Αφηρημένο

Ιστορικό

καρκίνο των ωοθηκών

Τα επιθηλιακά είναι η πιο θανατηφόρα όλων των γυναικολογικών κακοηθειών, και υψηλού βαθμού ορώδες καρκίνο των ωοθηκών (HGSC) είναι η πιο κοινή υπότυπος του καρκίνου των ωοθηκών. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει τη συχνότητα και το είδος του σημείου σωματικές μεταλλάξεις στο HGSC χρησιμοποιώντας ένα πρωτόκολλο ανίχνευσης μετάλλαξης που ονομάζεται OncoMap ότι απασχολεί φασματομετρίας μάζας που βασίζεται σε τεχνολογία του γονότυπου.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

το Κέντρο για τον καρκίνο Γονιδιώματος Discovery (CCGD) Πρόγραμμα στο Αντικαρκινικό Ινστιτούτο Dana-Farber (DFCI) έχει προσαρμοστεί μια πλατφόρμα του γονότυπου υψηλής απόδοσης για τον προσδιορισμό της κατάστασης μετάλλαξης του μια μεγάλη ομάδα γνωστών γονιδίων του καρκίνου. Το πρωτόκολλο ανίχνευσης μετάλλαξης, που ονομάζονται OncoMap έχει επεκταθεί για να ανιχνεύσει περισσότερες από 1000 μεταλλάξεις στα ογκογονίδια 112 σε δείγματα ιστού μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE). Πραγματοποιήσαμε OncoMap σε ένα σύνολο 203 FFPE προχωρήσει ανέβασε HGSC δείγματα. Απομονώσαμε γονιδιωματικό DNA από αυτά τα δείγματα, και μετά από μια σειρά δοκιμασιών διασφάλισης της ποιότητας, έτρεξε κάθε ένα από αυτά τα δείγματα στην πλατφόρμα v3 OncoMap. δείγματα όγκων 56% (113/203) έτρεφε υποψήφιος μεταλλάξεις. Εξήντα-πέντε δείγματα είχαν απλές μεταλλάξεις (32%), ενώ τα υπόλοιπα δείγματα είχαν ≥2 μεταλλάξεις (24%). 196 υποψήφια κλήσεις μετάλλαξη έγιναν σε 50 γονίδια. Οι πιο κοινές σωματικές ογκογονίδιο μεταλλάξεις βρέθηκαν στο

EGFR

,

KRAS, PDGRFα, KIT και PIK3CA

. Άλλες μεταλλάξεις που βρέθηκαν σε επιπλέον γονίδια βρέθηκαν στις χαμηλότερες συχνότητες (& lt? 3%).

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

ανάλυση Sequenom χρησιμοποιώντας OncoMap επί ϋΝΑ που εξάγεται από FFPE δείγματα καρκίνου των ωοθηκών είναι εφικτή και οδηγεί σε η ανίχνευση δυνητικά druggable μεταλλάξεων. Screening HGSC για σωματικές μεταλλάξεις στα ογκογονίδια μπορεί να οδηγήσει σε πρόσθετες θεραπείες για αυτόν τον πληθυσμό ασθενών

Παράθεση:. Matulonis UA, Hirsch Μ, Palescandolo Ε, Kim E, Liu J, van Hummelen P, et al. (2011) Υψηλής Απόδοσης Ανάκριση των σωματικών μεταλλάξεων σε υψηλού βαθμού υδαρής καρκίνου των ωοθηκών. PLoS ONE 6 (9): e24433. doi: 10.1371 /journal.pone.0024433

Επιμέλεια: Λιν Ζανγκ, University of Pennsylvania School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Αυγ 2011? Αποδεκτές: 9, Αυγούστου 2011? Δημοσιεύθηκε: 8, Σεπτεμβρίου, 2011

Copyright: © 2011 Matulonis et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση ήταν παρέχονται από τις ακόλουθες πηγές: τον καρκίνο των ωοθηκών εξειδικευμένο πρόγραμμα της ερευνητικής αριστείας (P50CA105009), η Madeline Franchi ωοθηκών Ταμείου Καρκίνου, και του Εκτελεστικού Συμβουλίου Γυναικών του Ινστιτούτου Καρκίνου Dana-Farber. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Δρχ. Hahn και Drapkin λειτουργούν ως σύμβουλοι για και έχουν λάβει επιχορηγήσεις για την έρευνα από τη Novartis Pharmaceuticals. Αυτό δεν μετέβαλε την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές σχετικά με την κοινοχρησία δεδομένων και υλικών. Οι άλλοι συγγραφείς έχουν καμία σύγκρουση συμφερόντων να αναφέρουν.

Εισαγωγή

επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών είναι η πιο θανατηφόρα όλων των γυναικολογικών κακοηθειών, και οι νέες θεραπείες που απαιτούνται και για τις δύο νεοδιαγνωσθέντες ασθενείς, καθώς και όπως ασθενείς με υποτροπιάζοντα καρκίνο [1]. Εντός επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών, HGSC είναι η πιο κοινή υποτύπου και σχετίζεται με την αρχική ανταπόκριση σε χημειοθεραπεία κατά την πρώτη διάγνωση. Ωστόσο, οι περισσότεροι καρκίνοι επαναληφθεί και γίνονται όλο και πιο ανθεκτικά χημειοθεραπεία. Η επιτυχία της συμβατικής χημειοθεραπείας για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών έχει φθάσει σε ένα πλατώ, και τα νέα μέσα μοριακά και γενετικά χαρακτηρίζουν τον καρκίνο των ωοθηκών, προκειμένου να «εξατομίκευση» και βελτίωση της θεραπείας απαιτούνται [2], [3].

έχουν σημείο ενεργοποίηση μεταλλάξεων σε πρωτο-ογκογονίδια έχουν παρατηρηθεί σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους, και τέτοιες μεταλλάξεις μπορεί να προσδίδουν «ογκογονίδιο εθισμός» στις σχετικές καρκινικά κύτταρα [4]. Αυτή η εξάρτηση ογκογονιδίου παρέχει μια βάση για τη στόχευση ενεργοποιημένων ογκογονιδίων σε θεραπεία όπως αποδεικνύεται από την επιτυχία του imatinib και erlotinib σε καρκίνους που φιλοξενούν

BCL-ABL

και

EGFR

αλλαγές, αντίστοιχα. Άφθονα στοιχεία δείχνουν τώρα ότι αυτές οι μεταλλάξεις κέρδος-of-λειτουργία δεν συμβαίνουν τυχαία μέσα ογκογονίδια, αλλά αντ ‘αυτού, οι μεταλλάξεις που επηρεάζουν ένα σχετικά μικρό αριθμό κωδικονίων αντιπροσωπεύουν τη συντριπτική πλειοψηφία των γεγονότων ενεργοποίησης στον καρκίνο. Για παράδειγμα, απλές αλλαγές βάσεως στα κωδικόνια 12, 13 και 61 σε

KRAS

μεταλλάξεις αποτελούν την πλειοψηφία του ενεργοποίησης ογκογόνους μεταλλάξεις [5]. Ομοίως,

BRAF

μεταλλάξεις επηρεάζουν το κωδικόνιο 600 συνιστούν & gt? 90% του μελανώματος

BRAF

μεταλλάξεις? γενετικές αλλαγές σε επιπλέον 10-12 κωδικόνια αντιπροσωπεύουν περισσότερα από τα υπόλοιπα σχετίζονται με τον καρκίνο

BRAF

μεταλλάξεις έχουν ταυτοποιηθεί μέχρι σήμερα [6], [7].

Για τον προσδιορισμό αυτών των ογκογόνων μεταλλάξεων στο αρχειακό ιστούς, έχουμε προσαρμόσει μια πλατφόρμα προσδιορισμού του γονότυπου υψηλής απόδοσης για τον προσδιορισμό της κατάστασης μετάλλαξης ενός μεγάλου πάνελ γνωστών ογκογονιδίων του καρκίνου [8], [9]. Συγκεκριμένα, έχουμε αναπτύξει ένα πρωτόκολλο ανίχνευσης μετάλλαξης, που ονομάζεται OncoMap, η οποία απασχολεί φασματομετρίας μάζας με βάση τεχνολογία προσδιορισμού του γονότυπου (Sequenom) για την ταυτοποίηση ογκογόνους μεταλλάξεις. Η τρέχουσα έκδοση του πρωτοκόλλου αυτού είναι σε θέση να ανιχνεύσει περισσότερες από 1000 μεταλλάξεις σε 112 συνήθως μεταλλαγμένα γονίδια στα δύο φρέσκα δείγματα κατεψυγμένου και ενσωματωμένες σε παραφίνη ιστού. Η παρούσα έκθεση περιγράφει την επιτυχή εφαρμογή μας OncoMap σε μια σειρά ασθενών με προχωρημένο HGSC προκειμένου να εντοπίσει ογκογόνων μεταλλάξεων.

Αποτελέσματα

Στην αρχική OncoMap ανάλυση, 56% (113/203) των όγκων δείγματα έτρεφε υποψήφιος ογκογόνων μεταλλάξεων. Εξήντα-πέντε δείγματα είχαν απλές μεταλλάξεις (32%) ενώ το υπόλοιπο είχε ≥2 μεταλλάξεις (24%). Συνολικά, 196 υποψήφια κλήσεις μετάλλαξη έγιναν σε 50 γονίδια.

Τα συνηθέστερα μεταλλαγμένα ογκογονίδια ήταν

EGFR

(9,4%),

KRAS

(4,5%),

PDGFRα

(4,5%),

KIT

(3,0%), και

PIK3CA

(3%)? άλλοι που είχαν λιγότερο συχνά μεταλλάσσεται περιλαμβάνονται:

BRAF

(1%),

CUBN

(0,5%),

και οι ΕΡΑ

(2,5%). Επίσης προσδιορίζονται οι μεταλλάξεις σε πολλά άλλα γονίδια σε χαμηλότερες συχνότητες όπως οι εξής:

ABL1

(2,5%),

STK11

(2,5%),

EPHA1

(2%),

RET

(1,5%),

SMARCB1

(1,5%),

ATM

(1%),

FLT3

(1%),

MLL3

(1%),

MYC

(1%),

NF2

(1%),

Notch1

(1%),

ΝΤΡΚ1

(1%),

PIK3R1

(1%),

ROBO2

(1%),

APC

(0,5%),

FES

(0,5%),

FYN

(0,5%),

GATA1

(0,5%),

NF1

(0,5%),

NTRK3

(0,5 %),

PALB2

(0,5%),

PKHD1

(0,5%),

PTEN

(0,5%),

RUNX1

(0,5%) ,

ΠΕΑ

(0,5%),

SPTAN1

(0,5%), και

TSHR

(0,5%).

Η πιο κοινή σωματική μετάλλαξη που προσδιορίζονται περιλάμβανε την ογκοκατασταλτικό γονίδιο

ΤΡ53

, η οποία ανιχνεύθηκε στο 24.8% των δειγμάτων. Από OncoMap ανακρίνει μόνο ένα υποσύνολο των

TP53

μεταλλάξεις και δεν ανιχνεύει γεγονότα διαγραφή, η παρατηρούμενη συχνότητα

TP53

μεταβολές συμφωνεί με πρόσφατες εργασίες του Άτλαντα του έργου του καρκίνου Γονιδιώματος (TCGA) [10] ότι έχει επιβεβαιώσει το εύρημα ότι

TP53

μεταλλάξεις είναι η πιο κοινή σωματική μετάλλαξη σε καρκίνους HGSC. Επιπλέον, εντοπίστηκαν μεταλλάξεις σε άλλα γονίδια καταστολής όγκων, συμπεριλαμβανομένων

RB1 ​​

(3%) και

VHL

(3,5%).

Σωματικές μεταλλάξεις στη συνέχεια επικυρώνονται από την HME, και οι ακόλουθες επικυρώθηκαν:

EGFR

,

HRAS

,

KRAS

,

NRAS

,

PIK3CA

,

BRAF

,

RB1 ​​

,

TP53

,

ATM

,

CUBN

, και

FLNB

. Πίνακας S1 απαριθμεί τις επικυρωμένες μεταλλάξεις που βρέθηκαν στην ομάδα μας HGSC.

Συζήτηση

Η ομάδα μας απέδειξε ότι τα σωματικά ογκογονίδιο μεταλλάξεις μπορούν να ανιχνευθούν σε HGSC χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία που βασίζεται Sequenom ονομάζεται OncoMap ότι χρησιμοποιεί το DNA που προέρχεται από FFPE ιστούς. Αν και HGSC χαρακτηρίζεται από τον αριθμό αλλαγών αντιγράφου γονιδίου [11], χαμηλής συχνότητας μεταλλάξεις σε ένα αριθμό γονιδίων ογκογόνου βρέθηκαν στο 56% των καρκίνων σε 203 κοόρτη δείγμα μας, και πολλές από αυτές τις μεταλλάξεις είναι δυνητικά druggable χρησιμοποιώντας νέα βιολογικούς παράγοντες. Οι περισσότερες μεταλλάξεις βρέθηκαν σε χαμηλή συχνότητα, και οι περισσότερες ειδικές μεταλλάξεις βρέθηκαν σε λιγότερα από το 5% των δειγμάτων. Με επικύρωση HME διεξήχθη σε γονίδια που παρουσιάζουν ενδιαφέρον, και αρκετά σημαντικά γονίδια βρέθηκαν να μεταλλαχθεί? όλες οι μεταλλάξεις δεν επικυρώθηκαν λόγω του κόστους και το επίπεδο του ενδιαφέροντος. Στην κλινική πρακτική, αναμένουμε ότι όλες οι μεταλλάξεις που προσδιορίζονται από OncoMap προφίλ θα επικυρωθούν σε εργαστήρια CLIA εγκριθεί.

Έτσι, OncoMap η οποία χρησιμοποιεί την τεχνολογία Sequenom είναι σε θέση να ελέγξουν ανέξοδα για πολλαπλές μεταλλάξεις χρησιμοποιώντας DNA από δείγματα FFPE στην καρκίνων όπως HGSC που έχουν πολλαπλές μεταλλάξεις που υπάρχουν σε χαμηλή συχνότητα. Άλλα πλεονεκτήματα της OncoMap περιλαμβάνουν την ικανότητα να επεκτείνουν ταχέως τη βιβλιοθήκη μετάλλαξης «hotspot» καθώς οι πρόσθετες μεταλλάξεις ανακαλύφθηκαν και νέα νέα βιολογικούς παράγοντες δοκιμαστεί με επιτυχία. Περιορισμοί της OncoMap περιλαμβάνουν ότι μόνο «hotspot» Οι μεταλλάξεις που βρίσκεται και ότι η επικύρωση των μεταλλάξεων είναι απαραίτητο? άλλες μεταλλάξεις που δεν περιλαμβάνονται στο OncoMap πάνελ θα πρέπει να χαθεί. Παρά το γεγονός ότι είναι πλέον δυνατόν ολόκληρη exome ή αλληλουχίας ολόκληρο το γονιδίωμα σε ερευνητικά εργαστήρια, η συστηματική χρησιμοποίηση των τεχνολογιών αυτών σε τομές παραφίνης δείγματα δεν είναι δυνατή. Έτσι, OncoMap παρέχει μια γρήγορη, μέθοδο λογικό κόστος για τον εντοπισμό ογκογόνων μεταλλάξεων σε ανθρώπινα δείγματα καρκίνου.

Οι κλινικές επιπτώσεις των σωματικών μεταλλάξεων σε HGSC είναι άγνωστες και θα πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω. Σωματικές μεταλλάξεις σε καρκίνους μπορούν να οδηγήσουν σε συστατική ενεργοποίηση των οδών που κανονικά ενεργοποιείται από ενεργοποιημένους υποδοχείς αυξητικού παράγοντα σηματοδότησης, και αυτές οι μεταλλάξεις μπορούν να οδηγήσουν σε συνολική γενωμική αστάθεια [12]. Μεταβολές στα αριθμού αντιγράφων γονιδίου και η έκφραση του γονιδίου έχουν αμφότερα δειχθεί ότι είναι σημαντικά στον καρκίνο των ωοθηκών, ενώ οι μεταλλάξεις που πιστεύεται ότι είναι λιγότερο σημαντική [11].

Αρκετές μεταλλαγμένα ογκογονίδια ενδιαφέροντος βρέθηκαν σε ομάδα μας HGSC δείγματα που εξετάστηκαν και αναλύθηκαν με OncoMap.

EGFR

βρέθηκε να φιλοξενούν μεταλλάξεις σε κοντά στο 10% των περιπτώσεων, και οι αναστολείς του EGFR, όπως erlotinib θα μπορούσε να δοκιμαστεί σε αυτό το υποσύνολο των καρκίνων. Στον καρκίνο του πνεύμονα, αυτοί οι αναστολείς χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία καρκίνων που φιλοξενούν το εξόνιο 20 παραλλαγές, κωδικόνιο 719 παραλλαγές και υποκαταστάσεις L858R εκτός από άλλους τύπους

EGFR

μεταλλάξεων [13], [14]. Εντοπίσαμε HGSC με μια παραλλαγή κωδικόνιο 719, που επικυρώθηκαν από την HME. Έτσι, τον έλεγχο των αναστολέων EGFR φαίνεται δικαιολογημένη όταν ανιχνεύονται μεταλλάξεις του EGFR. Οι αναστολείς EGFR δοκιμαστεί σε καρκίνο των ωοθηκών με ποσοστά ανταπόκρισης 10% ή λιγότερο [15] – [17]? Ωστόσο, καμία από αυτές τις μελέτες προοπτικά δοκιμαστεί καρκίνους των ωοθηκών για μεταλλάξεις EGFR, μια πρακτική τώρα συνήθως γίνεται για μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα που έχει ως αποτέλεσμα την μοριακά στοχευμένη χρήση των αναστολέων EGFR.

EGFR

μεταλλάξεις και της έκφρασης δοκιμάστηκε για αναδρομικά Schilder et al, και μερική ανταπόκριση παρατηρήθηκε σε 1 ασθενή, ο οποίος είχε μια μετάλλαξη του EGFR [17].

ρυθμό μας

PIK3CA

μεταλλάξεις του 3% βρίσκονται σε HGSC παραλληλισμούς που διαπιστώθηκαν από το Sanger Κέντρο [18]. Άλλες ομάδες έχουν αναφερθεί χαμηλά ποσοστά και των δύο

ΑΚΤ

και

PIK3CA

μεταλλάξεις, αλλά υψηλότερη συχνότητα της ενίσχυσης του γονιδίου για

PIK3CA

[19]. Οι αναστολείς της οδού της PI3kinase βρίσκονται σήμερα υπό μελέτη στον καρκίνο των ωοθηκών, και δραστικότητα αυτών των παραγόντων έχει αναφερθεί στον καρκίνο των ωοθηκών [20], [21]. Για παράδειγμα, MK2206, ένας αναστολέας της ΑΚΤ, δοκιμάστηκε σε μία μελέτη Φάσης 1 σε ασθενείς με προχωρημένους συμπαγείς όγκους. Όλα τα 3 ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών που είχαν συμπεριληφθεί στη μελέτη αυτή έδειξε μια μείωση στα επίπεδα CA125 τους, γεγονός που υποδηλώνει δραστικότητα κατά του όγκου του ΜΚ-2206 στον καρκίνο των ωοθηκών. GDC0941, ένας αναστολέας PI3kinase, έχει επίσης αποδειχθεί δραστηριότητα στον καρκίνο των ωοθηκών ειδικά σε καταστάσεις

PIK3CA

ενίσχυσης. Με την ανάπτυξη πρόσθετων αναστολείς της οδού PI3kinase και λόγω της αντικαρκινική δράση αυτών των παραγόντων στον καρκίνο των ωοθηκών, τον εντοπισμό των εκτροπών της οδού αυτής θα καταστεί όλο και πιο σημαντική σε HGSC.

Άλλα επικυρωμένη γονίδια ενδιαφέροντος βρίσκονται στο μελέτη μας περιλαμβάνουν

BRAF

,

KRAS

,

HRAS

, και

NRAS

, και όλα αυτά τα γονίδια έχουν στη διάθεσή τους βιολογικούς παράγοντες που θα μπορούσαν να στοχεύουν τα αποτελέσματα αυτών ογκογόνο μεταλλάξεων.

Οι TP53

μεταλλάξεις που βρίσκονται συνήθως σε καρκίνο των ωοθηκών [22], και υποστηρίζει τα δεδομένα μας και παραλληλισμούς αυτά τα δεδομένα

Το έργο αυτό επιβεβαιώνει τα πρόσφατα δημοσιευμένα στοιχεία TCGA [10].? μελλοντικές μελέτες θα είναι αναγκαίο να συσχετίσει την παρουσία αυτών των μεταλλάξεων με βιολογική δραστικότητα και την πρόγνωση του καρκίνου και αν αυτές οι μεταλλάξεις προβλέψουμε αντικαρκινική δράση της στοχευμένης βιολογικούς παράγοντες. Επιπλέον, συσχετίζοντας σωματικές μεταλλάξεις με άλλες αντικειμενικές εκτιμήσεις της γενετικής μακιγιάζ των καρκίνων όπως προφίλ γονιδιακής έκφρασης και τον αριθμό αντιγράφων του γονιδίου θα είναι ζωτικής σημασίας για την κατανόηση μια πιο ολοκληρωμένη γενετική εικόνα της HGSC.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς και δείγματα ασθενών

αρχεία Παθολογίας εξετάστηκαν μεταξύ 1999 και 2004 από το Τμήμα Γυναικολογικής Παθολογίας στο Νοσοκομείο Brigham and Women της Βοστόνης MA, και της Διεθνούς Ομοσπονδίας Γυναικολογίας και Μαιευτικής (FIGO) στάδιο επιλέχθηκαν ΙΙΙ ή IV HGSC περιπτώσεις καρκίνου των ωοθηκών. Η Dana-Farber /Harvard Cancer Center Διοικητικό κριτική Θεσμική (IRB) χορήγησε την έγκριση για να συλλέξει δείγματα FFPE. Επειδή όλα τα δείγματα ήταν de-εντοπίστηκαν, η IRB μας τυγχάνει απαλλαγής για τη συλλογή των δειγμάτων, χωρίς τη συγκατάθεση του ασθενούς.

δείγματα FFPE εξετάστηκαν από μια γυναικολογική ογκολογία παθολόγο (ΜΗ), οι οποίοι αναθεωρούνται εκθέσεις παθολογίας, καθώς και FFPE μπλοκ ιστού και επιλέγονται οι περιοχές υψηλότερο ποσοστό καρκίνου που τελικά πυρήνα για την εκχύλιση του DNA. Οι ασθενείς με μεταλλάξεις βλαστικής σειράς γνωστών BRCA αποκλείστηκαν σε αυτό το σύνολο και να μελετηθούν σε ένα άλλο σύνολο δεδομένων. Επελέγησαν συνολικά 203 δείγματα.

εξαγωγή DNA και ποσοτικοποίηση

Το γονιδιακό DNA εξήχθη από τις πυρήνα δείγματα ασθενών ιστού FFPE με Kit ιστών QIAamp DNA FFPE (Qiagen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, πυρήνες αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο και περαιτέρω υπέστησαν λύση σε ρυθμιστικό διάλυμα μετουσίωσης λύσης που περιέχει πρωτεϊνάση Κ Το κυτταρόλυμα ιστός επωάστηκε στους 90 ° C για να αντιστραφεί φορμόλη διασταύρωσης. Χρησιμοποιώντας QiaCube, το λύμα εφαρμόστηκε στη στήλη πρόσδεσης DNA και η στήλη πλύθηκε σειριακά, και στη συνέχεια εκλούστηκε σε 30 μΙ αποσταγμένου νερού. Γονιδιωματικό DNA ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. 250 ng γονιδιωματικού DNA χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση.

OncoMap v3.0 πραγματοποιήθηκε σε όλα τα δείγματα, και τα γονίδια και ο αριθμός των μεταλλάξεων δοκιμάζεται στην παρούσα έκδοση του OncoMap εκδοχή παρατίθενται στον Πίνακα 1. Αρχικά, σχεδιάστηκαν εκκινητές που επιτρέπουν την ανίχνευση μετάλλαξης. Που προέρχονται από όγκους γενωμικό DNA υποβλήθηκε σε ενίσχυση ολόκληρο το γονιδίωμα. Στη συνέχεια, πολυπλεξίας PCR σε όγκο γονιδιακού DNA για να ενισχύσουν τις περιοχές που φιλοξενούν τόπους ενδιαφέροντος, ή νουκλεοτίδια «ερώτημα». Μετά την μετουσίωση, τα προϊόντα PCR επωάσθηκαν με ολιγονουκλεοτίδια τα οποία ανασυνδεθεί άμεσα παρακείμενη στην νουκλεοτιδίων ερωτήματος και μια αντίδραση επέκτασης εκκινητή εκτελέστηκε με την παρουσία αλυσίδας-τερματισμού δι-δεοξυνουκλεοτίδια που παράγουν τα προϊόντα DNA αλληλόμορφο-ειδική. Προϊόντα επέκτασης εκκινητή κηλιδώθηκαν πάνω σε ένα ειδικά σχεδιασμένο τσιπ και αναλύεται με φασματομετρία μάζας MALDI-TOF για τον προσδιορισμό της κατάστασης μετάλλαξης. Από αλληλόμορφο (ή μετάλλαξη) καλώντας εξαρτάται αποκλειστικά από τη μάζα του προκύπτοντος προϊόντος επέκτασης του εκκινητή, η δοκιμασία Sequenom δεν απαιτεί επισήμανση εκκινητή ακριβά φθορισμού και έχει ένα πολύ χαμηλό ποσοστό σφάλματος. Το κόστος λειτουργίας μόνο το OncoMap μεταλλακτική δοκιμασία είναι περίπου $ 200 ανά ανεξάρτητο δείγμα από τον αριθμό των δειγμάτων που τρέχουν.

Η

Αφού ταυτοποιήθηκαν μεταλλάξεις, την επικύρωση πραγματοποιήθηκε σε ένα επιλεγμένο υποσύνολο των μεταλλάξεων με τη χρήση του πολυ-βάσης ΗΜΕ χημεία επέκταση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8], [9]. Εκκινητές και ανιχνευτές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας Sequenom MassARRAY Δοκιμασία Σχεδιασμός 3,0 λογισμικού, εφαρμόζοντας τις παραμέτρους προεπιλεγμένη επέκταση multi-βάση, αλλά με τις ακόλουθες τροποποιήσεις: κατ ‘ανώτατο όριο εισόδου multiplex επίπεδο ρυθμίζεται σε 6? μέγιστη μπάλα επανάληψη βάσης ρυθμίζεται στο 200.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

Επικυρώθηκε Μεταλλάξεις από HME. Αυτός ο πίνακας παραθέτει τις επικυρωμένες μεταλλάξεις που βρέθηκαν στην ομάδα μας HGSC. Η επαλήθευση εκτελέστηκε από HME

doi:. 10.1371 /journal.pone.0024433.s001

(DOC)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελαν να αναγνωρίσουν τον Robert T. Jones, Χριστίνα Κ Go, και η Christine A. Roden για το έργο τους σχετικά με τις τεχνικές πτυχές της λειτουργίας OncoMap σε αυτά τα δείγματα.