Αφηρημένο

Η ανώμαλη μεθυλίωση του DNA έχει παρατηρηθεί σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας? Ωστόσο, οι περισσότερες μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει μη ποσοτικές προσεγγίσεις για τη μέτρηση της DNA μεθυλίωση. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να ποσοτικοποιηθούν μεθυλίωση εντός επιλέξτε πάνελ γονιδίων προηγουμένως ταυτοποιηθεί ως στόχοι για επιγενετικών σίγηση σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και για την ταυτοποίηση γονιδίων με αυξημένα μεθυλίωση που μπορεί να διακρίνει τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας από την κανονική ιστούς. Εντοπίσαμε 49 γυναίκες με διηθητικό καρκίνο εκ πλακωδών κυττάρων του τραχήλου της μήτρας και 22 γυναίκες με φυσιολογική δείγματα κυτταρολογίας. Όξινο θειώδες-τροποποιημένο γονιδιακό DNA ενισχύθηκε και ποσοτική Pyrosequencing ολοκληρωθεί για 10 γονίδια (

APC

,

CCNA

,

Cdh1

,

CDH13

,

WIF1

,

Timp3

,

DAPK1

,

RaRb

,

FHIT

, και

SLIT2

). Ένα μεθυλίωση δείκτης υπολογίστηκε ως η μέση επί τοις εκατό μεθυλίωσης σε όλες τις CpG θέσεις αναλύθηκαν ανά γονίδιο (~ 4-9 CpG τοποθεσία) ανά ακολουθία. Ένα δυαδικό cut-σημείο ορίστηκε σε & gt? 15% μεθυλίωση. Εξετάστηκε Ευαισθησία, ειδικότητα και την περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC (AUC) της μεθυλίωσης σε μεμονωμένα γονίδια ή έναν πίνακα. Η διάμεση δείκτης μεθυλίωση ήταν σημαντικά υψηλότερη σε περιπτώσεις σύγκριση με τους ελέγχους σε 8 γονίδια, ενώ δεν υπήρχε διαφορά στο μέσο μεθυλίωσης για 2 γονίδια. Σε σύγκριση με τον ιό HPV και την ηλικία, το συνδυασμό του επιπέδου μεθυλίωσης του DNA των

DAPK1

,

SLIT2

,

WIF1

και

RaRb

με τον ιό HPV και την ηλικία βελτιωθεί σημαντικά η AUC 0,79 – 0,99 (95% CI: 0.97-1.00,

p-value

= 0,003). Pyrosequencing ανάλυση επιβεβαίωσε ότι διάφορα γονίδια είναι κοινοί στόχοι για την παρεκκλίνουσα μεθυλίωση σε καρκίνο του τραχήλου και του DNA επίπεδο μεθυλίωσης των τεσσάρων γονιδίων φαίνεται να αυξάνει την ειδικότητα για τον εντοπισμό του καρκίνου σε σύγκριση με μόνη την ανίχνευση του HPV. Μεταβολές στη μεθυλίωση του DNA συγκεκριμένων γονιδίων στους καρκίνους του τραχήλου, όπως

DAPK1

,

RaRb

,

WIF1

, και

SLIT2

, μπορεί επίσης να εμφανιστεί νωρίς στην τραχηλική καρκινογένεση και θα πρέπει να αξιολογούνται

Παράθεση:. Siegel EM, Riggs BM, Delmas AL, Koch Α, Hakam Α, Μπράουν KD (2015) Ποσοτική μεθυλίωσης του DNA Ανάλυση των υποψηφίων γονιδίων στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. PLoS ONE 10 (3): e0122495. doi: 10.1371 /journal.pone.0122495

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Osman El-Maarri, Πανεπιστήμιο της Βόννης, Institut πειραματικής αιματολογία και τη μετάγγιση του φαρμάκου, Γερμανία

Ελήφθη: 26 του Ιουνίου 2014? Αποδεκτές: 22 Φλεβάρη 2015? Δημοσιεύθηκε: 31 Μαρ, 2015

Copyright: © 2015 Siegel et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Τα δεδομένα υποκείμενα τα ευρήματα αυτής της μελέτης θα είναι διαθέσιμα κατόπιν αιτήματος και δεν διατίθενται ελεύθερα σε ένα δημόσιο χώρο αποθήκευσης. Τα δεδομένα δεν μπορούν να δημοσιοποιούνται λόγω των περιορισμών της IRB την έγκρισή μας, συμπεριλαμβανομένου και του μικρού μεγέθους του δείγματος που μπορεί να μειώσει την ανωνυμία και την ένταξη των PHI ασθενή εντός του συνόλου δεδομένων για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων των ασθενών. Οι τελικές σύνολο δεδομένων και των πρώτων πυρογραμμάτων είναι διαθέσιμες κατόπιν αιτήματος με το ακόλουθο: Moffitt Κέντρο Καρκίνου Πληροφορίες Τμήμα Shared Services ([email protected]) ή τις ακόλουθες μελέτη κύριοι ερευνητές: Erin M. Siegel (Μέλος Τμήμα Βοηθός του Cancer Epidemiology Moffitt Κέντρο Καρκίνου 12902 Magnolia Drive, Tampa, FL 33612) E-mail: [email protected], Kevin D. Brown (Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήματος Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας του Πανεπιστημίου της Φλόριντα College of Medicine Gainesville, FL 32610) E-mail: [email protected] ( 352) 273-5458

Χρηματοδότηση:. Υποστήριξη για τη μελέτη αυτή δόθηκε από το Πανεπιστήμιο της Φλόριντα-Moffitt Συνεργατική Grant (UF09060) και επιχορήγηση του National Cancer Institute 1RO3 CA143980-01 με EMS και KDB. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το Μηχανισμό ιστών Core και της διευκόλυνσης Collaborative Services βασικών δεδομένων στο H. Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, ένα NCI οριστεί Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου, υπό τον αριθμό επιχορήγησης P30-CA76292. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Επιγενετικές γονιδιακή σίγηση μέσω πυκνά μεθυλίωσης του DNA εντός νησίδες CpG έχει αποδειχθεί να συμβεί σε πολλούς τύπους όγκων συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV) -associated τον καρκίνο του τραχήλου [1]. ογκοκατασταλτικά γονίδια (ΕΠΠ) που είναι σαφείς σημασίας στην παθογένεση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας είναι κοινοί στόχοι για γονιδιακή σίγηση σε αυτή τη νόσο [2,3]. Η ταυτοποίηση ενός πάνελ παρεκκλίνοντα μεθυλιωμένων ΟΚΓ που αντιπροσωπεύουν ένα ευρύ φάσμα λειτουργιών καταστολής όγκου (

i

.

e

., Κυτταρική σηματοδότηση, τη μεταγραφή γονιδίων, του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, και κυτταρικής προσκόλλησης ) έχει μεγάλη υπόσχεση να παρέχει ένα ισχυρό σύνολο των βιοδεικτών μεθυλίωσης DNA για χρήση στη διάγνωση της νόσου ή /και την πρόγνωση [4].

Τα γονίδια που κωδικοποιούν διάφορους βασικούς ρυθμιστές της ογκογόνο οδό /β-κατενίνης Wnt, όπως

Cdh1

(E-cadherin),

APC

, και

WIF1

, συχνά σιγήσει μέσω πυκνών μεθυλίωσης των περιοχών υποκινητή τους στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [5]. Για παράδειγμα,

Cdh1

γονίδιο υπερμεθυλίωση έχει παρατηρηθεί στην πλειοψηφία των πρωτογενών όγκων και του τραχήλου της μήτρας σε σημαντικό αριθμό υψηλού βαθμού τραχηλικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας-3 (CIN3), γεγονός που υποδηλώνει ότι η επιγενετική κατάσταση αυτού του γονιδίου έχει ένα δυναμικό εφαρμογή ως βιοδείκτη της αυχενικής κακοήθειας [6]. Άλλα γονίδια φέρεται υπερμεθυλίωση στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας με λίγο ή καθόλου μεθυλίωση σε κανονική ή χαμηλού βαθμού CINS περιλαμβάνουν

DAPK1

[7,8],

RaRb

[8,9],

Timp3

[10], CCNA [11] και

FHIT

[7]. Ωστόσο, υπήρξαν ασυνέπειες στην αναφερόμενη επικράτηση του DNA υπερμεθυλίωση αρκετών TSG εντός του τραχήλου της μήτρας [2,12], η οποία μπορεί να οφείλεται στη χρήση μη ποσοτικών μεθόδων για την ανίχνευση μεθυλίωσης.

Μέχρι σήμερα, η πλειοψηφία των μελετών που εξετάζουν επιγενετικές γεγονότα αποσιώπηση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας έχουν στηριχθεί σε ημι-ποσοτικές ή ποιοτικές προσεγγίσεις για να σκοράρει γονίδιο μεθυλίωσης [2], όπως μεθυλίωσης ειδική PCR (MSP) ή ημι-ποσοτική MSP (QMSP) [13]. Ωστόσο, αυτές οι δοκιμασίες έχουν αναφερθεί να υπερεκτιμήσει την επικράτηση του έκτροπου μεθυλίωσης για κάποιο loci δείκτη, ειδικά σε ετερογενείς πληθυσμοί DNA [4]. Μέσα στην τελευταία δεκαετία, διθειώδες Pyrosequencing έχει αναδειχθεί ως ποσοτική μέθοδος για τη μέτρηση της μεθυλίωσης DNA σε μεμονωμένες θέσεις CpG εντός ενός πληθυσμού μορίων DNA [14,15]. Pyrosequencing μπορεί να χρησιμοποιηθεί με μια ποικιλία βιολογικών δειγμάτων (

i

.

e

. (FFPE), κατεψυγμένα, γρατζουνιές ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη σταθεροποιημένα με φορμαλίνη,

κλπ

. ), γεγονός που καθιστά αυτή την προσέγγιση επιδεκτικές για χρήση σε κλινικό περιβάλλον [4]. Μέχρι σήμερα, έχουν υπάρξει πολύ λίγες εξετάσεις της μεθυλίωσης του DNA στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας χρησιμοποιώντας αυτό το εξαιρετικά ακριβή, ποσοτική ανάλυση [16].

Για τη μελέτη αυτή, επιλέξαμε ένα σύνολο 10 ΕΠΠΕ (

APC

,

CCNA

,

Cdh1

,

CDH13

,

DAPK1

,

FHIT

,

RaRb

,

SLIT2

,

Timp3

,

και WIF1

) ότι, με βάση μια έρευνα της βιβλιογραφίας, είχε προηγουμένως αποδειχθεί ότι είναι στόχοι για παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του DNA στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, αλλά δεν πλήρως δοκιμαστεί με τη χρήση ποσοτικών μεθόδων. Επιπλέον, τα γονιδιακά προϊόντα λειτουργούν σε διαφορετικά βιολογικές οδούς, καθένα από τα οποία έχει αποδειχθεί ότι έχουν επίδραση HPV που σχετίζονται με την καρκινογένεση του τραχήλου της μήτρας [2]. Τα γονίδια αυτά υποβλήθηκαν σε ανάλυση Pyrosequencing σε δείγματα πλακώδες καρκίνωμα (SCC) του τραχήλου της μήτρας και του τραχήλου της μήτρας κανονική κύτταρα. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να προσδιοριστούν τα γεγονότα γονίδιο μεθυλίωσης χρησιμεύουν για τη διάκριση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας από τα φυσιολογικά κύτταρα που θα μπορούσαν τελικά να προστεθεί στο πρότυπο διαγνωστικό έλεγχο για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας.

Υλικά και Μέθοδοι

Επιλογή Ασθενών και δεδομένα

Χρησιμοποιώντας ένα σχέδιο ασθενών-μαρτύρων, εντοπίσαμε 49 γυναίκες με διηθητικό καρκίνο του SCC οι οποίοι ταιριάζουν συχνότητα με την ηλικία και την εθνικότητα σε γυναίκες με φυσιολογική κυτταρολογία δείγματα (μάρτυρες). Περιπτώσεις είχαν συμπεριληφθεί αν είχαν (1) μια χειρουργική διαδικασία μεταξύ των ετών 1991 και 2006 στο Κέντρο Καρκίνου Moffitt, (2) αρχειοθετημένα μπλοκ όγκου FFPE, και (3) δεν υπάρχει θεραπεία ακτινοβολίας πριν από την επέμβαση. Για τους ελέγχους, συλλέξαμε φυσιολογικά κύτταρα του τραχήλου από γυναίκες με φυσιολογική κυτταρολογία και μεγάλη πιθανότητα να είναι HPV θετικές. Εν συντομία, υγρή κυτταρολογική βάση (LBC) δείγματα (Ν = 22) συλλέχθηκαν από τις γυναίκες που συναίνεσε να συμμετάσχουν στη μελέτη μας κατά τη διάρκεια μιας επίσκεψης κλινική είτε σε υψηλού κινδύνου σεξουαλικώς μεταδιδόμενα κλινική νόσο του Τμήματος Υγείας Hillsborough County ή κολποσκόπηση κλινική σε Τάμπα Γενικό Νοσοκομείο, Tampa, Fl. Εξετάσαμε, επίσης, μια σειρά από κανονική του τραχήλου της μήτρας φορμόλη σταθερό ενσωματωμένα σε παραφίνη (FFPE) τετράγωνα μακριά από τις γυναίκες αρχειοθετούνται από τις γυναίκες που είχαν διαγνωστεί με είτε καλοήθεις ινομυωμάτων της μήτρας μαλακών ιστών (Ν = 15) για να εξετάσει τα επίπεδα μεθυλίωσης σε όλη με τις μεθόδους διατήρησης των ιστών (LBC έναντι FFPE). Όλοι οι ιστοί είχαν παθολογικά ή κυτταρολογικά επανεξετάζονται και, ενδεχομένως, το στάδιο του όγκου, το βαθμό και ιστολογική διάγνωση επιβεβαιώθηκε. Κλινικοπαθολογοανατομικών και τα αποτελέσματα τα δεδομένα ελήφθησαν από το Αρχείο Καρκίνου Moffitt.

Ηθική Δήλωση

Όλες οι δραστηριότητες μελέτης και τις διαδικασίες συναίνεσης εγκρίθηκαν από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review στο Πανεπιστήμιο της Νότιας Φλόριντα (IRB # 102998) . FFPE μπλοκ ιστού από τις περιπτώσεις και έλεγχοι που συλλέγονται στο πλαίσιο της κλινικής φροντίδας. Η παραίτηση του εν επιγνώσει συναίνεση εγκρίθηκε για τη χρήση του απο-προσδιορίζονται αρχειοθετούνται ιστών από τις γυναίκες που δεν παρέχουν εν επιγνώσει συναίνεση από το Πανεπιστήμιο της Νότιας Φλόριντα IRB. Δεν ήταν εφικτό να συναινέσει για την αξιοποίηση των υπολειμματικών δειγμάτων εντοπίστηκαν για τη μελέτη αυτή, η οποία ήταν όλα τουλάχιστον 5 ετών, όταν λαμβάνονται. Οι γυναίκες με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση για μια IRB εγκεκριμένο έντυπο συγκατάθεσης για τη συλλογή των δειγμάτων κυτταρολογίας υγρής-based (Ν = 22).

Απομόνωση DNA και Εξόρυξη

ιστούς FFPE είχαν macrodissected από τρεις 10 μΜ παχιά τμήματα και DNA που εκχυλίζεται με χρήση του Qiagen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Valencia, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Για LBC δείγματα, ένα δείγμα 1-4 κ.εκ. PreservCyt φυγοκεντρήθηκε και το DNA εκχυλίζεται από τα κύτταρα που έχουν καθιζάνει χρησιμοποιώντας το Qiagen QIAmp DNA Mini Kit (Valencia, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. συγκέντρωση του DNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα NanoDrop1000 Φασματοφωτόμετρο (Wilmington, DE).

Ανίχνευση Το DNA του HPV και Δακτυλογραφία

Η INNO-LiPA HPV Γονοτυπικές Extra AMP (Innogenetics, Βέλγιο) διεξήχθη για να ενισχύσει ένα 65 -BP θραύσμα χρησιμοποιώντας το SPF

10 PCR εκκινητής που σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. SFP

10 προϊόντα επιμηκύνσεως από δείγματα HPV-θετικά στη συνέχεια αναλύθηκαν με αντίστροφης υβριδοποίησης για την HPV δοκιμασία ανάστροφης υβριδοποίηση ανιχνευτή γραμμή (LiPA). δοκιμασία LiPA ανιχνεύει 13 καρκινογόνος (HPV-16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59, -68 και), 3 πιθανώς καρκινογόνες (HPV-53, -66 και -70) και 9 μη καρκινογόνες τύπους HPV (HPV-6, -11, -34, -40, -42, -43, -44, -54, και -74) [17]. Θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι περιελάμβαναν DNA από κυτταρικές σειρές HeLa, νερό και το δείγμα θετικού ελέγχου περιλαμβάνεται στο κιτ.

Pyrosequencing

όξινο θειώδες νάτριο μετατροπή του γενωμικού DNA (10 μg) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση DNA EZ Μεθυλίωση -Άμεση σετ (Zymo Έρευνας, Orange, CA) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Ποσοτική ανάλυση μεθυλίωσης του DNA διεξήχθη με Pyrosequencing όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Τμήματα των γονιδίων ενισχύθηκαν από όξινο θειώδες μετατρέπεται DNA με PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές που αναφέρεται στο S1 πίνακα. Για την απομόνωση του μονόκλωνου amplicon, ο αντίστροφος εκκινητής που χρησιμοποιείται σε όλες τις αντιδράσεις PCR συντέθηκαν με ένα μόριο βιοτίνης στο 5 ‘άκρο. Εν συντομία, η PCR πραγματοποιήθηκε σε έναν όγκο αντίδρασης 30 μΐ, το οποίο περιείχε 1 μΙ προτύπου με όξινο θειώδες τροποποιημένο DNA, PyroMark PCR Master Mix (Qiagen, Valencia, CA), Coral Πυκνό Φορτίου, 25 mM MgCl

2 ( για SLIT2), 10 μΜ εκάστου των ειδικών γονιδίων προς τα εμπρός και αντίστροφο εκκινητή. Θερμοκυκλοποίηση διεξήχθη χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους γενικούς όρους: 95 ° C για 15 λεπτά, ακολουθούμενη από 50 κύκλους στους 95 ° C για 30 sec, 47-55 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 72 ° C για 1 λεπτό και τελική επέκταση στους 72 ° C για 10 λεπτά. Μετά την ενίσχυση, 5-20 μλ προϊόντος PCR αναμείχθηκε με σφαιρίδια sepharose στρεπταβιδίνη συζευγμένη με (GE Healthcare) σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης (Qiagen, Germantown, MD) και αραιώνεται σε 60-80μl συνολικός όγκος με dH

2O. Τα σφαιρίδια στη συνέχεια συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κενό παρασκεύασμα σταθμό εργασίας, εκκινητής προσδιορισμού αλληλουχίας (S1 πίνακας) προστέθηκε, και θερμάνθηκε στους 80 ° C για 2min. Αλληλούχιση εκκινητής συγκολλάται με το βιοτινυλιωμένο κλώνο DNA ως το μίγμα της αντίδρασης ψύχεται σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δείγματα pyrosequenced χρησιμοποιώντας σύστημα PyroMark MD και CpG μεθυλίωση μετράται χρησιμοποιώντας λογισμικό PyroMark CpG. Όλα Pyrosequencing διεξήχθη κατά μέσο όρο σε δύο ανεξάρτητες αντιδράσεις PCR. Οι έλεγχοι περιελάμβαναν ανάλυση Pyrosequencing καθολικά μεθυλιωμένου ϋΝΑ ανθρωπίνου γονιδιώματος (CpGenome DNA, Millipore, Billerica, ΜΑ), μη μεθυλιωμένο ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA (ανθρώπινο DNA σπέρματος), και καμία μήτρα DNA προστίθεται στην αντίδραση Pyrosequencing.

Στατιστική ανάλυση

οι διαφορές μεταξύ υπόθεσης και του ελέγχου χαρακτηριστικά εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας Chi του Pearson

2, Fishers ‘Ακριβής ή Φοιτητών T-test. Μια μεθυλίωση Index (ΜΙ) υπολογίστηκε ως η μέση επί τοις εκατό μεθυλίωσης σε όλους τους χώρους CpG αναλύονται ανά γονιδιακή αλληλουχία (~ 4-9 CpG τοποθεσία). Ακοντιστές συντελεστή βαθμό συσχέτισης με ΒοηίεΓοηϊ διορθωθεί

p-value

χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί εάν ΜΙ συσχετίστηκαν μεταξύ των γονιδίων. Οι διαφορές στην MI μεταξύ των περιπτώσεων και των ελέγχων, συνολικά και στρωματοποιημένη ανά ηλικία (& lt?. 44 ετών έναντι ≥ 44 ετών) και την κατάσταση του HPV (θετικά έναντι αρνητικών), προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το Mann-Whitney test. Εξετάστηκε Ευαισθησία, ειδικότητα και την ακρίβεια [εμβαδόν υπό την καμπύλη (AUC)] του ΜΙ να διαφοροποιήσει τις περιπτώσεις και τους ελέγχους. Αξιολογήσαμε την αυξητική προστιθέμενη επίπεδο μεθυλίωσης του DNA σε μοντέλα πρόβλεψης που περιλαμβάνονται γνωστούς παράγοντες κινδύνου για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, την ηλικία (συνεχής) και HPV θετικότητας (οποιουδήποτε τύπου έναντι κανένα) χρησιμοποιώντας τη μέθοδο με την Janes

et al

αξία. [19]. Κατ ‘αρχάς, μοντέλα λογιστικής παλινδρόμησης ταιριάζουν με και χωρίς τις μεταβλητές μεθυλίωση? οι σχετίζονται προβλεπόμενες τιμές για όλα τα θέματα εντός του συνόλου δεδομένων που υπολογίζεται από κάθε μοντέλο και απεικονίζονται. Δοκιμάσαμε την ισότητα των δύο καμπυλών ROC χρησιμοποιώντας την εντολή STATA roccomp (Stata v12.0) [20]. Binary cut-σημεία για να χαρακτηρίσει ένα γονίδιο ως μεθυλιωμένο ορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα

a priori

cut-σημείο ΜΙ & gt? 15%. Κριτήρια για την ένταξη στον πίνακα γονίδιο μεθυλίωσης του DNA ήταν: (1) σημαντικές διαφορές MI μεταξύ των περιπτώσεων και τους ελέγχους? (2) MI δεν συσχετιζόταν σημαντικά μεταξύ των γονιδίων (Rho & lt? 0,65)? αν Rho≥0.65, είχε συμπεριληφθεί μόνο ένα γονίδιο? και (3) η AUC & gt? 0,60 για ΜΙ & gt?. 15% για τη διαφοροποίηση περιπτώσεις από τους ελέγχους

Μεταξύ των περιπτώσεων, αξιολογήσαμε τη συσχέτιση μεταξύ μεθυλίωσης (γονιδίων ή πάνελ γονιδίων) και ελεύθερη νόσου (DFS) και η συνολική επιβίωση ( OS). DFS ορίστηκε ως χρόνος από τη διάγνωση μέχρι την πρώτη υποτροπή, δεύτερη όγκου ή θανάτου λόγω καρκίνου του τραχήλου της μήτρας και OS καθώς ο χρόνος από τη διάγνωση μέχρι την ημερομηνία του θανάτου. εκτιμήσεις επιβίωσης Kaplan-Meier και πολυμεταβλητή μοντέλα παλινδρόμησης κατά Cox εξετάζονται συνεργασία με DFS και OS, τον έλεγχο για γνωστούς προγνωστικούς παράγοντες (π.χ., τοπικά προχωρημένο στάδιο (≥Stage IIB2), τάξη, την ηλικία, τη θεραπεία και HPV). Η τιμή p 0,05 (δύο όψεων) θεωρήθηκε σημαντική. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Stata /MP έκδοση 12.1 (StataCorp LP, College Station, TX, USA).

Αποτελέσματα

Χαρακτηριστικά των περιπτώσεων (Ν = 49) και ομάδα ελέγχου (Ν = 22) παρουσιάζονται στον πίνακα 1. Η μέση ηλικία των περιπτώσεων ήταν ελαφρώς υψηλότερη από τους ελέγχους (47 ± 15 χρόνια

vs

43 ± 16 έτη αντίστοιχα.)? Ωστόσο, αυτό δεν ήταν μια σημαντική διαφορά (

p-value

= 0,32). HPV DNA ανιχνεύθηκε στο 96% (47/49) των περιπτώσεων και το 55% (11/22) των ελέγχων (

p-value

& lt? 0,0001). Μεταξύ περιπτώσεις, το 88% των όγκων ήταν HPV-16 ή -18 θετική σε σύγκριση με το 14% της ομάδας ελέγχου. Πενήντα ένα τοις εκατό των περιπτώσεων είχε ένα πρώιμο στάδιο διάγνωση (Στάδιο Ι.Α.1 /1B1), ενώ το 41% ​​είχε τοπικά προχωρημένη νόσο (Στάδιο 1Β2 ή υψηλότερη).

Η

Ποσοτική μεθυλίωσης του DNA Ανάλυση

μεθυλίωση του DNA μέσα στο

APC

,

CCNA

,

Cdh1

,

CDH13

,

DAPK1

,

FHIT

,

RaRb

,

SLIT2

,

Timp3

,

και WIF1

γονίδια, καθένα από τα οποία έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι είναι ένας στόχος για παρεκκλίνουσα μεθυλίωσης του DNA στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [2], ποσοτικοποιήθηκε με Pyrosequencing. Η μεθοδολογία αυτή ποσοτικοποιεί, σε μια στοχευμένη περιοχή γονιδιώματος του 30-50bp, επί τοις εκατό μεθυλίωσης σε μεμονωμένες θέσεις CpG εντός ενός πληθυσμού μορίων DNA. Πυκνά μεθυλίωσης κυτοσίνης εντός CpG νησίδες, και πιο συγκεκριμένα σε άμεση γειτνίαση της θέσης έναρξης της μεταγραφής (TSS), συνδέεται με παρακωλύουν τη συναρμολόγηση της βασικής μηχανής μεταγραφικό εντός του πυρήνα υποκινητή με αποτέλεσμα μπλοκάρεται μεταγραφικής έναρξης και γονιδιακή σίγηση [21]. Έτσι, Pyrosequencing δοκιμασίες που αναπτύχθηκαν από την ομάδα μας έχουν σχεδιαστεί για τη μέτρηση της μεθυλίωσης κυτοσίνης σε, ή κοντά σε, το TSS (Σχήμα 1). Περιορισμοί όπως η αλληλουχία νουκλεοτιδίων της περιοχής που θα αναλυθεί και τεχνικές πτυχές της δοκιμασίας (

i

.

e

., Εκκινητές ενίσχυσης /αλληλούχισης δεν πρέπει να περιέχουν CpG δινουκλεοτίδια, αποτελεσματική και ειδική PCR ενίσχυση,

κλπ

.) τελικά επηρέασε την περιοχή προσδιορίστηκαν για κάθε γονίδιο στον πίνακα μας. Όλα Pyrosequencing δοκιμασίες που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη αναπτύχθηκαν από την ομάδα μας και δεν έχουν περιγραφεί προηγουμένως, εκτός από ένα εμπορικά διαθέσιμο προσδιορισμό για

DAPK1

. Το Σχήμα 1 απεικονίζει την αρχιτεκτονική γονίδιο (

i

.

e

., Η θέση και το μέγεθος των CpG νησιού, την περιοχή και τον αριθμό των CpG δινουκλεοτιδίων αναλύονται) και παρέχει ένα αντιπροσωπευτικό πυρόγραμμα για κάθε γονίδιο που υποδεικνύει ο τοις εκατό μεθυλίωσης της κάθε δινουκλεοτίδιο CpG που εξετάστηκαν. δείκτης μεθυλίωσης DNA (MI) υπολογίστηκε ως ο μέσος όρος μεθυλίωσης σε όλες τις CpG θέσεις εντός της περιοχής από αλληλουχία Pyrosequencing.

Illustrated είναι η γονιδιωματική αρχιτεκτονική του κάθε τόπου που εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη. Περιλαμβάνονται είναι η σχετική θέση του εξονίου 1, η θέση έναρξης της μεταγραφής (TSS), που συνδέονται CpG νησιού, και η περιοχή αναλύθηκε για μεθυλίωση με Pyrosequencing. Επίσης δείχνεται ένα αντιπροσωπευτικό πυρόγραμμα και μετράται μεθυλίωση κυτοσίνης σε κάθε CpG δινουκλεοτιδίου αναλύονται στην σχεδιασμένη δοκιμασία Pyrosequencing. Γονίδια που αναλύονται είναι

APC

(Α),

Cdh1

(Β),

CCNA

(C),

CDH13

(D),

FHIT

(Ε)?

RaRb

(F)?

SLIT2

(G)?

Timp3

(H)?

WIF1

(Ι) και

DAPK1

(J).

Η

Σε γενικές γραμμές, βρήκαμε όλοι οι προσδιορισμοί Pyrosequencing να αποδίδει καλά, με χαμηλά ποσοστά αποτυχίας προσδιορισμού, υψηλής συντελεστές ενδο-class συσχέτισης (ΔΠΔ), και με συνέπεια υψηλά επίπεδα μεθυλίωσης για θετικούς μάρτυρες. Παρατηρήσαμε πολύ χαμηλά ποσοστά αποτυχίας (≤1%) για δοκιμές με PCR αμπλικόνια & lt? 190 μονάδες βάσης σε μέγεθος. Η εξαίρεση ήταν η σχεδιαστεί

Timp3

δοκιμασία, όπου συναντήσαμε ένα ποσοστό αποτυχίας ~ 6% για να ενισχύσει τη στοχοθετημένη περιοχή και ένα ποσοστό αποτυχίας ~ 8% προκειμένου να αποκτήσει δεδομένα Pyrosequencing επαρκούς ποιότητας. APC, η οποία είχε μέγεθος αμπλικονίου από 194 bps, είχε επίσης ένα ποσοστό αποτυχίας για να ενισχυθεί η στοχευμένη περιοχή του ~ 6%? Ωστόσο, όλα τα αμπλικόνια που δημιουργούνται δεδομένα Pyrosequencing υψηλής ποιότητας. Έχουμε λάβει υψηλής ποιότητας στοιχεία από ≥90% των δειγμάτων ασθενών, με μόνο ένα δείγμα αποκλειστεί λόγω ανεπαρκούς DNA για ενίσχυση. Το ΔΠΔ για τις δοκιμασίες Pyrosequencing ήταν & gt? 0,94 για όλα τα γονίδια εκτός FHIT (ICC = 0,69), η οποία είχε χαμηλή εντός και μεταξύ των ατόμων μεταβλητότητα (1,41 και 2,11, αντίστοιχα). Τέλος, ο θετικός έλεγχος για πλήρως μεθυλιωμένο ΟΝΑ μεθυλιώθηκε με συνέπεια σε όλες τις Pyrosequencing προσδιορισμούς και παρτίδες (μέση ± SD = 90 ± 6%). Στην περίπτωση του

CCNA

, η μελέτη μας περιλαμβάνει την ανάλυση των 20 περιπτώσεων και 22 ελέγχους (Πίνακας 2), λόγω της ανεπαρκούς ποσοτήτων DNA για να ολοκληρωθεί η μελέτη αυτού του γονιδίου σε όλα τα δείγματα.

επίπεδα μεθυλίωσης σε χώρους CpG μέσα σε ένα γονίδιο ήταν σχετικά σταθερή, όπως απεικονίζεται στο Σχ S1 για

DAPK1

,

RaRb

,

και SLIT2

. Σχήμα 2 παρουσιάζεται η κατανομή των MI (

i

.

e

., Μεσαίο και διατεταρτημοριακό εύρος) για κάθε γονίδιο που εξετάστηκαν από Pyrosequencing. Η μεσαία ΜΙ ήταν σημαντικά υψηλότερη σε DNA που συλλέγονται από τα δείγματα SCC σε σύγκριση με το DNA από την κανονική δείγματα κυτταρολογίας σε 8 από τα 10 γονίδια που εξετάστηκαν (

DAPK1

,

RaRb

,

CCNA

,

SLIT2

,

WIF1

,

APC

,

Cdh1

, και

FHIT

). Αντίθετα,

CDH13

, και

Timp3

δεν έδειξε σημαντική διαφορά στη μέση MI μεταξύ ασθενών και μαρτύρων. Ο Πίνακας 2 παρουσιάζει μια λεπτομερή σύνοψη των MI για όλα τα γονίδια από το καθεστώς υπόθεση. Μεταξύ των ελέγχων, η διάμεση MI ήταν & lt? 5% για όλα τα γονίδια εκτός από

Timp3

(12,4%) και

SLIT2

(7,1%) και η μεθυλίωση επίπεδα άνω του 15% παρατηρήθηκαν μόνο για δύο γονίδια (

Timp3 και CDH13)

. Μεταξύ των περιπτώσεων, η διάμεση MI ήταν & gt? 10% για

DAPK1

,

CCNA

,

SLIT2

,

WIF1

,

και Timp3

(Πίνακας 2). Υπογραμμίζοντας την ετερογενή φύση της μεθυλίωσης του DNA στα καρκινικά κύτταρα, μετρήσαμε ένα ευρύ φάσμα σε ΜΙ για διάφορα γονίδια σε όλες τις περιπτώσεις που αναλύθηκαν. Για παράδειγμα, η διάμεση

DAPK1

ΜΙ ήταν 12% με μια σειρά από & lt? 1% έως 96%. Δοκιμάσαμε για μια πιθανή συσχέτιση στην μεθυλίωση μεταξύ γονιδίων και μόνο

SLIT2

και

CCNA

έδειξε μια σημαντική συσχέτιση (Rho = 0,68?

p-value

& lt? 0.001). οι

τα γονίδια κατά Mann-Whitney

p-value (

** τιμή p & lt? 0,0001 και * η τιμή-p & lt? 0,05). δείκτης μεθυλίωση (ΜΙ) του κάθε γονιδίου παρουσιάζεται για φυσιολογικό τραχηλικό δείγμα (Ν) και του καρκίνου (Τ) ως boxplot. Μουστάκια των boxplot σηματοδοτήσει το 5

ου και 95

ου εκατοστημόρια, το πλαίσιο σηματοδοτεί το 25

ου (χαμηλό όριο του κουτιού), μέση και 75η (άνω όριο του κουτιού) τοις εκατό, και ακραίες τιμές (●).

η

Εμείς διερευνηθεί εάν τα επίπεδα μεθυλίωσης του DNA διαφέρει ανάλογα με την ηλικία και την κατάσταση του HPV. Συνολικά, διάμεση τιμή

RaRb

,

Cdh1

,

και CDH13

μεθυλίωση ήταν υψηλότερη μεταξύ των γυναικών ελέγχου ≥ 44 χρόνια ηλικίας (

p-value = 0,02

,

p-value

= 0.01, και

p-value

= 0,04, αντίστοιχα). Οι σημαντικές διαφορές στο μέσο μεθυλίωσης μεταξύ των περιπτώσεων και οι έλεγχοι διατηρήθηκαν όταν στρωματοποιημένη ανά ηλικία (& lt? 44 χρόνια της ηλικίας τους ή ≥44 ετών) για

DAPK1

,

RaRb

,

CCNA και WIF? λαμβάνοντας υπόψη ότι η SLIT2

,

APC

,

CHD1 και FHIT ήταν μόνο διαφέρει σημαντικά μεταξύ των νεότερων ασθενών και μαρτύρων

(τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μεταξύ των ελέγχων, το DNA ΜΙ ήταν παρόμοια μεταξύ των HPV θετικών και αρνητικών HPV γυναίκες. Επιπλέον, όταν ο περιορισμός σε HPV-θετικές περιπτώσεις και τους ελέγχους, βρήκαμε πολύ παρόμοια αποτελέσματα για την μεσαία διαφορές στη μεθυλίωση και της ευαισθησίας /ειδικότητας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

επίπεδα μεθυλίωσης Διακρίνουν υποθέσεις από Έλεγχοι

χρησιμοποιώντας μια συντηρητική

a priori

όριο της ΜΙ & gt? 15% να ορίσει ένα γονίδιο ως μεθυλιωμένο, η

DAPK1

γονίδιο που ταξινομούνται ως μεθυλιώνονται στο 44% των περιπτώσεων και 0% των ελέγχων.

SLIT2

και

RaRb

υπέστησαν μεθυλίωση πάνω από 15% σε 61% και 23% των περιπτώσεων, αντίστοιχα, και κανένας από τους μάρτυρες. Χρησιμοποιώντας ΜΙ & gt? 15%,

DAPK1

και

SLIT2

είχε 100% ειδικότητα και 43% και 61% ευαισθησία, αντίστοιχα (Πίνακας 3). Όλα τα αλλά δύο γονίδια είχαν υψηλή ειδικότητα (100%), χωρίς τους ελέγχους που ταξινομούνται ως μεθυλιωμένο άνω του 15% (

i

.

e

., Κανένα ψευδώς θετικά). Στη συνέχεια, εξετάσαμε κατά πόσο η DNA ΜΙ που μετράται μέσα σε ένα συνδυασμό των γονιδίων βελτίωσε το διαχωρισμό των ομάδων. Το πάνελ των γονιδίων επιλέχτηκε χρησιμοποιώντας

a priori

κριτήρια (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι). Από τις 8 γονίδια με σημαντικά υψηλότερο MI στις περιπτώσεις (1),

CCNA

αποκλείστηκε λόγω στατιστικά σημαντική συσχέτιση με το

SLIT2

και (2)

APC

,

Cdh1

και

FHIT

αποκλείστηκαν λόγω της χαμηλής AUC (& lt? 0,60). Τα υπόλοιπα γονίδια (

DAPK1

,

RaRb

,

SLIT2

και

WIF1

) αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητά τους να εντοπίζουν τραχήλου της μήτρας περιπτώσεων καρκίνου σε σχέση με τον HPV μόλυνση και την ηλικία. Αξιολογήσαμε την αυξητική αξία της προσθήκης επίπεδα μεθυλίωσης του DNA σε μοντέλα πρόβλεψης που περιλαμβάνονται γνωστοί παράγοντες κινδύνου για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, την ηλικία (συνεχής) και την κατάσταση του HPV (θετικά έναντι αρνητικών) χρησιμοποιώντας μια μέθοδο με την Janes

et al

. [19,20]. Το μοντέλο ROC με οποιονδήποτε HPV λοίμωξη (ναι έναντι όχι) και την ηλικία (συνεχής) είχε προβλέψει AUC του 0,79. Χρησιμοποιώντας αυτό ως σημείο αναφοράς, μπορούμε στατιστικώς σύγκριση της προβλεπόμενης AUC από μοντέλα που προστίθενται DNA ΜΙ για τα τέσσερα γονίδια, σε όλους τους συνδυασμούς. Ο συνδυασμός του

DAPK1

,

SLIT2

,

WIF1

και

RaRb

(συνεχής) βελτίωσε σημαντικά την προβλεπόμενη AUC 0,79 – 0,98 (95% CI : 0.97-1.00,

p-value

= 0,002) (Σχήμα 3) για τον εντοπισμό περιπτώσεων εναντίον τους ελέγχους. Κατά τον καθορισμό θετική μεθυλίωση ως ΜΙ & gt? 15%, ο συνδυασμός του

DAPK1

,

SLIT2

,

WIF1

και

RaRb

(κανένας

vs

1-4 γονίδια & gt? 15% μετουσιωμένο) είχε την υψηλότερη ευαισθησία (90%) και η ειδικότητα (100%), με AUC 0,95 (95% CI: 0,91-0,99)

ROC των προβλεπόμενων ευαισθησία και 1-ειδικότητα όταν το DNA ΜΙ για

DAPK1

,

RaRb

,

SLIT2

και

WIF1

γονίδια προστέθηκε σε ένα μοντέλο με την ιδιότητα του HPV και την ηλικία. Η δοκιμή της ισότητας μεταξύ AUC για τον HPV και την ηλικία (AUC = 79%, διακεκομμένη γραμμή) σε σύγκριση με το δείκτη μεθυλίωση για

DAPK1

,

RaRb

,

SLIT2

και

WIF1

, HPV, και την ηλικία (AUC = 98%, συμπαγής γραμμή),

p-value = 0,0002

.

Η

Gene μεθυλίωση, Χαρακτηριστικά των όγκων και των ασθενών επιβίωση

τραχήλου της μήτρας περιπτώσεων καρκίνου διαγνώστηκαν μεταξύ 1993 και 2001, με μέσο χρόνο παρακολούθησης 5 ετών (2,4 μηνών έως 17 ετών).

Timp3

είχε χαρακτηριστεί ως έκτροπα μετουσιωμένο (& gt? 15%) συχνότερα σε φτωχά διαφοροποιημένοι όγκοι σε σύγκριση με εκείνους που καλά-να-μετρίως διαφοροποιημένων (63% έναντι 8%?

p-value

= 0.004).

DAPK1

ήταν πιο συχνά μεθυλιώνονται (MI & gt? 15) σε τοπικά προχωρημένους όγκους (στάδιο & gt? 2Β2) (65% έναντι 22%,

p-value

= 0,007). Υπήρχε μια τάση για υψηλότερες

DAPK1

μεθυλίωση σε όγκους που υποτροπίασαν περιφερικά (διάμεση τιμή ΜΙ = 36%) σε σύγκριση με εκείνους που ποτέ δεν επανεμφανίστηκαν (διάμεση τιμή ΜΙ = 13%) ή επανεμφανίστηκαν σε τοπικό επίπεδο (διάμεση τιμή ΜΙ = 5%) (

p-value

= 0,08). Το μεσαίο DFS και OS ήταν 10,3 χρόνια και 8 ετών, αντίστοιχα. Δεν υπήρχαν σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ μεμονωμένων γονιδίων μέσω μεθυλίωσης ή το καθορισμένο πίνακα των γονιδίων (

DAPK1

,

SLIT2

,

WIF1

και

RaRb

) και DFS ή OS (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη χρησιμοποίησε ποσοτικά Pyrosequencing να μετρηθεί το επίπεδο της μεθυλίωσης του DNA εντός 10 TSG στην κανονική του τραχήλου της μήτρας και του τραχήλου της μήτρας δείγματα καρκίνου. Από την εισαγωγή του, η τεχνική αυτή έχει σταθερά κερδίσει εύνοια ως προτιμώμενο μέσο για τη μέτρηση της μεθυλίωσης του DNA [14]. Αρκετές μελέτες έχουν αξιολογήσει τόσο την ακρίβεια και ορθότητα των Pyrosequencing για την ανάλυση της μεθυλίωσης του DNA σε ετερογενή μίγματα του DNA. Χρησιμοποιώντας ορίζεται αναλογίες των μεθυλιωμένων και μη μεθυλιωμένων DNA, Murphy

et al

. [22] μετράται ομοιόμορφα υψηλούς συντελεστές συσχέτισης Pearson (R

2 & gt? 0,99) όταν συσχετισμός μετράται

vs

. υπολογίζεται μεθυλίωση του DNA εντός ενός πάνελ γονιδίων. Από αυτές και άλλες παρόμοιες μελέτες [23,24], Pyrosequencing έχει αποδειχθεί με συνέπεια να μετρηθεί με ακρίβεια CpG μεθυλίωσης εντός ετερογενή μίγματα του DNA. Reed

et al

. [23] παρατήρησαν ότι κατά τη μέτρηση της μεθυλίωσης του DNA σε μίγματα που περιέχουν χαμηλή (& lt? 10%) CpG μεθυλίωση, Pyrosequencing συνήθως ελαφρώς υπερεκτιμηθεί η μεθυλίωση του DNA, το οποίο είναι σύμφωνο με τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από άλλες ομάδες [22,24]. Για παράδειγμα, οι μετρούμενες τιμές της μεθυλίωσης κυμαίνονται από 0 έως 4% CpG μεθυλίωσης όταν δείγματα DNA μη μεθυλιωμένο ελέγχου (ανθρώπινο σπέρμα γονιδιωματικό DNA) αναλύθηκαν για

APC

γονίδιο μεθυλίωσης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτή η μεταβλητότητα κατά την ανάλυση των χαμηλών επιπέδων μεθυλίωσης του DNA, το οποίο είναι παρόμοιο με συνδυασμένη Bisulfite Περιορισμός Ανάλυσης (COBRA), ώθησε Colella

κ.ά.

. [14] να προτείνει τουλάχιστον ένα όριο μεθυλίωση του 10% να εφαρμοστεί σε κηρύξει ένα γονίδιο ως μεθυλιωμένο. Λόγω αυτής της ανησυχίας, χρησιμοποιήσαμε ένα

a priori

επίπεδο & gt?. 15% για την ταξινόμηση των γονιδίων ως μεθυλιωμένο

Η χρήση των ποσοτικών μεθόδων για τον προσδιορισμό των επιπέδων μεθυλίωσης του DNA είναι κρίσιμης σημασίας για να ταξινομήσει με ακρίβεια μεθυλίωσης κατάσταση. Μη και ημι-ποσοτικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση της μεθυλίωσης του DNA τείνουν να υπερεκτιμούν τον επιπολασμό μεθυλίωση που οδηγεί σε ένα μεγάλο αριθμό των ψευδώς θετικών (

i

.

e

. Χαμηλή ειδικότητα). Αυτή η υπερεκτίμηση είναι εμφανές από το γεγονός ότι τα γονίδια που αναφέρθηκαν προηγουμένως ως μεθυλιωμένο σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας με χρήση μη ή ημι-ποσοτικές μέθοδοι είχαν πολύ χαμηλά επίπεδα μεθυλίωσης που μετράται σε προσδιορισμούς Pyrosequencing χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή (

i

.

e

& lt?. 10% μεθυλίωσης). Για παράδειγμα, η μέση συχνότητα μεθυλίωσης που αναφέρθηκαν για

Cdh1

(58%, εύρος: 0-91%) [2] είναι υψηλότερη από αυτή που παρατηρείται σε αυτήν την μελέτη, στην οποία δεν υπάρχουν όγκοι μεθυλιώθηκε υψηλότερη από 10%. Μεταξύ των μελετών που χρησιμοποιήθηκαν ημι-ποσοτικές μεθόδους [6,10,25], Wisman

et al

. ανέφερε επίσης δεν μεθυλίωση του

Cdh1

στην SCC [25]. Shivapurkar

et al

. ανέφερε ένα μεσαίο ποσοστό μεθυλίωσης ως 3,65 (Εύρος 0-53%)? Ωστόσο, όταν εφαρμόζεται η κοινή QMSP cut-σημείο κατά τον χαρακτηρισμό ενός γονιδίου, όπως μεθυλιώνονται (ΔΔΟ & gt? 0), το 89% των όγκων ταξινομήθηκαν ως έχει

Cdh1

μεθυλιωμένο [6]. Αυτό τονίζει το δυναμικό υπερεκτίμηση των

Cdh1

συχνότητα μεθυλίωσης στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Παρατηρήσαμε ότι μόνο το 7% των περιπτώσεων και κανένας από τους μάρτυρες είχαν

APC

ΜΙ & gt? 15%, το οποίο είναι παρόμοιο με δύο μελέτες που χρησιμοποιήθηκαν για τη μέτρηση QMSP

APC

μεθυλίωση [25,26] και διαφέρει από Yang

et al

. ο οποίος ανέφερε ότι το 63% του καρκίνου του τραχήλου μεθυλιώθηκαν [9]. Η συχνότητα της μεθυλίωσης του DNA που αναφέρθηκαν για

FHIT

χρησιμοποιώντας MSP ήταν 39% (εύρος 8% -80%) [7,27-29]? Ωστόσο, παρόμοια με τα ευρήματά μας, Wisman

et al

. ανέφερε την απουσία του

FHIT

μεθυλίωσης στο SCC χρησιμοποιώντας QMSP [25].

CDH13

μεθυλίωση από QMSP έχει αναφερθεί σε 40% και 82% των όγκων [2], η οποία διαφέρει από τα ευρήματά μας από το 6% των όγκων με ΜΙ άνω του 15%.

Pyrosequencing ανάλυση επιβεβαίωσε προηγούμενες μελέτες που δείχνουν ότι

DAPK1

,

SLIT2

,

WIF1

και

RaRb

γονίδια είναι κοινοί στόχοι για την παρεκκλίνουσα μεθυλίωση στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [8, 9,25,27-32]. Η

DAPK1

γονίδιο κωδικοποιεί μία εξαρτώμενη από καλμοδουλίνη κινάση σερίνης-θρεονίνης που είναι ένας θετικός μεσολαβητής γάμμα-ιντερφερόνης που επάγεται κυτταρικό θάνατο [33] και

DAPK1

σίγηση πιστεύεται ότι παράγει ένα απόπτωση ανθεκτική /φαινοτύπου προ-επιβίωσης [34]. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι

DAPK1

μεθυλίωση ήταν ένα από τα καλύτερα συνολικά προγνωστικούς παράγοντες του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας.