Αφηρημένο

Ιστορικό

Το γεγονός ότι οι υποδοχείς για την απόπτωση TNF που σχετίζονται με την πρόκληση συνδέτη (TRAIL) είναι σχεδόν πάντοτε εκφράζονται σε καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) αντιπροσωπεύει το σκεπτικό για την απασχόληση TRAIL-υποδοχείς στόχευση ενώσεων για την θεραπεία των ασθενών που πάσχουν από αυτού του όγκου. Ωστόσο, πρώτες εκθέσεις σχετικά με τη χρήση αυτών των βιοδραστικών παραγόντων που παρέχονται απογοητευτικά αποτελέσματα. Ως εκ τούτου υποθέσαμε ότι η απώλεια του συνδεδεμένου με μεμβράνη TRAIL-R μπορεί να είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα κάποιου CRC και ότι η αξιολόγηση της χρώσης της μεμβράνης και όχι εκείνη του συνολικού έκφραση του TRAIL-R θα μπορούσε να προβλέψει την απόκριση σε TRAIL-R στόχευση ενώσεων σε αυτό τον όγκο .

Σκοπός και Μέθοδοι

Έτσι, αξιολογήσαμε το πρότυπο ανοσοφθορισμό του TRAIL-υποδοχέων και Ε-καδερίνης για την αξιολόγηση του κλάσματος του συνδεδεμένου με μεμβράνη TRAIL-υποδοχείς σε 231 επιλεγμένους ασθενείς με πρώιμου σταδίου CRC υποβάλλονται μόνο χειρουργική θεραπεία. Επιπλέον, ερευνήσαμε αν χρώση μεμβράνης για TRAIL-υποδοχείς καθώς και η παρουσία των μεταλλάξεων KRAS ή της αστάθειας του μικροδορυφορικού DNA (MSI) είχε επιπτώσεις στην επιβίωση και έτσι μια προγνωστική ισχύ.

Αποτελέσματα

Όπως ήταν αναμενόμενο, όλα σχεδόν τα δείγματα CRC χρωματίστηκαν θετικά για TRAIL-R1 και 2. Αντ ‘αυτού, χρώση μεμβράνης για αυτούς τους υποδοχείς ήταν θετική σε μόνο 71% και 16% των δειγμάτων, αντίστοιχα. θα μπορούσε να ανιχνευθεί καμία συσχέτιση μεταξύ της κατάστασης μετάλλαξης του KRAS ή MSI-φαινότυπο και την πρόγνωση. TRAIL-R1 ένταση χρώσης συσχετίζεται με την επιβίωση στην μονοπαραγοντική ανάλυση, αλλά μόνο μεμβρανώδη χρώση του TRAIL-R1 και TRAIL-R2 στις κυτταρικές μεμβράνες ήταν ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης επιβίωσης (COX πολυπαραγοντική ανάλυση: TRAIL-R1: p = 0,019, RR 2,06 [1,12 -3,77]? TRAIL-R2:. p = 0,033, RR 3,63 [1,11 – 11,84])

Συμπεράσματα

σε αντίθεση με τις τρέχουσες υποθέσεις, η απώλεια της χρώσης μεμβράνης για TRAIL-υποδοχείς είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό της πρώιμης CRC στάδιο, το οποίο αντικαθιστά την προγνωστική σημασία της έντασης χρώσης τους. Η αποτυχία να επιτευχθεί θεραπευτικά αποτελέσματα σε πρόσφατες κλινικές δοκιμές με χρήση TRAIL-υποδοχείς που στοχεύουν ενώσεις μπορεί να οφείλεται σε ανεπαρκή επιλογή των ασθενών που φέρουν όγκους με δεσμευμένο σε μεμβράνη TRAIL-υποδοχείς

Παράθεση:. Kriegl L, Jung Α, Horst D, Rizzani Α, Jackstadt R, Hermeking H, et al. (2012) αστάθεια μικροδορυφόρου, KRAS μεταλλάξεις και η κυτταρική κατανομή του TRAIL-υποδοχείς σε πρώιμα στάδια του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 7 (12): e51654. doi: 10.1371 /journal.pone.0051654

Επιμέλεια: Rakesh Κ Srivastava, Το Πανεπιστήμιο του Κάνσας Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 του Φλεβάρη 2012? Αποδεκτές: 5, Νοέμβρη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 20 του Δεκεμβρίου 2012

Copyright: © 2012 Kriegl et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) με την DFG επιχορήγηση 605 /2-1 με EDT και από την Else Kröner-Fresenius Stiftung με τη χορήγηση 2011_A226 να EDT. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ορθοκολικό καρκίνωμα (CRC) είναι μια κοινή κακοήθεια που αντιπροσωπεύουν πάνω από 1 εκατομμύριο περιπτώσεις όγκων σε όλο τον κόσμο και εκπροσωπεί την τέταρτη όγκων που σχετίζονται αιτία θανάτου. Δυστυχώς, ενώ θεραπευτική χειρουργική θεραπεία είναι εφικτές σε ασθενείς με όγκους σε αρχικό στάδιο, η πρόγνωση των ασθενών με προχωρημένη ασθένεια παραμένει απογοητευτική [1].

Τα τελευταία χρόνια, οι πρόοδοι στην κατανόηση της βιολογίας του CRC έχουν οδήγησε στη δημιουργία πολλών θεραπειών που βασίζονται σε μηχανισμούς. Μετά την αναγνώριση της π.χ. ο ρόλος του EGF-R και VEGF-R στον πολλαπλασιασμό και την αγγειογένεση, αρκετές ενώσεις όπως cetuximab, panitumumab ή bevacizumab υποβληθούν σε κλινικές έρευνες και έδειξαν να επηρεάσει θετικά την επιβίωση των ασθενών [2] – [4]. Αναμένεται ότι μια ολοκληρωμένη απογραφή της συνεισφοράς δίνεται από μονοπάτια ενιαία σηματοδότηση για καρκινογένεση θα επιτρέψει την απασχόληση των θεραπειών προσαρμοσμένα σε περιορισμένο αριθμό μεμονωμένων μοριακών στόχων.

Μια άλλη πρόσφατη περίπτωση μιας θεραπείας μηχανισμό που βασίζεται εκπροσωπείται με την ανάπτυξη ενώσεων με στόχο τις «θάνατος-υποδοχείς» TRAIL-R1 και TRAIL-R2 για να επάγει εκλεκτικά απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα [5]. Η ανάπτυξη τέτοιων παραγόντων βασίζεται στην λογική που παρέχονται από μελέτες που δείχνουν ότι χτυπώντας έξω από TRAIL ή απόφραξη του TRAIL-υποδοχέων οδηγεί σε ενισχυμένη σχηματισμό όγκου και τη μετάσταση

in vivo

[6] και ότι η απώλεια του TRAIL-υποδοχέων έκφρασης σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου συσχετίζεται με κακή πρόγνωση και την υποτροπή του όγκου (κριτική από Walczak και οι συνεργάτες του [7]). Από αυτή την άποψη, θα μπορούσαμε πρόσφατα δείχνουν ότι η χρώση μεμβράνης για TRAIL υποδοχείς καθορίζει την πρόγνωση των ασθενών που πάσχουν από ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [8] και ότι η έκφραση του διαλυτού OPG παραπλανητικού υποδοχέα δέσμευσης TRAIL συσχετίζεται με το στάδιο του όγκου και τον σχηματισμό μεταστάσεων σε ασθενείς που έχουν προσβληθεί με καρκίνωμα του παχέος εντέρου [9]. Επί του παρόντος οι διάφορες TRAIL-υποδοχείς στόχευση ενώσεων που υποβάλλονται σε κλινική έρευνα σε διαφορετικές οντότητες του όγκου [5], [7].

Προηγούμενη αναδρομικές μελέτες που δείχνουν μια σχεδόν αμετάβλητη χρώση για TRAIL-υποδοχέων του παχέος δείγματα καρκίνου αντιπροσώπευαν το σκεπτικό για την απασχόληση του TRAIL-υποδοχέων που στοχεύουν παράγοντες στη θεραπεία αυτού του όγκου. Απροσδόκητα όμως, η ποσοτική εκτίμηση του TRAIL-υποδοχέων χρώση ένταση συσχετίστηκε με διαφορετικές προγνωστική αποτελέσματα σε αυτές τις μελέτες [10] – [13]. Επιπλέον, πρώτες εκθέσεις για τις κλινικές δοκιμές πρώιμη φάση με TRAIL-υποδοχείς στόχευση ενώσεων σε CRC έδειξαν απογοητευτικά αποτελέσματα, προκαλώντας περαιτέρω διερεύνηση σε ένα πιθανό ρόλο των υποδοχέων για TRAIL ως θεραπευτικός στόχος σε αυτή του όγκου.

Για να αντιμετωπιστεί αυτό πρόβλημα ερευνήσαμε μια σειρά ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου πρώιμο στάδιο χωρίς κομβικές ή μακρινή μετάσταση υποβάλλονται σε καμία άλλη θεραπεία από χειρουργική επέμβαση, και κατηγοριοποιούνται δείγματα όγκου σύμφωνα με την παρουσία ή απουσία του TRAIL-υποδοχείς στην επιφάνεια των κυττάρων του όγκου ως εναλλακτική λύση για το σόλα ημιποσοτική εκτίμηση του TRAIL-υποδοχέων χρώση χρησιμοποιούνται σε προηγούμενες μελέτες. Βρήκαμε ότι παχέος εντέρου παρουσιάζουν ετερογενή πρότυπο έκφρασης του TRAIL υποδοχέα-1 και -2 σε σχέση με μεμβρανώδη εμφάνισής τους. Οι διαφορές στην έκφραση του TRAIL-υποδοχέων σε διαφορετικές υποκυτταρικά διαμερίσματα, αντί ένταση χρώσης τους προέβλεψε ανεξάρτητα την πρόγνωση των ασθενών CRC, αντιπροσωπεύοντας έτσι έναν δείκτη ταυτοποίηση ενός υποσυνόλου των όγκων που έχουν χάσει την ευαισθησία στην απόπτωση με τη μεσολάβηση υποδοχέων.

Υλικά και Μέθοδοι

Κλινικά δείγματα

Καρκίνος του παχέος εντέρου δείγματα από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή με θεραπευτική πρόθεση μεταξύ των ετών 1994 και 2004, στο Πανεπιστήμιο του Μονάχου ανασύρθηκαν από το αρχείο του Ινστιτούτου Παθολογίας του πανεπιστημίου μας. Η συλλογή των δειγμάτων και των πληροφοριών των ασθενών έγινε σε ανώνυμη μορφή, σε συμφωνία με τις κατευθυντήριες γραμμές της επιτροπής δεοντολογίας του Πανεπιστημίου του Μονάχου. Μόνο παχέος αδενοκαρκινώματα με μέτρια διαφοροποίηση (G2 σύμφωνα με την ταξινόμηση WHO), T-κατηγορίες Τ2 και Τ3 έχοντας ούτε κομβικών (N0) ούτε μακρινή μετάσταση (Μ0) κατά το χρόνο της διάγνωσης, και έτσι σε φάση Ι και ΙΙΑ σύμφωνα με την ΤΝΜ ταξινόμηση του καρκίνου του παχέος εντέρου, θεωρήθηκαν (Τ2 /T3N0M0 G2) [14]. Επιπλέον, για να ελαχιστοποιηθεί μια πιθανή επιρροή του ράδιο- ή χημειο-θεραπεία επί TRAIL-υποδοχείς κατάσταση [15], [16] και την πρόγνωση των ασθενών, οι ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε εισαγωγική ή επικουρική θεραπεία εκτός από χειρουργική θεραπεία εξαιρέθηκαν από την παρούσα κοόρτη. δεδομένα επιβίωσης ανακτήθηκαν από το μητρώο του όγκου του Μονάχου (www.tumoregister-muenchen.de). Περιπτώσεις είχαν λογοκριθεί όπου οι ασθενείς είχαν χάσει την παρατήρηση ή έχασαν τη ζωή τους οφείλεται σε άλλους λόγους από καρκίνο του παχέος εντέρου. Η μελέτη συμμορφωθεί με τις απαιτήσεις της επιτροπής δεοντολογίας του Ludwig-Maximilian Universität του Μονάχου.

Κατασκευή μικροσυστοιχίες ιστού

παχέος μικροσυστοιχίες ιστού (TMA) κατασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Εν συντομία 5 μm Η &? Ε τομές των σταθεροποιημένων με φορμαλίνη τομές παραφίνης (FFPE) δείγματα όγκου χρησιμοποιήθηκαν για να καθορίσουν αντιπροσωπευτικές περιοχές βιώσιμου ιστού του όγκου. Από αυτούς τους τομείς 1,0 χιλιοστά βελόνα διαμέτρου πυρήνα βιοψίες ελήφθησαν από αντίστοιχες περιοχές στο μπλοκ του όγκου FFPE χρησιμοποιώντας ένα arrayer ιστού (Beecher Instruments, η Sun Prarie, WI, USA). Οι πυρήνες τοποθετήθηκαν σε μπλοκ παραφίνης συστοιχία υποδοχής σε καθορισμένες συντεταγμένες. Για να εξασφαλιστεί ότι οι αντιπροσωπευτικές μέρη των όγκων ερευνήθηκαν ελήφθησαν τρεις πυρήνες του κάθε όγκου. Για να ληφθεί επίσης η ετερογένεια του όγκου υπόψη, δοκιμίων από κεντρικές περιοχές των όγκων, καθώς και από το μεταναστευτικό μέτωπο. Οι πυρήνες στο μπλοκ παραφίνης επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 37 ° C για τη βελτίωση της πρόσφυσης μεταξύ πυρήνων και παραφίνη του τμήματος αποδέκτη.

Ανοσοϊστοχημεία

χρώση ανοσοϊστοχημική έγινε σε τομές 5 μm του ΤΜΑ μπλοκ. Αντι-TRAIL-R1 μονοκλωνικό αντίσωμα κατσίκας (Santa Cruz Biotechnology Inc., Χαϊδελβέργη, Γερμανία Cat.No. sc-6823), αντι-TRAIL-R2 μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (Calbiochem, California, USA Cat.No. PC392), Ε- καντερίνης μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (Invitrogen, Carlsbad, CA) εφαρμόστηκαν ως πρωτογενές αντίσωμα. Coimmunofluorescence διεξήχθη χρησιμοποιώντας την ακόλουθη φλουορεσκεΐνη σημασμένα δευτερογενή αντισώματα: για TRAIL-υποδοχείς ΡΙΤΟ-συζευγμένο αντι-κατσίκας IgG (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, ΡΑ) και για Cdh1 ένα Cy3-συζευγμένο αντι-ποντικού IgG (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, ΡΑ). Αυτά τα αντισώματα είχαν προηγουμένως χρησιμοποιηθεί και επικυρώθηκαν [8]. Το αντιγόνο ανάκτηση έγινε με βρασμό των τμημάτων σε Target Ανάκτηση Solution (Dako, Αμβούργο, Γερμανία) με τη χρήση ενός φούρνου μικροκυμάτων 2 φορές κάθε 15 λεπτά στους 750 W. Η ενδογενής υπεροξειδάση παρεμποδίστηκε με επώαση σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 7,5% για 10 λεπτά. Vectastain ABC-Kit Elite καθολική (Vector Laboratories, CA, USA) μαζί με AEC χρωμογόνο (Zytomed Systems) χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη. Τέλος, πλάκες με αιματοξυλίνη (Vector).

Αξιολόγηση των TRAIL-R1 και TRAIL-R2 ανοσοϊστοχημεία

TRAIL-R1 και TRAIL-R2 ανοσοχρώση αξιολογήθηκε με την ταξινόμηση της έντασης χρώσης σύμφωνα με μια ημιποσοτική βαθμολογία που κυμαίνεται από 0 έως 2, αντίστοιχα για τα αρνητικά, ασθενών και ισχυρών θετικών βαθμούς ανοσοαντιδραστικότητα (Σχήμα 1). Σύμφωνα με το σκεπτικό ότι αποτελεί προϋπόθεση για την λειτουργική δράση του TRAIL-υποδοχέων είναι η έκφραση μεμβρανώδης επιφάνεια [18], μια δεύτερη αξιολόγηση έγινε με την κατηγοριοποίηση δείγματα όγκου σύμφωνα με την παρουσία ή απουσία του TRAIL-υποδοχέων χρώση στις κυτταρικές μεμβράνες, ανεξάρτητα από την ταυτόχρονη παρουσία κυτταροπλασματικών χρώσης και την ένταση χρώσης του (Εικόνα 2). Εκτός από την επιθεώρηση κατά το συμβατικό μικροσκόπιο φωτός, να διακρίνει με μεγαλύτερη ευαισθησία μεταξύ της μεμβράνης και κυτταροπλασματική χρώση για TRAIL-υποδοχείς, το πρότυπο ανοσοφθορισμό του συν-χρώση TRAIL-υποδοχέων και Ε-καδερίνης διεξήχθη με τη χρήση ομοεστιακού μικροσκοπίου (εκπρόσωπος μοτίβα χρώση σε Σχήμα 3). Εικόνες συλλήφθηκαν με μια συσκευή LSM 700 (Zeiss) χρησιμοποιώντας ένα σχέδιο Αχρωματικός 20 × /0,8 στόχο M27, ZEN 2009 λογισμικό (Zeiss) και τις ακόλουθες ρυθμίσεις: το μέγεθος της εικόνας 2048 × 2048 και 16 bit? pixel /παραμονής των 25,2 μs? pixel Μέγεθος 0,31 μm? ισχύς του λέιζερ 2%? πλοίαρχος κέρδος 600-1000. Μετά την εικόνα συλλαμβάνοντας τα πρωτότυπα αρχεία LSM μετατράπηκαν σε αρχεία TIFF. Για να εξαιρέσετε δείγματα μεταβλητότητα intraobserver αξιολογήθηκαν δύο φορές από έναν παρατηρητή που δεν είχαν καμία προηγούμενη γνώση της πρόγνωσης ή άλλων μεταβλητών κλινική-παθολογική. Παραδειγματικές χαρακτηριστικά του TRAIL-υποδοχέων χρώση σε δείγματα καρκίνου ή σε μη-όγκου του παχέος ιστούς δείχνεται αντίστοιχα στην Εικόνα 1, Εικόνα 2, και στο Σχήμα S1.

(Α) Ποσοστό δειγμάτων που δεν δείχνει χρώση, αδύναμα ή ισχυρή ανοσολογική αντίδραση. (Β-D): αντιπροσωπευτικά τυπική μικροσκοπική εμφάνιση χρώσης TRAIL-R1 (Β: αριθ. Χρώση C: ασθενής και D: ισχυρή χρώση). (Δ έως ΣΤ): χρώση του TRAIL-R2 (Ε:. Καμία χρώση F: αδύναμη και G: ισχυρή χρώση). Οι παρούσες τμήματα είναι εκπρόσωπος ενός παχέος καρκίνο βαθμού 2 στο στάδιο ΙΙ (T3N0M0) στην μεγέθυνση 630 ×.

Η

(Α) το ποσοστό των δειγμάτων όγκου δείχνει χρώση μεμβράνης για TRAIL-R1 και ρυμουλκουμένων R2. Εκπρόσωπος χαρακτηριστική μικροσκοπική εμφάνιση της χρώσης TRAIL-R1 με κυρίαρχο κυτταροπλασματική (Β) ή χρώση μεμβράνης (C). Τυπικό μοτίβο χρώσης TRAIL-R2 με κυρίαρχη κυτταροπλασματική χρώση (D) ή χρώση μεμβράνης (Ε). Μεγέθυνσης, × 800. Οι παρούσες τμήματα είναι εκπρόσωπος ενός παχέος καρκίνο βαθμού 2 στο στάδιο ΙΙ (T3N0M0) στην μεγέθυνση 630 ×.

Η

Εκπρόσωπος πρότυπο συν-χρώση του TRAIL-R1 και Ε-καδχερίνη στις κυτταρικές μεμβράνες ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα με συνεστιακή μικροσκοπία δείχνουν (Α) ένα πρότυπο κυρίαρχο έναντι χρώσης μεμβράνη (Β) μη μεμβρανώδη χρώση. Η χρώση για TRAIL-R1 (πράσινο, αριστερό πάνελ), E-cadherin (κόκκινο, μεσαίο πάνελ) και επικαλύψεις αυτών χρώση (δεξιά πλευρά).

Η

Αναλύσεις μεταλλάξεων KRAS

Για τις αναλύσεις των μεταλλάξεων στο εξόνιο 2 του ογκογονιδίου KRAS στο κωδικόνιο 12/13, υλικό αφέθηκε από μόνο 200 από τους 231 ασθενείς (86,6%). Ως εκ τούτου, γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από μικροδιατομής των περιοχών ιστού που περιέχει όγκου όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Pyro-αλληλούχιση έγινε χρησιμοποιώντας την πυρο-Gold κιτ (Qiagen, Germany) και HotStar Taq-πολυμεράσης (Qiagen, Germany). Το έναυσμα PF2 χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό αλληλουχιών αντι-νόημα. Η συσκευή PyroMark Ε24 (Qiagen, Γερμανία) και το λογισμικό PyroMark ™ Ε24 χρησιμοποιήθηκαν για αλληλούχιση, και αναλύει ακολουθία [20], [21].

σταθερότητας Μικροδορυφορικοί ανάλυση

Για να προσδιορίσετε την κατάσταση των μικροδορυφόρων σταθερότητας [μικροδορυφορικού σταθερότητα (MSS) ή υψηλού βαθμού αστάθεια μικροδορυφόρου (MSIH)], διερευνήθηκαν δύο δείκτες μονονουκλεοτίδης επανάληψη BAT-25 και BAT-26. DNA ενισχύθηκε σε duplex PCR (Qiagen κυτίο DNA Multiplex PCR, 100 ηΜ BAT25 και 100 ηΜ BAT26-ειδικούς εκκινητές – Πίνακας S3) εφαρμόζοντας το ακόλουθο προφίλ κύκλου: μετουσίωση στους 95 ° C για 15 λεπτά, 34 κύκλους μετουσίωσης στους 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 57 ° C για 90 sec και επέκταση στους 72 ° C για 60 δευτερόλεπτα, με ένα τελικό στάδιο επέκτασης στους 60 ° C για 30 λεπτά, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22], [23]. 1 μΐ του προϊόντος της PCR αναμείχθηκε με 18,5 μΙ υψηλά απιονισμένου φορμαμιδίου (HiDi φορμαμίδιο) και 0.5 μl DNA Μέγεθος Πρότυπο LIZ 500 /(-250) (αμφότερα Applied Biosystems, Darmstadt, Γερμανία). Αυτό το μίγμα μετουσιωμένης για 3 λεπτά στους 94 ° C, αμέσως τοποθετήθηκαν επί πάγου, και διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα ΑΒΙ 3130 Genetic Analyzer. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με τη χρήση λογισμικού GeneMapper (Applied Biosystems).

Ανάλυση της έκφρασης του KRAS4A μορφών ματίσματος και KRAS4B

Για την παρούσα έρευνα επαρκές υλικό αφέθηκε για μόνο 128 από 231 δείγματα όγκων (55,4 %). Επομένως ολόκληρο RNA απομονώθηκε από μικροδιατομή περιοχές όγκου χρησιμοποιώντας κιτ RNeasy (Qiagen? 74404) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Οι συγκεντρώσεις RNA μετρήθηκαν με υν-φωτομετρία. 200-1000 ng του απομονώσεις RNA μεταγράφηκαν ανάστροφα με την παρουσία 100 μΜ τυχαίων εξαμερών εκκινητών και των 200 U RevertAid ανάστροφης μεταγραφάσης (αμφότερα από Fermentas, St. Leon, Γερμανία? SO142, EP0441). 2 μΐ του ακατέργαστου RT-αντίδρασης χρησιμοποιήθηκαν ως το υπόδειγμα σε RT-qPCRs απασχολούν Light Cycler 480 Probes κύριο (Roche? 04902343001) με ειδικό εκκινητή ζεύγη και η Universal ProbeLibrary Probes (Roche – Πίνακας S3). Cp (κρίσιμο σημείο) τιμές της RT-qPCRs ειδικά για

KRAS4A, KRAS4B

και το γονίδιο αναφοράς

HPRT

(

υπο-ξανθίνη phosphoribosyl- τρανσφεράσης

) προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μια LightCycler 480 συσκευή (Roche). Όλες οι συγκεντρώσεις του

KRAS4A, KRAS4B

-ειδικών RNAs ομαλοποιήθηκαν στην έκφραση του

HPRT

γονίδιο (ΔCp). Πειράματα έγιναν εις διπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον δύο φορές. Για την επικύρωση της πειραματικό σύστημα, σχετικές ποσότητες των δύο παραλλαγές ματίσματος KRAS4A και KRAS4B αξιολογήθηκαν σε κυτταρικές σειρές SW948 και HCT15 όπως είχε περιγραφεί ότι SW948 εκφράζουν περισσότερο παραλλαγή KRAS4A από HCT15 κύτταρα [25]. Το αποτέλεσμα ήταν να αναπαραχθεί (Σχήμα S3) την επικύρωση έτσι το πειραματικό set-up. Επιπλέον, ανέγνωσε το σύστημά μας κατέδειξαν υψηλή ανθεκτικότητα ως καμπύλες βαθμονόμησης με τη χρήση ορίζεται ποσότητες μήτρας DNA έδειξε γραμμικότητα τουλάχιστον πάνω από τέσσερις καταγραφής κλίμακες κάτω σε 100 αντίτυπα του συγκεκριμένου τύπου RNA (Σχήμα S3).

Η στατιστική ανάλυση

Cross-πινακοποιήσεις υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher. Η ανάλυση Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση του καρκίνου συγκεκριμένες επιβίωση. Σημασία της στατιστική Kaplan-Meier ελέγχθηκε εφαρμόζοντας την δοκιμασία log-rank. Η πολυπαραγοντική ανάλυση έγινε με τη χρήση του πολυπαραγοντικό μοντέλο παλινδρόμησης Cox. Στατιστικά στοιχεία υπολογίστηκαν με τη χρήση του SPSS έκδοση 15.0 (SPSS Inc.). τιμές p & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

Ασθενείς και δείγματα

Η εξέταση για τα δείγματα καρκίνου διεξήχθη σε ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή με θεραπευτική πρόθεση. μεταξύ του 1994 και του 2004 στο ίδρυμά μας. Η επιλογή των δειγμάτων περιορίστηκε σε ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα με μέτρια διαφοροποίηση (G2), T-κατηγορίες Τ2 και Τ3 σε ασθενείς που έχουν ούτε κομβικών (N0) ούτε μακρινή μετάσταση (Μ0) κατά το χρόνο της διάγνωσης, και περιορίζεται σε ασθενείς που λαμβάνουν μόνο χειρουργική θεραπεία . Αυτό οδήγησε σε μια συλλογή από 231 ασθενών για την ανάλυση. Η συλλογή αποτελείται από 55% άνδρες και 45% γυναίκες ασθενείς. 64% των ασθενών ήταν ηλικίας άνω των 65 ετών (μέση ηλικία 56 ± 8,1 χρόνια), ενώ το υπόλοιπο 36% των ασθενών είχαν μέση ηλικία 75 ± 6,9 χρόνια. 85% των ασθενών που διαγνώστηκαν με όγκο στο στάδιο Τ3 ενώ το 15% των ασθενών που είχαν επηρεαστεί από έναν όγκο στο στάδιο Τ2. Τα δεδομένα επιβίωσης λογοκρίθηκε ως υπόθεση παρακολούθηση διακόπηκε ή ασθενείς πέθαναν για λόγους άλλους από καρκίνο του παχέος εντέρου. Τα χαρακτηριστικά αυτού του πληθυσμού ασθενών συνοψίζονται στον πίνακα 1.

Η

TRAIL-R1 και TRAIL-R2 χρώση σε ορθοκολικό καρκίνο δείγματα

Για να εκτιμηθεί η χρώση του TRAIL-υποδοχέων σε δείγματα όγκων πραγματοποιήσαμε την πρώτη ανάλυση ημι-ποσοτική με βάση την κατηγοριοποίηση των δειγμάτων σύμφωνα με την απουσία χρώσης, ή την παρουσία ενός ασθενούς ή ισχυρή ένταση χρώσης για τους αντίστοιχους υποδοχείς. Σύμφωνα με αυτό το κριτήριο, 87 (38%) των δειγμάτων καρκίνου του παχέος εντέρου έδειξε μια ισχυρή θετική χρώση, 129 (56%) παρουσίασαν ασθενή χρώση, ενώ 15 (6%) δείγματα χρωματίστηκαν εντελώς αρνητικά για TRAIL-R1 (Εικόνα 1). Όπως και σε δείγματα όγκων εξετάστηκε TRAIL-R2, μία ισχυρή χρώση παρατηρήθηκε σε 110 (48%) των περιπτώσεων, ένα αδύναμο χρώση σε 116 (50%), ενώ μόνο το 5 (2%) δείγματα χρωματίστηκαν αρνητικά για TRAIL-R2 (Εικόνα 1). Σε μία επακόλουθη ανάλυση προσδιορίσαμε την κυτταρική κατανομή του TRAIL-R1 και TRAIL-R2 με την κατηγοριοποίηση δείγματα όγκου ανάλογα με την παρουσία ή απουσία χρώσης για τις αντίστοιχες TRAIL-υποδοχείς επί των κυτταρικών μεμβρανών. Όπως κρίθηκε με ανοσοϊστοχημική χρώση και την επικαλυπτόμενη πρότυπο ανοσοφθορισμό του TRAIL-υποδοχέων και της Ε-καδερίνης, χρώση μεμβράνης για TRAIL-R1 θα μπορούσε να ανιχνευθεί σε 163 (71%) περιπτώσεις, ενώ αρνητική χρώση ή αποκλειστικά κυτταροπλασματική χρώση βρέθηκε σε 68 (29 %) περιπτώσεις. Για χρώση μεμβράνη TRAIL-R2 παρατηρήθηκε σε 36 περιπτώσεις (16%)? κυτταροπλασματικό ή αρνητική χρώση παρατηρήθηκε σε 195 περιπτώσεις (84%).

Ως εκ τούτου, ενώ τα περισσότερα δείγματα όγκου χρωματίζονται εντελώς θετικά για TRAIL υποδοχέα 1 και 2, το κλάσμα του όγκου που δείχνει δείγματα χρώση μεμβράνης για αυτούς τους υποδοχείς ήταν σημαντικά χαμηλότερα. Όταν η ένταση έκφρασης και η κυτταρική κατανομή του TRAIL-υποδοχέων σε δείγματα όγκων αναλύθηκαν σε σχέση με διάφορες μεταβλητές κλινικο-παθολογική συμπεριλαμβανομένου του καθεστώτος KRAS μετάλλαξη και την παρουσία αστάθεια μικροδορυφόρου, κανένας συσχετισμός θα μπορούσε να ανιχνευθεί όπως κρίνεται με την ακριβή δοκιμή του Fisher (Πίνακες S1 και S2).

προγνωστική σημασία της έκφρασης TRAIL-υποδοχέα και κυτταρικό εντοπισμό σε καρκίνο του παχέος εντέρου

Όταν η έκφραση του TRAIL-υποδοχέων θεωρήθηκε σε σχέση με την επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου, TRAIL -R1 ένταση χρώσης (υψηλή έκφραση εναντίον χαμηλή /καθόλου έκφραση) συσχετίστηκε με σημαντικά καλύτερη πρόγνωση: η 5-ετής επιβίωση των ασθενών που φέρουν όγκους με συνολική υψηλότερη TRAIL-R1 έκφραση ήταν 70% έναντι 56% των ασθενών με χαμηλό ή συνολικά δεν χρώση για TRAIL-R1? Η 10-χρόνος επιβίωσης για αυτούς τους ασθενείς ήταν αντίστοιχα 31% έναντι 25% (p = 0.008? Σχήμα 4Α). Επιπλέον, όταν τα δείγματα του όγκου σε κατηγορίες ανάλογα με την παρουσία ή απουσία χρώσης μεμβράνη για TRAIL-υποδοχείς, οι ασθενείς με όγκους που εμφανίζουν χρώση TRAIL-R1 στην επιφάνεια των κυτταρικών μεμβρανών έδειξαν να έχουν μια καλύτερη πρόγνωση εναντίον ασθενείς με κυτταροπλασματική ή καθόλου χρώση (5 ετής επιβίωση 65% έναντι 44%? 10-ετή επιβίωση: 30% έναντι 22%, p = 0,003 – Εικόνα 4Β)

(Α) επιβίωση οικόπεδο των ασθενών που πάσχουν από ορθοκολικό καρκίνο ACC. . με TRAIL-R1 ένταση χρώσης. Σε αυτό και τα ακόλουθα γραφήματα λογοκρίνονται περιπτώσεις υποδεικνύονται από ένα σταυρό. καμπύλες (Β) επιβίωση του πληθυσμού των ίδιων των ασθενών σε κατηγορίες ανάλογα με χρώση TRAIL-R1 επί της κυτταρικής μεμβράνης. (Γ) Η επιβίωση οικόπεδο των ασθενών σύμφωνα με την ένταση χρώσης για TRAIL-R2 (ισχυρές έναντι ασθενής έκφραση). plot (D) επιβίωση του πληθυσμού του ίδιου ασθενούς σε κατηγορίες ανάλογα με TRAIL-R2 κυτταρική κατανομή. (Ε) Η επιβίωση των ασθενών σύμφωνα με μεμβράνη κατάσταση χρώση των δύο TRAIL-υποδοχείς. Καμπύλες Kaplan-Meier αντιπροσωπεύουν συνολική επιβίωση σχετίζεται με χρώση μεμβράνης του υποδοχέα TRAIL 1 και 2 ασθενείς έναντι φέρουν όγκους χρώση αρνητική και για τους δύο υποδοχείς TRAIL.

Η

Όταν θεωρήθηκε χρώση TRAIL-R2, η ένταση της έκφρασης δεν συσχετίζονται σημαντικά με την επιβίωση (ρ = 0,17? Σχήμα 4C). Ωστόσο, εάν οι ασθενείς κατανεμήθηκαν ανάλογα με την παρουσία ή απουσία χρώσης για τις κυτταρικές μεμβράνες, κηλίδωση μεμβράνη για TRAIL-R2 σε δείγματα όγκων συσχετίστηκε με σημαντικά καλύτερη ασθενή επιβίωση (5-ετή επιβίωση: 83% έναντι 57%? 10- χρόνο επιβίωσης: 38% έναντι 26% p = 0,015? Σχήμα 4D). Όταν η επιβίωση των ασθενών αναλύθηκε σύμφωνα με τη διπλή θετικότητα για TRAIL-υποδοχείς, δηλαδή όταν η επιβίωση των ασθενών με ταυτόχρονη χρώση μεμβράνη για TRAIL-R1 και TRAIL-R2 συγκρίθηκε με εκείνη των ασθενών που δεν εμφανίζει χρώση ή κυτταροπλασματική χρώση μόνο, η επιβίωση των ασθενών με χρώση μεμβράνη και για τις δύο TRAIL υποδοχείς αυξήθηκε σε 92% έναντι 44% των ασθενών χωρίς μεμβρανώδη χρώση (p = 0.012, Εικόνα 4Ε). Μια περαιτέρω ανάλυση λαμβάνοντας υπόψη το πιθανώς ότι, όπως έχει ήδη αναφερθεί, KRAS μεταλλάξεις, μια μειωμένη ποσότητα της παραλλαγής ματίσματος KRAS4A σε σχέση με την παραλλαγή ματίσματος KRAS4B, ή MSI-φαινότυπο μπορεί να επηρεάσει την επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του παχέος [26] – [28] , απέτυχε να δείξει οποιαδήποτε σημαντική προγνωστική επίδραση στην ομάδα των ασθενών μας (Εικόνα S2).

Τέλος, για να αξιολογηθεί η συγκεκριμένη επίδραση του TRAIL-υποδοχέων χρώση για επιβίωση, μια ανάλυση παλινδρόμησης κατά Cox, συμπεριλαμβανομένων ταυτόχρονα την κυτταρική κατανομή του TRAIL υποδοχείς, η ένταση χρώσης τους και άλλες συναφείς μεταβλητές κλινικο-παθολογικές εκτελέστηκε. Αυτό έδειξε ότι η χρώση μεμβράνης για TRAIL-R1 και για TRAIL-R2 μεμονωμένα και ανεξάρτητα προβλέπει την επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου μας συλλογικά (TRAIL-R1: p = 0,019, RR 2,06 [1,12 – 3,77]? TRAIL-R2: p = 0,033 , RR 3,63 [1,11 – 11,84]). Αντίθετα, παρά τη σημαντική συσχέτιση βρέθηκε στη δοκιμή μακράς-rank, η ένταση της χρώσης /έκφραση του TRAIL-υποδοχείς δεν μπορούσε να επιβεβαιωθεί ως ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου για υποτροπή (Πίνακας 2).

Η

Συζήτηση

TRAIL-υποδοχείς στην παθοφυσιολογία και θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου

Η απώλεια του TRAIL-υποδοχέων έχει δειχθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου. Συγκεκριμένα, πολλές διαφορετικές μελέτες υποστηρίζουν την άποψη ότι TRAIL σηματοδότησης παίζει

in vivo

μια σημαντική λειτουργία στην πρόληψη σχηματισμού μετάστασης [29] – [32]. Πρόσφατα επίσης δείξει ότι η έκφραση του TRAIL-υποδοχέων συσχετίζεται με εκείνη αρκετών δεικτών απόπτωσης παρέχοντας έτσι μια σύνδεση μεταξύ του λειτουργικός ρόλος αυτών των υποδοχέων και προγνωστική σημασία τους [33].

Προηγούμενες εκθέσεις σχετικά με την σχεδόν πανταχού παρούσα έκφραση του TRAIL-υποδοχέων σε CRC αντιπροσώπευε το σκεπτικό για τη χρήση του TRAIL-υποδοχέων στόχευσης παράγοντες για την αντιμετώπιση αυτού του όγκου. Παραδόξως όμως, ενώ η συχνή απώλεια του TRAIL-υποδοχείς έχουν αναφερθεί για διάφορες οντότητες του όγκου θα μπορούσαν να αποτελέσουν εμπόδιο για την κλινική αποτελεσματικότητα αυτών των ενώσεων [8], [10], [34], [35] δεν υπάρχει συστηματική αξιολόγηση της χρώσης μεμβράνη TRAIL υποδοχείς σε δείγματα CRC είναι διαθέσιμη. Επιπλέον, πρώτες εκθέσεις σχετικά με τις κλινικές δοκιμές πρώιμη φάση με TRAIL-υποδοχείς στόχευση αγωνιστικά αντισώματα σε CRC απέτυχε να παρουσιάζει σαφείς ενδείξεις αποτελεσματικότητας [36] με αποτέλεσμα την περαιτέρω διερεύνηση επί TRAIL-υποδοχείς ως θεραπευτικός στόχος για τη θεραπεία αυτού του όγκου. Για την αντιμετώπιση αυτού του ζητήματος, βασίζοντας την πρόσφατα ευρήματα μας στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [8] που εξέδωσε την αξιολόγηση της κυτταρικής διανομής TRAIL-υποδοχέων ως κριτήριο για την αξιολόγηση της προγνωστικής σημασίας τους. Επίσης, για τη μείωση των πιθανών παραγόντων πόλωση, αποφασίσαμε να αναλύσουμε ένα ομοιογενές συλλογική ασθενή με όγκους σε πρώιμο στάδιο, χωρίς μετάσταση υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση και μόνο. ​​

Προγνωστική σημασία της TRAIL-υποδοχέων χρώση ένταση

Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες [10], [12], [13], σε ομάδα μας, η μεγάλη πλειοψηφία των δειγμάτων έδειξε θετική χρώση για TRAIL-R1 και TRAIL-R2, σχεδόν το ήμισυ των δειγμάτων που δείχνει μια ισχυρή χρώση (Σχήμα 1). Όπως έχουμε αξιολόγησε την προγνωστική σημασία του TRAIL-υποδοχέων χρώση, TRAIL-R1 βαθμολογίες ένταση χρώσης (ισχυρή έναντι χαμηλής /no-χρώση) έδειξε σημαντική συσχέτιση με την επιβίωση στη δοκιμή μακράς-rank, υψηλότερη TRAIL-R1 ένταση χρώσης που σχετίζονται με καλύτερη επιβίωση (ρ = 0.008, Εικόνα 4Α)? Αντίθετα, TRAIL-R2 ένταση χρώσης, KRAS-κατάσταση, η σχετική ποσότητα της παραλλαγής ματίσματος KRAS4A ή MSI-φαινοτύπου δεν έδειξε συσχέτιση με την επιβίωση (Σχήμα 4C, το Σχήμα S2). Τα αποτελέσματα αυτά είναι σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες που ανέφεραν μια θετική συσχέτιση μεταξύ της επιβίωσης των ασθενών και την έκφραση του TRAIL-R1 [10], [33]. Για άγνωστους λόγους, καμία επίδραση [13] ή ακόμα και μια αρνητική συσχέτιση για TRAIL-R1, αλλά trendy θετική συσχέτιση για TRAIL-R2 με την επιβίωση έχουν επίσης αναφερθεί [12].

Προγνωστική σημασία της κυτταρικής κατανομής των ρυμουλκουμένων υποδοχείς ως εναλλακτική λύση για τη χρώση ένταση

στην προσπάθεια να αποσαφηνίσει περαιτέρω το θέμα αυτό, θα αξιολογηθεί στη συνέχεια αν η παρουσία ή απουσία χρώσης μεμβράνη TRAIL-υποδοχέων θα μπορούσαν καλύτερα συσχετίζονται με την επιβίωση, τότε η μόνη αξιολόγηση της έντασης χρώσης τους. Σε αντίθεση με την σχεδόν πανταχού παρούσα χρώση για TRAIL-υποδοχείς, ένα σημαντικό κλάσμα των δειγμάτων έδειξε χρώση αρνητική μεμβράνη για TRAIL-R1 και TRAIL-R2 (Σχήμα 2). Με την υιοθέτηση του κριτηρίου αυτού, πενταετής επιβίωση σε ασθενείς που φέρουν όγκους που εμφανίζουν TRAIL-R1 ή χρώση TRAIL-R2 σε κυτταρικές μεμβράνες ήταν υψηλότερη από αυτή των ασθενών που δεν δείχνει χρώση ή κυτταροπλασματική χρώση μόνο (Σχήμα 4). Οι ασθενείς που φέρουν όγκους με χρώση διπλής θετικής μεμβράνης και για τις δύο TRAIL υποδοχείς επέζησαν σημαντικά περισσότερο σε σύγκριση με τους ασθενείς που δείχνει χρώση διπλής αρνητικής μεμβράνης (Σχήμα 4Ε). Το γεγονός ότι στην πολυμεταβλητή ανάλυση που περιλαμβάνει την επίδραση της κυτταρικής κατανομής του TRAIL-υποδοχέων, καθώς και εκείνη των ένταση χρώσης τους, το τελευταίο δεν θα μπορούσε να επιβεβαιωθεί ως ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας υποδηλώνει ότι η ανίχνευση του TRAIL-υποδοχέων χρώση στην κυτταρική μεμβράνη είναι ο κύριος καθοριστικός παράγοντας της επιβίωσης: αυτό είναι συνεπές με τις διαθέσιμες για ασθενείς που πάσχουν από ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [8], με δεδομένα τα τελευταία

in vitro

στοιχεία για το ρόλο του TRAIL-υποδοχέων εσωτερικοποίηση στην αντίσταση στην TRAIL [18] , και με την έννοια ότι οι δεσμευμένες σε μεμβράνη TRAIL-υποδοχείς εκτίθεται στην επίδραση των κυκλοφορούντων TRAIL. Προηγούμενες μελέτες είχαν δείξει καμία προγνωστική σημασία για TRAIL-R2, ή μόνο μια τάση προς μια θετική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης αυτού του υποδοχέα και της επιβίωσης [12]? υποθέτουμε ότι η αποτυχία να αναγνωρίσει το ρόλο του TRAIL-R2 για τον προσδιορισμό της επιβίωσης των ασθενών σε προηγούμενες μελέτες αντανακλά την υψηλότερη προγνωστική σημασία της κυτταρικής κατανομής του TRAIL-υποδοχέων εναντίον εκείνη της έντασης χρώσης τους.

Κλινική συνέπειες της η λειτουργική έννοια του TRAIL-υποδοχέων χρώση στις κυτταρικές μεμβράνες

η απώλεια της έκφρασης του TRAIL-υποδοχέων έχει πιθανές συνέπειες όσον αφορά την απασχόληση των αγωνιστικών αντισωμάτων που στοχεύουν TRAIL-υποδοχείς αυτή τη στιγμή στο στάδιο των κλινικών ερευνών ως θεραπεία του καρκίνου: αν και θα μπορούσαμε να επιβεβαιώνουν ότι η μεγάλη πλειονότητα των όγκων χρωματίστηκαν θετικά για TRAIL-υποδοχείς, βρήκαμε ότι η απώλεια του TRAIL-υποδοχείς στην κυτταρική μεμβράνη είναι ένα σύνηθες χαρακτηριστικό του CRC με κυρίαρχη προγνωστική σημασία? θα πρέπει επομένως να εξεταστεί αν η μη δείχνει σημάδια αποτελεσματικότητα σε πρόσφατες κλινικές δοκιμές με χρήση TRAIL-υποδοχείς αγωνιστικά αντισώματα [36] μπορεί να οφείλονται σε ανεπαρκή επιλογή των ασθενών που φέρουν όγκους με δεσμευμένο σε μεμβράνη TRAIL-υποδοχείς. Από την άλλη πλευρά, λόγω της άθροισης των προγνωστικών αποτελεσμάτων του TRAIL-R1 και TRAIL-R2, οι ασθενείς εμφανίζουν χρώση μεμβράνης για τους δύο υποδοχείς θα μπορούσαν να επωφεληθούν από τη συνδυασμένη χορήγηση αντισωμάτων που στοχεύουν τους δύο υποδοχείς ή με την χορήγηση του ανασυνδυασμένου TRAIL [37] .

το γεγονός ότι, ανεξάρτητα από τον κυτταρικό εντοπισμό τους, σχεδόν όλα τα δείγματα όγκων έδειξε κάποια έκταση της χρώσης για TRAIL-υποδοχείς είναι σε συμφωνία με την ιδέα ότι η γενετική απώλεια ή μετάλλαξη του TRAIL-υποδοχέων είναι ένα σπάνιο γεγονός στην καρκινικά κύτταρα [34], [38]. Οι διαφορές στην κυτταρική κατανομή αυτών των υποδοχέων υποδηλώνει αντί ότι η ανεπάρκεια της TRAIL-υποδοχέων διακίνησης προς την εξωτερική κυτταρική μεμβράνη ή μηχανισμοί της εσωτερίκευσης παίζουν ρόλο στον προσδιορισμό της λειτουργικής απώλειας του TRAIL-υποδοχέων. Σε αυτό το πλαίσιο, ενδοκυττάρωση που διαμεσολαβείται από κλαθρίνη πρόσφατα περιγραφεί ως αιτία αντίστασης στην TRAIL σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [18] και διάφορες ενώσεις αποδείχθηκε ότι αυξάνουν την έκφραση του TRAIL-υποδοχέων, καθώς και τον εντοπισμό τους πάνω στις κυτταρικές μεμβράνες [39], [ ,,,0],40].