Αφηρημένο

Παρά το γεγονός ότι ο καρκίνος είναι μια γενετική ασθένεια, επιγενετικές μεταβολές εμπλέκονται στην έναρξη και την εξέλιξη της. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η επαναπρογραμματισμό του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων χρησιμοποιώντας Oct3 /4, Sox2, Klf4, και cMyc μειώνει κακοήθειας του καρκίνου. Ως εκ τούτου, ο επαναπρογραμματισμός καρκίνος μπορεί να είναι μια χρήσιμη θεραπεία για χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα. Αναφέρθηκε επίσης ότι η εισαγωγή της ενδογενούς μικρού μεγέθους, μη-κωδικοποίησης ριβονουκλεοτίδια όπως microRNA (του miR) 302s και miR-369-3p ή -5p είχε ως αποτέλεσμα την επαγωγή του κυτταρικού επαναπρογραμματισμού. Mirs είναι μικρότερα από τα γονίδια των παραγόντων μεταγραφής, που τους καθιστά πιθανώς κατάλληλες για χρήση σε κλινικές στρατηγικές. Ως εκ τούτου, μπορούμε να επαναπρογραμματιστούν τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου χρησιμοποιώντας miR-302s και miR-369-3p ή -5p. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και εισβολή και τη διέγερση της μετάβασης φαινοτύπου μεσεγχυματικών-to-επιθηλιακό καρκίνο του παχέος εντέρου σε κύτταρα. Είναι σημαντικό ότι, η εισαγωγή των ριβονουκλεοτιδίων οδήγησε σε επιγενετικές επαναπρογραμματισμό απομεθυλίωσης DNA και τροποποίηση ιστονών γεγονότα. Επιπλέον,

in vivo

χορήγηση των ριβονουκλεοτιδίων σε ποντικούς προκάλεσε την επαγωγή του καρκίνου κυτταρικής απόπτωσης, η οποία περιλαμβάνει την μιτοχονδριακή Bcl2 οικογένεια πρωτεϊνών. Η παρούσα μελέτη δείχνει ότι η εισαγωγή του miR-302s και miR-369s θα μπορούσε να προκαλέσει κυτταρικό επαναπρογραμματισμό και ρυθμίζουν κακοήθεις φαινότυποι των ανθρώπινων καρκίνου του παχέος εντέρου, γεγονός που υποδηλώνει ότι η κατάλληλη παράδοση των λειτουργικών μικρού μεγέθους ριβονουκλεοτίδια μπορεί να ανοίξει μια νέα λεωφόρο για θεραπεία κατά της ανθρώπινης κακοήθεις όγκους .

Παράθεση: Ogawa Η Γου Χ, Kawamoto Κ, Nishida Ν, Konno Μ, Koseki J, et al. (2015) Τα microRNAs Προκαλέστε Επιγενετική επαναπρογραμματισμός και καταστέλλουν κακοήθεις φαινότυποι των Ανθρωπίνων καρκίνο παχέος εντέρου κύτταρα. PLoS ONE 10 (5): e0127119. doi: 10.1371 /journal.pone.0127119

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Maria Cristina Vinci, Centro Cardiologico Monzino, Ιταλία

Ελήφθη: 19 Γενάρη 2015? Αποδεκτές: 10 του Απρίλη 2015? Δημοσιεύθηκε: May 13, 2015

Copyright: © 2015 Ogawa et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Θεσμικών κληροδοτήματα ελήφθησαν εν μέρει από την Taiho Pharmaceutical Co, Ltd (https://www.taiho.co.jp/english/), Evidence Based ιατρική (EBM) Κέντρο Ερευνών (https://ebmrce.co.jp/index.html), Chugai Co., Ltd. (https://www.chugai-pharm.co.jp/english/index.html), Yakult Honsha Co., Ltd. (https://www.yakult.co.jp/english/index.html), και η Merck Co., Ltd. (https://www.merck.co.jp/en/index .html). Η εργασία αυτή υποστηρίζεται επίσης ένα Grant-in-Aid για την Επιστημονική Έρευνα από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας (https://www.mext.go.jp/english/? # 23390199, # 25112708, # 25134711, 30253420 #, # 26670604? MM, KM, HI)? μια Grant-in-Aid από το Υπουργείο Υγείας, Εργασίας και Πρόνοιας (https://www.mhlw.go.jp/english/? # H23-003? Μ.Μ., Η.Ι.)? επιχορήγηση από το Εθνικό Ινστιτούτο Βιοϊατρικής Καινοτομίας (https://www.nibio.go.jp/english/index.html? # 12-4? Μ.Μ., Η.Ι.)? και μια επιχορήγηση από το Πανεπιστήμιο της Οσάκα Drug Discovery Ταμεία (https://www.osaka-u.ac.jp/en/index.html? Μ.Μ., Η.Ι.). Μερική υποστηρίγματα ελήφθησαν από την Takeda Επιστήμη και Ιατρική Ίδρυμα Ερευνών (https://www.takeda-sci.or.jp/index.html? MM, HI), Princess Τακαμάτσου Cancer Ταμείο Έρευνας (http: //www.ptcrf.or .jp /english? MM, HI), Suzuken Ίδρυμα Memorial (https://www.suzukenzaidan.or.jp? ΜΚ), Yasuda Ιατρικό Ίδρυμα (https://www.yasuda-mf.or.jp? ΝΝ), πάγκρεας Ίδρυμα Ερευνών (https://www.jprf.or.jp/shoreisho.html? ΚΚ), Nakatani Ίδρυμα (https://www.nakatani-foundation.jp? ΗΙ), και Νακατόμι Ίδρυμα της Ιαπωνίας (https: //www.nakatomi.or.jp/en/index.html? ΜΚ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Θεσμικών κληροδοτήματα ελήφθησαν εν μέρει από την Taiho Pharmaceutical Co, Ltd (http: //www.taiho.co.jp/english/), με βάση στοιχεία Ιατρική (EBM) Κέντρο Ερευνών (https://ebmrce.co.jp/index.html), Chugai Co, Ltd (http: //www. chugai-pharm.co.jp/english/index.html), Yakult Honsha Co., Ltd. (https://www.yakult.co.jp/english/index.html), και η Merck Co., Ltd. ( https://www.merck.co.jp/en/index.html)? Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Κάθε κύτταρο του καρκίνου σε μεγάλο βαθμό προέρχεται από βλαστικά ή προγονικά κύτταρα του φυσιολογικού σωματικού ιστού μέσω της γενετικής και επιγενετικές αλλοιώσεις. Αυτές οι αλλαγές αδρανοποιήσουν την ανάπτυξη περιορισμός ογκοκατασταλτικά γονίδια (ΕΠΠ) και να ενεργοποιήσετε ογκογονιδίων που προάγουν την ανάπτυξη. Τα κανονικά σωματικά κύτταρα αναπτύσσονται από ένα γονιμοποιημένο ωοκύτταρο μέσω ενός επιγενετικό πρόγραμμα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η έκτοπη εισαγωγή ορίζεται κωδικοποίησης γονιδίων, OCT3 /4, SOX2, KLF4, και c-myc (OSKM), ή ΟΣΚ, τα οποία εκφράζονται αποκλειστικά στα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (ΟΚΕ), προκαλεί πλήρη επαναπρογραμματισμό των διαφοροποιημένων σωματικών κυττάρων πίσω στο πολυδύναμα βλαστοκύτταρα. Έχουμε προηγουμένως έδειξαν ότι η εισαγωγή OSKM σε επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα του γαστρεντερικού οργάνων διαμορφώνει την κακοήθη φαινότυπο. Τα ευρήματά μας πρότεινε ότι επαναπρογραμματισμός μπορεί να καταστείλει την εισβολή καρκίνου, αντοχή φαρμάκου, και ογκογονικότητα μέσω της εκ νέου ενεργοποίησης της οδού p16INK4a ογκοκατασταλτικό με απομεθυλίωση της αλληλουχίας προαγωγού [1]. Επιπλέον, μια πρόσφατη μελέτη ποντίκι διαγονιδιακών παράγοντες ΟΣΚ έδειξε ότι οι επιγενετικές τροποποιήσεις που εμπλέκονται στην έναρξη του όγκου και την ανάπτυξη

in vivo

. Αυτή η μελέτη απέδειξε επίσης ότι, σε συνδυασμό με την απενεργοποίηση των σημάτων TSG όπως μεταλλαγμένο APC και οι τροποποιήσεις μπορούν ενορχηστρώνει επιγενετικές μεταβολές από την Polycomb πολύπλοκη ομάδα στον πυρήνα υπομονάδα ιστόνης Η3 στη λυσίνη-27 [2]. Σε συνδυασμό με τα προηγούμενα ευρήματα [1-6], επιγενετικές μεταβολές, ανεξάρτητα από τα αίτια ή τα αποτελέσματα των γενετικών αλλαγών, συμβάλλουν στην εμφάνιση και την ανάπτυξη των κακοηθειών και μπορεί να είναι ελκυστική για την ανακάλυψη νέων θεραπευτικών στόχων κατά του καρκίνου του ανθρώπου.

Θεραπευτικές εφαρμογές που αυξάνουν την ενδογενή μονοπάτια σηματοδότησης πρέπει να έχουν ελάχιστη τοξικότητα

in vivo

. Σε αυτό το πλαίσιο, την ανακάλυψη φαρμάκων από ενδογενείς microRNAs (miRNAs, miR), μικρού μεγέθους μη κωδικοποιητική ριβονουκλεοτιδίων (22 bp κατά μέσο όρο), είναι πιθανές πηγές για τις καινοτόμες θεραπευτικές στρατηγικές [7,8]. Επειδή συντίθεται ώριμη Mirs δεν ενσωματωθεί στο γονιδίωμα, θα πρέπει να ασκούν τα καθήκοντά τους χωρίς ανεπιθύμητα συμβάντα γονιδιωματικής ολοκλήρωσης και, αν συνδυαστεί με ένα σύστημα χορήγησης φαρμάκων, Mirs θα μπορούσε να ασκήσει αυτές τις συγκεκριμένες επιπτώσεις για θεραπευτικούς στόχους [7,8].

Πρόσφατες μελέτες ανακάλυψη miR εντόπισαν κρίσιμες ομάδες, συμπεριλαμβανομένων των miR-302s, τα οποία ενισχύουν την επίδραση επαναπρογραμματισμό σε συνεργασία με την μεταφορά ιογενή μεσολάβηση του παράγοντα μεταγραφής [9-12]. Έχει αποδειχθεί ότι ένα σύνολο τριών Mirs (miR-302s, miR-369s και miR-200c) που επιλέγονται από τα πολυάριθμα Mirs εκφράζεται αποκλειστικά σε επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα (iPSCs) /ΟΚΕ, προκάλεσε τον επαναπρογραμματισμό [13]? ένα σημαντικό ρόλο για miR-367 αποδείχθηκε επίσης [12]. Σύμφωνα με πληροφορίες, η εισαγωγή του miR-302s που προκαλείται τόσο διακοπή του κυτταρικού κύκλου με αλληλεπίδραση με εξαρτώμενες από κυκλίνη κινάσες (CDKs) και την παγκόσμια απομεθυλίωση του DNA σε καρκίνο του ήπατος και μελάνωμα

in vitro

[4,5,14]. Εδώ, μελετήθηκε η επίδραση του miR-302s και miR-369s

in vitro

και

in vivo

. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι επαναπρογραμματισμό του καρκίνου με τη χρήση miR-302s και miR-369s μπορεί να είναι μια αποτελεσματική θεραπευτική επιλογή για τη θεραπεία του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Καρκίνος του παχέος εντέρου κυττάρων γραμμές ΗΤ29, DLD-1, κύτταρα SW480, HCT116, Caco2, Colo201, RKO, και Lovo και τερατοκαρκινώματος κυτταρική γραμμή NTERA (NTera 2 /cl.D1 [NT2 /D1]) ελήφθησαν από RIKEN (Tsukuba, Japan). Αυτά τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Nakalai Tesque, Kyoto, Japan) με 10% FBS (Gibco Life Technologies, Τόκιο, Ιαπωνία) και 500 μg /ml πενικιλίνης-στρεπτομυκίνης.

Επιμόλυνση

Ειδικές Mirs και αρνητικού ελέγχου (NC) miR χρησιμοποιούνται σε

in vitro

και

in vivo

ανάλυση αγοράστηκαν (Gene Σχεδιασμός Inc., Οσάκα, Ιαπωνία? S1 πίνακα). Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ειδικές Mirs και NC miR χρησιμοποιώντας λιπομόλυνση (LP) ή ανθρακικό απατίτη (CA). Σε LP, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με Mirs χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη iMax (Invitrogen, Darmstadt, Germany) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Κυττάρων επαναπρογραμματισμό

ΗΤ29 κύτταρα και κύτταρα DLD-1 διαμολύνθηκαν με 10 ηΜ κάθε miR χρησιμοποιώντας CA. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε RPMI-1640 με 10% FBS για 24 ώρες και επιμόλυνσης επαναλαμβάνεται κάθε δύο ημέρες για ένα σύνολο τριών φορών. Μετά την τρίτη επιμόλυνση, τα κύτταρα σπάρθηκαν επί επικαλυμμένων με Matrigel και κατεργασμένων με μιτομυκίνη Ο εμβρυϊκών ινοβλαστών ποντικού (MEF). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε εμβρυϊκό αρχέγονο μέσο κυτταρικής καλλιέργειας που περιέχει DMEM /F12 (Gibco Life Technologies, Tokyo, Japan), συμπληρωμένο με 2 mM GlutaMAX, 20% αντικατάσταση knockout ορού (Gibco Life Technologies), 0,1 mM μη βασικά αμινοξέα (ΝΕΑΑ, Gibco Ζωή Technologies), 10 ng /ml παράγοντα βασικής ανάπτυξης ινοβλάστης (bFGF, Wako, Tokyo, Japan), 55 μΜ 2-μερκαπτοαιθανόλη (Gibco Life Technologies), 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη, και χημικοί αναστολείς, συμπεριλαμβανομένων 0,5 μΜ A83-01 (Stemgent , Cambridge, ΜΑ), 3 μΜ CHIR99021 (Stemgent), και 0.5 μΜ PD0325901 (Stemgent), στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Media αλλάχθηκε κάθε δύο ημέρες και τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε 21%

2 θερμοκοιτίδα CO για επιπλέον 21 ημέρες. Κατά την περίοδο αυτή, τα εν λόγω καρκινικά κύτταρα παρακολουθήθηκαν για τον σχηματισμό ES-σαν αποικίες. Αυτά συλλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση με αλκαλική φωσφατάση (ΑΡ) Ζωντανοί Stain (500 Χ) (Invitrogen) χρησιμοποιώντας όλα-σε-ένα μικροσκόπιο φθορισμού (ΒΖ-9000? Keyence, Osaka, Japan) με την ψηφιακή φωτογραφική ικανότητα για επιλογή σύμφωνα με την τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για τη μελέτη Mirs αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης, τα κύτταρα DLD-1 επιμολύνθηκαν με BLOCK-iT Alexa φθορισμού Ελέγχου (Invitrogen) με CA ή LP. Εν συντομία, σπαρμένων κυττάρων DLD-1 σε μία πλάκα 6 φρεατίων επιμολύνθηκαν με BLOCK-iT Alexa Fluorescent Ελέγχου και φωτογραφήθηκαν μετά την επιμόλυνση χρησιμοποιώντας ένα Keyence ΒΖ-8000 μικροσκόπιο. Η ένταση φθορισμού των επιμολυσμένων κυττάρων όπως παρατηρείται με χρήση διαλογέα κυττάρων FACS BD FACSAria III.

Λουσιφεράσης δοκιμασία

Το 3 ‘μη μεταφραζόμενη περιοχή (3′-UTR) του CDK2 ενισχύθηκε με RT-PCR χρησιμοποιώντας τους εκκινητές 5’-CTAGCTAGCTAGCCTTCTTGAAGCCCCCA-3 ‘και 5′-CTAGCTAGCGAGCTACAAACTAAATTACA-3’. Εκκινητές υποκλωνοποιήθηκαν, συνδέθηκε εντός του Expression pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target (Promega) χρησιμοποιώντας NheI, και επιβεβαιώθηκε με άμεση αλληλούχιση. Λουσιφεράσης δοκιμασίες διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας 5 χ 10

3 DLD-1 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε μια πλάκα 96 φρεατίων. Κύτταρα επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 3000 (Invitrogen) σε OptiMEM μειωμένη μέσα άνευ ορού (Gibco) με 200 ng κενό φορέα ή φορέα λουσιφεράσης-CDK2 3’UTR και είτε NC miR ή miR-302s (τελική συγκέντρωση, 25 nmol /L). Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με χρήση του Dual-Glo σύστημα δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. επίπεδο σε σχέση λουσιφεράσης υπολογίστηκε ως (Δείγμα Luc /ΚβηϊΙΙθ δείγματος) /(Έλεγχος ΚβηϊΙΙθ Luc /Control), όπου Luc είναι η δραστηριότητα της λουσιφεράσης πρώτες πυγολαμπίδας και Renilla είναι η δραστηριότητα του εσωτερικού ελέγχου επιμόλυνσης της λουσιφεράσης.

δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων

για να εκτιμηθεί ο πολλαπλασιασμός και η ευαισθησία του ΑΡ-θετικών ES-σαν σχηματισμού αποικιών καρκινικά κύτταρα σε 5-φθοριοουρακίλη (5-FU, Kyowa Hakko Kirin Co, Tokyo, Japan), 1 × 10

3 κύτταρα εκτίθενται σε διάφορες συγκεντρώσεις της 5-FU για 72 ώρες σε μία πλάκα 96 φρεατίων. Βιώσιμα κύτταρα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την κυτταρική Μετρώντας Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Molecular Technologies, Tokyo, Japan). Για να εκτιμηθεί η επίδραση αυτών των υποδεικνύεται Mirs στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τα κύτταρα ΗΤ29 και κύτταρα DLD-1 (5 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε μία πλάκα 12 φρεατίων) επιμολύνθηκαν με είτε miR-302s, miR-302s συν miR -369s, ή NC miR, όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα κύτταρα μετρήθηκαν καθημερινά για τρεις ημέρες, αρχής γενομένης 24 ώρες μετά την επιμόλυνση.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής, 5 × 10

4 DLD-1 κύτταρα επιμολύνθηκαν με κάθε miR σε πλάκα 24 φρεατίων, σε επεξεργασία με θρυψίνη μετά από 72 ώρες, πλύθηκε με φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) και σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη σε πάγο. Μετά τη φυγοκέντρηση, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 50 mg /ml διάλυμα ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) (Dojindo Molecular Technologies) και 0,1 mg /ml RNase Α (Invitrogen) και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ένα διαλογέα κυττάρου FACS BD FACSAria III. Κάθε ιστόγραμμα κατασκευάστηκε με δεδομένα από τουλάχιστον 10.000 συμβάντα και χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του ποσοστού του πληθυσμού κυττάρων σε κάθε φάση.

Κυττάρων εισβολή

δοκιμασία

δοκιμασίες εισβολή Transwell διεξήχθησαν σε 24- και τροποποιημένα θάλαμοι προ-επικαλυμμένα με Matrigel (BD BIOCOAT, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). DLD-1 κύτταρα και SW480 κύτταρα επιμολυσμένα με είτε 10 nM του miR-302s, miR-369s, miR-302s συν miR-369s και NC miR χρησιμοποιώντας CA. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και επανα-εναιωρούνται σε συγκέντρωση 10 × 10

4 κύτταρα /ml σε μέσο χωρίς ορό, και 0.5 ml κυτταρικού εναιωρήματος προστέθηκε στην κορυφή της κάθε φρεάτιο του. Μετά από 48 ώρες επώαση, τα κύτταρα μεταναστεύουν εντός του κατώτερου θαλάμου, που περιέχει 10% FBS ως χημειο-προσελκυστικό, σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με Wright-Giemsa χρώση (Diff-Quick? Sysmex, Kobe, Japan). Τέσσερα τυχαία πεδία μετρήθηκαν εις τριπλούν. Τα δεδομένα εκφράζονται ως η μέση τιμή με το πρότυπο σφάλμα του μέσου (SEM) του εισέβαλαν κυττάρων σε μία σχετική αναλογία σε σύγκριση με NC miR-αγωγή καρκινικών κυττάρων.

διαφοροποίηση κυττάρων μελέτη

Για να προσδιοριστεί η ικανότητα διαφοροποίησης των παραγόμενων ES-σαν σχηματισμού αποικιών καρκινικά κύτταρα

in vitro

, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε επιπλέοντα καλλιέργειας για να σχηματίσουν εμβρυοειδή σώματα (EBS). Μετά από 4-5 ημέρες, η EBS μεταφέρθηκαν σε πλάκες 0,1% επικαλυμμένες με ζελατίνη και καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 με 10% FBS για 14 επιπλέον ημέρες.

RNA ανάλυση

Ολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen, Tokyo, Japan). ποιότητα του RNA εκτιμήθηκε με NanoDrop ND-1000 φασματοφωτόμετρο (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) στα 260 και 280 nm (Α260 /280). Η αντίστροφη μεταγραφή (RT) για miR διεξήχθη

in vitro

με την Taqman Reverse Transcription Kit microRNA (Applied Biosystems, Tokyo, Japan). qPCR διεξήχθη με την καθολική Taqman PCR Master Mix (Applied Biosystems).

RT-PCR

έκφραση RNU48 in vitro και έκφρασης RNU6B in vivo χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικός έλεγχος για να προσδιοριστεί η σχετική έκφραση του miR. RT για miR διεξήχθη

in vitro

με miScript II RT Kit (Qiagen, Tokyo, Japan). qPCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας το miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen). έκφραση RNU6B χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Πολλαπλών μεταβολών υπολογίστηκαν και κανονικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο CT. mRNA επίπεδα προσδιορίστηκαν με χρήση του συστήματος αντίστροφης μεταγραφής (Promega, Tokyo, Japan) και LightCycler FastStart Αντίδραση Mix SYBR Green Ι σε μια Lightcycler (Roche, Tokyo, Japan). Όλα τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν με ένα έλεγχο GAPDH. μελέτες έκφρασης RNA ήταν ανεξάρτητα επαναλαμβάνεται τουλάχιστον τρεις φορές για να επιβεβαιώσετε την επαναληψιμότητα.

ανάλυση Πρωτεΐνη

επίπεδα πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με ανοσοαποτύπωση. Αντισώματα έναντι Bak (1: 200, Santa Cruz, Santa Cruz, CA), Bid (1: 200, Santa Cruz), Bcl-2 (1: 1000, CST, Τόκιο, Ιαπωνία), Bcl-XL (1: 1000, CST), Mcl-1 (1: 1000, CST), Caspase8 (1: 1000, CST), Caspase3 (1: 1000, CST), CyclinD1 (1: 200, Santa Cruz), CDK2 (1: 200, Santa Cruz ), CDK4 (1: 200, Santa Cruz), E-cadherin (1: 1000, CST), βιμεντίνη (1: 1000, CST), Zeb1 (1: 1000, CST), φωσφο-Rb (Ser807 /811) ( 1: 1000, CST), και το ACTB εσωτερικού ελέγχου (1: 2000., Sigma Aldrich, Tokyo, Japan) χρησιμοποιήθηκαν

ανοσοαποτύπωσης

οι σβώλοι κυττάρων λύθηκαν σε πάγο δροσερό ραδιοανοσοκαθίζησης ρυθμιστικό δοκιμασίας με αναστολέα πρωτεάσης. Οι πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας την δοκιμασία Bradford. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε 4-10% Mini-PROTEAN προκατασκευασμένων πηκτωμάτων (BioRad, Tokyo, Japan). Μετά από ολονύκτια ηλεκτροφορητική μεταφορά σε μεμβράνη PVDF, οι μεμβράνες αποκλείσθηκαν με Blocking Μία λύση (Nacalai Tesque, Tokyo, Japan) για 1 ώρα και επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C με το πρωτογενές αντίσωμα υποδεικνύεται. Τέλος, οι μεμβράνες επωάστηκαν με δευτερεύον αντι-ποντικού ή κουνελιού IgG ολόκληρο συζευγμένο με υπεροξειδάση (GE Healthcare Life Sciences, Tokyo, Japan) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. συνδέεται με τις στοχευόμενες πρωτεΐνες αντισώματος οπτικοποιήθηκε με χημειοφωταύγεια χρησιμοποιώντας Amersham ECL Prime Western Blotting Αντιδραστηρίων Ανίχνευσης (GE Healthcare Life Sciences).

Η ανοσοκυτταροχημεία

Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με PBS και διαποτισμένη με 0.1% TritonX-100 για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μη ειδική σύνδεση παρεμποδίστηκε με επώαση σε αίγα ή ορό αλόγου (Vectastain, Funakoshi, Tokyo, Japan) για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού αντι-ανθρώπου Oct3 /4 (1: 400, MBL, Ναγκόγια, Ιαπωνία), πολυκλωνικά κουνελιού αντι-ανθρώπινης Sox2 (1: 400, MBL), μονοκλωνικό ποντικού αντι-ανθρώπινο Nanog (1: 2000, CST ), μονοκλωνικό ποντικού αντι-ανθρώπινο Ki-67 αντιγόνο (1: 400, ϋΑΚΟ) και μονοκλωνικά αντι-ανθρώπινης Ε-καντερίνης (1: 200, CST). Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και υφίσταται κατεργασία με δευτερεύον αντίσωμα για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Δευτερογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αντι-κουνελιού IgG (Η + L), F (ab ‘) 2 θραύσμα (Alexa Fluorr 488 Σύζευγμα, 1: 1000, CST) ή IgG αντι-ποντικού (Η + L), F (ab’) 2 θραύσματος (Alexa Fluorr 555 Σύζευγμα) (1: 1000, CST). Οι πυρήνες βάφτηκαν με αντιδραστήριο παρατείνει Χρυσό αντιξεθωριάσματος με DAPI (Invitrogen). Οι εικόνες συλλήφθηκαν με Keyence ΒΖ-8000 μικροσκόπιο.

μεθυλίωσης του DNA ανάλυση

miR302-επιμολυσμένα DLD-1 καρκίνος παχέος κύτταρα αναλύθηκαν για DNA μεθυλίωση. Εν συντομία, τα κύτταρα επιμολυσμένα με miR-302s ή την παρωδία ελέγχου. Μεθυλιωμένος πρωτεΐνες ανοσοκαταβυθίστηκαν από το προϊόν λύσης κυττάρου χρησιμοποιώντας πρωτεΐνη μεθυλίωση δέσμευσης. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε προσδιορισμό αλληλουχίας (Takara, Kyoto, Japan) για να ληφθεί ολόκληρο δεδομένα μεθυλίωσης του DNA γονιδιώματος κλίμακα. Δεδομένων μεταξύ των δύο δειγμάτων συγκρίθηκαν για να προσδιοριστεί η απόκριση της μεθυλίωσης του DNA με miR-302s επιμόλυνση.

ιστόνης μεθυλίωση ανάλυση

εξόρυξη ιστόνης και τη μέτρηση των παγκόσμιων επίπεδα μεθυλίωσης των ιστονών 3 λυσίνη-4 (H3K4 ) διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το κιτ Παγκόσμια ιστόνης Η3-K4 μεθυλίωση σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή (Abnova, Ταϊπέι, Ταϊβάν).

ποντίκι μελέτη

οι μελέτες σε πειραματόζωα διεξήχθησαν αυστηρά σύμφωνα με τις αρχές και διαδικασίες που έχουν εγκριθεί από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα του Πανεπιστημίου της Οσάκα (αριθμός έγκρισης, 24-122-011). Η δοκιμασία ογκογονικότητα εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα

in vivo

μοντέλο ξενομοσχεύματος. Πρώτον, 5 × 10

6 κύτταρα αιωρούνται σε ένα συνολικό όγκο 200 μL DMEM /Matrigel (1: 1 (ν /ν) εναιώρημα) εγχύθηκαν στα πλευρά του 7-8 εβδομάδων θηλυκά ποντίκια (BALB /cAJcl-ηυ /ηυ). Όταν οι όγκοι του όγκου φθάσει τα 100 mm

3, όπως μετράται με παχύμετρο και υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τον τύπο V = (ab

2) /2, όπου α είναι το μήκος και b είναι το πλάτος, οι όγκοι συλλέχθηκαν και κομμένα σε 3 -4 χιλιοστών

3 τμήματα για σειριακή μεταμόσχευση. Οι τομές για να επιβεβαιωθεί vasculaturization με ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας CD31, ένα αγγειακού ενδοθηλιακού δείκτη. Διαδοχικά μεταμοσχευμένα ξενομοσχεύματα ΗΤ29 είχε την πιο άφθονη αγγείωση, ομοιόμορφα κατανεμημένα σε όλο το όγκου, και είχε την ελάχιστη ποσότητα κεντρική νέκρωση. σύμπλοκα Mirs /CA χορηγήθηκαν χρησιμοποιώντας μια βελόνα 30G μέσω της φλέβας της ουράς. Το μέγεθος του όγκου και το σωματικό βάρος μετρήθηκαν μία φορά κάθε 3 ημέρες. Ξενομοσχεύματος όγκους και αίμα ποντικού συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της θυσίας και διατηρούνται σε 10% ουδέτερη ρυθμισμένου φορμαλίνης για ιστολογική εξέταση και ανοσοϊστοχημικές μελέτες ή σε Αντιδραστήριο RNAlater RNA Σταθεροποίηση (Qiagen, Tokyo, Japan).

Ανθρακικό απατίτη παρασκευή

Για να προετοιμάσει ένα μείγμα CA επιμόλυνσης

in vitro

, 2 μg κάθε miR-302 (-a, -Β, -C, -D), miR-369 (-3p, -5p) ή NC miR αναμίχθηκε με 4 μΙ 1 Μ CaCl

2 σε 1 mL διττανθρακικού άνευ ορού (44 mM) -buffered μέσο ϋΜΕΜ (ρΗ 7,5) επωάστηκε στους 37 ° C για 30 λεπτά, και χρησιμοποιήθηκε για επιμόλυνση [15- 17]. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε κυρίως για

in vitro

πειράματα. Για

in vivo πειράματα

, ένα ανόργανο διάλυμα (0,9 mM Ν &

2 ΡΟ

4, 1,8 mM ΟαΟ

2, ρΗ 7.5) αντικατέστησε το διάλυμα DMEM. Για ένα ποντίκι, ένα μίγμα 15 μg εκάστου miR χρησιμοποιήθηκε για την εφάπαξ ένεση. Το διάλυμα φυγοκεντρήθηκε στις 12000 rpm για 3 λεπτά και το σφαιρίδιο διαλύεται σε 200 μΐ φυσιολογικού ορού που περιείχε 0,5% αλβουμίνη. Προϊόντα στο διάλυμα υποβλήθηκαν σε υπερήχους (38 kHz, 80 W) σε ένα λουτρό νερού για 10 λεπτά κάτω των 20 ° C για να δημιουργήσει σύμπλοκα miR /CA, η οποία έγινε ένεση ενδοφλεβίως εντός 5 λεπτών.

Τα δείγματα ασθενούς

Κλινικά δείγματα συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης από εννέα ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική εκτομή για καρκίνο του παχέος εντέρου στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Οσάκα και συναφή νοσοκομεία της το 2005. οι ασθενείς συνοψίζονται στον πίνακα S2. Όλοι οι ασθενείς ήταν σε συμφωνία με τη χρήση εκτομή δείγματα σε αυτή τη μελέτη, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές που εγκρίθηκαν από το Διοικητικό Θεσμικών Ερευνών (εγκεκριμένο πρωτόκολλο # 213).

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση

Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση έγινε σε 3.5 μm εγκλεισμένα σε παραφίνη τομές από ξενομοσχεύματα. ενσωματωμένες σε παραφίνη τομές από-παραφινοποιήθηκαν σε Hemo-De (Farma) και επανυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη σειρά αιθανόλης. Τα πλακίδια θερμάνθηκαν σε ρυθμιστικό ανάκτηση αντιγόνου για 40 λεπτά, αποκλείστηκαν με κατσίκα ή ορό αλόγου για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και επωάστηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-ανθρώπινου αντιγόνου Ki67 (1: 400, ϋΑΚΟ), πολυκλωνικό κουνελιού αντι-ανθρώπινο Oct3 /4 (1: 100, MBL), πολυκλωνικά κουνελιού αντι-ανθρώπινης Sox2 (1: 200, MBL), ή αντι-ανθρώπινο ΟΚ20 (ϋΑΚΟ) αντισωμάτων ποντικού μονοκλωνικό όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Το ABC σύστημα Vectastain (Vectastain, Funakoshi, Ιαπωνία) χρησιμοποιήθηκε για να απεικονίσει αντιγόνο. Counter-χρώση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αιματοξυλίνη.

ανοσοφθορισμού ανάλυση

ανάλυση ανοσοφθορισμού διεξήχθη επί 3,5 ​​μm τομών εγκλεισμένων σε παραφίνη από ξενομοσχεύματα για την ανίχνευση καρκινικών αγγείων. ενσωματωμένες σε παραφίνη τομές από-παραφινοποιήθηκαν και κατεργάστηκε όπως περιγράφεται για ανοσοϊστοχημεία. Οι τομές αποκλείσθηκαν με ορό κατσίκας για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και επωάστηκαν με αντι-ποντικού CD31 αντίσωμα αρουραίου (1:20, Dianova, Hamburg, Germany) επί μία νύκτα στους 4 ° C. Την επόμενη ημέρα, η IgG δευτερεύον αντίσωμα αντι-αρουραίου (Η + L), F (ab ‘) 2 θραύσμα (Alexa Fluorr555 συζυγές): εφαρμόστηκε (1 1000, CST). Οι τομές αντι-βάφτηκαν με Αντιδραστήριο παρατείνει Χρυσό αντιξεθωριάσματος με DAPI. Οι εικόνες συλλήφθηκαν με Keyence ΒΖ-8000 μικροσκόπιο.

βαφή Alcian Blue

βαφή Alcian Blue διεξήχθη επί 3,5 ​​μm τομών εγκλεισμένων σε παραφίνη από ξενομοσχεύματα για την ανίχνευση βλέννα. Εν συντομία, τα πλακίδια απο-pareffinized σε Hemo-De (Farma), επανυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη σειρά αιθανόλης, βυθισμένο σε 3% οξικό οξύ για 3 λεπτά, και χρωματίζονται με μπλε της Αλσατίας διάλυμα (1 g μπλε της Αλσατίας 8GX, 3 ml οξικού οξύ, και 97 ml αποσταγμένου νερού) για 20 λεπτά. Οι τομές στη συνέχεια πλένονται και οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με Kernechtrot (TCI, Tokyo, Japan) για 5 λεπτά.

Προσδιορισμός απόπτωσης

Η Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Biovision, Milpitas, CA) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή για το

in vitro

πρώιμη και όψιμη φάση ανίχνευση αποπτωτικών κυττάρων. Εν συντομία, για την ανίχνευση της απόπτωσης

in vitro

, 20 × 10

4 DLD-1 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-302s, miR-369s, miR-302s συν miR-369s ή NC miR χρησιμοποιώντας CA σε ένα πλάκα 6 φρεατίων εις τριπλούν 60 ώρες πριν από τη δοκιμασία. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ένα διαλογέα κυττάρου FACS BD FACSAria III. Τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Για την ανίχνευση διαλείμματα DNA σε αποπτωτικά κύτταρα

in vitro

, χρησιμοποιήσαμε το αδιέξοδο Φθορομετρικής TUNEL System (Promega) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με κάθε miR χρησιμοποιώντας CA χρησιμοποιώντας το Σύστημα Slide Nunc Lab-Tek II τμήμα (Fisher Scientific, Tokyo, Japan). Τα πλακίδια πλύθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση και μονιμοποιήθηκαν σε 4% φορμαλδεΰδη σε PBS για 25 λεπτά στους 4 ° C. Τα πλακίδια πλύθηκαν δύο φορές σε PBS και κατέστησαν διαπερατά σε 0.2% Triton Χ-100 σε PBS για 5 λεπτά. Τα πλακίδια στη συνέχεια πλύθηκαν σε PBS, εξισορροπημένη σε ρυθμιστικό διάλυμα εξισορρόπησης για 7 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και σημάνθηκαν με TdT μείγμα αντίδρασης επί 60 λεπτά στους 37 ° C σε υγροποιημένο θάλαμο για να αποφευχθεί η έκθεση φως. Τα πλακίδια βυθίστηκαν σε 2Χ SSC για 15 λεπτά για να σταματήσει η αντίδραση. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με τη χρήση με το αντιδραστήριο παρατείνει Χρυσό αντιξεθωριάσματος με DAPI. Τα αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν με μία Keyence ΒΖ-8000 μικροσκόπιο.

Για να ανιχνευθούν αποπτωτικά κύτταρα

in vivo

, μια δοκιμασία TUNEL διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, πλάκες-παραφινοποιήθηκαν σε Hemo-De, επανυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη σειρά αιθανόλης, βυθισμένο σε 0,85% NaCl, και μονιμοποιήθηκαν σε 4% φορμαλδεΰδη. Τα κύτταρα διαπερατά με διάλυμα /ml Πρωτεϊνάσης Κ 20 μg επί 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα πλακίδια εξισορροπημένη με Ρυθμιστικό Εξισορρόπησης για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και να επισημαίνονται χρησιμοποιώντας TdT μείγμα αντίδρασης επί 60 λεπτά στους 37 ° C σε υγροποιημένο θάλαμο. Τα πλακίδια βυθίστηκαν σε 2Χ SSC για 15 λεπτά για να σταματήσει η αντίδραση. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με χρήση αντιδραστηρίου παρατείνει Χρυσό αντιξεθωριάσματος με DAPI. Αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν από Keyence BZ-8000 μικροσκόπιο.

Αποτελέσματα

Η ενδογενής έκφραση του miR-302s και miR-369s σε πρωτογενείς όγκους και κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου

προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι το miR-302a, -Β, -C, και-d (miR-302s), miR369-3p, -5p (miR-369s) και miR-200c θα μπορούσε να προκαλέσει κυτταρικό επαναπρογραμματισμό σε φυσιολογικά σωματικά κύτταρα [13]. Εδώ, θα palneed να επαναπρογραμματίσει τα καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιούν αυτές τις Mirs. Ξεκινήσαμε με τη διερεύνηση της ενδογενούς έκφρασης αυτών των Mirs σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές και κλινικά δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου (Σχήμα 1Α και 1Β). Η έκφραση του miR-302s σε καρκίνο του παχέος εντέρου ήταν πολύ χαμηλά ή μη ανιχνεύσιμα σε σύγκριση με εκείνη σε ανθρώπινα τεράτωμα κύτταρα NTERA, τα οποία εκφράζουν φέρεται ESC-ειδικά γονίδια και χρησιμοποιούνται ως κύτταρα ελέγχου για την αξιολόγηση της έκφρασης ESC-όπως γονίδιο σε πολλές μελέτες [2, 3, 5, 11]. Αντιθέτως, η έκφραση του miR-200c ήταν υψηλή σε εννέα πρωτογενείς όγκους που εξετάστηκαν και πολλές κυτταρικές σειρές, όπως ΗΤ29. Τα επίπεδα έκφρασης του miR-302s και miR-369s ήταν χαμηλότερη σε σύγκριση με εκείνη του miR-200c, υποδηλώνοντας ότι η έκφραση miR-200c είναι ήδη υψηλή σε πολλά καρκινικά κύτταρα κόλου και μπορεί να είναι ανθεκτική σε εξωγενή υπερέκφραση. Στη συνέχεια, επιμολυσμένα μόνο miR-302s ή miR-369s σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Για τη βελτιστοποίηση

in vivo

πειράματα, τα οποία μιμούνται πρωτογενείς όγκους, μελετήσαμε τα πρότυπα χρώση ανοσοφθορισμού του CD31, ενός αγγειακού ενδοθηλιακού δείκτη, χρησιμοποιώντας ϋΑΡΙ αιματοξυλίνης πυρήνες, σε ξενομοσχεύματα της ΗΤ29, DLD-1 και τα κύτταρα SW480 (Εικ 1C). ΗΤ29 ξενομοσχεύματα είχε την πιο άφθονη αγγείωση, ομοιόμορφα κατανεμημένα σε όλο το όγκου, και το ελάχιστο ποσό του νέκρωση. Περαιτέρω ανάλυση του καρκίνου επαναπρογραμματισμό του miR-302s και miR-369s έγινε κυρίως με κύτταρα ΗΤ29 και άλλες συμπληρωματικές κυτταρικές σειρές.

Α) Σχετική έκφραση του ενδογενούς miR-302s (miR-302a, -Β, -C, και-d), miR-369s (miR-369-3p και -5p), και miR-200c σε πρωτογενείς όγκους και κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου. Η τερατοκαρκινώματος κυτταρική γραμμή ανθρώπινης NTERA χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Β) έκφραση Mirs σε ΗΤ29, DLD-1 και SW480 κυττάρων (η = 3). Γ) Ανάλυση ανοσοφθορισμού της έκφρασης CD31 σε ξενομοσχεύματα από ΗΤ29, DLD-1 και τα κύτταρα SW480. ξενομοσχεύματα ΗΤ29 εκτίθενται πολλά CD31-θετικά περιοχές με μικρή νέκρωση. Ράβδοι κλίμακας, 200 μm. Δ) σχετική έκφραση του miR-302s και miR-369s σε κύτταρα ΗΤ29 24 ώρες μετά την επιμόλυνση των 30 ηΜ miR-302s συν miR-369s (n = 3). NC, αρνητικός έλεγχος. Ε) σχετική έκφραση του miR-302s σε κύτταρα ΗΤ29 σε ημέρες 2 και 6 μετά την επιμόλυνση του miR-302s (n = 3). NC, αρνητικός έλεγχος. F) Για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης, ένα σημασμένο με φθορισμό dsRNA ολιγομερές επιμολύνθηκε με ανθρακικό απατίτη (CA) ή λιπομόλυνση (LP) σε κύτταρα DLD-1. Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης αξιολογήθηκε με μικροσκοπία φθορισμού και κυτταρομετρία ροής μετά από μία μόνο διαμόλυνση, όπως υποδεικνύεται. Ζ) Η σχετική έκφραση των miR-302s σε κύτταρα ΗΤ29 48 ώρες μετά την επιμόλυνση από την CA ή LP (n = 3).

Η

Η εξωγενής εισαγωγή του miR-302s και miR-369s προκαλεί κυτταρικό επαναπρογραμματισμό

επιμολυσμένα miR-302s συν miR-369s σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου χρησιμοποιώντας CA για την επίτευξη επιπέδων έκφρασης miR παρόμοια με εκείνα των κυττάρων NTERA, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος (Εικόνα 1D) [13]. Επιβεβαιώσαμε ότι το miR-302s ήταν αποτελεσματικά επιμολυσμένα (Σχήμα 1 Ε). Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης χρησιμοποιώντας CA ήταν υψηλότερη από εκείνη του LP υπό συνθήκες μας (Σχήμα 1F και 1G). Ως εκ τούτου, η μέθοδος CA χρησιμοποιήθηκε σε όλα τα επόμενα πειράματα.

Για να καθοριστεί εάν τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να επαναπρογραμματιστούν χρησιμοποιώντας Mirs, εξετάσαμε την επίδραση της εισαγωγής του εξωγενούς miR-302s με και χωρίς miR-369s τρεις φορές κατά τη διάρκεια της περίοδο επιμόλυνση. Την ημέρα 6, τα κύτταρα ήπια επεξεργασία με θρυψίνη, μεταφέρθηκαν πάνω σε MEF κύτταρα τροφοδότες, και καλλιεργήθηκαν για επιπλέον 21 ημέρες σε μέσο ES με τρεις χημικοί αναστολείς (3θ? 0,5 ​​μΜ A83-01, ένας αναστολέας ALK4 /5/7 υποδοχέα? 3 μΜ CHIR99021 , ένας αναστολέας της GSK-3β? και 0,5 μΜ PD0325901, έναν αναστολέα ΜΕΚ) (σχήμα 2Α) [5,13,18]. Γύρος αποικίες που προκαλείται κατά την επιμόλυνση των ΗΤ29 με miR-302s. Αυτές οι αποικίες ήταν παρόμοιες με αυτές των ΟΚΕ /iPSCs και προφανώς διαφορετικά από αυτά των μητρικών κυττάρων (Σχήμα 2Β). ΟΚΕ /iPSCs είναι γνωστό ότι είναι αλκαλική φωσφατάση-θετικά, έτσι ώστε να βάφονται τα κύτταρα χρησιμοποιώντας το ΑΡ ζωντανή λεκέ (Σχήμα 2C) να εντοπίσει και να πάρει αποικίες που αποτελούνταν από πραγματικά επαναπρογραμματιστούν κύτταρα [19]. Μεταξύ των κυττάρων που σχηματίζουν αποικίες ES-όπως, ΑΡ

+ αλλά όχι AP

– κύτταρα έδειξαν μία αύξηση των επιπέδων έκφρασης του OCT3 /4, SOX2 και Nanog (Σχήμα 2D) και miR-302s (Σχήμα 2Ε). Κύτταρα επιμολυσμένα με miR-302s συν miR-369s ή miR-302s και μόνο ήταν AP

+ σε καλλιέργεια μετά από 28 ημέρες από τον επαναπρογραμματισμό. Αυτά επαναπρογραμματιστούν κύτταρα εξέφρασαν πολυδύναμα πρωτεΐνες δείκτες, όπως Oct3 /4, Sox2, Nanog, και TRA-1-60 (Σχήμα 2F).

Α) Καθεστώς των μεθόδων του καρκίνου του επαναπρογραμματισμού με επιμόλυνση του miR-302s ή ΜΙΚ 302s συν miR-369s. Β) miR-302s επαγόμενη μορφολογικές αλλαγές στα κύτταρα ΗΤ29 σε ημέρες 1, 6, και 28. επαναπρογραμματιστούν ΗΤ29 έχουν εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα-όπως εμφάνιση. Ράβδοι κλίμακας, 100 μm. C) Τα κύτταρα χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας αλκαλική φωσφατάση (ΑΡ) των ζώντων λεκέ. Ράβδοι κλίμακας, 100 μm. Δ) Σχετική έκφραση

OCT3 /4

,

SOX2

και

Nanog

σε σύγκριση με το AP

– κύτταρα από qRT-PCR (n = 3). Ε) Η σχετική έκφραση των miR-302s και miR-369s στο AP

+, ΑΡ

– και NTERA κύτταρα. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. 0.05. Τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.