Αφηρημένο

φορμόλη-σταθερό, έχει εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) ιστών είναι μια πολύτιμη πηγή για την κλινική έρευνα. Ωστόσο, τα νουκλεϊκά οξέα που προέρχονται από ιστούς FFPE είναι κατακερματισμένες και χημικά τροποποιημένα που τους καθιστά δύσκολο να χρησιμοποιήσετε σε μοριακές μελέτες. Αναλύσαμε 23 φρέσκο ​​κατεψυγμένο (FF), 35 FFPE και 38 ζεύγη δειγμάτων FF /FFPE, που αντιπροσωπεύουν έξι διαφορετικούς τύπους ανθρώπινων ιστών (ουροδόχου κύστης, του προστάτη και καρκίνωμα παχέος εντέρου? Ήπατος και του παχέος εντέρου φυσιολογικό ιστό? Αντιδραστική αμυγδαλής), προκειμένου να εξεταστεί η πιθανή χρήση των δειγμάτων FFPE σε αλληλούχιση επόμενης γενιάς (NGS) με βάση αναδρομικές και προοπτικές κλινικές μελέτες. Δύο μέθοδοι για το DNA και τρεις μεθόδους για εξαγωγή RNA από ιστούς FFPE συγκρίθηκαν και βρέθηκαν να επηρεάζουν την ποσότητα του νουκλεϊκού οξέος και την ποιότητα. DNA και RNA από επιλεγμένες FFPE και ζεύγη δειγμάτων FF /FFPE χρησιμοποιήθηκαν για exome και ανάλυση μεταγραφικό. Παρασκευάσματα DNA βιβλιοθηκών exome-Seq ήταν πιο δύσκολο (29,5% επιτυχία) από εκείνη του RNA-Seq βιβλιοθήκες, πιθανώς λόγω των τροποποιήσεων FFPE ιστούς που προέρχεται από DNA. Οι βιβλιοθήκες θα μπορούσαν ακόμα να παρασκευαστεί από RNA που απομονώθηκε από δύο δεκαετία παλιά ιστούς FFPE. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση του CLC Bio Genomics Πάγκος εργασίας και αποκάλυψε συστηματικές διαφορές μεταξύ των βιβλιοθηκών FFPE ιστούς που προέρχεται από νουκλεϊκό οξύ FF και. Παρά το γεγονός αυτό, κατά ζεύγη ανάλυση του DNA exome-Seq δεδομένων έδειξε συμφωνία για το 70-80% των παραλλαγών σε FF και δείγματα FFPE αποθηκεύονται για λιγότερα από τρία έτη. δεδομένα RNA-Seq έδειξε υψηλή συσχέτιση του προφίλ έκφρασης σε ζεύγη FF /FFPE (Pearson Συσχετίσεις 0,90 +/- 0,05), ανεξαρτήτως του χρόνου αποθήκευσης (μέχρι 244 μήνες) και τον τύπο ιστού. Ένα κοινό σύνολο 1.494 γονίδια που ταυτίστηκε με προφίλ έκφρασης που ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ ζεύγη δειγμάτων FF και FFPE ανεξάρτητα από τον τύπο ιστού. Τα αποτελέσματά μας είναι ενθαρρυντικά και δείχνουν ότι η NGS μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη δείγματα FFPE και στις δύο προοπτικές και αναδρομικές μελέτες αρχείο που βασίζεται στην οποία τα δείγματα FF δεν είναι διαθέσιμα

Παράθεση:. Hedegaard J, K Thorsen, Lund ΜΚ, Hein Α-MK, Hamilton-Ντυτουά SJ, Βανγκ S, et al. (2014) Next-Generation αλληλουχίας του RNA και DNA που απομονώθηκε από Paired Φρέσκο-κατεψυγμένα και φορμόλη-Σταθερή εμπεδωθεί με παραφίνη Δείγματα Ανθρώπινου Καρκίνου και του φυσιολογικού ιστού. PLoS ONE 9 (5): e98187. doi: 10.1371 /journal.pone.0098187

Επιμέλεια: Zhuang Ζούο, UT MD Anderson Cancer Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 14 Μαρτίου, 2014? Αποδεκτές: 10 Απριλίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: May 30, 2014

Copyright: © 2014 Hedegaard et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Η πρόσβαση στα δεδομένα ακολουθία, η οποία περιέχει άτομο προσδιορισμό των πληροφοριών, χρειάζεται υπογραφή σε μια ελεγχόμενη μορφή πρόσβασης, και μπορεί να έχει πρόσβαση σε ευρωπαϊκό Γονιδιώματος-phenome Αρχείο [25] χρησιμοποιώντας το αναγνωριστικό μελέτη EGAS00001000737 μετά από αίτημα προς την Επιτροπή για την πρόσβαση δεδομένων ΜΟΜΑ. μήτρες έκφρασης είναι διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς, μέσω ArrayExpress [REF: www.ebi.ac.uk/arrayexpress] υπό ένταξη:. E-mtab-2523

Χρηματοδότηση: Το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από τη δανική Εθνική Advanced Technology Ίδρυμα (https://hoejteknologifonden.dk/), Ο John και η Birthe Ίδρυμα Meyer και η δανική Εταιρεία Καρκίνου (https://www.cancer.dk/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Anne-Mette Κ Hein και Bjarne Knudsen απασχολούνται από CLC bio, το οποίο είναι μια εταιρεία QIAGEN. Mette Katrine Lund και Mogens Kruhøffer απασχολούνται από AROS Εφαρμοσμένη Βιοτεχνολογία. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις πολιτικές PLoS ONE για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

φορμόλη-σταθερές, (FFPE) δείγματα ιστού σε παραφίνη ενσωματωμένο αποθηκεύονται σε διαγνωστικές αρχεία παθολογία αντιπροσωπεύουν ένα ανεκτίμητο βιοτράπεζα για την αναδρομική κλινική έρευνα. Επιπλέον, τα δείγματα FFPE μπορεί να είναι χρήσιμη σε προοπτικές μελέτες παραλείποντας τη συλλογή των νωπών-κατεψυγμένων (FF) δείγματα. Δυστυχώς, τα νουκλεϊκά οξέα είναι πιο δύσκολο να εξαχθούν από FFPE ιστούς λόγω της ανάγκης για την απομάκρυνση της παραφίνης και για την εξουδετέρωση ομοιοπολικών αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-ΟΝΑ που προκύπτουν από τη διαδικασία στερέωσης. Επιπλέον, καθυστέρηση στερέωση (δηλ περιεγχειρητική ισχαιμικό ώρα), η διαδικασία στερέωσης, η προετοιμασία του ιστού, εμβάπτιση σε παραφίνη, και αρχειακή αποθήκευση συμβάλλουν στον κατακερματισμό, εγκάρσια σύνδεση και χημική τροποποίηση της FFPE ιστούς που προέρχονται από νουκλεϊκά οξέα. Οι αλλαγές αυτές παρεμβαίνουν με πολλές κλασικές μοριακές αναλύσεις που απαιτούν υψηλή ποιότητα νουκλεϊκά οξέα. Οι πρόοδοι στην αλληλούχιση επόμενης γενιάς (NGS) τεχνολογίες επιτρέπουν την έρευνα των γονιδιωμάτων, epigenomes και transcriptomes χρησιμοποιώντας περιορισμένο δείγμα υλικού. Επιπλέον, η ανάλυση αυτή μπορεί να γίνει με σχετικά μικρό κόστος, λαμβάνοντας υπόψη την τεράστια αύξηση στην ποσότητα των πληροφοριών που μπορούν να ληφθούν. Η δύναμη της NGS για να αναλύσει σε βάθος μεγάλο αριθμό σύντομες ακολουθίες ενδεχομένως καθιστά ιδανική τεχνολογία για να εφαρμόσει τις συνήθως αποσπασματικές νουκλεϊκά οξέα που μπορεί να εξαχθεί από δείγματα FFPE. Η ανάπτυξη αξιόπιστων μεθόδων NGS με βάση για χρήση με χαμηλής ποιότητας FFPE ιστούς που προέρχονται από τα νουκλεϊκά οξέα θα ανοίξει τα διαγνωστικά αρχεία παθολογία σε υψηλής απόδοσης χαρακτηριστικών, διευκολύνοντας εκτεταμένες αναδρομικές κλινικές μελέτες. Ομοίως, η δυνατότητα να χρησιμοποιηθούν τα δείγματα FFPE για μοριακή ανάλυση σε προοπτικές μελέτες θα είναι μεγάλο όφελος, με πιθανώς μειώνοντας ή ακόμα και εξαλείφοντας την ανάγκη για την επίπονη συλλογή και αποθήκευση κρυοσυντηρημένα κλινικά δείγματα.

Αν και τα νουκλεϊκά οξέα που απομονώθηκαν από FFPE ιστούς έχουν προηγουμένως μελετηθεί κυρίως χρησιμοποιώντας PCR- και μεθόδων που βασίζεται σε μικροδιάταξη, υπάρχουν αναφορές τώρα σχετικά με την εφαρμογή της NGS στο υλικό FFPE. Ένα από τα πρώτα προήλθε από Schweiger

et al.

Που ανέφεραν NGS-based ανάλυση του DNA (DNA-Seq) απομονώθηκαν από δείγματα FFPE [1]. Οι συγγραφείς βρήκαν μια καλή συσχέτιση μεταξύ συμφωνημένα FF και FFPE δείγματα καρκίνου του μαστού από έναν ασθενή κατά την ανάλυση του γονιδιώματος σε επίπεδο αριθμού αντιγράφων αλλαγές και τις συχνότητες παραλλαγή βασίζεται σε χαμηλή κάλυψη αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος [1]. Στη συνέχεια, Ξύλο

et al.

Συνδυασμένη συγκέντρωση των δειγμάτων και μείωση στην ποσότητα του DNA εισόδου για τη μελέτη του γονιδιώματος σε επίπεδο αριθμού αντιγράφων μεταβολές στα δείγματα FFPE [2]. Ένα επιπλέον χαρτί από την ομάδα Schweiger έδειξε ότι οι μελέτες της γονιδιωματικής παραλλαγές με βάση την αλληλούχιση του DNA από FFPE ιστού επωφελήθηκαν από την αύξηση της κάλυψης λαμβάνεται χρησιμοποιώντας στοχευμένες επανεύρεση της αλληλουχίας, τη μείωση των επιπτώσεων της στερέωσης προκαλείται από το θόρυβο [3]. Πρόσφατα, Tuononen

et al.

Εφαρμόζονται στοχεύουν επανεύρεση της αλληλουχίας του DNA για τον έλεγχο FFPE μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα για κλινικά σημαντική

EGFR

,

KRAS

και

BRAF

μεταλλάξεις και βρήκε μια σημαντική συσχέτιση με τα αποτελέσματα της PCR πραγματικού χρόνου αναλύσεων που βασίζονται εκτελούνται παράλληλα [4]. Spencer

et al.

Εφαρμόζεται στοχευμένη επανεύρεση της αλληλουχίας των γονιδίων που σχετίζονται με τον καρκίνο 27 έως 16 FF /FFPE ζεύγη αδενοκαρκινώματα πνεύμονα και διαπίστωσε, ότι παρά την αποδεδειγμένη αποτελέσματα της διαδικασίας στερέωσης, πανομοιότυπα παραλλαγές single-νουκλεοτίδιο θα μπορούσε να ανιχνευθεί αξιόπιστα [ ,,,0],5]. Fanelli

et al.

Ανέφεραν μία μέθοδο προσδιορισμού αλληλουχίας υψηλής απόδοσης για επιγενετικές προφίλ που βασίζονται στην τεχνολογία chip-seq, δείγματα FFPE από ένα μοντέλο λευχαιμίας ποντικού και από ένα περιορισμένο φάσμα ανθρώπινων καρκίνων (μία σεμίνωμα και έξι καρκινώματα μαστού) , που επιτρέπουν την ανάλυση των τροποποιήσεων ιστονών και δέσμευσης παράγοντα μεταγραφής σε μια κλίμακα γονιδιώματος σε επίπεδο [6], [7]. Gu

et al.

[8], [9] έδειξε ότι ανέρχεται χαμηλών εισροών FFPE ιστούς που προέρχεται από DNA θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί μαζί με μειωμένη αναπαράσταση διθειώδες αλληλουχίας (RRBS) για να επιτρέπει τις μελέτες του προφίλ μεθυλίωσης του DNA γονιδιώματος εμβέλειας σχετικά αρχειακό κλινικά δείγματα.

Weng

et al. ήταν

ένας από τους πρώτους για να περιγράψει NGS με βάση την ανάλυση του RNA (RNA-Seq) απομονώθηκαν από δείγματα FFPE [10]. Αυτοί οι συγγραφείς ανέφεραν συγκρίσιμα αποτελέσματα έκφρασης από το βαθύ αλληλουχίας των miRNAs προέρχονται από ζεύγη FF και καρκινώματα νεφρικών κυττάρων FFPE. Επιπλέον, βρήκαν μια υψηλή συσχέτιση σύγκριση των αποτελεσμάτων των NGS με εκείνα που ελήφθησαν παράλληλα με τη χρήση μικροσυστοιχιών και μεθοδολογίες RT-PCR. Πρόσφατα, Meng

et al.

Ανέφεραν την επιτυχή εφαρμογή των απολίνωση με βάση αλληλουχίας miRNA σε δείγματα καρκίνου αποθηκεύονται μέχρι 9 ετών [11]. Ενώ είναι γνωστό από μελέτες χρησιμοποιώντας παραδοσιακές μοριακές τεχνικές που μικρότερα μόρια RNA όπως miRNA είναι καλύτερα σε θέση να αντέξει στερέωση με φορμαλίνη [12], υπάρχει μια γενική προσδοκία ότι πλέον τα μόρια RNA είναι πιθανό να είναι πιο επιρρεπείς σε κατακερματισμό και τροποποιήσεις, καθιστώντας έτσι τους φτωχούς πρότυπα για RNA-Seq. Μια NGS με βάση τη μελέτη των πλέον μορίων RNA έχει αναφερθεί από Sinicropi

et al.

Ο οποίος διαπίστωσε ότι τα δεδομένα RNA-Seq προέρχεται από FFPE καρκίνους πρωταρχικό του μαστού ήταν επαρκούς ποιότητας για να μπορέσει ανακάλυψη βιοδεικτών [13]. Adiconis

et al.

Ανέφεραν μια συγκριτική ανάλυση των πέντε μεθόδων RNA-Seq εφαρμόζεται σε χαμηλής ποιότητας RNA (όπως αυτή που απομονώθηκε από FFPE ιστούς) και χαμηλής ποσότητας RNA [14]. Πρόσφατα, το Norton

et al.

Εφαρμόζεται RNA-Seq σε εννέα σειρές δείγματα όγκων του μαστού FF και FFPE αποθηκεύονται για μέχρι τέσσερα χρόνια και βρήκε καλή συσχέτιση μεταξύ των ζεύγη προφίλ έκφρασης FF και FFPE [15].

Θα επεκταθώ σε αυτές τις μελέτες όσον αφορά τον αριθμό και την ποικιλία των ανθρώπινων δειγμάτων διερευνηθεί και εκθέσεις μια συστηματική ανάλυση των δυνατοτήτων χρήσης NGS με βάση το προφίλ του ανθρώπινου δείγματα FFPE σε αναδρομικές και προοπτικές κλινικές μελέτες. Η μελέτη μας περιλαμβάνει (1) την αξιολόγηση των διαφορετικών στρατηγικών απομόνωση των νουκλεϊκών οξέων από ανθρώπινα δείγματα FFPE και ταιριάζουν FF και δείγματα FFPE? (2) την προετοιμασία των στοχευμένων γονιδιώματος (DNA exome-Seq) και ολόκληρο το μεταγραφικό (RNA-Seq) βιβλιοθήκες αλληλουχίας? και (3) σε βάθος ανάλυση των δεδομένων που λαμβάνονται NGS. Οι πρωταρχικοί στόχοι ήταν να προσδιορίσει και να χαρακτηρίσει συστηματικές επιδράσεις της διαδικασίας στερέωσης για τα επιτευχθέντα αποτελέσματα, καθώς και κρίσιμων παραμέτρων στη ροή εργασίας από χειρουργική επέμβαση για να αναλυθούν τα δεδομένα NGS. Διαθέσιμα κιτ εκχύλισης αξιολογήθηκαν σε σχέση με τον καθαρισμό του RNA και του DNA από επιλεγμένες ανθρώπινα δείγματα FFPE (φυσιολογικό ήπαρ, καρκίνωμα του ήπατος, αντιδραστική αμυγδαλές, καρκίνωμα του πνεύμονα, καρκίνωμα του μαστού, φυσιολογικό δέρμα από στήθος, και καρκίνωμα κύστης? Με το ταίριασμα δείγματα FF από το ήπαρ και δείγματα αμυγδαλών). Αυτό ακολουθήθηκε από αξιολόγηση της εκχυλίσεως του RNA και του DNA από ανθρώπινα δείγματα FFPE (ορθοκολικό καρκίνωμα, φυσιολογικό ήπαρ, καρκίνωμα της ουροδόχου κύστης, και αμυγδαλής) με διαφορετικές ρουτίνα αρχειακό χρόνους αποθήκευσης (έως 244 μήνες). Τέλος, DNA και RNA εκχυλίστηκαν από ταιριάζουν FF και τα ανθρώπινα δείγματα FFPE (ουροδόχου κύστης, του προστάτη και του παχέος εντέρου καρκινώματα καθώς και από φυσιολογικό ιστό του κόλου). Εκχυλίσματα DNA και RNA χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή των στοχευμένων γονιδιώματος (DNA exome-Seq) και ολόκληρο μεταγραφικό (RNA-Seq) βιβλιοθήκες αλληλουχίας και δεδομένα NGS ελήφθη αναλύθηκε, με επίκεντρο την ανακάλυψη της συστηματικής επιπτώσεις της διαδικασίας στερέωσης.

Μέθοδοι και Υλικά