Αφηρημένο

Η ακτινοθεραπεία είναι μια σημαντική μορφή θεραπείας για τον καρκίνο του στόματος. Ωστόσο, η ανάπτυξη του ραδιοαντοχή είναι ένα σημαντικό εμπόδιο στην αποτελεσματικότητα της ακτινοθεραπείας σε ασθενείς με καρκίνο του στόματος. Ο εντοπισμός πρόβλεψης της ραδιοαντοχή είναι ένα δύσκολο έργο και έχει συναντήθηκε με μικρή επιτυχία. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει τη διαφορική φασματικά χαρακτηριστικά των καθιερωμένων sublines ακτινοανθεκτικά και γονικής καρκίνο του στόματος κυτταρικές σειρές με φασματοσκοπία Raman. Έχουμε καθιερώσει sublines ακτινοανθεκτικά δηλαδή, 50Gy-UPCI: SCC029B και 70Gy-UPCI: SCC029B από τη γονική της UPCI: κυτταρική σειρά SCC029B, χρησιμοποιώντας κλινικά παραδεκτή 2Gy κλασματώνεται ιονίζουσας ακτινοβολίας (FIR). Η αναπτυχθείσα ραδιοανθεκτικά χαρακτήρας ελέγχθηκε με δοκιμασία κλωνογονικής επιβίωσης κυττάρου και είναι γνωστό πρωτεϊνικών δεικτών ραδιοαντοχή σχετίζονται όπως Mcl-1, Bcl-2, COX-2 και Σουρβιβίνης. Παρατηρήθηκε στον αριθμό των filopodia σε ραδιοανθεκτικά κύτταρα σε σχέση με τα γονικά κύτταρα? Altered κυτταρική μορφολογία με σημαντική αύξηση (0.001 ρ & lt). Η Raman φάσματα της γονικής UPCI: SCC029B, 50Gy-UPCI: SCC029B και 70Gy-UPCI: κύτταρα SCC029B αποκτήθηκαν και φασματικά χαρακτηριστικά υποδεικνύουν πιθανές διαφορές σε βιομόρια, όπως πρωτεΐνες, λιπίδια και νουκλεϊκά οξέα. Ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCA) παρέχονται τρεις συστάδες που αντιστοιχούν σε ακτινοανθεκτικά 50Gy, 70Gy-UPCI: sublines SCC029B και γονικής UPCI: κυτταρική σειρά SCC029B με μικρές επικάλυψη, η οποία προτείνουμε να μεταβληθεί μοριακό προφίλ που αποκτήθηκαν από τα ανθεκτικά στην ακτινοβολία κύτταρα οφείλεται σε πολλαπλές δόσεις της ακτινοβολίας. Τα ευρήματα της παρούσας μελέτης υποστηρίζουν τη δυνατότητα της φασματοσκοπίας Raman στην πρόβλεψη των ραδιοαντοχή και, ενδεχομένως, να συμβάλει στην καλύτερη πρόγνωση του καρκίνου του στόματος

Παράθεση:. Γιάσερ Μ, Shaikh R, Chilakapati ΜΚ, Teni T (2014) Raman φασματοσκοπικές Μελέτη της ακτινοανθεκτικά Προφορική sublines Καρκίνου Ιδρύθηκε από Κλασματωμένο ιονίζουσα ακτινοβολία. PLoS ONE 9 (5): e97777. doi: 10.1371 /journal.pone.0097777

Επιμέλεια: Gabriele Multhoff, Technische Universitaet Muenchen, Γερμανία

Ελήφθη: 7, Φεβρουαρίου 2014? Αποδεκτές: 23 του Απρίλη του 2014? Δημοσιεύθηκε: May 19, 2014

Copyright: © 2014 Γιασέρ et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Ο Raman φασματογράφος που χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη είχε αγοραστεί από το έργο DBT BT /PRI11282 /MED /32/83/2008, με τίτλο «Ανάπτυξη in vivo μεθόδους φασματοσκοπίας Raman λέιζερ για τη διάγνωση του στόματος προκαρκινικές και καρκινικές καταστάσεις,» Τμήμα Βιοτεχνολογίας, η κυβέρνηση της Ινδίας. Mohd Γιασέρ χρηματοδοτείται από μια υποτροφία από την Επιτροπή Πανεπιστήμιο Επιχορηγήσεις (UGC) – Ινδία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο του στόματος είναι η έκτη πιο κοινή μορφή καρκίνου σε όλο τον κόσμο [1]. Στην Ινδία, η εκτεταμένη χρήση καπνού σε διάφορες μορφές που ο κύριος τύπος καρκίνου στους άνδρες και η τρίτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στις γυναίκες κάνει [2], [3]. Επίσης, η επικράτηση του στόματος στοματικό τύπο καρκίνου του βλεννογόνου είναι υψηλό στην ινδική υποήπειρο [4]. Οι μέθοδοι θεραπείας του καρκίνου του στόματος βασίζονται σε διάφορους παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων στάδιο της νόσου, η πρόσβαση στην στοματική τοποθεσία, την ηλικία και τη φυσική κατάσταση του ασθενούς. Αν και η χειρουργική επέμβαση είναι η επιλογή της θεραπείας στα αρχικά στάδια? ακτινοθεραπεία κατέχει σημαντική θέση είτε μόνη της είτε σαν ένα πρόσθετο με χημειοθεραπεία [5], [6]. Πρότυπο πρωτόκολλο ακτινοθεραπεία περιλαμβάνει καθημερινή έκθεση της δόσης κλάσμα 2Gy για μερικές εβδομάδες, όταν οι ασθενείς λαμβάνουν μια αθροιστική δόση 50Gy να 70Gy κατά τη διάρκεια της ακτινοθεραπείας [7], [8], [9]. Κλασματοποιημένα ακτινοθεραπεία σκοτώνει γρήγορα διαιρούμενα πληθυσμό καρκινικών κυττάρων με μειωμένο αποτελέσματα επί γύρω φυσιολογικούς ιστούς. Έτσι, αυτή η μέθοδος παρέχει το χρόνο για τα φυσιολογικά κύτταρα για να ανασυστήσουν και να ανακτήσει ενώ μειώνει καρκινικά κύτταρα τα οποία έχουν ανωμάλως ενεργοποιούνται μονοπάτια μεταγωγής σήματος [10], [11]. Ωστόσο, μερικές φορές του όγκου επανέρχεται με μια επίκτητη ακτινοανθεκτικά φαινότυπο που θέτουν ως ένα εμπόδιο προς την αποτελεσματικότητα της ακτινοθεραπείας. Προκειμένου να καταστεί πιο αποτελεσματική ακτινοθεραπεία? είναι σημαντικό να εξερευνήσουν την ραδιοανθεκτικά φαινότυπο σε καρκινικά κύτταρα. Σύνδεσμος αρκετές πρωτεΐνες όπως ρ53 [12], Cox-2 [13], Ras [14], ρΑΚΤ [15], MDM2 [16], clusterin [17], Survivin [18], Bcl-2 [19] και Mcl-1 [20] με ραδιοαντοχή έχουν αναφερθεί νωρίτερα. Ωστόσο, μέχρι στιγμής δεν υπάρχει διαθέσιμο εργαλείο που μπορεί να προβλέψει απάντηση ακτινοθεραπεία σε ασθενείς με καρκίνο του στόματος που οδηγεί προς την καλύτερη θεραπεία.

Βιοϊατρική εφαρμογή των οπτικών φασματοσκοπικές τεχνικές, όπως φθορισμός, Fourier μεταφορά υπερύθρου (FTIR), διάχυτο ανάκλασης και φασματοσκοπία Raman (RS) για την ταξινόμηση των διαφόρων παθολογικών καταστάσεων και την ανίχνευση του καρκίνου έχει ήδη αναφερθεί [21] – [24]. Μεταξύ αυτών των τεχνικών, RS έχει προσθέσει πλεονεκτήματα, όπως είναι ελεύθερη ετικέτα, ευαίσθητη σε βιοχημικές μεταβολές, ισχύουν για

in vitro

και

in vivo

συνθήκες, έχει ελάχιστη παρέμβαση από το νερό και παρέχει μοριακή δακτυλικά αποτυπώματα [ ,,,0],25] – [27]. προηγούμενες μελέτες μας έχουν αποδείξει την αποτελεσματικότητα της RS στην ταξινόμηση υγιείς, προκακοήθων και κακοήθων βλαβών του στόματος Υποβλεννίου [28] – [29]? ταξινόμηση των φυσιολογικών και μη φυσιολογικών απολέπιση κύτταρα [30] και για την πρόβλεψη της ανταπόκρισης του όγκου προς την παράλληλη χημειο-ακτινοθεραπεία στους καρκίνους του τραχήλου [31]. Έχουμε δείξει τις δυνατότητες της RS για τον εντοπισμό νωρίς τις αλλαγές μετασχηματισμού στην προφορική στοματικού βλεννογόνου [32], τη σκοπιμότητα της στην ανίχνευση άσθμα και τον καθορισμό της ανταπόκρισης στη θεραπεία μέσω ορού σε ασθενείς με άσθμα [33], χαρακτηρίζοντας φυσιολογικό και το στόμα του ορού του καρκίνου [34] και προσδιορισμό φαινοτύπου αντοχής πολυφαρμάκου σε ανθρώπινα λευχαιμία [35] και κυτταρικές σειρές της μήτρας σάρκωμα [36].

(Α) κλωνογόνος καμπύλη επιβίωσης των κυττάρων. UPCI: SCC029B γονικών κυττάρων, 50Gy-UPCI: SCC029B ενδιάμεσα κύτταρα ανθεκτικά στην ακτινοβολία και 70Gy-UPCI: SCC029B τελικό κύτταρα ακτινοανθεκτικά. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων με μέση τιμή (± SD) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Μονόδρομη ANOVA στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε επιζώντες κλάσματα στις δεδομένες δόσεις, ρ & lt? 0,01 & amp? 0.001. (Β) Έκφραση των δεικτών ραδιοαντοχή σε ακτινοανθεκτικά προφορική sublines. Western blotting για Cox-2, Bcl-2, Mcl-1 και πρωτεϊνών Σουρβιβίνης? β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. ανάλυση πυκνομετρία Western blots από τρία ξεχωριστά πειράματα φαίνεται παρακάτω, ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± s.d. * Αντιπροσωπεύουν την έκφραση της πρωτεΐνης σε σύγκριση με γονική κυτταρική γραμμή, ενώ # αντιπροσωπεύουν την έκφραση της πρωτεΐνης σε σύγκριση μεταξύ 50Gy-UPCI: SCC029B και 70Gy-UPCI:. Sublines SCC029B (p & lt? 0,05)

Η

RS μελέτες που σχετίζονται με την ακτινοβολία που προκαλείται οι βιοχημικές αλλαγές σε κυτταρικές σειρές του προστάτη, των πνευμόνων και του καρκίνου του μαστού ακτινοβολείται με δόσεις ακτινοβολίας μεταξύ 15 και 50Gy αναφερθεί [37], [38]. Αυτές οι μελέτες διεξήχθησαν σε εφάπαξ δόσεις ακτινοβολίας που προσπάθησε να διερευνήσει την

in vitro

απόκριση ακτινοβολίας σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Από την άλλη πλευρά, πραγματοποιήσαμε την παρούσα μελέτη, εκμεταλλευόμενοι συνεχούς χαμηλής δόσης κλασματοποιημένη ακτινοβολία χρησιμοποιούνται συνήθως ως πρότυπο πρωτόκολλο ακτινοθεραπεία σε κλινικές για στοματική θεραπεία του καρκίνου. Στόχος μας ήταν να αναπτύξουμε

in vitro

ραδιοαντοχή χαρακτήρα στην κυτταρική σειρά πάνω από ένα χρονικό διάστημα και στη συνέχεια να διερευνήσει τη σκοπιμότητα της φασματοσκοπίας Raman για την κατηγοριοποίηση του απέκτησε γνώρισμα από τη γονική μη επεξεργασμένα κύτταρα του. Έχουμε καθιερώσει ακτινοανθεκτικά τον καρκίνο του στόματος sublines του στοματικού βλεννογόνου καταγωγής από κλινικά εφαρμόσιμη δόση ακτινοθεραπείας 2Gy. Μετά τον καθορισμό των sublines, ακτινοανθεκτικά χαρακτήρα τους αξιολογήθηκε με τη δοκιμασία κλωνογονικού επιβίωση των κυττάρων και Raman φασματικά χαρακτηριστικά λήφθηκαν από την RS. Για το καλύτερο της γνώσης μας, είμαστε πρώτα να αναφέρουν τη χρησιμότητα της RS στη αποκτήσει ακτινοανθεκτικά προφορική sublines καρκίνου ιδρύθηκε από τη γονική καρκίνο του στόματος κυτταρική σειρά από κλινικά χορηγείται κλασματοποιημένη ιονίζουσα ακτινοβολία.

Υλικά και Μέθοδοι

δημιουργία και Χαρακτηρισμός ακτινοανθεκτικά κυττάρων Lines

α) καλλιέργεια κυττάρων και η δημιουργία ακτινοανθεκτικά sublines με επεξεργασία γάμμα ακτινοβολίας

UPCI:. SCC029B, ανθρώπινη στοματική στοματικό βλεννογόνο κυτταρική γραμμή καρκινώματος παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr . Susanne Μ Gollin, Πανεπιστήμιο του Πίτσμπουργκ, ΗΠΑ [39]. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε Μέσο Eagle Τροποποιημένο Μέσο (DMEM, Gibco) συμπληρωμένο με 10% θερμοαπενεργοποιημένο εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS, Sigma-Aldrich) και αντιβιοτικά (100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2 υγροποιημένη ατμόσφαιρα.

(Α) ανάλυση μορφολογία των κυττάρων. Γονικός UPCI: κύτταρα SCC029B, ακτινοανθεκτικά 50Gy-UPCI: SCC029B και 70Gy-UPCI: κύτταρα SCC029B. Ράβδοι κλίμακας: 100 μm. (Β) Ομοεστιακή εικόνες των νηματοειδών-ακτίνης χρωματίζονται με Alexa Fluor-488 φαλλοϊδίνη, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με μετρητή DAPI. Ράβδοι κλίμακας: 20 μm. Βέλος δείχνει τΊΙοροάίβ ως πρόστιμο επεκτάσεις επιφάνεια του κυττάρου. Η ανάλυση βασίζεται σε 50 κύτταρα ανά πληθυσμό με μέση τιμή και τυπική απόκλιση τριών ανεξάρτητων πειραμάτων, απεικονίζονται στο κάτω δεξιά (p & lt? 0,01, 0,001)

Η

Για να δημιουργήσετε ακτινοανθεκτικά sublines, UPCI:. Κύτταρα SCC029B (1 × 10

6 κύτταρα) σπάρθηκαν σε πλάκες mm καλλιέργειας 100 (BD-Biosciences) που περιέχουν πλήρες μέσο. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε κανονικές συνθήκες και ακτινοβολούνται με 2Gy της ιονίζουσας ακτινοβολίας, χρησιμοποιώντας

6 ° Co-γ Γραμμικού Επιταχυντή (Bhabhatron-2, ACTREC, Memorial Κέντρο Tata) σε 60% συρροή. Αμέσως μετά την ακτινοβολία το μέσο καλλιέργειας ανανεώθηκε και τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε επωαστή μέχρι να φτάσει το 90% συρροή. Τα κύτταρα στη συνέχεια σε επεξεργασία με θρυψίνη, μετρήθηκαν και πέρασμα σε νέες πλάκες καλλιέργειας. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και πάλι με 2Gy ιονίζουσας ακτινοβολίας σε περίπου 60% συρροή. Αυτή η διαδικασία επαναλήφθηκε 25 φορές για την παραγωγή των ενδιάμεσων 50Gy-UPCI: SCC029B ακτινοανθεκτικά υπογραμμή και περαιτέρω συνεχίστηκε μέχρι 35 φορές για μια περίοδο 5 με 6 μήνες μέχρι την παραγωγή του τελικού 70Gy-UPCI:. SCC029B ακτινοανθεκτικά υπογραμμή

( Α) Γονική UPCI: κυτταρική σειρά SCC029B (β) 50Gy-UPCI: SCC029B δευτερεύουσα γρα ή (C) 70Gy-UPCI:.. SCC029B υπογραμμή

Η

β) δοκιμασία επιβίωσης κλωνογόνος κυττάρων

Εν συντομία , γνωστό αριθμό τόσο των γονικών και ακτινοανθεκτικά κύτταρα του UPCI: SCC029B σπάρθηκαν σε πλάκες mm καλλιέργειας 100 και διατηρούνται σε CO

2 θερμοκοιτίδα τη διάρκεια της νύχτας για τη συμμόρφωση με τις πλάκες. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα ακτινοβολήθηκαν με ακόμη δόσεις από 2Gy προς 8 Gy και επωάστηκαν στους 37 ° C για το σχηματισμό αποικιών. Μετά από 14 ημέρες, οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν με απόλυτη αιθανόλη και χρωματίστηκαν με 0,1% κρυσταλλικό ιώδες. Αποικίες που αποτελούνται από 50 ή περισσότερα κύτταρα μετρήθηκαν ως κλωνογόνο επιζώντες. Η αποτελεσματικότητα επιμετάλλωση τοις εκατό, τιμή D0 (δόση ακτινοβολίας στην οποία επιβιώνει 37% του πληθυσμού) και κλάσμα επιβίωσης σε μια δεδομένη δόση ακτινοβολίας υπολογίστηκαν με βάση την επιβίωση των μη-ακτινοβολημένα κύτταρα όπως περιγράφηκε νωρίτερα [40]. Τρία ανεξάρτητα πειράματα, κάθε φορά σε διπλότυπα με γονικών και ραδιοανθεκτικά sublines και καμπύλη επιβίωσης των κυττάρων μετά τον υπολογισμό χαράσσεται κλάσμα επιβίωσαν σε κάθε δόση. Περαιτέρω, One-way ANOVA στατιστική ανάλυση έγινε για να βρείτε τη σημαντική διαφορά στην επιβίωση σε διαφορετικές δόσεις ακτινοβολίας

(Α) 50Gy-UPCI: SCC029B υπογραμμή – γονική UPCI:. Κυτταρική σειρά SCC029B (Β) 70Gy- UPCI: SCC029B υπογραμμή – γονική UPCI: SCC029B κυτταρική γραμμή (C) 50Gy-UPCI: SCC029B υπογραμμή -70Gy-UPCI: SCC029B υπογραμμή

Η

(Α) Φορτία του παράγοντα 1, 2 και 3 (Β. ) 3-D διασποράς οικόπεδο για τη γονική UPCI: SCC029B κυτταρική γραμμή, ακτινοανθεκτικά 50Gy-UPCI: SCC029B και 70Gy-UPCI:.. sublines SCC029B

Η

γ) κηλίδωση Western

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης κυττάρων θηλαστικών που περιέχει αναστολέα πρωτεάσης 1% (Thermo επιστημονικούς, USA). Το κυτταρόλυμα φυγοκεντρήθηκε στις 13.000 rpm για 10 λεπτά στους 4 ° C και το υπερκείμενο που περιέχει ολικής κυτταρικής πρωτεΐνης συλλέχθηκε. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε ποσοτικά με χρωματομετρική δοκιμασία [41]. Δείγματα που περιείχαν 40 μg ολικών πρωτεϊνών διαχωρίστηκαν με 12% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF (εργαστηρίου PALL, USA). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα με επώαση εντός TBS που περιέχει 0.1% Tween (TBST, ρΗ 7.4) και 5% (w /v) γάλα με χαμηλά λιπαρά. Μετά τον αποκλεισμό, οι μεμβράνες επωάστηκαν με πολυκλωνικό κουνελιού IgG ανθρώπινο αντι-Mcl-1 (1:1000, sc-20679)? Bcl-2 (1:500, sc-492), Survivin (1:1000, SC-10811), γίδινο πολυκλωνικό IgG αντι-Cox-2 (1:500, sc-1747) και καθαριότητας κουνελιού πολυκλωνική IgG αντι-β ακτίνης (1:3000, sc-1616)? (Santa Cruz Biotech., USA) τη διάρκεια της νύχτας σε ρυθμιστικό αποκλεισμού. Μετά από πλύση έξι φορές σε TBST, οι μεμβράνες επωάστηκαν με ένα συζευγμένο με HRP αντίσωμα αντι-κουνελιού IgG (1:2800) ή αντίσωμα IgG αντι-κατσίκας (1:2500, Santa Cruz Biotechnology) σε ρυθμιστικό αποκλεισμού για 1 ώρα. Μετά από πλύση έξι φορές σε TBST και δύο φορές σε TBS, πρωτογενές αντίσωμα σύνδεση έγινε ορατή με ενισχυμένο σύστημα υπόστρωμα χημειοφωταύγειας (GE Healthcare, USA). Η κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε σε τρία ανεξάρτητα κυτταρολύματα των γονικών κυττάρων, 50Gy και 70Gy. Η ανάλυση πυκνομετρίας διεξήχθη με λογισμικό J εικόνας (ΝΙΗ, USA) έναντι έκφραση πρωτεΐνης housekeeping β-ακτίνης.

δ) Η μορφολογική αξιολόγηση και F-ακτίνης χρώση.

Μορφολογικές αλλαγές που παρατηρήθηκαν κατά κλασματοποιημένο ιονίζουσα ακτινοβολία φωτογραφήθηκαν με τη χρήση του ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Axiovert-200Μ, Zeiss) σε συνδυασμό με την ψηφιακή φωτογραφική μηχανή. Εκπρόσωπος εικόνες της γονικής UPCI: κυτταρική σειρά SCC029B, 50Gy-UPCI: SCC029B και 70Gy-UPCI: sublines SCC029B υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τη χρήση του λογισμικού Axiovision (αφήστε 4.7, Carl Zeiss)

Για νηματοειδή χρώση ακτίνης, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν. σε καλυπτρίδες, σταθεροποιήθηκαν με παραφορμαλδεΰδη (4%) για 15 λεπτά και κατέστησαν διαπερατά σε 0.7% Triton-X. Μια υψηλή συγγένεια νηματοειδή ακτίνη (Ρ-ακτίνη) ανιχνευτής Alexa Fluor-488 φαλλοειδίνη (τεχνολογίες Life, USA) αραιώθηκαν 1:20 (σε 1Χ PBS) και επωάζονται με τα κύτταρα σε καλυπτρίδες για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σε σκοτάδι. Μετά την επώαση, οι καλυπτρίδες πλύθηκαν δύο φορές με 1Χ PBS για 10 λεπτά. ΫΑΡΙ (1:20 αραιωμένο σε 1Χ PBS) χρώση έγινε για περίπου 1 λεπτό και στη συνέχεια οι καλυπτρίδες τοποθετούνται σε αντικαρκινικό παράγοντα σβέσης στερέωσης (Vectashield, Vector Labs, USA) σε μια καθαρή αντικειμενοφόρο πλάκα και εξετάστηκε με LSM 510 Meta Carl Zeiss συνεστιακού σύστημα (Carl Zeiss Micro Imaging GmbH, Γερμανία). Κάθε ένα από τα γονικά, 50Gy και 70Gy κύτταρα αναπτύχθηκαν σε διπλότυπα πάνω σε καλυπτρίδες και τυχαίες εικόνες για 50 κύτταρα αποκτήθηκαν. Με αυτόν τον τρόπο, η χρώση διεξήχθη τρεις φορές ανεξάρτητα και 50 κύτταρα αναλύθηκαν κάθε φορά από όλους τους τύπους πληθυσμό κυττάρων για απαρίθμηση filopodia.

Φασματοσκοπία Raman

α) Παρασκευή δείγματος και φασματική απόκτησης.

Γονική UPCI: SCC029B, 50Gy-UPCI: SCC029B και 70Gy-UPCI: κύτταρα SCC029B καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία mm πολιτισμό 100. Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα (3 χ 10

6 κύτταρα) από 6 ανεξάρτητες καλλιέργειες από καθένα από τα γονικά, 50Gy και 70Gy κύτταρα συλλέχθηκαν και φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) πλύση δόθηκε στα κυτταρικά σφαιρίδια πριν από την εγγραφή φασμάτων. Περίπου 7 φάσματα αποκτήθηκαν από κάθε σφαιρίδιο κυττάρων με τη χρήση οπτικών ινών σύστημα μικροανάλυση Raman όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33]. Έτσι, συνολικά ~ 40 φασμάτων ανά ομάδα αποκτήθηκαν για κάθε ένα από τα πατρικά, 50Gy και 70Gy κύτταρα.

Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, το σύστημα Raman χρησιμοποιούνται για τη μελέτη αποτελείται από ένα λέιζερ διόδου (Instruments Process) με μήκος κύματος 785 nm ως πηγή διέγερσης και υψηλής απόδοσης (HE-785, Horiba-Jobin-Yvon, Γαλλία) φασματογράφο σε συνδυασμό με μια CCD (Synapse, Horiba-Jobin-Yvon, Γαλλία) ως στοιχείο ανίχνευσης. Οπτική φιλτράρισμα των ανεπιθύμητων θορύβων, συμπεριλαμβανομένων σημάτων Rayleigh επιτυγχάνονται μέσω της «Superhead» το βοηθητικό εξάρτημα του συστήματος. Σούπερ κεφάλι σε συνδυασμό με ένα 40 × μικροσκοπική στόχος (Nikon, ΝΑ 0,65) χρησιμοποιήθηκε για την παροχή φωτός λέιζερ, καθώς και για τη συλλογή σήματα Raman. Ο φασματογράφος δεν έχει κινητά μέρη με σταθερό 950 gr /mm τρίψιμο και η φασματική ανάλυση σύμφωνα με τις προδιαγραφές του κατασκευαστή είναι ~ 4 εκατοστά

-1. Εκτιμώμενο μέγεθος κηλίδας λέιζερ στο δείγμα σφαιρίδιο κυττάρων ήταν 5-10 μm. Φάσματα εντάχθηκαν για 6 δευτερόλεπτα και κατά μέσο όρο πάνω από 3 συσσωρεύσεις. Τυπική ισχύς του λέιζερ στο δείγμα ήταν 40 + 0.05 mW.

β) Spectral προ-επεξεργασία και ανάλυση των δεδομένων.

Raman φάσματα προ-επεξεργασία με τη διόρθωση φορτισμένη διάταξη ζευγάρι (CCD) απάντηση από Εθνικό Ινστιτούτο Προτύπων και Τεχνολογίας (NIST) επίσημο πρότυπο υλικό αναφοράς 2241 (SRM 2241), ακολουθούμενη από την αφαίρεση των σημάτων υποβάθρου από οπτικά στοιχεία και CAF

παράθυρο 2. Για να αφαιρέσετε παρέμβαση της αργή κίνηση φόντο, πρώτη παράγωγα των φασμάτων (Savitzky – μέθοδος Golay) χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των δεδομένων [42], [43]. Στη συνέχεια φάσματα παρεμβολή στο 900-1800 cm

-1 εύρος και φορέα ομαλοποιηθεί. Ανάλυση της προ-επεξεργασία φασμάτων έγινε με τη χρήση PCA (ανάλυση σε κύριες συνιστώσες) αλγόριθμοι εφαρμόζονται σε MATLAB (Mathwork Inc.) με βάση το λογισμικό in-house [44]. PCA είναι χωρίς επίβλεψη εργαλείο επισκόπηση των δεδομένων που χρησιμοποιούνται για να δούμε τις διαφορές και τις ομοιότητες μεταξύ των φασμάτων. Αυτή η μέθοδος αποκαλύπτει ακραίες τιμές, τις ομάδες και τις τάσεις στα δεδομένα. Περιγράφει διακύμανσης των δεδομένων, προσδιορίζοντας μια νέα σειρά ορθογώνια χαρακτηριστικά, αυτές είναι γνωστές ως φορτία του παράγοντα ή κύριες συνιστώσες (PC) (p & lt? 0,05). Κύρια συστατικά είναι γραμμικοί συνδυασμοί των αρχικών μεταβλητών δεδομένων. Δεδομένου ότι η παρούσα μελέτη είναι μια διερευνητική μελέτη, επομένως, έχουμε πραγματοποιήσει μέθοδος PCA ανάλυσης και χρησιμοποιείται επίσης για τη μέθοδο αυτή σε προηγούμενες

in vitro

μελέτες μας σε κυτταρικές σειρές [35], [36].

μέση και τα φάσματα διαφορά υπολογίστηκαν για διαφορετικούς πληθυσμούς κυττάρων και χρησιμοποιήθηκαν για φασματική σύγκριση. Οι μέσες φάσματα υπολογίστηκαν από το υπόβαθρο αφαιρείται φάσματα πριν από παραγωγοποίηση με μέσο όρο παραλλαγές Υ-άξονα και τη διατήρηση του άξονα Χ σταθερές για κάθε κατηγορία. Η διόρθωση γραμμής βάσης έγινε με την τοποθέτηση ενός 5

ης τάξης πολυωνυμική συνάρτηση. Αυτά βασική διορθωθεί φάσματα χρησιμοποιηθεί για τη φασματική συγκρίσεις σε όλες τις ομάδες. Τα φάσματα Διαφορά δημιουργήθηκαν με αφαίρεση της μέσης φάσματα ραδιοανθεκτικά κύτταρα (50Gy-UPCI: SCC029B & amp? 70Gy-UPCI: SCC029B) με γονικά κύτταρα (UPCI: SCC029B), καθώς και με την αφαίρεση φάσματα των 50Gy-UPCI: SCC029B από 70Gy-UPCI :. κύτταρα SCC029B

Στατιστική Ανάλυση

τα δεδομένα αναλύθηκαν στατιστικά με μονόδρομη ANOVA και του Student t-test, χρησιμοποιώντας Graph Pad Prism 5 λογισμικού (έκδοση 5.01). Μια τιμή ρ μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Η στατιστική ανάλυση που χρησιμοποιείται για την επεξεργασία φασμάτων Raman περιγράφονται κάτω από το αντίστοιχο τμήμα.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

α) Ανάπτυξη και επικύρωση των ακτινοανθεκτικά sublines

Τα πρωτόκολλα της ακτινοθεραπείας για τον καρκίνο του στόματος θεραπεία αποτελείται από ένα σύνολο 50Gy να 70Gy δόση ακτινοβολίας vide χαμηλή δόση ακτινοθεραπείας του 2Gy. Ως εκ τούτου, δύο ακτινοανθεκτικά sublines δηλαδή 50Gy-UPCI: SCC029B και 70Gy-UPCI: SCC029B ιδρύθηκαν από συνολικά 25 και 35 κλάσματα 2Gy αντίστοιχα σε μια περίοδο 5-6 μηνών. Η ραδιοανθεκτικά χαρακτήρας του sublines δείχθηκε με δοκιμασία κλωνογονικού κυτταρικής επιβίωσης. Έχουμε παρατηρήσει σημαντική αύξηση στην επιβίωση των κυττάρων για τα δύο από τα ραδιοανθεκτικά sublines σε σύγκριση με γονική κυτταρική γραμμή με κλωνογόνο προσδιορισμό [Εικ-1 (Α)]. δόσεις D0 για τη γονική άδεια, 50Gy και 70Gy υπογραμμή υπολογίστηκαν και βρέθηκε να είναι 4,5 Gy, 5.1Gy και 5.6Gy αντίστοιχα. Μια αύξηση στην αξία D0 για τις ακτινοανθεκτικά sublines από γονική κυτταρική σειρά του υποδεικνύει αποκτούν τον ιδιαίτερο χαρακτήρα ραδιοαντοχή τους. Προσδιορίσαμε επίσης την ιδιότητα του γνωστού ραδιοανθεκτικά και αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη δείκτες όπως Bcl-2 (λέμφωμα Β κυττάρων-2), Mcl-1 (μυελοειδή λευχαιμία κυττάρων-1), Survivin & amp? Cox-2 (κυκλοοξυγενάσης-2) με κηλίδωση Western. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα-1 (Β) μία αύξηση στα επίπεδα αυτών των πρωτεϊνών παρατηρήθηκε σε ραδιοανθεκτικά υποσειρές (εκτός Mcl-1 σε 50Gy-UPCI: SCC029B) σε σύγκριση με τη γονική κυτταρική γραμμή. Οι-Mcl 1 επίπεδα στο ενδιάμεσο 50Gy-UPCI: SCC029B υπογραμμή ήταν αν και συγκρίσιμες (ανάλυση πυκνομετρίας, Σχήμα-1 Β, κατώτερο) με εκείνη της γονικής κυτταρικής γραμμής και βρέθηκε να είναι περαιτέρω σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε ραδιοανθεκτικά 70Gy: UPCI-SCC029B υπογραμμή . Αξίζει να σημειωθεί ότι Mcl-1 έχει μικρό χρόνο ημιζωής λόγω της ταχείας κύκλου εργασιών της μέσω ουμπικουιτίνωση [45] και αν Mcl-1 κυτταρική σταθερότητα έναντι διαφόρων παραγόντων στρες έχει μελετηθεί, αλλά λίγα είναι γνωστά για ρυθμιστικού μηχανισμού της εξαιτίας της θεραπείας ακτινοβολίας. Το αποτέλεσμά μας πιθανόν υποδηλώνει ότι οδών συμπεριλαμβανομένων Bcl-2, Survivin και Cox-2 μπορεί να συνεισφέρει στην αύξηση της επιβίωσης για ραδιοανθεκτικά κύτταρα σε πρώιμα στάδια της ανάπτυξης αποκτήθηκαν ραδιοαντοχή ενώ Mcl-1 μπορεί να έχει ένα ρόλο στην μεταγενέστερο στάδιο. Επιπλέον, όπως αναφέρεται στην δοκιμασία κλωνογονική επιβίωση των κυττάρων, ο 50Gy-UPCI: κύτταρα SCC029B αποκτήσει το χαρακτήρα ραδιοαντοχή και υψηλότερα επίπεδα άλλων πρωτεϊνών που σχετίζονται με ραδιοαντοχή σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη του ραδιοαντοχή είναι ένα σύνθετο φαινόμενο που δεν μπορεί να συνδέεται με ένα μόνο δείκτη ή πρωτεΐνη μέσα στο κύτταρο. Η σημαντική αύξηση στην έκφραση αυτών των δεικτών επιβεβαιώνει με προηγούμενες εκθέσεις, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που προέρχονται από το εργαστήριο μας για τη σύνδεση τους με ραδιοαντοχή στη στοματική καρκινώματα πλακωδών κυττάρων [13], [18] – [20], [46] – [47].

β) μορφολογίας ακτινοανθεκτικά sublines

Έχουμε παρατηρήσει αλλαγμένη μορφολογία του ακτινοανθεκτικά sublines σε σύγκριση με γονική κυτταρική γραμμή. Οι 50Gy-UPCI: SCC029B κύτταρα παρουσίασαν ατρακτοειδή μορφολογία ενώ 70Gy-UPCI: κύτταρα SCC029B βρέθηκαν να είναι πιο επιμήκη και ακανόνιστο σχήμα [Σχήμα-2 (Α)]. Το κέρδος αυτών των μορφολογικών χαρακτηριστικών σε ακτινοανθεκτικά sublines ίσως υπαινίσσονται προς μετατραπεί χαρακτηριστικό της που σχετίζονται με τη μετανάστευση και την εισβολή. Περαιτέρω, προκειμένου να γνωρίσουν από κοντά στην αναδιοργάνωση της ακτίνης τους? έχουμε εκτελούνται νηματοειδή χρώση ακτίνης (F-ακτίνη) στις γονικές, 50Gy και 70Gy UPCI: κύτταρα SCC029B. F-ακτίνης χρώση έδειξαν σημαντική αύξηση [Εικ-2 (Β)] του αριθμού των filopodia σε 50Gy (ρ & lt? 0,01) και 70Gy-UPCI: SCC029B (ρ & lt? 0.001) κυττάρων σε σύγκριση με τη γονική UPCI: κύτταρα SCC029B. Οι μορφολογικές αλλαγές που εμφανίζουν τα ανθεκτικά στην ακτινοβολία κύτταρα μπορεί να είναι ένα πρόσθετο φαινότυπο που αποκτήθηκαν λόγω της συνεχούς κλασματοποιημένη θεραπεία με ακτινοβολία.

γ) Φασματοσκοπία Raman γονικής και ακτινοανθεκτικά sublines

Η μέση κανονικοποιημένα φάσματα για τη γονική UPCI : κυτταρική σειρά SCC029B, ακτινοανθεκτικά 50Gy και 70Gy-UPCI: sublines SCC029B ήταν υπολογίζονται και απεικονίζονται στο Σχήμα-3. Mean φάσμα έχει χρησιμοποιηθεί ως αντιπροσωπευτικό φάσμα για τις αντίστοιχες κυτταρικές γραμμές στην φασματική ανάλυση. Όπως, απεικονίζεται στο Σχήμα-3, τα φασματικά χαρακτηριστικά κυριάρχησαν οι ζώνες γύρω από 1008 (φαινυλαλανίνη), 1270 (αμίδιο III), 1450 (δ CH

2) και 1660 (αμίδιο Ι) cm

-1 και μπορεί να αποδοθεί σε κυτταρικές πρωτεΐνες. Ότι, ταινίες στο 1310 (CH

3 /CH

2) συστροφή ή κάμψη τρόπους λιπιδίων), τη δομή 1340 (δακτύλιος αδενίνης) και 1.378 εκατοστά

-1 προτείνουν (δακτύλιος τρόπους αναπνοής των νουκλεϊκών οξέων) παρουσία κυτταρικών νουκλεϊκών οξέων και των λιπιδίων. Οι μέσες φάσματα για 50Gy-UPCI: κύτταρα SCC029B [Εικ-3 (Β)] έδειξε μετακινούνται 1310, 1450 και 1660 εκατοστά

-1? ενώ ένας εξέχων κορυφή παρατηρήθηκε σε 1.550 εκατοστά

-1 (τρυπτοφάνη). Ομοίως, στη μέση φάσματα ακτινοανθεκτικά 70Gy-UPCI: κύτταρα SCC029B [Εικ-3 (C)] που σχετίζονται με την ένταση παραλλαγές σε 1270, 1310, 1340 και 1660 εκατοστά

-1, ενώ η στροφή σε 1.450 εκατοστά

-1 WAS παρατηρηθεί. Έτσι, μπορεί να παρατηρηθεί ότι παρατηρήθηκαν συνολικές διαφορές στη μορφή των μετατοπίσεων σε ζώνες Raman και παραλλαγές της έντασης στη μέση φάσματα των δύο ομάδων 50Gy και 70Gy

Για να φέρει έξω φασματικές διαφορές μεταξύ των ομάδων.? Τα φάσματα διαφορά υπολογίσθηκαν από τη μέση φάσματα. Τα φάσματα διαφορά παρέχουν μια πιο σαφή εικόνα για τις διαφορές μεταξύ των ομάδων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα-4, τα φάσματα διαφορά υπολογίστηκαν για 50Gy-UPCI: SCC029B και 70Gy-UPCI: κύτταρα SCC029B αφαιρώντας τους από τη γονική UPCI: κύτταρα SCC029B [Εικ-4 (Α, Β)] και μεταξύ των δύο ραδιοανθεκτικά κύτταρα [Σχ-4 (C)]. Το φάσμα διαφορά (50Gy – γονική) παρουσίασαν θετική κορυφές στα 1008, 1340, 1378, 1450, 1550, 1664 εκατοστά

-1 και αρνητικές κορυφές στα 1240 και 1310 εκατοστά

-1? υποδηλώνοντας αλλαγές στις πρωτεΐνες και νουκλεϊκά οξέα, πιθανώς λόγω της αλλαγμένης κυτταρικής σηματοδότησης καταρράκτες προκαλούνται από ακτινοβολία [48]. Η αξιοσημείωτη αλλαγή στο 1550 cm

-1 σε κύτταρα 50Gy είναι ενδεικτική ελεύθερα προσβάσιμο τρυπτοφάνης πιθανώς ως αποτέλεσμα της αναδίπλωσης των πρωτεϊνών /εσφαλμένη αναδίπλωση από ενεργοποιημένα chaperones οφείλεται στο στρες ακτινοβολίας. Ομοίως, στο φάσμα διαφοράς (70Gy – γονική) θετική κορυφές παρατηρήθηκαν στα 1340 και 1378 cm

-1 η οποία συνδέεται με το DNA, ενώ αρνητική κορυφή παρατηρήθηκαν στα 1240, 1450 και 1650 cm

-1 σχετίζεται με πρωτεΐνη αλλαγή

Όπως φαίνεται από κλωνογονική δοκιμασία, τόσο η 50Gy-UPCI:. SCC029B και 70Gy-UPCI: κύτταρα SCC029B έχουν αποκτήσει ακτινοανθεκτικά χαρακτήρα σε σύγκριση με γονικά κύτταρα. Επίσης, τα κύτταρα 70Gy είναι σχετικά πιο ραδιοανθεκτικά από κύτταρα 50Gy και παρουσιάζουν διακριτά φάσματα διαφορά, η οποία μπορεί να οφείλεται σε διαφορετικές ιδιότητες που αποκτήθηκαν από αυτούς. Επιπλέον, η (50Gy-70Gy) διαφορά φάσμα δείχνουν θετικές κορυφές στα 1008, 1450, 1550 και 1664 εκατοστά

-1 όλα σχετίζονται με τις πρωτεΐνες, ενώ αρνητική κορυφή που σχετίζονται με το DNA παρατηρήθηκε σε 1.378 εκατοστά

-1. Η παρουσία διακεκριμένων θετική κορυφή της τρυπτοφάνης (1550 εκατοστά

-1) σε 50Gy ακτινοανθεκτικά δευτερεύουσα γρα ή υπόδειξη προς τα εμπλουτισμένα τρυπτοφάνη ομάδες που μπορεί να έχουν αντι-οξειδωτική ιδιότητα λόγω της ινδολικά ομάδα η οποία χρησιμεύει ως ρίζα υδρογόνου δότη [49]. Δεδομένου ότι, ιονίζουσα ακτινοβολία μπορεί να επάγει αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) παραγωγή που μπορεί να προκαλέσει ενδογενή επίθεση στην ραχοκοκαλιά δεοξυριβοζυλικής του DNA [50], [51]. Για να αντισταθμίσει την επίδραση των ROS, τα κύτταρα έχουν πολλές αντιοξειδωτικές παράγοντες που μπορούν να σκουπίζω ROS και την προστασία από την ακτινοβολία [52]. Η διακριτή τρυπτοφάνης κορυφή υπόλειμμα σε κύτταρα ραδιοανθεκτικά 50Gy ίσως συσχετίζονται με τέτοιους παράγοντες που είναι πλούσια σε αυτούς τους τύπους υπόλειμμα το οποίο θωρακίζει το κύτταρο κατά του οξειδωτικού στρες. Η αυξητική ρύθμιση αυτών των παραγόντων έχουν επίσης αναφερθεί στο πλαίσιο της ραδιοαντοχή [53] – [55]. Επιπλέον, η καταγεγραμμένη φάσμα μπορεί να οδηγήσει σε μια μέση και αντιπροσωπευτικό φάσμα του δεδομένου κυτταρικής γραμμής που αντανακλά μια γενική ενημέρωση για την κατάσταση των κυττάρων? διότι σε ένα κύτταρο ιζήματος, η ανίχνευση δέσμη συναντά μία στοίβα κυττάρων και σκέδασης μπορεί να αναμένεται από διαφορετικές οργανίδια όπως πυρήνες, μιτοχόνδρια και άλλα κυτταρικά διαμερίσματα.

δ) Πολυμεταβλητή Ανάλυση

Όπως προαναφέρθηκε , PCA χρησιμοποιήθηκε για να διερευνήσει τη σκοπιμότητα της κατάταξης μεταξύ των ακτινοανθεκτικά 50Gy και 70Gy sublines από την γονική κυτταρική σειρά. PCA συχνά χρησιμοποιούμενη μέθοδος για τη συμπίεση δεδομένων και απεικόνισης για να παρατηρήσει το πρότυπο στα δεδομένα. Είναι μια μαθηματική ανάλυση με την οποία τα χαρακτηριστικά στο σύνολο δεδομένων των χιλιάδων σημείων επιλυθεί σε μερικές σημαντικές ιδιοδιανύσματα που μπορεί να εκφράσει το σύνολο των διαθέσιμων δεδομένων με τα αποτελέσματα τους για κάθε φάσμα. Αυτό μπορεί να παρέχει επιτακτική ανάγκη ενδείξεις σχετικά με βιοχημικές μεταβολές μεταξύ των διαφόρων ομάδων, στην περίπτωση διαφορετικές τάξεις μας μακρομορίων. Περαιτέρω, τα προφίλ των κύριων συστατικών, επίσης γνωστή ως φορτίσεις παράγοντα μπορεί να παρέχει ζωτικής σημασίας ενδείξεις σχετικά με βιοχημικές μεταβολές μεταξύ των διαφόρων κατηγοριών. Φόρτωση των παραγόντων 1, 2 και 3 που οδηγούν σε οριοθέτηση μεταξύ των ομάδων παρουσιάζονται στο Σχήμα-5 (Α). Σύμφωνο φασματική μεταβλητότητα, όπως προτείνεται από τα φάσματα διαφορά? τα οικόπεδα φόρτωσης δείχνουν επίσης διαφορές ως προς το περιεχόμενο του DNA, τα αμινοξέα και τα προφίλ πρωτεΐνης των γονικών και ακτινοανθεκτικά ομάδες. Για την οπτική διάκριση, προβάλλουμε κάθε ένα από τα φάσματα στο νεοσύστατο χώρο συντεταγμένη των επιλεγμένων υπολογιστές. Πρώτα τρεις σημαντικές διακρίσεις PCs επιλέχθηκαν για τρισδιάστατη απεικόνιση των δεδομένων. Τρεις συστάδες που ανήκουν σε γονική UPCI: κύτταρα SCC029B και ραδιοανθεκτικά 50Gy- UPCI: SCC029B, 70Gy-UPCI: κύτταρα SCC029B παρατηρήθηκε [Εικ-5 (Β)]. Ενώ 50Gy-UPCI: κύτταρα SCC029B σχηματίζεται ένα ξεχωριστό σύμπλεγμα, αλλά μικρή επικάλυψη μεταξύ των ομάδων των 70Gy-UPCI: Παρατηρήθηκε SCC029B και γονικών κυττάρων. Αυτά ομαδοποίηση πρότυπο μπορεί να οφείλεται σε συνολική διαφορετικές βιοχημικές προφίλ που αποκτήθηκαν από τους τύπους κυττάρων. Λαμβάνοντας υπ ‘όψη ότι PCA θα αποκαλύψει μια συνολική αλλαγή, συμπεριλαμβανομένων των διαφόρων κυτταρικών προφίλ, αυτό δείχνει ότι ακτινοανθεκτικά κύτταρα έχουν αποκτήσει μια αλλαγμένη μοριακό προφίλ διαφορετικό από μητρικά κύτταρα της με λεπτές διαφοροποιήσεις.

Συμπέρασμα

η παρούσα εργασία, έχουμε δημιουργήσει ακτινοανθεκτικά sublines από το πατρικό του στόματος στοματικό βλεννογόνο κυτταρική σειρά χρησιμοποιώντας κλινικά παραδεκτή κλασματοποιημένη δόση ακτινοβολίας. Η αποκτηθείσα ανθεκτικός χαρακτήρας προσδιορίσθηκε με την πρότυπη δοκιμασία κλωνογονικού κυτταρικής επιβίωσης. Η 50Gy-UPCI: SCC029B και 70Gy-UPCI: SCC029B ιδρύθηκε ακτινοανθεκτικά sublines βρέθηκαν να είναι πιο ανθεκτικά στην ακτινοβολία σε σχέση με τη γονική του UPCI: κυτταρική σειρά SCC029B. Οι υποσειρές επίσης χαρακτηρίζονται από αξιολόγηση έκφρασης των πρωτεϊνικών δεικτών που σχετίζονται ραδιοαντοχή όπως Mcl-1, Bcl-2, COX-2 και Σουρβιβίνης που υποστηρίζουν αποκτήσει ραδιοανθεκτικά φαινότυπο τους. Αλλοιωθεί μορφολογικά χαρακτηριστικά παρατηρήθηκαν σε αυτά τα μακροπρόθεσμα ακτινοβολημένα κύτταρα που ήταν διαφορετικό από τα μητρικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων και σημαντική αύξηση του αριθμού filopodia σε 50Gy-UPCI: κύτταρα SCC029B και 70Gy-UPCI: κύτταρα SCC029B ακτινοανθεκτικά. Περαιτέρω, η φασματοσκοπία Raman έγινε σε αυτά τα ανθεκτικά στην ακτινοβολία κύτταρα και μητρικά κύτταρα για τη μελέτη διαφορικών φασματικό προφίλ τους. Αυτή η μελέτη είναι η πρώτη του είδους της σχετικά με το βοηθητικό πρόγραμμα της RS στο χαρακτηρισμό των κεκτημένων ακτινοανθεκτικά sublines. Η παρατηρούμενη απόκλιση φάσματα μεταξύ των γονικών και αμφότερα τα κύτταρα ραδιοανθεκτικά ήταν majorly λόγω αλλαγών στο DNA, λιπιδίων και το προφίλ πρωτεΐνης των κυττάρων. Μεταβολές σε περιεχόμενο DNA αυτών των κυττάρων μπορεί να είναι λόγω των πολλών γενετικών προσβολών συμβαίνουν μέσω των πολλαπλών κλασμάτων της ακτινοβολίας από FIR και την αλλαγή στα λιπίδια μπορεί να είναι κατά κύριο λόγο οφείλεται στην αλλαγμένη μορφολογία αυτών των κυττάρων όπως φαίνεται παραπάνω. Η πολυπαραγοντική ανάλυση με τη χρήση PCA αποκάλυψε ότι η ακτινοανθεκτικά 50Gy-UPCI: SCC029B και 70Gy-UPCI: κύτταρα SCC029B μπορεί να χαρακτηριστεί από τη γονική UPCI του: τα κύτταρα SCC029B. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα της δουλειάς μας είναι πολύ ελπιδοφόρα και δείχνουν τη σκοπιμότητα της RS ως πιθανή μη επεμβατική εργαλείο για τους ασθενείς με καρκίνο του στόματος στην πρόβλεψη της απόκρισης ακτινοβολίας μέσω φασματικών δεικτών. Μπορεί να βελτιώσει τα ποσοστά επιβίωσης των ασθενών λόγω της οπτικής διάγνωσης για να τις κατηγοριοποιήσετε ακτινοευαίσθητα και ανθεκτικά είδη?