Abstract

Το γονίδιο p53 είναι μεταλλαγμένο σε περισσότερο από το 50% των ανθρώπινων όγκων. Μεταλλαγμένη ρ53 ασκεί ένα ογκογόνο λειτουργία και συχνά άκρως εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα οφείλεται σε διαφυγή του πρωτεασώματος εξαρτώμενη από αποικοδόμηση. Έτσι, επανενεργοποίηση πρωτεασώματος εξαρτώμενη αποδόμηση της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης ρ53 είναι μια ελκυστική στρατηγική για τη διαχείριση του καρκίνου. Προηγουμένως, βρήκαμε ότι το τριοξείδιο αρσενικού (ΑΤΟ), ένα φάρμακο για την οξεία προμυελοκυτταρική λευχαιμία, υποβαθμίζει μεταλλαγμένης πρωτεΐνης ρ53 μέσω ενός μονοπατιού πρωτεασώματος. Ωστόσο, παραμένει ασαφές ποια είναι η Ε3 λιγκάση που στοχεύει μεταλλαγμένο p53 για την αποικοδόμηση. Στην παρούσα μελέτη, επιδιώξαμε να προσδιορίσει ένα απαραίτητο Ε3 λιγάση για ATO μεσολάβηση της υποβάθμισης του μεταλλαγμένου p53. Βρήκαμε ότι ΑΤΟ επάγει την έκφραση του Pirh2 Ε3 λιγάση στο μεταγραφικό επίπεδο. Βρήκαμε επίσης ότι η εξουδετέρωση της Pirh2 αναστέλλει, ενώ έκτοπη έκφραση της Pirh2 ενισχύει, ATO που προκαλείται υποβάθμιση της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης p53. Επιπλέον, βρήκαμε ότι Pirh2 Ε3 λιγάση αλληλεπιδρά φυσικά με και στοχεύει μεταλλαγμένο p53 για polyubiquitination και στη συνέχεια του πρωτεασώματος υποβάθμιση. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι ΑΤΟ συνεργάζεται με HSP90 ή αναστολέα HDAC την προώθηση αποικοδόμηση ρ53 μεταλλαγμένη και την καταστολή της ανάπτυξης σε κύτταρα όγκου. Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ATO προωθεί μεταλλαγμένο p53 υποβάθμιση εν μέρει μέσω της επαγωγής της Pirh2-εξαρτώμενο μονοπάτι πρωτεασώματος

Παράθεση:. Yan W, Jung YS, Zhang Υ, Chen X (2014) τριοξείδιο του αρσενικού επανενεργοποιεί Proteasome- Εξαρτημένη αποδόμηση της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης ρ53 σε καρκινικά κύτταρα στο μέρος μέσω ενισχυμένη έκφραση του Pirh2 Ε3 λιγάση. PLoS ONE 9 (8): e103497. doi: 10.1371 /journal.pone.0103497

Επιμέλεια: Yi Li, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30 Απρίλη 2014? Αποδεκτές: 3 Ιουλίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 12 Αυγούστου 2014

Copyright: © 2014 Yan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας Grant CA 121.137 και CA 076069. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, η συλλογή δεδομένων και η ανάλυση, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

εσφαλμένου νοήματος μεταλλάξεις του p53 γονίδιο, συγκεντρωμένα κυρίως εντός της περιοχής δέσμευσης DNA πυρήνα, συμβαίνουν σε ένα μεγάλο κλάσμα των ανθρώπινων όγκων [1]. Αυτές οι μεταλλάξεις παράγουν ρ53 πρωτεΐνες με μια αλλαγμένη δραστικότητα δέσμευσης DNA αλληλουχία-ειδική, η οποία δεν μπορεί να προκαλέσει μια σειρά των γονιδίων στόχων του ρ53 φυσικού τύπου για την καταστολή του όγκου [2]. Επιπλέον, οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες ρ53 βρέθηκαν να έχουν ογκογόνο δραστηριότητες, που ορίζεται ως κέρδος της λειτουργίας (GOF) [3], [4].

Οι επιδράσεις της μεταλλαγμένης ρ53 για την ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου είναι εκτεταμένες. Σε σύγκριση με ρ53-ηυΙΙ ποντικούς, μεταλλαγμένο ρ53 knock-in ποντίκια εμφανίζουν σημαντικά διαφορετικά φάσματα όγκου και υψηλή συχνότητα εμφάνισης μετάστασης όγκου [5] – [7]. Το πιο σημαντικό, οι κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι ένα υψηλό επίπεδο του μεταλλαγμένου ρ53 συσχετίζεται με περισσότερο επιθετικούς όγκους και χειρότερη έκβαση [8] – [10]. Επιπλέον, μεταλλαγμένη ρ53 είναι κλινικά σημαντική επειδή η έκφραση του καθιστά τα κύτταρα ανθεκτικά σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα [11], [12]. Προφανώς, το κέρδος της λειτουργίας του μεταλλαγμένου ρ53 εξαρτάται εν μέρει από την μεταγραφική δραστικότητα του [5], [13] – [18], και κυρίαρχη-αρνητική δραστικότητα του προς την οικογένεια ρ53 [19] – [23].

σε αντίθεση με άγριου τύπου ρ53, μεταλλαγμένης πρωτεΐνης ρ53 βρέθηκε να αποφύγει πρωτεασώματος εξαρτώμενη από την υποβάθμιση [24] – [28], που οδηγεί σε hyperstabilization του σε όγκους [29]. Αρκετοί μηχανισμοί μπορούν να προκαλέσουν μεταλλαγμένη πρωτεΐνη ρ53, προκειμένου να αποφύγει πρωτεασώματος εξαρτώμενη από αποικοδόμηση. Μια πιθανότητα είναι ότι σχετίζονται με όγκους στρες μπορεί να προκαλέσει την αλληλεπίδραση της μεταλλαγμένης ρ53 με τις πρωτεΐνες συνοδείας, όπως HSP70 και HSP90, που αδρανοποιεί Ε3 λιγάσες MDM2 και CHIP και συνεπώς σταθεροποιεί το μεταλλαγμένο ρ53 [24] – [27]. Πράγματι, η αναστολή της έκφρασης HSP90 ή δραστηριότητα απελευθερώνει MDM2 και τσιπ για να υποβαθμίσει ρ53 μεταλλαγμένη [26], [30]. Μια άλλη πιθανότητα είναι ότι το μεταλλαγμένο ρ53 είναι ικανό να σχηματίζει συσσωματώματα αμυλοειδούς σε όγκους, τα οποία είναι ανθεκτικά στην αποδόμηση του πρωτεασώματος [27], [31]. Η ικανότητα του μεταλλαγμένου σταθεροποίησης ρ53 παρουσιάζει μια θεμελιώδη αίνιγμα σε θεραπευτική παρέμβαση για τους ασθενείς με καρκίνο με ένα μεταλλαγμένο ρ53. Έτσι, η αποτελεσματική επανενεργοποίηση του πρωτεασώματος εξαρτώμενη αποδόμηση της μεταλλαγμένης ρ53 σε καρκινικά κύτταρα έχει θεραπευτική σημασία.

Πρόσφατα βρήκαμε ότι το αρσενικό στόχοι μεταλλαγμένο ρ53 για την αποικοδόμηση, με αποτέλεσμα την καταστολή της ανάπτυξης σε στερεά καρκινικά κύτταρα [32] . Το αρσενικό είναι ένα μεταλλοειδές με σημαντική αποτελεσματικότητα και μέτρια δυσμενείς επιπτώσεις σε ασθενείς με οξεία προμυελοκυτταρική λευχαιμία, μυέλωμα, και τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα [33]. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι το αρσενικό επάγει την έκφραση του άγριου-τύπου ρ53, TAp73, και TAp63 σε κύτταρα όγκου [32], [34]. Οι δραστηριότητες αυτές του αρσενικού παρέχει μια στρατηγική για τη μείωση μεταλλαγμένο p53 κυρίαρχη-αρνητική συνάρτηση και άλλων GOF δραστηριότητες. Αν και το αρσενικό μειώνει τη σταθερότητα του μεταλλαγμένης πρωτεΐνης ρ53 μέσω ενός μονοπατιού πρωτεασώματος [32], το Ε3 λιγάση που στοχεύει μεταλλαγμένη p53 για την αποικοδόμηση παραμένει άγνωστη. Σε αυτή τη μελέτη, θα αντιμετωπίσει αυτό το ζήτημα για να διευκολύνει την ανάπτυξη της τριοξείδιο του αρσενικού (ATO) ως ένα δυνητικό αντικαρκινικό φάρμακο για τον έλεγχο των όγκων με μεταλλαγμένο p53.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρική γραμμή ΜΙΑ PaCa-2 (που περιέχει μεταλλαγμένο R248W) και ανθρώπινη κερατινοκυττάρων HaCaT κυτταρική γραμμή (που περιέχει μεταλλαγμένο H179Y /R282W) καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35].

πλασμίδια και siRNA

Ανθρώπινο πλήρους μήκους Pirh2, Pirh2-DN (μια Ε3 λιγάση ελαττωματικό μεταλλαγμένο), και Pirh2-ΔRING (το δαχτυλίδι δάχτυλο διαγραφή τομέα μεταλλαγμένα) χρησιμοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36]. Όλες οι πρωτεΐνες Pirh2 οι FLAG-ετικέτα στο Ν άκρο. FLAG-tagged φορέα έκφρασης ουβικουϊτίνης σε pcDNA3 χρησιμοποιήθηκε όπως περιγράφεται προηγουμένως [36].

Δύο μικρά παρεμβαλλόμενα RNAs (siRNAs) έναντι Pirh2, 5′-GCC CAA CAU CAG ACU UGU G dTdT-3 ‘και 5’ -GGA AGU GCA GUG CAU ΑΑΑ C dTdT-3 ‘, και δύο κωδικοποιημένα siRNAs, 5′-GCA GUG UCU CCA CGU ACU Μια dTdT-3’ και CGA UUG UCA AAU AAU U dTdT-3 ‘, αγοράστηκαν 5’-GGC από Dharmacon RNAi Technologies. Τα siRNAs επιμολύνθηκαν σε κύτταρα χρησιμοποιώντας SilentFect (Bio-Rad) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στους χρόνους που υποδεικνύονται μετά τη διαμόλυνση για περαιτέρω πειράματα.

Αντισώματα

Rabbit anti-p53 (FL-393) αγοράστηκε από την Santa Cruz Biotechnology Inc. κουνελιού πολυκλωνικό αντι-Pirh2 αγοράστηκε από Bethyl Laboratories Inc. ποντικού μονοκλωνικό αντι-ΡΕΑΟ Μ2 και κουνελιού αντι-ακτίνης αγοράστηκαν από την Sigma.

Αντίστροφη μεταγραφή PCR δοκιμασία

Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen). cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ Iscript ™ cDNA Synthesis (Bio-Rad). Για τη μέτρηση Pirh2 mRNA, RT-PCR έγινε με πρόσθιο εκκινητή 5′-3 ‘και CTGCGAGCACTATGACAGAG-αντίστροφος εκκινητής 5′-TTCATAGCTAGGCATAAGTTAC-3’. Η ακτίνη ενισχύθηκε με πρόσθιο εκκινητή 5′-TCCATCATGAAGTGTGACGT-3 ‘και αντίστροφος εκκινητής 5′-TGATCCACATCTGCTGGAAG-3’.

αναστολή πρωτεοσώματος δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν επί 24 ώρες, ακατέργαστα ή προεπεξεργασία με MG132 αναστολέα πρωτεασώματος (4 μΜ) επί 2 ώρες, και στη συνέχεια κατεργάζεται με ΑΤΟ για 6 ώρες.

ανοσοκαθίζηση και ανάλυση Western blot

Το πείραμα ανοσοκατακρήμνισης διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [37]. Εν συντομία, HaCaT και τα κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 ή 7.5 μΜ ΕΦΕ για 6 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό, λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris-Cl, ρΗ 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Nonidet Ρ-40, και 0.4 mM PMSF), κατεργασία με υπερήχους, και διαυγάστηκε με φυγοκέντρηση . Τα κυτταρολύματα (500 μα συνολικών πρωτεϊνών) επωάστηκαν για 4 ώρες στους 4 ° C με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα συζευγμένα με τα σφαιρίδια πρωτεΐνης Α-αγαρόζης (Sigma) και στη συνέχεια πλύθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Ανοσοκαταβυθισμένες σύμπλοκα πρωτεΐνης και λύματα ολόκληρων κυττάρων υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE. Για κάθε σετ, 5% του ολικού κυτταρολύματος χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος εισόδου. αντίσωμα IgG χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Τα ανοσοστυπώματα έγιναν ορατές με αντιδραστήρια ανίχνευσης SuperSignal West Femto χημειοφωταύγειας (Pierce).

GST παρασκεύασμα πρωτεΐνης σύντηξης

S-τρανσφεράση γλουταθειόνης (GST) ταμπέλα σήμα Pirh2, Pirh2-ΔRING, ή Pirh2-DN ήταν εκφράζεται από pGEX-4Τ-3 (Amersham Pharmacia Biotech). Τα ανασυνδυασμένα GST-tagged πρωτεΐνες καθαρίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [37]. Εν συντομία, τα συντήξεις GST του Pirh2, Pirh2-ΔRING, και Pirh2-DN εκφράστηκαν σε E.coli BL21 (DE3) (Novagene) κατά την επαγωγή με 0.5 mM IPTG για 4 ώρες στους 37 ° C. Τα βακτηριακά κύτταρα συλλέχθηκαν και μετά επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα GST λύσης (200 mM Tris-Cl, ρΗ 8,0, 0,5 Μ NaCl, 100 mM EDTA, 0,1% Triton Χ-100, και 0.4 mM PMSF). Ακολούθως, κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε υπερήχους και διαυγάζεται με φυγοκέντρηση. πρωτεΐνες σύντηξης GST καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας σφαιρίδια γλουταθειόνης-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

δοκιμασία

p53 ουβικιτινίωση

35S-επισημασμένη ρ53 φυσικού τύπου ή μεταλλαγμένο ρ53 ( πρωτεΐνες R175H και R273H) συντέθηκαν με ίη vitro μεταγραφή και μετάφραση χρησιμοποιώντας το σύστημα προϊόντος λύσης δικτυοκυττάρου συζευγμένο ΤΝΤ Τ7 (Promega). 5 μΐ (~ 2 × 10

4 cpm) των in vitro μεταφράζεται p53 προστέθηκαν σε GST-Pirh2 (2 μg) και αναμίχθηκε σε πάγο για 1 ώρα για να σχηματίσουν σύμπλοκα GST-Pirh2-p53. Τα σύμπλοκα προστέθηκαν σε ρυθμιστικό ουβικιτινίωση (50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4, 2 mM ΑΤΡ, 5 mM MgCl

2, 2 mM DTT, και 1 διάλυμα αναγέννησης × ενέργειας (ERS)), που περιέχει Ε1 (100 ng) , Ε2 (200 ng), και ουβικιτίνης (2 μg), και επωάστηκαν στους 30 ° C για 2 ώρες. Τέλος, τα μείγματα αντίδρασης διαχωρίστηκαν σε SDS-PAGE και αναλύθηκαν με αυτοραδιογραφία. Ε1, Ε2, ERS, και ουβικιτίνης αγοράστηκαν από τη Βοστώνη Biochem.

Στατιστικά

συγκρίσεις Δύο ομάδας αναλύθηκαν από

t

δοκιμή δύο όψεων του Student.

σ τιμές

υπολογίστηκαν, και

σ

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

Το τριοξείδιο του αρσενικού υποβαθμίζει μεταλλαγμένη πρωτεΐνη p53 μέσω του πρωτεασώματος εξαρτώμενη μονοπάτι

είναι γνωστό ότι σε κύτταρα όγκου, hyperstabilization της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης ρ53 αποδίδεται στην παράκαμψη των πρωτεασώματος εξαρτώμενη από την υποβάθμιση [24] – [27], [31], [38]. Έτσι, η επανενεργοποίηση του πρωτεασώματος εξαρτώμενη αποδόμηση της μεταλλαγμένης ρ53 σε κύτταρα όγκου έχει θεραπευτική σημασία. Προηγουμένως, βρήκαμε ότι ΑΤΟ μειώνει τη σταθερότητα του μεταλλαγμένης πρωτεΐνης ρ53 μέσω ενός μονοπατιού πρωτεασώματος [32]. Το πιο σημαντικό, δείξαμε ότι knockdown του ενδογενές μεταλλαγμένο ρ53 ευαισθητοποιεί, ενώ έκτοπη έκφραση της μεταλλαγμένης ρ53 απευαισθητοποιεί, τα καρκινικά κύτταρα στο αρσενικό θεραπεία [32]. Σταθερά, μια άλλη μελέτη έδειξε ότι το αρσενικό προκαλούμενη αποικοδόμηση της μεταλλαγμένης ρ53 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων που p53R273H εκφράζουν με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο [39]. Ωστόσο, παραμένει ασαφές ποια λιγάση Ε3 είναι υπεύθυνη για μεταλλαγμένο p53 υποβάθμιση του αρσενικού που προκαλείται. Για να ελεγχθεί αυτό, επιβεβαιώσαμε ότι το αρσενικό προκαλούμενη αποικοδόμηση της μεταλλαγμένης ρ53 είναι μέσω του πρωτεασώματος εξαρτώμενη από μονοπάτι. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα HaCaT ήσαν μη επεξεργασμένα ή επεξεργασμένα με 4 μΜ MG132, ένας αναστολέας της 26S πρωτεασώματος, απουσία ή παρουσία ΕΦΕ. Βρήκαμε ότι το αρσενικό που προκαλείται από μεταλλαγμένο p53 υποβάθμιση καταργήθηκε πλήρως από MG132 (Εικ. 1Α). Ομοίως, βρήκαμε ότι το αρσενικό προκαλούμενη αποικοδόμηση της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης ρ53 ανεστάλη με MG132 σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa2 (Εικ. 1Β). Επιπλέον, βρήκαμε ότι, αντίθετα με την επίδραση της οδού πρωτεασώματος επί πρωτεΐνη ρ53 άγριου τύπου [40], η αναστολή της οδού της πρωτεασώματος και μόνο ήταν ανίκανος της αύξησης του επιπέδου της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης ρ53 (Εικ. 1 Α-Β), σε συνέπεια με μια προηγούμενη έκθεση [41]. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι το αρσενικό επανενεργοποιεί πρωτεασώματος εξαρτώμενη αποδόμηση της μεταλλαγμένης ρ53 σε κύτταρα όγκου.

κηλίδες Western παρασκευάστηκαν με εκχυλίσματα από HaCaT (Α) και τα κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 (Β), τα οποία ήταν μη επεξεργασμένα ή προεπεξεργασία με 4 μΜ MG132 για 2 ώρες, και στη συνέχεια χωρίς θεραπεία ή θεραπεία με ΑΤΟ για 6 ώρες.

Η

Το τριοξείδιο του αρσενικού υποβαθμίζει μεταλλαγμένη πρωτεΐνη ρ53 μέσω επαγωγής Pirh2 Ε3 λιγκάσης

Προηγουμένως, βρήκαμε ότι το αρσενικό προκαλεί έκφραση Pirh2 Ε3 λιγάση να υποβαθμίσει ογκογόνο πρωτεΐνη ΔNp63, ένα μέλος της οικογένειας p53 [34]. Pirh2 είναι γνωστό ότι είναι μια πρωτεΐνη στόχευσης άγριου-τύπου ρ53 για την αποικοδόμηση [42] Ε3 λιγάση, [43]. Έτσι, ερευνήσαμε αν ΑΤΟ επάγει την έκφραση του Pirh2 σε καρκινικά κύτταρα που φέρουν ένα μεταλλαγμένο ρ53. Βρήκαμε ότι κατά την κατεργασία με ΑΤΟ, το επίπεδο της Pirh2 μεταγραφημάτων ήταν σημαντικά αυξημένη σε ΜΙΑ PaCa-2 και κύτταρα HaCaT (Εικ. 2Α), ταυτόχρονα με την αύξηση του Pirh2 πρωτεΐνης (Εικ. 2Β). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ATO μπορεί μεταγραφικά επάγουν την έκφραση του Pirh2 να υποβαθμίσει p53 μεταλλαγμένο σε καρκινικά κύτταρα.

(A) Το επίπεδο των Pirh2 μεταγραφή αυξάνεται κατά ATO. RT-PCR ανάλυση διεξήχθη με ολικό RNA απομονωμένο από ΜΙΑ PaCa-2 και HaCaT κύτταρα χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με 7,5 μΜ ΑΤΟ για 2-6 ώρες. Η ακτίνη mRNA ενισχύθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) στυπώματα Western παρασκευάστηκαν με εκχυλίσματα από ΜΙΑ PaCa-2 και HaCaT κύτταρα μη επεξεργασμένα ή επεξεργασμένα όπως στο (Α), και στη συνέχεια διερευνήθηκε με αντισώματα έναντι Pirh2 και ακτίνης, αντίστοιχα.

Η

Στη συνέχεια, εξετάστηκε αν έκτοπη έκφραση της Pirh2 ενισχύει αρσενικού-επαγόμενη αποικοδόμηση της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης ρ53. Βρήκαμε ότι η έκτοπη έκφραση της Pirh2 ή ΑΤΟ θεραπεία μόνο μείωσε σημαντικά το επίπεδο της μεταλλαγμένης ρ53 σε HaCaT και κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 (Σχ. 3Α-Β). Το πιο σημαντικό, βρήκαμε ότι ένας συνδυασμός έκτοπη έκφραση της Pirh2 και ΑΤΟ θεραπεία μειώθηκε περαιτέρω το επίπεδο της μεταλλαγμένης ρ53 (Σχ. 3Α-Β). Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι το μεταλλαγμένο ρ53 μπορεί να αποικοδομηθεί με Pirh2 Ε3 λιγάση, και η δραστικότητα της Pirh2 μπορεί να ενισχυθεί με αγωγή ΑΤΟ μέσω άγνωστων μηχανισμών.

(Α-Β) στυπώματα Western παρασκευάστηκαν με εκχυλίσματα από HaCaT (Α ) και ΜΙΑ PaCa-2 (Β) κύτταρα, τα οποία επιμολύνθηκαν με pcDNA3 ή pcDNA3-FLAG-Pirh2 για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 5 ή 7.5 μΜ ΕΦΕ για 6 ώρες. Τα στυπώματα στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν με αντισώματα έναντι FLAG ετικέτα, ρ53, και η ακτίνη, αντίστοιχα. (C) Σχηματική παρουσίαση της πρωτεΐνης Pirh2 μαζί με τις θέσεις των δακτύλων και RING τομείς Zn, δύο μεταλλάξεις υποκατάστασης C145S και C148S στον τομέα RING (Pirh2-DN), και τη διαγραφή του τομέα RING στο Pirh2 (Pirh2-ΔRING). (Δ-Ε) έκτοπη έκφραση της Pirh2-DN ή Pirh2-ΔRING έχει ελάχιστη ή και καμία επίπτωση στο επίπεδο των μεταλλαγμένων p53. Western blots παρασκευάστηκαν με εκχυλίσματα από HaCaT (D) και ΜΙΑ PaCa-2 κύτταρα (Ε), τα οποία επιμολύνθηκαν με pcDNA3, pcDNA3-FLAG-Pirh2-DN, pcDNA3-FLAG-Pirh2-ΔRING, ή pcDNA3-FLAG-Pirh2 για 24 h. Τα στυπώματα στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν με αντισώματα έναντι FLAG ετικέτα Pirh2, ρ53, και η ακτίνη, αντίστοιχα.

Η

Είναι γνωστό ότι Pirh2 απαιτεί τομέα RING του να ουβικιτίνη άγριου τύπου ρ53 για την αποικοδόμηση του πρωτεασώματος [44]. Για να προσδιορίσετε αν δραστηριότητας λιγάση Ε3 των Pirh2 απαιτείται για τη ρύθμιση των μεταλλαγμένων έκφραση p53, δύο FLAG-tagged Pirh2 μεταλλάξεις, Pirh2-ΔRING (λείπει RING περιοχή δακτύλου) και Pirh2-DN (που περιέχει δύο υποκατάσταση μεταλλάξεις C145S και C148S στον τομέα RING), χρησιμοποιήθηκαν (Σχ. 3C). Δείξαμε ότι σε αντίθεση με τον άγριο τύπο Pirh2, έκτοπη έκφραση της Pirh2-ΔRING ή Pirh2-DN ήταν ανίκανη μείωση του επιπέδου της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης ρ53 σε κύτταρα HaCaT και ΜΙΑ PaCa-2 (Σχ. 3D-E).

Για να εξετασθεί περαιτέρω κατά πόσον ενδογενούς Pirh2 μεσολαβεί αρσενικό-επαγόμενη αποικοδόμηση της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης ρ53, κύτταρα HaCaT και μΙΑ PaCa-2 επιμολύνθηκαν παροδικά με ένα κωδικοποιημένο siRNA (SCR-1 και -2) ή ένα siRNA κατά Pirh2 (siPirh2-1 και -2) για 3 ημέρες, και στη συνέχεια ψευδο-κατεργασμένα ή κατεργασμένα με ATO. Δείξαμε ότι το επίπεδο της Pirh2 μειώθηκε σημαντικά από Pirh2, αλλά όχι κωδικοποιημένα, siRNAs (Εικ. 4Α-Β). Είναι σημαντικό ότι, βρήκαμε ότι Pirh2 knockdown ήταν σε θέση να διασώσουν αρσενικό προκαλούμενη αποικοδόμηση της μεταλλαγμένης ρ53 (Εικ. 4Α-Β). Μπορούμε επίσης να σημειωθεί ότι το αρσενικό θεραπεία αυξημένη έκφραση Pirh2, ταυτόχρονα με μια μειωμένη έκφραση της μεταλλαγμένης ρ53 (Εικ. 4Α-Β).

κηλίδες Western παρασκευάστηκαν με εκχυλίσματα από HaCaT (Α) και ΜΙΑ PaCa-2 (Β κύτταρα), τα οποία επιμολύνθηκαν με μπερδεμένο siRNA # 1 (SCR-1) (λωρίδες 1-2), SCR-2 (διαδρομές 5-6), siRNA έναντι Pirh2-1 (siPirh2-1) (λωρίδες 3-4), ή siPirh2-2 (λωρίδες 7-8), και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΑΤΟ για 6 ώρες. Τα στυπώματα στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν με αντισώματα εναντίον Pirh2, ρ53, και η ακτίνη, αντίστοιχα.

Η

Pirh2 αλληλεπιδρά φυσικά με μεταλλαγμένη πρωτεΐνη ρ53 για polyubiquitination

Όπως Ε3 λιγάση συχνά σωματικά αλληλεπιδρά με τα υποστρώματα του , εξετάσαμε αν Pirh2 συνδέει φυσικά με μεταλλαγμένο p53. Για να ελεγχθεί αυτό, HaCaT και τα κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΑΤΟ για 6 ώρες, και στη συνέχεια ενδογενές μεταλλαγμένο ρ53 και Pirh2 σε κύτταρα ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντισώματα έναντι ρ53 και Pirh2, αντίστοιχα. Δείξαμε ότι η ενδογενής Pirh2 ανιχνεύθηκε σε μεταλλαγμένο ανοσοσύμπλοκα ρ53 (Εικ. 5Α). Επιπλέον, μεταλλαγμένη ρ53 ανιχνεύθηκε σε Pirh2 ανοσοσύμπλοκα (Εικ. 5Β). IgG χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος κατά τη διάρκεια της ανοσοκαθίζηση και ανίκανο ανοσοκαταβύθιση μεταλλαγμένης ρ53 ή Pirh2 (Σχ. 5Α-Β).

(Α) κύτταρα HaCaT και ΜΙΑ PaCa-2 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 ή 7.5 μΜ ΑΤΟ για 6 ώρες. Κυτταρικά εκχυλίσματα από HaCaT (αριστερά) και ΜΙΑ PaCa-2 (δεξιά) κύτταρα ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-ρ53 ή IgG ελέγχου. Τα ανοσοσύμπλοκα στη συνέχεια χρησιμοποιείται για την ανίχνευση της ρ53 μεταλλαγμένη και Pirh2 μαζί με λύματα πλήρων κυττάρων ως έλεγχος εισόδου. (Β) Το πείραμα διεξήχθη όπως περιγράφεται στο (Α), εκτός του ότι το αντίσωμα αντι-Pirh2 χρησιμοποιήθηκε στην ανοσοκατακρήμνιση. (Ο-Ε) In vitro συντεθεί

35S-επισημασμένη ρ53 φυσικού τύπου (Γ), R175H (D), και R273H (Ε) αναμίχθηκαν με GST, GST-tagged Pirh2, Pirh2-DN, ή Pirh2-ΔRING . Τα σύμπλοκα στη συνέχεια αναμίχθηκαν με ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει Ε1, Ε2 (UbcH5b), και Ub και στη συνέχεια επωάζονται στους 30 ° C για 2 ώρες. Ουβικουιτινωμένης ρ53 αναλύθηκε με SDS-PAGE και ανιχνεύθηκαν με αυτοραδιογραφία. (F) Ένα μοντέλο Pirh2 μεσολάβηση της υποβάθμισης του μεταλλαγμένου p53 που προκαλείται από την ATO.

Η

Στη συνέχεια, ερευνήσαμε αν Pirh2 χρησιμεύει ως Ε3 λιγάση για ουβικουϊτινίωση του μεταλλαγμένου p53. Για να το ελέγξετε, στη δοκιμασία ουμπικουιτίνωση vitro πραγματοποιήθηκε με

35S-σημασμένο μεταλλαγμένο p53R175H ή p53R273H μαζί με ανασυνδυασμένη GST-Pirh2, GST-Pirh2-DN, ή Pirh2-ΔRING. Δείξαμε ότι οι μεταλλαγμένες ρ53 polyubiquitinated με Pirh2 αλλά όχι από Pirh2-DN και Pirh2-ΔRING (Σχ. 5D-E, συγκρίνετε λωρίδα 3 με λωρίδες 4 και 5). Δεδομένου ότι άγριου-τύπου ρ53 είναι ένα γνωστό στόχο του Pirh2, άγριου-τύπου ρ53 χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Ομοίως, δείξαμε ότι άγριου τύπου ρ53 ήταν polyubiquitinated από Pirh2 αλλά όχι από Pirh2-DN και Pirh2-ΔRING (Εικ. 5C, συγκρίνετε λωρίδα 3 με λωρίδες 4 και 5). Μαζί, αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι Pirh2 είναι ικανή polyubiquitinating μεταλλαγμένης ρ53.

Το τριοξείδιο του αρσενικού συνεργάζεται με HSP90 ή αναστολέα HDAC την προώθηση αποικοδόμηση ρ53 μεταλλαγμένη και την καταστολή της ανάπτυξης σε κύτταρα όγκου

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι σε καρκινικά κύτταρα, πρωτεΐνη συνοδού HSP90 αλληλεπιδρά με μεταλλαγμένο ρ53 για να σχηματίσει MDM2-p53-HSP90 πολύπλοκες και συνεπώς σταθεροποιεί το μεταλλαγμένο ρ53 [24], [26], [45]. Κατά συνέπεια, οι αναστολείς της HSP90 γκελνταναμυκίνη και 17AAG διαταράσσουν MDM2-p53-HSP90 συγκρότημα να υποβαθμίσει ρ53 μεταλλαγμένη [26], [30], [45]. Επιπλέον, SAHA, ένας αναστολέας των HDAC, βρέθηκε να μειώνει την έκφραση του μεταλλαγμένου p53 μέσω αναστολής HDAC8 μεσολάβηση μεταγραφή μεταλλαγμένο p53 [46] και HDAC6 μεσολάβηση σταθερότητα της πρωτεΐνης μεταλλαγμένης ρ53 [30]. Για να διερευνηθεί περαιτέρω εάν οι αναστολείς της HSP90 και HDACs είναι ικανά να επάγουν την έκφραση Pirh2 να υποβαθμίσει ρ53 μετάλλαξη, HaCaT και τα κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 17AAG ή SAHA. Δείξαμε ότι 17AAG ή θεραπεία SAHA είχε μικρή έως και καθόλου επίδραση στην έκφραση της πρωτεΐνης σε Pirh2 HaCaT (Εικ. 6Α) και τα κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 (Σχ. 6Β). Το αποτέλεσμα δείχνει ότι ΑΤΟ και αναστολείς της HSP90 και HDACs μπορεί να υποβαθμίσει μεταλλαγμένη πρωτεΐνη p53 μέσω διαφορετικών οδών. Έτσι, υποθέσαμε ότι ΑΤΟ μπορεί να συνεργάζεται με HSP90 ή αναστολέα HDAC την προώθηση αποικοδόμηση ρ53 μεταλλαγμένη και την καταστολή της ανάπτυξης σε κύτταρα όγκου. Για να ελεγχθεί αυτό, HaCaT και τα κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΑΤΟ, 17AAG, ή SAHA, μόνα τους ή σε συνδυασμό. Βρήκαμε ότι η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη p53 ήταν σημαντικά μειωμένη από την ATO, 17AAG, ή SAHA, και μειώθηκε περαιτέρω από το συνδυασμό της ΕΦΕ με 17AAG ή SAHA (Εικ. 6C-D). Σταθερά, βρήκαμε ότι ο πολλαπλασιασμός των HaCaT (Σχ. 6Ε) και ΜΙΑ PaCa-2 κύτταρα (Σχ. 6F) ανεστάλη σημαντικά από την ΑΤΟ, 17AAG, ή SAHA και αναστέλλεται περαιτέρω με συνδυασμό του ΑΤΟ με 17AAG ή SAHA. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο συνδυασμός του ΑΤΟ με άλλους αντικαρκινικούς παράγοντες, όπως αναστολείς της HSP90 και HDACs, μπορεί να επιτύχει συνεργιστική θεραπείες για όγκους που φέρουν μια μεταλλαγμένη ρ53.

(Α-Β) στυπώματα Western παρασκευάστηκαν με εκχυλίσματα από HaCaT (Α) και τα κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 (Β), τα οποία ήταν μη επεξεργασμένα ή επεξεργασμένα με 1 μΜ 17AAG ή 2 μΜ SAHA για 12 ώρες. Τα στυπώματα στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν με αντισώματα κατά ακτίνης Pirh2 και, αντίστοιχα. (C-D) στυπώματα Western παρασκευάστηκαν με εκχυλίσματα από HaCaT (C) και τα κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 (δ), που ήταν μη επεξεργασμένα ή επεξεργασμένα με 7.5 μΜ ΑΤΟ, 1 μΜ 17AAG ή 2 μΜ SAHA, μόνες ή σε συνδυασμό για 12 h. Τα στυπώματα στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν με αντισώματα έναντι ρ53 και ακτίνη, αντίστοιχα. κύτταρα (Ε-Ρ) HaCaT (Ε) και ΜΙΑ PaCa-2 (Ρ) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο (C-D) για 24 ώρες. Επιζώντα κύτταρα από δύο ομάδες ελέγχου και αγωγής μετρήθηκαν και παρουσιάζονται ως μέση ± SD από τρία ξεχωριστά πειράματα. *,

σ

& lt?. 0.05

Η

Συζήτηση

Υπό κανονικές συνθήκες, άγριου-τύπου p53 εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα, λόγω της υποβάθμισης που προκαλείται από πολλαπλές λιγασών Ε3 , συμπεριλαμβανομένων MDM2, Pirh2, COP1, ARF-BP1 και WWP1 [43]. Σε αντίθεση, μεταλλαγμένο ρ53 συχνά συσσωρεύεται σε υψηλά επίπεδα σε καρκινικά κύτταρα, αν και η έκφραση της σε φυσιολογικούς ιστούς είναι επίσης διατηρείται σε χαμηλά επίπεδα μέσω της δράσης του MDM2 [28]. Το όγκου-ειδικό hyperstabilization του μεταλλαγμένου ρ53 είναι ένας κρίσιμος καθοριστικός παράγοντας της GOF της. Πράγματι, σίγηση του μεταλλαγμένου ρ53 με siRNA αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων [16], [47]. Έτσι, η στόχευση μεταλλαγμένο ρ53 για την αποικοδόμηση παρέχει μια λογική για ελκυστικές αντικαρκινικά στρατηγικές για να εξασθενήσει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Πρόσφατα, προτάθηκε ότι σε μη πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα όγκου, καταστέλλοντας μακροαυτοφαγία προωθεί τον κύκλο εργασιών των μεταλλαγμένης πρωτεΐνης ρ53 μέσω συνοδού μεσολάβηση αυτοφαγία σε ένα λυσόσωμα-εξαρτώμενο τρόπο [29]. Δυστυχώς, η απαίτηση υπό όρους μη διάδοσης των καρκινικών κυττάρων περιορίζει τις δυνατότητες του συνοδού-μεσολάβηση αυτοφαγία για κλινική εφαρμογή. Επιπλέον, επί του παρόντος διαθέσιμες χημειοθεραπείες είναι ανίκανοι να καταστρέφουν μεταλλαγμένης ρ53. Για παράδειγμα, πολλοί πρώτης γραμμής αντικαρκινικούς παράγοντες αυξάνουν τόσο άγριου τύπου ρ53 και ρ53 μεταλλαγμένη και μπορεί να προωθήσει το σχηματισμό όγκων και εξέλιξης σε όγκους με μεταλλαγμένο p53 [28], [48]. Ετσι, η σταθεροποίηση του μεταλλαγμένου ρ53 με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες περιορίζει παραδόξως την αποτελεσματικότητα αυτών των θεραπειών.

Προηγουμένως, βρήκαμε ότι ΑΤΟ, ένα φάρμακο κλινικώς προτιμάται για οξεία προμυελοκυτταρική λευχαιμία, μειώνει τη σταθερότητα του μεταλλαγμένης πρωτεΐνης ρ53 μέσω ενός μονοπατιού πρωτεασώματος και απόφραξη της οδού πρωτεασώματος μπορεί να ανακουφίσει το αρσενικό που προκαλείται από μεταλλαγμένο p53 υποβάθμιση [32], [49]. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι ΑΤΟ επάγει την έκφραση της Pirh2 Ε3 λιγάση. Επιπλέον, βρήκαμε ότι knockdown του Pirh2 αναστέλλει, ενώ έκτοπη έκφραση της Pirh2 ενισχύει, αρσενικού-επαγόμενη αποικοδόμηση της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης ρ53. εύρημα μας δείχνει ότι το αρσενικό-επαγόμενη έκφραση Pirh2 σε καρκινικά κύτταρα επανενεργοποιεί το πρωτεάσωμα εξαρτώμενη μεταλλαγμένο αποδόμησης ρ53 (Εικ. 5F). Παρά το γεγονός ότι το μεταλλαγμένο ρ53 μπορούν να στοχευθούν από MDM2 σε φυσιολογικά κύτταρα, MDM2 δεν μπορεί polyubiquitinate p53 μεταλλαγμένο σε καρκινικά κύτταρα [28]. Αυτό το ελάττωμα είναι πιθανόν να οφείλεται σε αυξημένα επίπεδα HSP70 και HSP90 σε καρκινικά κύτταρα, τα οποία σχηματίζουν σύμπλοκα με πρωτεΐνη μεταλλαγμένη p53 [24] – [26], [45]. Επιπλέον, υπερεκφράζεται MDM2 ισομορφή Β σε καρκινικά κύτταρα μπορεί να αλληλεπιδρούν με το πλήρους μήκους MDM2 και αναστέλλουν MDM2 μεσολάβηση μεταλλαγμένο p53 ουβικιτινίωση [38]. Αυτές οι αλλαγές δώσει την ευκαιρία να στοχεύσει όγκους που φιλοξενούν ένα μεταλλαγμένο p53. Πράγματι, βρήκαμε ότι ATO συνεργάζεται με 17AAG ή SAHA για να αναστέλλουν την έκφραση p53 μεταλλαγμένο και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων.

Αν και έκτοπη έκφραση Pirh2 ή ATO θεραπεία μόνη της μπορεί να μειώσει σημαντικά το επίπεδο των μεταλλαγμένων p53, ο συνδυασμός της έκτοπη έκφραση του Pirh2 και ΑΤΟ θεραπεία μειώνει περαιτέρω το επίπεδο των μεταλλαγμένων ρ53 (Σχ. 3Α-Β). Αυτό σημαίνει ότι η ικανότητα του Pirh2 Ε3 λιγκάσης να υποβαθμίσει μεταλλαγμένο ρ53 μπορεί να ενισχυθεί με αγωγή ΕΦΕ. Μια δυνατότητα μπορεί να οφείλεται σε ΑΤΟ επαγόμενη μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις της μεταλλαγμένης ρ53 και Pirh2. Πράγματι, έχει αναφερθεί ότι κατά τη χορήγηση του αρσενικού στην οξεία προμυελοκυτταρική λευχαιμία (APL), PML-ΚΑΚα σύντηξης υφίσταται ογκοπρωτεϊνης τροποποίησή της με SUMO από μικρές ουβικιτίνης όπως τροποποιητές (SUMO) και στη συνέχεια υποβάλλονται σε RNF4 μεσολάβηση της υποβάθμισης του πρωτεασώματος [50], [51 ]. Η αδρανοποίηση του τροποποίησή της με SUMO εντελώς μπλοκ PML υποβάθμιση [52]. Έτσι, οι περαιτέρω μελέτες δικαιολογείται να διερευνήσει κατά πόσο Pirh2 και /ή μεταλλαγμένο ρ53 έχουν τροποποιηθεί από SUMO, το οποίο μπορεί να ενισχυθεί με επεξεργασία του ΑΤΟ σε καρκινικά κύτταρα.