μετράται. GaQ ενεργοποίησης γονιδίου p53

3 επαγόμενη επάγει 8-πλάσια αύξηση στην δραστικότητα της λουσιφεράσης pTRPC6p-luc1 (ράβδος 3). αποσιώπηση του γονιδίου p53 με χρήση p53 siRNA αντιστρέφει αυτή η ενεργοποίηση αποτέλεσμα και υποστηρικτής TRPC6 καταργείται (bar 4). Η επιμόλυνση του pTRPC6p-luc1 σε Η1299 και PC3 κύτταρα σε απουσία ή παρουσία GaQ

3 δεν έχει επίδραση επί της δραστικότητας του προαγωγού TRPC6. Μετά εξωγενής προσθήκη cDNA ρ53 Wt σε GaQ

3-αγωγή Η1299 κύτταρα ο υποκινητής TRPC6 δείχνει 9-πλάσια αύξηση στην δραστικότητα της λουσιφεράσης (bar 7). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η p53 ρυθμίζει υποστηρικτής TRPC6 μεταγραφικά. (C) pTRPC63p-luc2, ο TRPC6-p53RE (-422 να -400) κλωνοποιήθηκε σε φορέα λουσιφεράσης επιμολύνεται σε GaQ

3-κατεργασμένα κύτταρα MCF-7. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ρ53 επάγει μια αύξηση κατά 6 φορές στην δραστικότητα λουσιφεράσης TRPC6-p53RE (ράβδος 3). αποσιώπηση του γονιδίου p53 με χρήση p53 siRNA καταργεί την αύξηση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης (bar 4). Η αύξηση της δραστηριότητας TRPC6 προαγωγός είναι απούσα σε Η1299 και PC3 κύτταρα. Τα δεδομένα δείχνουν ότι η ρ53 ρυθμίζει υποκινητή TRPC6 μέσω TRPC6-p53RE. (Δ) Η mmpTRPC6p-luc2 κατασκεύασμα με μεταλλαγμένη αλληλουχία TRPC6-p53RE επιμολύνεται σε GaQ

3-κατεργασμένα κύτταρα MCF-7. Καμία αύξηση στη δραστηριότητα λουσιφεράσης παρατηρείται, δείχνει την ιδιαιτερότητα της TRPC6-p53RE. Για το σχήμα 2b-2d, (* (κόκκινο) αντιπροσωπεύει σημαντική διαφορά στα αποτελέσματα όλες οι τιμές p & lt? 0.05), n = 7, Anova, μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SD)

Η

WT p53 συνδέεται άμεσα με. στοιχείο απόκρισης του στο υποστηρικτής TRPC6

η σύνδεση του p53 στην περιοχή ζεύγος 22 βάσεων σε υποκινητή TRPC6 αναλύθηκε κάτω από το

in-vitro

συνθήκες χρησιμοποιώντας EMSA (Εικόνα 3Α). Τα δεδομένα έδειξαν πρόσδεση του ρ53 στο αλληλουχία TRPC6-p53-RE ως μια σαφής μετατόπιση και υπερ-μετατόπιση του συμπλόκου παρατηρήθηκε (λωρίδα 2). Η σύνδεση μεταξύ ρ53 και το στοιχείο απόκρισης του είχε χαθεί κατά πρωτείνη θερμικού μετουσίωσης ρ53 (λωρίδα 3). Η σύνδεση μεταξύ ρ53 και στοιχείου απόκρισης του ήταν πολύ ειδική καθώς μετάλλαξη της αλληλουχίας RE ζεύγος ρ53 22 βάσεων καταργηθεί η δέσμευση μεταξύ ρ53 και RE του (λωρίδα 5-8). Η σύνδεση μεταξύ ρ53 και στοιχείο απόκρισης αυτού στο στοιχείο 5 ‘προαγωγού ρ21 χρησιμεύει ως θετικός έλεγχος (λωρίδα 9-12). Για να ορίσετε περαιτέρω ο ρόλος της TRPC6-p53RE στην επαγωγή TRPC6 p53-μεσολάβηση κάτω από το

in-vivo

συνθήκες, πραγματοποιήσαμε ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης (chip) θα δοκιμασίες σε GaQ

3-επεξεργασμένα κύτταρα MCF-7. Συνεπής με λουσιφεράσης αποτελέσματα, ανιχνεύσαμε ένα συγκεκριμένο προϊόν PCR που προέρχεται από TRPC6-p53RE (Σχήμα 3Β, άνω φωτογραφία). Εισόδου χρησιμεύει ως μάρτυρας, σε περίπτωση απουσίας του GaQ

3 p53 θεραπεία δεν έδειξε σύνδεση με το p53RE στον υποκινητή TRPC6. Κατά την επεξεργασία των κυττάρων MCF-7 με GaQ

3, ρ53 δείχνει σύνδεση προς RE του στον υποκινητή TRPC6, PCR με εκκινητές περιπλεγμένο χρησιμεύει ως αρνητικός έλεγχος. Από την άλλη πλευρά δεν πρόσδεση μεταξύ του ρ53 και p53RE στον υποκινητή TRPC6 παρατηρείται σε Η1299 και PC3 κύτταρα (Σχήμα 3Β, κάτω πάνελ). Αυτά τα αποτελέσματα διαπιστώθηκε ότι η TRPC6-p53RE ήταν υπεύθυνος για την p53 μεσολάβηση επαγωγή της δραστηριότητας TRPC6 υποκινητή και ότι η p53 μεταγραφικά προκαλεί TRPC6 μέσω υποστηρικτής δεσμευτικός ως προς όλα GaQ

3-επεξεργασμένα κύτταρα. Από GaQ

3 επάγει μια εκθετική αύξηση στην ενδοκυτταρική απελευθέρωση ασβεστίου στα κύτταρα του καρκίνου με Wt ρ53 και ρ53 εμφανίζεται τώρα να μεταγραφικά ρυθμίζει την TRPC6 διαύλων ασβεστίου στο GaQ

3-επεξεργασμένα κύτταρα, το ρόλο των TRPC6 στην παρατηρείται p53-μεσολαβούμενη απελευθέρωση ασβεστίου. Flow-κυτταρομετρίας ανάλυση της ενδοκυτταρικής απελευθέρωσης ασβεστίου δείχνει ότι GaQ

3 θεραπεία επάγει μια εκθετική αύξηση στην απελευθέρωση του ενδοκυτταρικού ασβεστίου στην 8

ου hr επώασης του (εικόνα 3D, κόκκινη γραμμή), κατόπιν αποσιώπηση γονιδίου TRPC6 χρησιμοποιώντας TRPC6 siRNA παρατηρήσαμε ότι η 8 ώρες εκθετική αύξηση των ενδοκυτταρικά επίπεδα ασβεστίου αντιστράφηκε και η αύξηση των επιπέδων του ασβεστίου έγινε γραμμική όπως παρατηρήθηκε προηγουμένως σε ρ53 null (Η1299) και ρ53 μεταλλαγμένη (PC3) κύτταρα. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η GaQ

3 επαγόμενη και ρ53-διαμεσολαβούμενη αύξηση στην ενδοκυτταρική απελευθέρωση ασβεστίου οφείλεται στην ρ53-εξαρτώμενη μεταγραφική άνω ρύθμιση του πρωτεΐνης TRPC6 στα επεξεργασμένα κύτταρα καρκίνου.

Α) EMSA διεξάγεται για να μελετήσει τη σύνδεση μεταξύ της p53 και το στοιχείο απόκρισης του στο υποστηρικτής TRPC6 κάτω από το

in-vitro

συνθήκες. Μια μετατόπιση και μια υπερ-μετατόπιση του p53, p53AB και την ρ53-RE παρατηρούνται στην λωρίδα 2. Η σύνδεση μεταξύ ρ53 και RE του χάνεται μετά από μια μεταλλαγμένη αλληλουχία ρ53 RE χρησιμοποιείται για EMSA, δείχνοντας υψηλή ειδικότητα αυτής της αλληλεπίδρασης ( λωρίδα 6), πρόσδεση μεταξύ του ρ53 και των γνωστών p215’RE του χρησιμοποιείται ως έλεγχος (λωρίδα 9-12). (Β) χρωματίνης ανοσοκαθίζηση διεξάγεται σε GaQ

3-κατεργασμένα κύτταρα MCF-7 για να επιβεβαιωθεί

in-vivo

πρόσδεση του ρ53 στο p53RE στον υποκινητή TRPC6. p53 εμφανίζει δεσμευτικό θετικά TRPC6-p53RE αποκλειστικά σε GaQ

κύτταρα 3-θεραπεία. Input χρησιμεύει ως θετικός έλεγχος και κωδικοποιημένα εκκινητές για PCR χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος (n = 5). (Γ) Η σύνδεση μεταξύ TRPC6 και p53 RE δεν παρατηρείται σε Η1299 και PC3 κύτταρα ακόμη και με την παρουσία του GaQ

3 (n = 5). (Δ) Ανάλυση πορεία Χρόνος ενδοκυτταρική απελευθέρωση ασβεστίου παρατηρείται στην GaQ

3-θεραπεία MCF-7 κύτταρα (κόκκινη γραμμή) και GaQ

3-θεραπεία MCF-7 κύτταρα, όπου το γονίδιο TRPC6 έχει σιγήσει χρησιμοποιώντας TRPC6 siRNA ( μαύρη γραμμή). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι GaQ

3 επάγει την απότομη αύξηση της ενδοκυτταρικής απελευθέρωσης ασβεστίου σε ρ53 (+ /+) κύτταρα MCF-7 από 6

ου hr επώασης της. Η αποσιώπηση της TRPC6 καταργεί αυτό το 6

ου αύξηση ώρα στην ενδοκυτταρική απελευθέρωση ασβεστίου (* (κόκκινο) αντιπροσωπεύει σημαντική διαφορά στα αποτελέσματα μεταξύ κόκκινου και μαύρη γραμμή στο 8

ου χρόνου hr σημείο, σ & lt? 0.029) , n = 5, ANOVA, μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SD).

η

TRPC6 επάγει εξαρτώμενη από ασβέστιο απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα

Αναλύσαμε περαιτέρω τη φυσιολογική σημασία αυτής της p53-εξαρτώμενη ρύθμιση του έκφραση TRPC6 και τα ενδοκυτταρικά επίπεδα ασβεστίου. Από το p53 είναι ένας βασικός παράγοντας στην διέπουν την κυτταρική αποπτωτικών στρατηγικές σε καρκινικά κύτταρα. Υποθέσαμε ότι η ρ53-εξαρτώμενη έκφραση TRPC6 μπορούσε να είναι ένα άλλο κυτταρικό μονοπάτι μέσω του οποίου θα μπορούσε να ρ53 διεγείρουν απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα. Έτσι, το αποτέλεσμα της έκφρασης TRPC6 στην κυτταρική απόπτωση αναλύθηκε σε κύτταρα άγριου τύπου ρ53 (MCF-7, U2OS, HCT ρ53 (/+) +), κύτταρα ρ53 μεταλλαγμένη (Α-43, PC3) και ρ53 null κύτταρα (Η1299) . Αυτές οι κυτταρικές γραμμές εκτοπικά εκφραζόμενη με TRPC6 cDNA (Σχήμα 4α) και την κυτταρική απόπτωση συγκρίθηκε με τον έλεγχο (μη-επιμολυσμένα κύτταρα) κύτταρα χρησιμοποιώντας χρώση αννεξίνης-ν και το κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική αύξηση στην αποπτωτική κλάσμα των TRPC6 υπερεκφράζουν καρκινικά κύτταρα, ανεξάρτητα από την κατάσταση του γονιδίου ρ53. Στη συνέχεια παρατηρήσαμε το ρόλο του ενδοκυτταρικού ασβεστίου σε TRPC6 απόπτωση που διαμεσολαβείται από σβέση ενδοκυτταρική απελευθέρωση ασβεστίου μέσω ΤΜΒ-8. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σβέση της ενδοκυτταρικής απελευθέρωσης ασβεστίου μέσω ΤΜΒ-8 καταργήθηκε TRPC6 διαμεσολαβείται απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα. Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι η TRPC6-εξαρτώμενη αύξηση στην ενδοκυτταρική απελευθέρωση ασβεστίου ήταν κρίσιμη για την απόπτωση, έτσι η ρ53-εξαρτώμενη αύξηση στην έκφραση TRPC6 σε καρκινικά κύτταρα μπορεί να είναι μια στρατηγική για να επάγει απόπτωση μέσω οδών ασβεστίου με μεσολάβηση. Αυτό μπορεί να είναι ένα άλλο κυτταρικό μονοπάτι που εγκρίθηκε από p53 να προκαλέσει την αποπτωτική απόκριση και λειτουργούν ως το πρωταρχικό ογκοκατασταλτικό μόριο σε καρκινικά κύτταρα. Αυτά τα δεδομένα ορίζει TRPC6 ως πιθανή πρωτεΐνη αποπτωτικών οποία στο μέλλον θα μπορούσε να σπείρει το δυναμικό να λειτουργεί ως μόριο γονίδιο-αντικαρκινική θεραπεία. Για να κατανοήσουμε TRPC6 επαγόμενη απόπτωση σε λεπτομέρειες παρατηρήσαμε την ενεργοποίηση και καταστολή της ένα βασικό σύνολο 84 γονιδίων (SA-Bio επιστήμες, PAHS012) που εμπλέκεται και στην επαγωγή και την αναστολή της απόπτωσης. Η ανάλυση της έκφρασης του mRNA των γονιδίων αυτών διεξήχθη σε κύτταρα άγριου τύπου ρ53 (MCF-7, U2OS, HCT ρ53 (+ /+)), κύτταρα ρ53 μεταλλαγμένη (Α-43, PC3) και κύτταρα ρ53 null (Η1299) (Σχήμα 4β). Στην πειραματική διάταξη τα κύτταρα αυτά υπερεκφράζεται με τον αποπτωτικό cDNA TRPC6. Τα αποτελέσματα ήταν συνεπή σε όλες τις κυτταρικές σειρές και έδειξε ότι TRPC6 υπερέκφραση είχε ως αποτέλεσμα την αρνητική ρύθμιση των γονιδίων που εμπλέκονται στην αναστολή της απόπτωσης και αυξητικά τα γονίδια που εμπλέκονται στην επαγωγή κυτταρικής απόπτωσης (Εικόνα 4β (λωρίδα 1, 5, 7, 8, 11 & amp? 12)). Είναι ενδιαφέρον ότι, κατά την έκτοπη έκφραση της TRPC6 cDNA σε καρκινικά κύτταρα, όπου το ενδοκυτταρικό ασβέστιο σβήστηκε μέσω ΤΜΒ-8 αγωγή, το πρότυπο έκφρασης γονιδίου μεταβλήθηκε και οι εκφράσεις των γονιδίων που εμπλέκονται στην κυτταρική απόπτωση ήταν σταθερά χαμηλή (Σχήμα 4β (λωρίδα 17, 18 , 19, 20, 22 & amp? 24)). Η θεραπεία με δοξορουβικίνη, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος, είχε σαν αποτέλεσμα προς τα πάνω ρύθμιση των γονιδίων που εμπλέκονται στην απόπτωση (Σχήμα 4β (λωρίδα 2, 3, 4, 6, 9 & amp? 10)). Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα καρκίνου χρησιμεύουν ως έλεγχοι (Σχήμα 4β (λωρίδα 13, 14, 15, 16, 21 & amp? 23)). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι TRPC6 προκαλεί απόπτωση μέσω αύξησης των ενδοκυτταρικών επιπέδων του ασβεστίου και μέσω αυτής της οδού μεταβάλλει την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στην απόπτωση, υποδηλώνοντας ότι η TRPC6 είναι ένας πιθανός υποψήφιος για προ-αποπτωτικών στρατηγικές αντι-καρκίνου. Αυτή η νέα μοριακή οδό μέσω της οποίας ρ53 κατά την ενεργοποίηση από GaQ

3 ρυθμίζει μεταγραφικά την έκφραση της προ-αποπτωτικών κανάλι TRPC6 ασβεστίου, το οποίο με τη σειρά του προκαλεί ασβέστιο-μεσολαβούμενη απόπτωση είναι μια ενδιαφέρουσα στρατηγική που υιοθετήθηκε από το ρ53 να λειτουργήσει ως καταστολέας όγκου. Περαιτέρω, αυτή η οδός μπορεί να αξιοποιηθεί για να αποκτήσουν τα οφέλη αντικαρκινικά στο μέλλον.

Α) Η επίδραση της TRPC6 υπερ-έκφραση παρατηρείται κατά την κυτταρική απόπτωση σε κύτταρα άγριου τύπου ρ53 (MCF-7, U2OS, ρ53 HCT (+ /+)), κύτταρα ρ53 μεταλλαγμένη (Α-431, PC3) και μηδενικά κύτταρα p53 (Η1299) χρησιμοποιώντας χρώση αννεξίνης-ν και το κυτταρομετρία ροής. Σημαντική αύξηση σε αποπτωτική κλάσμα TRPC6 υπερ-εκφράζοντα κύτταρα παρατηρείται ανεξάρτητα από την κατάσταση ρ53 γονίδιο. Ενδοκυτταρική σβέσης ασβεστίου μέσω ΤΜΒ-8 καταργεί TRPC6-απόπτωση? μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμεύει ως αρνητικός έλεγχος, δοξορουβικίνη χρησιμεύει ως θετικός έλεγχος (* αντιπροσωπεύει σημαντική διαφορά μεταξύ κυττάρων TRPC6 επεξεργασμένα και TRPC6 επεξεργασμένο και ΤΜΒ-8-κατεργασμένων κυττάρων? όλες τις τιμές ρ & lt? 0,05, η = 7? Τ.Α, ANOVA). (Β) TRPC6 επάγει την έκφραση των αποπτωτικών γονιδίων σε καρκινικά κύτταρα. συστοιχίας γονιδίων PCR για γονίδια που εμπλέκονται στη ρύθμιση της κυτταρικής απόπτωσης διεξάγεται σε TRPC6 cDNA επιμολυσμένα ρ53 κύτταρα άγριου τύπου (MCF-7, U2OS, HCT ρ53 (+ /+)), κύτταρα ρ53 μεταλλαγμένη (Α-431, PC3) και p53 null κύτταρα κύτταρα (Η1299). Υπερ-έκφραση των TRPC6 οδηγεί σε μειορύθμιση των γονιδίων αναστέλλουν την απόπτωση και αυξητική ρύθμιση των προ-αποπτωτικών γονιδίων (λωρίδα 1, 5, 7, 8, 11 & amp? 12). Η ενδοκυτταρική σβέσης ασβέστιο σε TRPC6 υπερεκφράζουν αποτελέσματα κυττάρου σε αναστολή των αποπτωτικών gens και αύξηση στην έκφραση των αντι-αποπτωτικών γονιδίων (λωρίδα 17, 18, 19, 20, 22 & amp? 24). Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμεύουν επίσης ως έλεγχοι (λωρίδα 13, 14, 15, 16, 21 & amp? 23)? θεραπεία doxorubicin χρησιμεύει ως θετικός έλεγχος που οδηγεί σε προς τα πάνω ρύθμιση των γονιδίων που εμπλέκονται στην απόπτωση (λωρίδα 2, 3, 4, 6, 9 & amp? 10). (n = 10)

Η

Συζήτηση

στην παρούσα ερευνητική εργασία έχουμε αποδείξει ότι η ενδοκυτταρική απελευθέρωση ασβεστίου είναι υπό τον έλεγχο μεταγραφής του καταστολέα όγκου ρ53, μέσω ρ53-εξαρτώμενη μεταγραφική ρύθμιση του γονιδίου TRPC6. Γονιδίωμα ευρεία ανάλυση των θέσεων δέσμευσης ρ53 στις περιοχές υποκινητή των διαύλων ασβεστίου έδειξαν παρουσία της ρ53 RE σε γονιδιακή TRPC6. Δείξαμε ότι GaQ3 επάγει την έκφραση του TRPC6 μόνο σε καρκινικά κύτταρα με φυσικού τύπου ρ53 και ρ53 γονίδιο σίγηση αντιστρέφει την GaQ3 επαγόμενη αύξηση στην έκφραση TRPC6. Αυτά τα δεδομένα ορίζει επίσης ότι TRPC6 είναι ένας άμεσος μεταγραφικός στόχος της ρ53 και ρ53 δεσμεύεται με το στοιχείο απόκρισης του στον υποκινητή TRPC6. Έχουμε βρει την θέση δέσμευσης ρ53 στο γονίδιο υποκινητή Kb TRPC6 0.6 το οποίο βρίσκεται 400 ζεύγη βάσεων ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής 1. Η ξαφνική αύξηση του ενδοκυτταρικού ασβεστίου και απελευθέρωσης ασβεστίου-προκαλούμενης κυτταρικής απόπτωσης σε GaQ

3-αγωγή καρκινικά κύτταρα οφείλεται σε ρ53-εξαρτώμενη μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου TRPC6. Σε αυτό το ερευνητικό έργο που έχουμε δείξει άμεση σχέση μεταξύ της ικανότητας ρ53 μεταγραφής και σηματοδότησης ασβεστίου.

Η κατανόηση της σχέσης μεταξύ της σηματοδότησης ασβεστίου και p53 είναι σημαντικό στην προοπτική του καρκίνου καθώς και οι δύο αυτοί παράγοντες ρυθμίζουν την κυτταρική ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση, τη γήρανση , πολλαπλασιασμός στο φυσιολογικό, κυτταρικό και μοριακό επίπεδο [12], [13]. Στο παρελθόν ένα Ca

2 + διαπερατοί στα κανάλια trpC έχει αποδειχθεί ότι συμμετέχουν σε μία ποικιλία κυτταρικών λειτουργιών με τη ρύθμιση ενδοκυτταρικού Ca

2 + σηματοδότησης [14]. TRPC6 μεσολάβηση Ca

2+ σηματοδότηση ενεργοποιεί γονίδιο του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, όπως καλμοδουλίνη πρωτεϊνική κινάση και ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεϊνική κινάση [15]. Ο ρόλος των TRPC6 στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου δεν είναι σαφές? Ωστόσο πολλαπλούς μηχανισμούς εμπλέκονται στην ενεργοποίηση του καναλιού TRPC6 και ρύθμιση σε καρκινικά κύτταρα. Οι φυσιολογικές και κυτταρικών παραγόντων που εμπλέκονται στην εξέλιξη της ασθένειας του καρκίνου είναι επίσης γνωστό ότι ρυθμίζει την έκφραση κυτταρικής TRPC6 [16] – [20]. Οι κυτταρικοί παράγοντες όπως η ενεργοποίηση του υποδοχέα της μεμβράνης μέσω TFN-α και Ca

2+ εξάντληση κυτταρική κατάστημα που εμπλέκονται στην εξέλιξη του καρκίνου είναι γνωστό ότι επάγουν την έκφραση TRPC6 [16] – [20]. Πρόσφατα ο ρόλος ενός σημαντικού μορίου σηματοδότησης ROS στην ενεργοποίηση TRPC6 παρατηρείται [18]. Από ROS εμπλέκεται τόσο την εξέλιξη του καρκίνου και της ρύθμισής της, έτσι είναι σημαντικό να προσδιορίσει το ρόλο της πρωτεΐνης TRPC6 στην ανάπτυξη της ασθένειας του καρκίνου ή κανονισμού. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι διάφορα προ-αποπτωτικά παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των μελών της οικογένειας πρωτεϊνών Bcl-2 και αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) ρυθμίζουν την Ca

2+ ευαισθησία τόσο του Ca

2+ κανάλια απελευθέρωση στο ER και τα μιτοχόνδρια [21]. Περαιτέρω δεν υπάρχουν δεδομένα που αφορούν την σχέση μεταξύ της ογκοκατασταλτικό ρ53 και ρύθμιση του ασβεστίου σηματοδότησης μεταγραφική ρύθμιση της γονιδιακής TRPC6 σε καρκινικά κύτταρα είναι διαθέσιμα. Είναι σημαντικό να προσδιοριστεί η σχέση μεταξύ της p53 και ελέγχου της ενδοκυτταρικής απελευθέρωσης ασβεστίου και το ρόλο που διαδραματίζει η γονιδιακή TRPC6 στο GaQ

3-θεραπεία καρκινικών κυττάρων. Η ρ53 και TRPC6 επάγεται δεδομένου ότι οι αλλαγές στο κυτοσολικό συγκεντρώσεις Ca

2+ μπορεί να προκαλέσει οδούς που ρυθμίζουν ένα ευρύ φάσμα κυτταρικών γεγονότων, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που είναι σημαντικές στην ογκογένεση [21] σηματοδότησης.

Περαιτέρω μια νέα σχέση μεταξύ του ενδοκυτταρικού Ca

παρατηρήθηκε απελευθέρωση και p53 2+ όπου Ca

2+ απελευθέρωση σταθεροποιηθεί η σύνδεση του p53 σε μεταγραφικό συνενεργοποιητή p300 και επίσης σταθεροποιηθεί η δέσμευση του συγκρότημα μεταγραφική p53-P300 με το p53-DNA θέση δέσμευσης της p53-ελάχιστο προαγωγέα [22]. Στην παρούσα ερευνητική εργασία που έχουμε διασαφηνιστεί η παρουσία ενός κυτταρικού cross-talk μεταξύ ρ53 και σηματοδότηση ασβεστίου, όπου σηματοδότηση ασβέστιο ενεργοποιεί την ρ53 μεταγραφικά [6] και το δραστικό ρ53 αυξάνουν την ενδοκυτταρική απελευθέρωση ασβεστίου από μεταγραφικά ρύθμιση του υποκινητή του γονιδίου TRPC6. Έτσι ασβέστιο-εξαρτώμενη απόπτωση μπορεί να προκαλούνται από ρ53 και ασβέστιο σηματοδότηση μπορεί να παίξει κρίσιμο ρόλο στην ρ53 απόπτωση που διαμεσολαβείται. Πρόσφατα γονίδιο TRPC6 έχει δείξει σημαντικό ρόλο στην παθολογική καρδιακή υπερτροφία και την αναδιαμόρφωση σε απάντηση στο στρες [23], [24]. Διαγραφή των TRPC6 εμποδίζει το στρες που προκαλείται από υπερβολική καρδιακή αναδιαμόρφωση και η υπερέκφραση του TRPC6 αναπτύσσουν αυθόρμητη καρδιακή υπερτροφία στο μοντέλο ποντικών, προτείνοντας προς μια πιθανή σχέση μεταξύ της έκφρασης TRPC6 και κυτταρικό θάνατο και διαίρεση, δεδομένου ότι η καρδιακή αναδιαμόρφωση περιλαμβάνει και τις δύο αυτές διαδικασίες. έκφραση TRPC6 είναι επίσης γνωστό ότι επάγει ποδοκυττάρου κυτταροσκελετική αναδιαμόρφωση [25], τα ανθρώπινα διαφοροποίηση των κερατινοκυττάρων [26], και του ιππόκαμπου διαφοροποίηση νευρώνα [27]. Ένας σημαντικός ρόλος της TRPC6 Έχει επίσης ανακαλυφθεί στην επούλωση των πληγών, όπου ένα γονιδίωμα-ευρεία οθόνη προσδιορίζονται TRPC6 σημαντικό για μετασχηματισμό μυοϊνοβλάστη και ποντικούς γονίδιο-διαγράφεται TRPC6 έδειξαν εξασθενημένη δερματική και καρδιακής επούλωση τραύματος μετά από τραυματισμό. Οι προηγούμενες εκθέσεις δείχνουν προς μια σύνδεση μεταξύ της έκφρασης TRPC6 και ρύθμιση των διαδικασιών που σχετίζονται κυτταρικής διαίρεσης και κυτταρικό θάνατο, σε αυτή την έκθεση που υποδηλώνει μια ισχυρή ρόλο του TRPC6 ως p53-ρυθμίζεται προ-αποπτωτική πρωτεΐνη στο μοντέλο καρκίνου. Εν κατακλείδι, εδώ έχουμε διαλευκανθεί ένα νέο ρόλο του TRPC6 διαύλου ασβεστίου για να λειτουργήσει ως ρ53 κατάντη πρωτεΐνη τελεστή η οποία επάγει την απόπτωση με τη ρύθμιση κυτταρικών επιπέδων ασβεστίου στα καρκινικά κύτταρα. Αυτή η οδός φαίνεται να είναι ένα στρατηγική που υιοθετήθηκε από πρωτεΐνη ρ53 να χρησιμοποιήσει σηματοδότηση ασβέστιο ως μέσο μια αποτελεσματική προ-αποπτωτικών αντικαρκινική με μεταγραφικά ρύθμιση TRPC6 διαύλων ασβεστίου, έτσι χρησιμοποιώντας TRPC6 ως πιθανός μηχανισμός για να λειτουργήσει ως καταστολέας όγκου.

Υποστήριξη Πληροφορίες

αρχείου S1.

Συμπληρωματικό υλικό και τις μεθόδους

doi:. 10.1371 /journal.pone.0071016.s001

(DOC)