Αφηρημένο

Η οικογενής ομαδοποίηση καρκίνου του παχέος εντέρου εμφανίζεται στο 15-20% των περιπτώσεων, ωστόσο, αναγνωρίζεται σύνδρομα καρκίνου εξηγούν μόνο ένα μικρό κλάσμα της ασθένειας αυτής. Έτσι, η γενετική βάση για την πλειονότητα των κληρονομικών ορθοκολικού καρκίνου παραμένει άγνωστη.

ΕΡΗΒ2

έχει πρόσφατα ενοχοποιηθεί ως γονίδιο καταστολέας υποψήφιος όγκου σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογηθεί η συμβολή του

ΕΡΗΒ2

με κληρονομικό καρκίνο του παχέος εντέρου. Εμείς διαλογή για βλαστικής γραμμής

ΕΡΗΒ2

παραλλαγές αλληλουχίας σε 116 με βάση τον πληθυσμό οικογενή παχέος περιπτώσεων καρκίνου με προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA. Στη συνέχεια υπολόγισε τις συχνότητες του πληθυσμού και χαρακτήρισαν τις βιολογικές δραστηριότητες του

ΕΡΗΒ2

παραλλαγών που εντοπίζονται. Τρεις νέες nonsynonymous αλλαγές παρερμηνεύσιμη εντοπίστηκαν. Δύο από αυτές τις παραλλαγές (A438T και G787R) οδηγούν σε σημαντικές αλλαγές υπόλειμμα, ενώ το τρίτο οδηγεί σε συντηρητική υποκατάσταση στην καρβοξυ-τελική περιοχή SAM (V945I). Οι πρώτες δύο παραλλαγές βρέθηκαν φορά στις 116 περιπτώσεις, ενώ η παραλλαγή V945I ήταν παρούσα σε 2 περιπτώσεις. Γονότυπων του επιπλέον ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου και τον έλεγχο θεμάτων αποκάλυψε ότι A438T και G787R αντιπροσωπεύουν σπάνιες

ΕΡΗΒ2

αλληλόμορφα.

In vitro

λειτουργικές μελέτες δείχνουν ότι η υποκατάσταση G787R, που βρίσκεται στην περιοχή κινάσης, προκαλεί διαταραχή της δραστικότητας κινάσης του υποδοχέα και συνεπώς είναι παθογόνος, ενώ η παραλλαγή A438T διατηρεί τη λειτουργία του υποδοχέα του και πιθανόν να αντιπροσωπεύει ένα ουδέτερο πολυμορφισμό. Ιστός όγκου από την υπόθεση παραλλαγή G787R εκδηλώνεται απώλειας ετεροζυγωτίας, με απώλεια του αλληλόμορφου άγριου τύπου, υποστηρίζοντας ένα ρόλο καταστολέα όγκων για

ΕΡΗΒ2

σε σπάνιες περιπτώσεις ορθοκολικού καρκίνου. Σπάνιες βλαστική

ΕΡΗΒ2

παραλλαγές μπορεί να συμβάλει σε ένα μικρό κλάσμα του κληρονομικού καρκίνου του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Ζωγόπουλο G, Jorgensen C, Bacani J, Montpetit Α, Lepage P, Ferretti V, et al. (2008) βλαστικής σειράς

ΕΡΗΒ2

Receptor Παραλλαγές σε οικογενής του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 3 (8): e2885. doi: 10.1371 /journal.pone.0002885

Επιμέλεια: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Γερμανία

Ελήφθη: 20 Δεκ 2007? Αποδεκτές: 3 του Ιούλη 2008? Δημοσιεύθηκε: 6, Αυγούστου 2008

Copyright: © 2008 Ζωγόπουλο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, National Institutes of Health υπό RFA # CA-96-011 (για να SG) και μέσω συμφωνιών συνεργασίας με τα μέλη του καρκίνου του παχέος εντέρου Οικογένεια Μητρώο και αναστολέων πρωτεάσης Το περιεχόμενο αυτού του χειρογράφου δεν αντανακλά απαραίτητα τις απόψεις ή τις πολιτικές του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου ή κάποιο από τα συνεργαζόμενα ιδρύματα ή ερευνητές στο Colon ΚΠΑ, ούτε αναφορά εμπορικών επωνυμιών, εμπορικών προϊόντων ή οργανισμών υποδηλώνει την έγκριση από την κυβέρνηση των ΗΠΑ ή το Colon ΚΠΑ. Cancer Care Ontario, ως φιλοξενούσα οργάνωση στην Γονιδιώματος ARCTIC, αναγνωρίζει ότι το σχέδιο αυτό χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από Γονιδιώματος του Καναδά, μέσω της Genomics Institute Οντάριο, από το γονιδίωμά του Κεμπέκ, το Ministère du Développement ÿconomique et Περιφερειακή et de la Recherche du Québec και το Οντάριο Ινστιτούτο Έρευνας για τον Καρκίνο. GZ είναι υπότροφος του Συλλόγου Πανεπιστημίου Χειρουργών και ο παραλήπτης ενός Terry Fox Foundation Research Fellowship από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου του Καναδά. TJH είναι αποδέκτης ενός ιατρού-Επιστήμονας Βραβείο στη μεταγραφική έρευνα από την Burroughs Wellcome Ταμείο

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι μια κοινή κακοήθεια στη δυτική κοινωνία, με 15-20% των περιπτώσεων ανάπτυξη με βάση την φαινομενική γενετική προδιάθεση [1]. Ωστόσο, οι αναγνωρισμένες οικογενή καρκίνο του παχέος εντέρου σύνδρομα-οικογενή αδενωματώδη πολυποδίαση (FAP), Κληρονομική μη πολυποδίαση καρκίνο του παχέος εντέρου (HNPCC) και

MYH

-Associated πολυποδίαση (MAP) -Λαμβάνεται για πολύ λιγότερο από το ένα τρίτο των κληρονομικών . ορθοκολικό καρκίνο, αφήνοντας το επιπλέον κληρονομικές συνιστώσα αυτής της νόσου ανεξήγητη [1]

στη μεγάλη πλειονότητα των καρκίνων του παχέος, μεταλλακτική ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης WNT παίζει ουσιαστικό ρόλο στην έναρξη ογκογένεση [2] – [4 ]. Υπερενεργοποίηση σηματοδότηση Wnt συνηθέστερα συμβαίνει νωρίς το αδένωμα προς αλληλουχία καρκίνωμα ως συνέπεια της αδρανοποίησης μεταλλάξεων στο

APC

ογκοκατασταλτικό γονίδιο ή ενεργοποιεί ογκογόνο

β-κατενίνης

μεταλλάξεις. Αυτές οι γενετικές αλλοιώσεις οδηγούν σε συστατική ενεργοποίηση του β-κατενίνης /TCF4 σύμπλεγμα το οποίο, με τη σειρά του, οδηγεί υπερέκφραση σηματοδότηση Wnt στόχων. Αυτά τα κατάντη επενεργητές του μονοπάτι Wnt περιλαμβάνουν γονίδια με ένα κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη των όγκων παχέος εντέρου, όπως τα

EphB

και

εφρίνης

γονίδια [5], [6].

ένας ρόλος για

ΕΡΗΒ2

, μέλος της τυροσίνης κινάσης της οικογένειας Eph, ως ογκοκατασταλτικό γονίδιο σε παχέος καρκινογένεση έχει προταθεί από αρκετές πρόσφατες διαπιστώσεις.

ΕΡΗΒ2

χάρτες σε μια χρωμοσωμική περιοχή (1ρ36.1) διαγράφονται συχνά σε αυτούς τους όγκους [7]. Επιπλέον, ανοσοϊστοχημικές μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση πολλαπλές ισομορφές EphB συχνά καταστέλλεται σε διηθητικά ανθρώπινο ορθοκολικό όγκους [8]. Επιπλέον, Alazzouzi

et al

. έδειξαν πρόσφατα μια υψηλή συχνότητα εμφάνισης

ΕΡΗΒ2

μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου σε μικροδορυφορικών ασταθής παχέος όγκους και παρεκκλίνουσα

ΕΡΗΒ2

μεθυλίωση προαγωγού και στις δύο μικροδορυφορικών σταθερή και ασταθής νεοπλάσματα [9]. Απώλεια της έκφρασης ΕΡΗΒ2 σε όγκους παχέος εντέρου έχει συνδεθεί επίσης με χειρότερη πρόγνωση [10].

Μεταλλακτική αδρανοποίηση του

ΕΡΗΒ2

έχει συνδεθεί με την καρκινογένεση προστάτη. Huusko

et al. Περιγράφεται

πρόσφατα μία ποικιλία

ΕΡΗΒ2

μεταλλάξεις σε όγκους του προστάτη και σε κυτταρικές σειρές [11], και μια κοινή νοηματική μετάλλαξη έχει συσχετιστεί με τον καρκίνο του προστάτη σε άνδρες αφροαμερικάνων με οικογενειακό ιστορικό της ασθένειας αυτής [12]. Αυτά τα ευρήματα λαμβανόμενα μαζί με το καθιερωμένο ρόλο των υποδοχέων EphB σε καρκίνο του παχέος εντέρου, μας ώθησε να υποθέσει ότι η βλαστική γραμμή

ΕΡΗΒ2

μεταλλάξεις μπορεί να ευθύνεται για τουλάχιστον ένα κλάσμα των γενετικών αλλοιώσεων βασίζεται η ανεξήγητη τμήμα της κληρονομικής ορθοκολικό καρκίνο, και μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα νέο σύνδρομο που προκαλούν καρκίνο γενετική προδιάθεση για ορθοκολικό και προστατικό καρκίνο. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε 116 βάσει πληθυσμού οικογενή παχέος περιπτώσεων καρκίνου για βλαστικής γραμμής

ΕΡΗΒ2

μεταλλάξεις. Οι 116 εξεταζομένων που ελέγχθηκαν είχαν τουλάχιστον ένα επιπλέον πληγείσα συγγενής πρώτου βαθμού. Οι περιπτώσεις αυτές είχαν μικροδορυφορικού σταθερή όγκους, και δεν πληρούν τα διαγνωστικά κριτήρια για FAP, HNPCC και MAP. Εμείς εμπλουτίζεται επίσης σειρά μας με τα άτομα που πληρούν τα παραπάνω κριτήρια ένταξης και είχε προσωπικό ή οικογενειακό ιστορικό καρκίνου του προστάτη. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι σπάνια

ΕΡΗΒ2

αλληλόμορφα συμβάλλουν σε ένα μικρό κλάσμα του οικογενούς καρκίνου του παχέος εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

Θέματα Μελέτη και DNA δείγματα

Biospecimens ελήφθησαν από το Οντάριο οικογενή καρκίνο του παχέος εντέρου μητρώου (OFCCR), μέλος του National Cancer Institute Συνεταιρισμός Οικογένεια μητρώα για καρκίνο του παχέος εντέρου Σπουδών (https://epi.grants.cancer.gov/CFR/about_colon.html) [13]. Η OFCCR περιλαμβάνει 3.770 παχέος περιπτώσεις καρκίνου διαγνώστηκαν στην επαρχία του Οντάριο, στον Καναδά μεταξύ 1997-2000, με την ηλικία κατά τη στιγμή της διάγνωσης από 20 έως 74. ηλικία και θέματα ελέγχου φύλου συνδυάζεται με καμία προσωπική ιστορία του καρκίνου του παχέος εντέρου είχαν προσληφθεί μέσω τηλεφώνου από μια λίστα τυχαία επιλεγμένων οικιστικών αριθμούς τηλεφώνου για Οντάριο και από τον πληθυσμό με βάση Rolls φόρου του Υπουργείου Οικονομικών του Οντάριο. Τα άτομα της μελέτης έδωσε ένα δείγμα φλεβικού αίματος και περιφερικά λεμφοκύτταρα απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας Ficoll-Paque, σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή (Amersham Biosciences, Baie d’Urfé, Κεμπέκ, PQ, Canada). Η μέθοδος φαινόλη-χλωροφόρμιο χρησιμοποιήθηκε για να απομονώσει γονιδιωματικό DNA από λεμφοκύτταρα και κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος. Το πρωτόκολλο QIAamp (Qiagen Inc., Mississauga, Ontario, Canada) χρησιμοποιήθηκε για την εκχύλιση γενωμικού DNA από ιστούς παραφίνης. Όλα τα άτομα της μελέτης υπέγραψαν τη γραπτή συγκατάθεση για να συμμετάσχουν σε Mount Sinai Hospital Διοικητικό Συμβούλιο Δεοντολογίας Έρευνας εγκεκριμένη μελέτη της έρευνας.

ΕΡΗΒ2

Μετάλλαξη Screening

Χρήση αυτοματοποιημένης αλληλουχίας (Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer , Foster City, CA, USA), που ελέγχονται για βλαστική

ΕΡΗΒ2

(Εηίτεζ Gene ID: 2048? REFSEQ: NM_004442, NM_017449) παραλλαγές αλληλουχίας σε 116 οικογενή παχέος περιπτώσεις (μέση ηλικία κατά τη διάγνωση 54 χρόνια, σειρά 22 έως 74 ετών, 59 γυναίκες, 57 άνδρες). Η ανάλυσή μας περιελάμβανε ασθενείς με προσωπική (n = 6) και /ή οικογενειακό ιστορικό (πατέρας, η = 19? αμφιθαλή, n = 23? μισή αδελφός, η = 4) του καρκίνου του προστάτη. Οι ασθενείς με FAP, HNPCC ή MAP αποκλείστηκαν. Μια σειρά από καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές (Caco2, ΟοΙο320ϋΜ, Colo320HSR, ΗΤ29, LS513, LS1034, SW837, SW948, SW1417, Τ84) επίσης εξετάστηκαν. Εμείς αλληλουχία ολόκληρη την κωδικοποιητική περιοχή και τουλάχιστον 50 bp του ιντρονική αλληλουχία στα όρια εξονίου /ιντρονίου. Οι αλληλουχίες εκκινητών PCR και τους όρους που προβλέπονται στον πίνακα S1. Οι παραλλαγές εντοπίζονται αριθμημένα σε σχέση με REFSEQ NM_004442.

A438T, D679N και G787R συχνότητες αλληλόμορφων

επιλέχθηκαν Ένα τυχαίο δείγμα των περιπτώσεων και μάρτυρες από τη σειρά OFCCR για μελέτες για την αξιολόγηση της A438T, D679N και G787R αλληλόμορφο συχνότητες. Δείγματα DNA των λεμφοκυττάρων από μια πρόσθετη σειρά περιπτώσεων OFCCR (n = 364 για A438T? n = 1160 για D679N? n = 182 για G787R) και των ελέγχων πληθυσμού συμφωνημένα (n = 384 για A438T? n = 1,133 για D679N? n = 199 για G787R) εξετάστηκαν για την αξιολόγηση των συχνοτήτων του πληθυσμού των παραλλαγών A438T, D679N και G787R. δοκιμασίες προσδιορισμού του γονότυπου για τα A438T, D679N και G787R παραλλαγές αναπτύχθηκαν με χρήση φθορισμού πόλωσης-Single Επέκταση βάσης (FP-SBE) [14], SNPstream [14] και RFLP, αντίστοιχα (Πίνακας S2).

Γενεαλογικό και Απώλεια της ετεροζυγωτίας (ΑΕ) αναλύσεις

Δοκιμές για διαχωρισμό στις οικογένειες των εξεταζομένων μεταφέρουν τις παραλλαγές A438T και G787R πραγματοποιήθηκε με απευθείας αλληλούχιση, χρησιμοποιώντας είτε λεμφοκυττάρων ή αρχειοθέτησης DNA από τεμάχια ιστού σε παραφίνη ενσωματωμένα. Απώλεια ετεροζυγωτίας διεξήχθη με όγκο φυσιολογικά δείγματα αλληλούχιση ζευγαρωμένα /αρχειακό DNA και σύγκριση αλληλουχίας αυτοραδιογραφήματα για μείωση της έντασης του μη μεταλλαγμένου σήματος σε σύγκριση με την μεταλλαγμένη αλληλουχία (Πίνακας S2). Αυτές οι αντιδράσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το κιτ Cycle Sequencing Thermo Sequenase ραδιοσημασμένα Terminator, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (USB Corporation, Cleveland, Ohio, USA)

Βιοχημικός Χαρακτηρισμός του A438T & amp.? G787R Παραλλαγές

Το

A438T

και

G787R

παραλλαγές αλληλουχίας cDNA δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας PCR-based ιστοσελίδα κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση και REFSEQ NM_004442 (ΟηΟεηε Technologies Inc., Rockville, MD, USA) σαν το εκμαγείο. Τα προϊόντα PCR κλωνοποιήθηκαν σε pcDNA3 (Invitrogen Canada Inc.), και επαλήθευσε ακολουθία. DU145 (ένα δώρο από τον Dr. Irene Andrulis, Samuel Lunenfeld Research Institute) αναπτύχθηκαν σε ΜΕΜ /10% FBS. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με τα διάφορα

ΕΡΗΒ2

cDNA κατασκευάσματα (τύπου άγρια,

A438T

, ή

G787R

) χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen Canada Inc., Burlington, Ontario , Καναδάς), σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Πέντε ώρες μετά την επιμόλυνση, το μέσο αλλάχθηκε σε μέσο λιμοκτονίας (ΜΕΜ /0,5% FBS) επί 16 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια διεγέρθηκαν με 2 μg /ml preclustered εφρίνης b1-Fc (εφρίνης b1-Fc, R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ, USA? Αντι-Ρο αντίσωμα, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, ΡΑ, USA) για 30 λεπτά. Τα επιμολυσμένα ΕΡΗΒ2 ανοσοκατακρημνίστηκε χρησιμοποιώντας αντι-ΕΡΗΒ2 αντιορό [15] και ανοσοστυπώθηκαν με αντι-φωσφοτυροσίνης (4G10, Upstate Biotechnology, Lake Placid, New York, USA) ή αντι-ΕΡΗΒ2. Έκφραση και ανοσοκαθίζηση παραλλαγών ΕΡΗΒ2 για

in vitro δοκιμασίες κινάσης

διεξήχθη όπως ανωτέρω, εκτός κύτταρα αφέθηκαν μη διεγερμένα πριν από την κυτταρική λύση και ανοσοκατακρήμνιση όπως περιγράφεται προηγουμένως από τους Holland

κ.ά.

. [16] Τα πηκτώματα αναλύθηκαν και ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα Storm phosphoimager (Molecular Dynamics Inc., Sunnyvale, California, USA).

Αποτελέσματα

μεταλλάξεων προβολή της

ΕΡΗΒ2

γονίδιο σε 116 ασθενείς με οικογενή καρκίνο του παχέος εντέρου που προσδιορίζονται 3 νέα αλλαγές παρανοηματική νουκλεοτιδίων και η παραλλαγή D679N προταθεί προηγουμένως από Huusko

et al.

[11] να είναι παθογόνος σε καρκίνο προστάτη (Πίνακας 1). Τρεις μη συνδεδεμένοι ασθενείς βρέθηκαν να φέρουν το αλληλόμορφο D679N, που είχαν διαγνωστεί με καρκίνο του παχέος εντέρου στις ηλικίες των 57, 59 και 67 ετών αντίστοιχα. Ωστόσο, η επακόλουθη ανάλυση των πρόσθετων θεμάτων δείχνει ότι D679N αντιπροσωπεύει μια σπάνια ουδέτερη

ΕΡΗΒ2

πολυμορφισμό, δεδομένου ότι το αλληλόμορφο παραλλαγή παρατηρήθηκε σε παρόμοιες συχνότητες σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου (11 από 1133) και τους ελέγχους του πληθυσμού-συμφωνημένα (11 από 1160).

Η

επίσης, ελέγχονται για

ΕΡΗΒ2

μεταλλάξεις σε 10 ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές σειρές, και Caco2 βρέθηκε να εκφράσει μια νέα παραλλαγή, R4Q (nt. 11 A → G), εκτός από τον υποδοχέα ΕΡΗΒ2 άγριου τύπου. Η υποκατάσταση αμινοξέος R4Q μπορεί να προκαλέσει μια αλλαγή στο πεπτίδιο σήμα, το οποίο μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένη έκφραση ΕΡΗΒ2. Ωστόσο, ανοσοκαθίζηση με αντι-ΕΡΗΒ2 αντιορό, ακολουθούμενη από ανοσοαποτύπωση χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αντιφωσφοτυροσίνης, έδειξε ότι παρά την εκτέλεση της παραλλαγής R4Q, ο CAC02 κυτταρική γραμμή παράγει ένα λειτουργικό υποδοχέα ΕΡΗΒ2 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Δύο από τους τρεις μυθιστόρημα nonsynonymous παραλλαγές (A438T & amp? G787R) εντοπίσαμε αποτέλεσμα βιοχημικά σημαντικές και δυνητικά παθογόνων αλλαγές υπόλειμμα. Το υπόλειμμα που επηρεάζονται από την υποκατάσταση A438T βρίσκεται στην εξωκυτταρική περιοχή ινωδονεκτίνης τύπου III [17]. Δεδομένου ότι αυτή η περιοχή μπορεί να εμπλέκεται σε δέσμευση συνδέτη, έχουμε δεδομένο ότι η παραλλαγή A438T μπορούσε έχουν μειωμένη δραστηριότητα δέσμευσης και λειτουργία σηματοδότησης. Η παραλλαγή G787R επηρεάζει ένα υπόλειμμα στον τομέα κινάσης, και αυτή η υποκατάσταση μπορεί συνεπώς να επηρεάσει άμεσα την κινάση του υποδοχέα και τη βιολογική δραστηριότητα [18]. Η τρίτη νέα παραλλαγή (V945I) ανιχνεύθηκε σε δύο ασθενείς, και οδηγεί σε μία συντηρητική υποκατάσταση στο ακραίο καρβοξυ-τελικό άκρο του τομέα SAM [19]? δεν έχουμε χαρακτηρίζεται αυτό το αλληλόμορφο περαιτέρω.

Η παραλλαγή A438T βρέθηκε σε έναν ασθενή ο οποίος είχε δύο πρωτογενείς καρκίνους. Είχε διαγνωστεί με καρκίνο του προστάτη και μικροδορυφορικού σταθερή δεξιάς καρκίνος του παχέος εντέρου στις ηλικίες των 61 και 64 ετών, αντίστοιχα (Σχήμα 1Α, Οικογενειακά 1). Ο πατέρας του πρόγονο που μεταφέρονται επίσης την παραλλαγή A438T και είναι το μόνο άλλο μέλος της οικογένειας με καρκίνο του παχέος εντέρου, είχε διαγνωστεί με καρκίνο του μικροδορυφορικού σταθερή σιγμοειδές στην ηλικία των 76 χρόνων. Από τα μη προσβεβλημένα μέλη της οικογένειας 6 δοκιμάστηκε για την αλλαγή αυτή εσφαλμένου νοήματος, 3 βρέθηκαν να φέρουν την παραλλαγή A438T (Εικόνα 1Α). Αλληλούχιση αναλύσεις ζεύγη δειγμάτων γενωμικού DNA όγκο-φυσιολογική αποκάλυψαν απώλεια του άγριου τύπου

ΕΡΗΒ2

αλληλόμορφο στο καρκίνο του παχέος εντέρου από το proband, αλλά όχι στο καρκίνου του παχέος εντέρου από τον πατέρα του (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). όγκου του πατέρα εκδηλώνεται ΑΕ της παραλλαγής, παρά τον άγριο τύπο,

ΕΡΗΒ2

αλληλόμορφο. Η τελευταία αυτή παρατήρηση μπορεί να αντανακλά τη συχνή απώλεια του 1ρ36.1 χρωμοσωμικής περιοχής κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης [7], [8], και όχι η στοχευμένη απενεργοποίηση του

ΕΡΗΒ2

τόπο από ΑΕ.

+ /-, φορέας? – /-, Μη-φορέα? LOH +, ορθοκολικό καρκινικό ιστό βρέθηκε να εκδηλωθεί LOH, με απώλεια του αλληλόμορφου άγριου τύπου? Ca, καρκίνος.

Η

Η παραλλαγή G787R ανιχνεύθηκε σε έναν ασθενή με διάγνωση καρκίνου του ορθού στην ηλικία των 67 ετών (Σχήμα 1Β, Οικογένεια 2). Αυτός ο όγκος έδειξε απώλεια του αλληλόμορφου άγριου τύπου (Σχήμα 2). Η ασθενής ανέφερε επίσης ιστορικό καρκίνου του θυρεοειδούς ωοθυλακίων τύπου σε ηλικία 73 χρόνων. Αυτό πρόγονο επελέγη για τη διαλογή μεταλλάξεων λόγω οικογενειακό ιστορικό καρκίνου του παχέος εντέρου στην μητρική πλευρά. Ωστόσο, τα στοιχεία προσδιορισμού του γονότυπου αποκάλυψε ότι η παραλλαγή αλληλόμορφου G787R είτε προέρχεται από την πατρική πλευρά ή είναι το αποτέλεσμα μιας

de novo

μετάλλαξη (Εικόνα 1Β). Η κόρη του proband είναι η μόνη άλλη φορέας αυτής της παραλλαγής, και αυτή είναι σήμερα επηρεάζεται από την ηλικία των 45 ετών.

Σε σχέση με τις εντάσεις των ζωνών γουανίνης στην αντίδραση προσδιορισμού αλληλουχίας, η ένταση του νουκλεοτιδίου γουανίνης στο θέση 2359 μειώνεται σημαντικά στο δείγμα του όγκου, γεγονός που υποδηλώνει απώλεια του αλληλίου άγριου τύπου (G) στον όγκο αλλά όχι με τον παρακείμενο φυσιολογικό ιστό (βέλος δείχνει nt. 2359).

η

εκτιμάται η αλληλόμορφο συχνότητες των παραλλαγών A438T και G787R με διαλογή μια πρόσθετη σειρά βάσει πληθυσμού περιπτώσεις ορθοκολικού καρκίνου και σύμπτωση ηλικίας και φύλου άτομα ελέγχου. Τα αποτελέσματα προσδιορισμού του γονότυπου προτείνουν ότι αυτά τα δύο αλληλόμορφα είναι σπάνιες παραλλαγές (Πίνακας 1). Ούτε παραλλαγή ανιχνεύθηκε σε θέματα ελέγχου και δεν είχαν εντοπιστεί σε οποιεσδήποτε πρόσθετες παχέος περιπτώσεις καρκίνου. Ως εκ τούτου, για να αξιολογηθεί περαιτέρω η πιθανή παθογόνο ρόλο της A438T και παραλλαγές υποδοχέα G787R, χαρακτηρίσαμε ενδογενή δραστικότητα κινάσης τυροσίνης τους.

Βιοχημικός χαρακτηρισμός των A438T και G787R ισομορφές αποκάλυψε ότι η παραλλαγή G787R είναι λειτουργικά διαταραγμένη, ενώ η αλλαγή A438T πιθανόν αντιπροσωπεύει ένα ουδέτερο πολυμορφισμό. κύτταρα DU145, τα οποία δεν εκφράζουν μια ενδογενή λειτουργικό υποδοχέα ΕΡΗΒ2 [11], επιμολύνθηκαν παροδικά είτε με τον υποδοχέα ΕΡΗΒ2 άγριου τύπου ή μία από τις δύο παραλλαγές. Βρήκαμε μειωμένη αυτοφωσφορυλίωση του υποδοχέα G787R, αλλά όχι την παραλλαγή A438T, μετά ephrinB1 διέγερση σε σύγκριση με τον υποδοχέα φυσικού τύπου (Εικόνα 3Α). Επιβεβαιώσαμε ότι ο υποδοχέας G787R μείωσε την καταλυτική δραστηριότητα χρησιμοποιώντας μία in vitro δοκιμασία κινάσης. Η ικανότητα του υποδοχέα G787R αυτοφωσφορυλίωσης ή να φωσφορυλιώσουν το υπόστρωμα ενολάσης ήταν περίπου 9-φορές χαμηλότερη από εκείνη του υποδοχέα άγριου τύπου (Σχήμα 3Β), αποδεικνύοντας ότι η μετάλλαξη G787R μεταβάλλει δραστικότητα υποδοχέα και δεν είναι μια σπάνια ουδέτερο πολυμορφισμό.

Πίνακας Α: Μειωμένη αυτοφωσφορυλίωση της παραλλαγής ΕΡΗΒ2 G787R σε απάντηση ephrinB1 διέγερση. κύτταρα DU145 διαμολύνθηκαν παροδικά με κατασκευάσματα cDNA (κενός φορέας? άγριου τύπου, wt? A438T? G787R) και είτε αριστερά μη διεγερμένα (-) ή διεγέρθηκαν (+) με preclustered ephrinB1-Fc για 30 λεπτά. ΕΡΗΒ2 ανοσοκατακρημνίστηκε (IP) και ανοσοστυπώθηκαν (IB) με αντιφωσφοτυροσίνης (4G10) για την αξιολόγηση αυτοφωσφορυλίωση υποδοχέα. Το κυτταρόλυμα ανοσοστυπώθηκαν με antiEPHB2 να διαπιστωθεί ότι υπήρξε ίση αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης. Πίνακας Β: καταργήθηκε δραστηριότητα κινάσης της παραλλαγής ΕΡΗΒ2 G787R. Ιη vitro δοκιμασίες κινάσης πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση φυσικού τύπου ΕΡΗΒ2 ή ανοσοκαταβύθισης G787R και ενολάσης ως εξωγενές υπόστρωμα. Πριν από την απεικόνιση ή immonoblotting κατά ΕΡΗΒ2, φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση γέλης και χρώση με Coomassie. Αυτοραδιογράφημα που δείχνει

ενσωμάτωση 32PγATP σε ΕΡΗΒ2 και ενολάσης (άνω πάνελ), αντι-ΕΡΗΒ2 ανοσοστύπωμα (μεσαίο πλαίσιο) και ίση φόρτωση των ενολάσης εμφανίζεται (κάτω πίνακας). Ο πίνακας δείχνει τη σχετική δραστηριότητα κινάσης του υποδοχέα ΕΡΗΒ2 άγριου τύπου (στο 100%)

vs.

Την παραλλαγή G787R.

Η

Συζήτηση

Το Εφεσ οικογένεια υποδοχέων είναι η μεγαλύτερη γνωστή υποομάδα των υποδοχέων κινασών τυροσίνης. Αυτή η οικογένεια υποδιαιρείται σε δύο διακριτές κατηγορίες, EphA (Α1 έως Α10) και EphB (Β1 έως Β6), με βάση την δέσμευση συγγένειες τους για δύο συνδέτη οικογένειες αγκυροβολημένες στην μεμβράνη με τα αντίστοιχα ονόματα τύπου Α (Α1 έως Α5) και Β (Β1 έως Β3) εφρινών [19], [20]. Μετά δέσμευση συνδέτη, Eph υποδοχείς ενεργοποιούν οδούς άπωση κυττάρου να ρυθμίζει κυτταρική διαμερισματοποίηση και παραγγέλθηκε κυτταρική μετανάστευση σε ποικιλία βιολογικών διεργασιών [19].

Ποντίκια μελέτες ζωικού μοντέλου έχουν δείξει ότι, στο λεπτό έντερο, EphB υποδοχείς διαμεσολαβούν πολλαπλασιασμός εντερική βλαστικών κυττάρων [21], καθώς και τη μετανάστευση των επιθηλιακών κυττάρων και την οργάνωση κατά μήκος της κρύπτης-λάχνης άξονα [5]. Δεδομένου ότι η απώλεια του ελέγχου μιτωτική δραστηριότητα, επιθηλιακά διαμόρφωση και την αρχιτεκτονική του ιστού είναι το σήμα κατατεθέν της ογκογένεσης, διατάραξη της κανονικής έκφρασης του υποδοχέα EphB και λειτουργία πιθανώς προωθεί παχέος καρκινογένεση. Συστατική έκφραση του υποδοχέα EphB μπορεί να διεγείρει την έναρξη του όγκου με τη διατάραξη πολλαπλασιαστική ομοιόσταση των βλαστικών κυττάρων, και δευτερεύουσα σίγηση της δράσης του υποδοχέα EphB μπορεί να επιτρέψει την επέκταση των καρκινικών κυττάρων, πέρα ​​από τα χωρικά όρια που επιβάλλονται από τη λειτουργία άθικτο υποδοχέα EphB για τη συμπλήρωση γειτονικές δομές ιστού [5], [6 ], [21]. Σε υποστήριξη αυτής της υπόθεσης, εμείς και άλλοι έχουν δείξει πρόσφατα μια αιτιώδη ρόλο για EphB αδρανοποίηση της εξέλιξης του καρκίνου [22]. Βρήκαμε ότι

EphB2

ή

EphB3

φίμωση στο Αρο

Min /+ ποντίκια οδηγεί σε επιταχυνόμενη και πιο επιθετική παχέος ογκογένεση.

Στην παρούσα μελέτη, θα προβληθεί 116 με βάση τον πληθυσμό οικογενείς περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου για μεταλλάξεις σε ένα γονίδιο καταστολέα υποψήφιος όγκων, ΕΡΗΒ2, και προσδιόρισε τρεις υποψήφιες παραλλαγές (A438T, D679N, G787R), που χαρακτηρίστηκαν περαιτέρω. Ακόμα κι αν το αλληλόμορφο A438T δεν παρατηρήθηκε στην ομάδα ελέγχου και βρέθηκε να διαχωρίζονται με νόσο στην Οικογενειακή 1, βιοχημικός χαρακτηρισμός υποδηλώνει ότι A438T είναι μια σπάνια ουδέτερο πολυμορφισμό? δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την πιθανότητα ότι επηρεάζει πιο λεπτές πτυχές της σηματοδότησης ΕΡΗΒ2, όπως ο σχηματισμός των ολιγομερών ανώτερης τάξης. Η παραλλαγή D679N έχει αναφερθεί προηγουμένως ότι σχετίζονται με τον καρκίνο του προστάτη [11]. Παρά το γεγονός ότι, παραμένει πιθανό ότι αυτή η παραλλαγή ρυθμίζει προδιάθεσης για καρκίνο του προστάτη, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι αυτό συμβαίνει σε συχνότητα πληθυσμό περίπου 1% και ότι αυτό δεν συμβαίνει, από μόνη της, να αυξήσει την ευαισθησία σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Παρατηρήσαμε το αλληλόμορφο D679N σε παρόμοιο αριθμό ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου και ελέγχους πληθυσμός αντιστοίχιση. Σε αντίθεση με αυτές τις τελευταίες παραλλαγές, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η παραλλαγή G787R είναι λειτουργικά σε κίνδυνο και μπορεί να είναι μια σπάνια αιτία της κληρονομικής ορθοκολικού καρκίνου. Η παραλλαγή G787R ταυτοποιήθηκε σε έναν ασθενή με διάγνωση καρκίνου του ορθού κατά 67 ετών, και βιοχημικός χαρακτηρισμός έδειξε ότι η υποκατάσταση G787R μειώνει σημαντικά ενδογενή δραστικότητα κινάσης του υποδοχέα.

Υπήρξαν δύο άλλες έρευνες εξέταση της συμβολής της βλαστική

ΕΡΗΒ2

μεταλλάξεις σε ορθοκολικό καρκίνο ευαισθησία. Oba

et al.

Διαλογή για

ΕΡΗΒ2

μεταλλάξεις σε όγκους του παχέος εντέρου και των αντίστοιχων φυσιολογικών ιστών κόλον από 50 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, και προσδιόρισε ένα ιντρόνιο 8 μεταβολή σε ένα μοναδικό δείγμα όγκου, η οποία οδηγεί σε μια μετάλλαξη ανοησίες. Ωστόσο, είναι ασαφές αν αυτό είναι μια σωματική μετάλλαξη, καθώς δεν υπάρχει καμία ένδειξη για το αν αυτή η γενετική αλλαγή παρατηρήθηκε επίσης στο ζευγαρωμένα φυσιολογικό δείγμα κόλον [23]. Αυτή η έρευνα εντόπισε επίσης 15 περιπτώσεις ΑΕ που αφορούν το

ΕΡΗΒ2

γονιδίων και ελέγχονται για μεταλλάξεις στο υπόλοιπο

ΕΡΗΒ2

αλληλόμορφο. Δεδομένου ότι δεν εντοπίστηκαν μεταλλάξεις στα υπόλοιπα αλληλόμορφο, Oba

et al.

Πρότεινε ότι

ΕΡΗΒ2

δεν είναι μια κλασική ογκοκατασταλτικό γονίδιο. Ωστόσο, δεδομένου ότι αναλύθηκαν μόνο 50 δείγματα πιθανόν σποραδικές περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου, ένας ρόλος ογκοκατασταλτικό για

ΕΡΗΒ2

δεν μπορεί να αποκλειστεί. Σε μια πιο πρόσφατη μελέτη, Kokko

et al.

Ανέφερε μια συσχέτιση των τριών νέων παραλλαγών με καρκίνο του παχέος εντέρου [24]. Βλαστικής σειράς αλλαγές παρανοηματική με αποτέλεσμα I361V, R568W, και D861N παρατηρήθηκαν σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, αλλά όχι σε υγιείς μάρτυρες. Ωστόσο, είναι πιθανό ότι αυτές οι τρεις παραλλαγές είναι σπάνιες ουδέτερους πολυμορφισμούς δεδομένου ότι η βιολογική σημασία των παραλλαγών δεν αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας απευθείας λειτουργικές δοκιμασίες. Οι ασθενείς εξετάζονται σε αυτές τις δύο τελευταίες μελέτες δεν έχουν κατ ‘ανάγκη σημαντικό οικογενειακό ιστορικό καρκίνου του παχέος εντέρου. Σε αντίθεση με αυτές τις δύο προηγούμενες εκθέσεις, η μελέτη μας σχεδιάστηκε για να αξιολογήσει ειδικά το ρόλο των βλαστικής σειράς

ΕΡΗΒ2

μεταλλάξεις σε ασθενείς με οικογενή καρκίνο του παχέος εντέρου, και όχι σε σποραδικές περιπτώσεις. Παρά τις διαφορές σχεδιασμός της μελέτης, καθώς και οι τρεις αυτές έρευνες δείχνουν ότι

ΕΡΗΒ2

μεταλλάξεις βλαστικής σειράς δεν είναι κοινές εμφανίσεις σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Περαιτέρω έρευνες μεγαλύτερα μεγέθη δειγμάτων που απαιτούνται για την επιβεβαίωση αυτής της παρατήρησης.

Εν ολίγοις, έχουμε εντοπίσει μια βλαστική

ΕΡΗΒ2

παραλλαγή (G787R) με μειωμένη βιολογική δράση σε ένα παχέος ασθενή με καρκίνο, και δείχνουν ότι

ΕΡΗΒ2

μεταλλάξεις συμβάλλουν σε ένα μικρό κλάσμα της κληρονομικής ορθοκολικού καρκίνου. Η σπανιότητα της βλαστικής σειράς

ΕΡΗΒ2

μεταλλάξεις υποστηρίζει ένα πιο σημαντικό ρόλο για την ΕΡΗΒ2 στην παχέος την εξέλιξη του όγκου και όχι στην έναρξη του όγκου. Δεδομένου ότι οι υποδοχείς EphB (ΕΡΗΒ2, EPHB3 και EphB4) ακολουθούν παρόμοια πορεία των μεταγραφική σίγηση σε καρκίνους του παχέος εντέρου, όλα τα μέλη της οικογένειας των υποδοχέων EphB ίσως παίξει παρόμοιο ρόλο σε αυτή την ασθένεια. Συνεπώς, η οικογένεια EphB πιθανό αντιπροσωπεύει ένα μικρό ποσοστό του γενετική προδιάθεση για καρκίνο του παχέος εντέρου, αλλά έχει ένα σημαντικό ρόλο στην πρόοδο του όγκου. Παρά το γεγονός ότι τα ευρήματά μας δείχνουν ότι το

EphB

γονίδιο της οικογένειας δεν θα πρέπει να ελέγχονται τακτικά για μεταλλάξεις βλαστικής σειράς σε οικογενείς περιπτώσεις, το

EphB

γονίδια υποψήφια καταστολείς των όγκων, πιθανότατα αντιπροσωπεύοντας σπάνιες περιπτώσεις οικογενούς καρκίνου του παχέος εντέρου .

Υποστήριξη Πληροφορίες

πίνακα S1.

doi: 10.1371 /journal.pone.0002885.s001

(0,06 MB DOC)

Πίνακας S2.

doi: 10.1371 /journal.pone.0002885.s002

(0,05 MB DOC)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστήσω τον Δρ Δ Daftary, κα Σ Holter, κα Α Janson για τη βοήθειά τους με τη συλλογή δεδομένων, και η κα Joelle Fontaine, η κα Τ Selander και το Mount Sinai Hospital Biospecimen Repository για τεχνική βοήθεια.