Αφηρημένο

Η παρεκκλίνουσα ενεργοποίηση και την κατάσταση μετάλλαξης των πρωτεϊνών στο φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης-3-κινάση (PI3K) /Akt /στόχου θηλαστικών ραπαμυκίνης (mTOR) και η ενεργοποιημένη από μιτογόνο πρωτεΐνη κινάση (ΜΑΡΚ) οδούς σηματοδότησης έχουν συνδεθεί με ογκογένεση σε διάφορους όγκους συμπεριλαμβανομένου του καρκινώματος urothelial (UC). Ωστόσο, η θεραπεία κατά του όγκου με μικρού μορίου αναστολείς mTOR κατά αποδείχθηκε ότι ήταν λιγότερο επιτυχείς από το αναμενόμενο. Έχουμε χαρακτηρίσει την μοριακός μηχανισμός αυτής της οδού σε καρκίνωμα ουροθηλίου παρεμβαίνοντας με διαφορετικά μοριακά συστατικά χρησιμοποιώντας μικρές χημικοί αναστολείς και τεχνολογίας siRNA και αναλύθηκαν επιπτώσεις στην κατάσταση μοριακής ενεργοποίησης, την ανάπτυξη των κυττάρων, πολλαπλασιασμό και την απόπτωση. Στην πλειοψηφία των κυτταρικών σειρών δοκιμάστηκαν παρατηρήθηκε συστατική ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ. Χειραγώγηση της mTOR ή Akt έκφραση ή δραστηριότητα ρυθμίζεται μόνο φωσφορυλίωση S6K1 αλλά όχι 4E-BP1. Αντ ‘αυτού, θα παρέχει αποδεικτικά στοιχεία για μια εναλλακτική mTOR ανεξάρτητη αλλά PI3K εξαρτώμενη ρύθμιση της 4Ε-BP1. Μόνο η ταυτόχρονη αναστολή και των δύο S6K1 και 4Ε-ΒΡ1 κατέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων αποτελεσματικά. Στιχομυθία μεταξύ PI3K και της οδού σηματοδότησης ΜΑΡΚ διαμεσολαβείται μέσω της PI3K και έμμεσες ανά δραστηριότητα S6K1. Αναστολή της ΜΕΚ1 /2 οδηγεί σε ενεργοποίηση της Akt αλλά όχι mTOR /S6K1 ή 4E-BP1. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η 4E-BP1 είναι ένας πιθανός νέος δείκτης μορίου στόχου και τη διαστρωμάτωση για αντι θεραπεία του καρκίνου στο UC και να υποστηρίξει την εξέταση μιας προσέγγισης πολλαπλών στόχευση κατά PI3K, mTORC1 /2 και ΜΑΡΚ

Παράθεση:. Nawroth R, Stellwagen F, Schulz WA, Stoehr R, Hartmann Α, Krause BJ, et al. (2011) S6K1 και 4Ε-BP1 είναι ανεξάρτητες Οργανωμένη και Ελέγχου Ανάπτυξης Cellular σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης. PLoS ONE 6 (11): e27509. doi: 10.1371 /journal.pone.0027509

Επιμέλεια: Irina Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 Αυγούστου, 2011? Αποδεκτές: 18 του Οκτωβρίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 15, Νοεμβρίου 2011

Copyright: © 2011 Nawroth et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα Siegfried Gruber. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι η πέμπτη πιο κοινή μορφή καρκίνου παγκοσμίως με περίπου 357.000 νέα κρούσματα και 145.000 θανάτους το 2010 [1]. Ουροθηλιακά καρκίνωμα (UC) που αντιπροσωπεύει το 90% όλων των όγκων της ουροδόχου κύστης είναι μια ετερογενής οντότητα που αποτελείται από θηλώδη όγκων και στερεών διηθητικά καρκινώματα τα οποία απαιτούν ριζική θεραπεία από τη στιγμή που έχουν προχωρήσει στον μυϊκό στρώμα της κύστης. Εάν δεν αντιμετωπιστεί, περίπου το 85% των ασθενών με εν τω βάθει όγκων της ουροδόχου κύστης θα πεθάνουν από την εξέλιξη της νόσου εντός δύο ετών από τη διάγνωση [2]. Ριζική κυστεκτομή με πυελική λεμφαδένων είναι το πρότυπο φροντίδας για διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Με την προσέγγιση αυτή 5ετή χωρίς εξέλιξη πιθανότητες επιβίωσης 65-68% μπορεί να επιτευχθεί σε όλα τα στάδια του όγκου [3], [4]. Παρά τις προόδους στην σισπλατίνη βασίζεται σε χημειοθεραπεία για ασθενείς με μεταστατική νόσο, η διάμεση συνολική χρόνος επιβίωσης 5 ετών είναι περιορισμένη σε 14-15 μήνες [5]. Έτσι, νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις είναι ιδιαίτερα επιθυμητή. Η καλύτερη γνώση σχετικά με ανώμαλη ενεργοποίηση των οδών σηματοδότησης κυττάρου που εμπλέκονται στην ογκογένεση της ουροδόχου κύστης μπορεί να παρέχει κατάλληλο μοριακοί στόχοι για νέες θεραπείες [6], [7], [8]. Μία τέτοια οδός είναι η οδός ΡΙ3Κ /Akt /mTOR σηματοδότησης που έχει συνδεθεί με την ογκογένεση σε πολλούς ιστούς [9], [10].

Κανονικά, κατά την ενεργοποίηση από κινάσες τυροσίνης υποδοχέα ή πρωτεΐνες RAS ΡΙ3Κ μετατρέπει phosphatidylinositol- 4,5-διφωσφορικής (PIP

2) σε phosphatidylinsositol-3,4,5-τριφωσφορική (PIP

3). Η αντίδραση αυτή μπορεί να αναστραφεί με την ΡΙ3Κ ανταγωνιστή ΡΤΕΝ (φωσφατάση και tensin ομόλογο διαγράφονται στο χρωμόσωμα 10). PIP

3 ΡϋΚ1 στρατολογεί (εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση 1) στην κυτταρική μεμβράνη όπου δεσμεύεται και φωσφορυλιώνει Akt στο T308 υπόλειμμα αμινοξέος. Akt θεωρείται ως η πιο κρίσιμη κόμβο σηματοδότηση σε αυτό το μονοπάτι που ρυθμίζουν διάφορα υποστρώματα επηρεάζουν τις κυτταρικές διεργασίες που εμπλέκονται στον έλεγχο της κυτταρικής ανάπτυξης και επιβίωσης [11]. σηματοδότηση Akt συγκλίνει μέσω των πρωτεϊνών οζώδη σκλήρυνση 1/2 (TSC1 /2) και του μικρού ΟΤΡάσης Rheb επί mTOR, μιας κινάσης σερίνης /θρεονίνης που σχηματίζει δύο διακεκριμένες σύμπλοκα πρωτεΐνης είτε με αρπακτικών (κανονιστική σχετιζόμενη πρωτεΐνη mTOR) αποδίδοντας mTORC1 ή rictor (ραπαμυκίνη αναίσθητη σύντροφος του mTOR) αποδίδοντας mTORC2 [10]. mTORC2 μπορεί να ενεργοποιηθεί με ΡΙ3Κ άμεσα και φωσφορυλιώνει Akt στο S473, τα οποία μαζί με φωσφορυλίωση στο T308 έχει ως αποτέλεσμα την πλήρη ενεργοποίηση του Akt [12], [13]. Akt φωσφορυλιώνεται στο S473 έχει συσχετιστεί με φτωχή πρόγνωση σε πολλούς καρκίνους συμπεριλαμβανομένων εκείνων του παγκρέατος, του ήπατος, του προστάτη και του μαστού [13]. Οι καλύτερες καθορισμένα υποστρώματα του mTORC1 είναι οι κινάσες p70S6K1 (S6K1) και πρωτεΐνη eIF4E δέσμευσης 1 (4Ε-BP1), δύο από τα οποία είναι σημαντικά στον έλεγχο της έναρξης μετάφρασης πρωτεΐνης [14], [15], [16]. Αποφωσφορυλιώθηκε 4Ε-ΒΡ1 μπορεί να συνδεθεί με το σύμπλοκο πρωτεΐνης elF4E να αποτρέψει cap-εξαρτώμενη μετάφραση και διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διαμεσολάβηση γεγονότα σηματοδότησης του μονοπατιού ΡΙ3Κ και ΜΑΡΚ σε όγκους [15]. Η φωσφορυλιωμένη S6K1 απαιτείται για τη μετάφραση του 5 ‘τερματικού ολιγοπυριμιδίνης (TOP) mRNAs. Η αποφωσφορυλίωση των S6K1 καταλήγει σε ένα βρόχο ανάδρασης που οδηγεί σε προς τα πάνω ρύθμιση του υποδοχέα τυροσίνης κινασών ή πρωτεΐνες υποστρώματος υποδοχέα ινσουλίνης (IRS), η οποία στη συνέχεια ενεργοποιούν το ΡΙ3Κ και επίσης την ΜΑΡΚ μονοπάτι σηματοδότησης [17], [18]. Στιχομυθία μεταξύ του PI3K και το δίκτυο σηματοδότησης ΜΑΡΚ συμβαίνει και με τον τρόπο του RAS και ERK1 /2, ενεργοποίηση της PI3K και επιπλέον mTORC1 μέσω TSC1 /2 [19], [20], [21], [22].

mTORC1 μπορεί να ανασταλεί επιλεκτικά από ραπαμυκίνη, ένα αντιβιοτικό μακρολιδίου, ότι σε ένα σύμπλοκο με την κυτταροπλασματική πρωτεΐνη ΡΚΒΡ12 αναστέλλει mTORC1 και σε υψηλότερες συγκεντρώσεις επίσης mTORC2 [23], [24]. Μυθιστόρημα αναστολείς mTOR στην κλινική χρήση, όπως το everolimus (RAD001) ή temsirolimus (CCI-779) είναι παράγωγα της ραπαμυκίνης. Χορηγείται ως φάρμακα κατά των όγκων, τα ποσοστά ανταπόκρισης σε ασθενείς διαφέρουν από 0-30% ανάλογα με το όγκου [25]. Είναι υποψία ότι ο σημαντικός περιορισμός στην κλινική εφαρμογή των αναστολέων mTOR αποτελέσματα από το mTORC1-S6K1-PI3K βρόχος ανάδρασης. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη αναστολέων που στοχεύουν τόσο, ΡΙ3Κ και mTOR, όπως NVP-BEZ235 μια ιμιδαζο [4,5-c] κινολίνη παράγωγο [24].

UC, γενετικές αλλοιώσεις στο μονοπάτι ΡΙ3Κ είναι συχνές και εμφανίζονται κυρίως σε PIK3CA, PTEN, Akt ή TSC1 /2 [26]. Οι PTEN διαγραφές και μεταλλάξεις καθώς και μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης που βρέθηκαν κυρίως σε υψηλότερα στάδια του όγκου και των βαθμών. Φωσφορυλιωμένη S6K1 είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης της νόσου ειδικά επιβίωσης [27], [28]. Σε προκλινικές μελέτες με κυτταρικές σειρές UC, ΡΙ3Κ αναστολή από LY294002 επέδειξε εξαρτάται από την κυτταρική γραμμή που χρησιμοποιείται για την ελάχιστη μείωση 40% στις πολλαπλασιαστικές επιδράσεις και μπλοκάρει κελί εισβολή [29], [30], [31]. Ανασύσταση του ΡΤΕΝ κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου και της γενετικής σίγηση του Akt οδήγησε σε αυξημένη ακτινοευαισθησία των κυττάρων του όγκου [27], [32]. Η πιθανή εφαρμογή των παραγώγων ραπαμυκίνης στη θεραπεία UC υποστηρίχθηκε από την ικανότητά τους να μειώνουν τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές που παράγονται κύστης και σε ένα μοντέλο ποντικού της προοδευτικής καρκίνου της ουροδόχου κύστης στις οποίες ρ53 και ΡΤΕΝ διαγράφονται στο ουροθήλιο της ουροδόχου κύστης [9], [33], [34], [35], [36]. Παρά τις πολλά υποσχόμενες προκλινικές παρατηρήσεις, τα προκαταρκτικά αποτελέσματα από μία και μόνο-βραχίονα, μελέτη φάσης ΙΙ με το everolimus ως μονοθεραπεία έδειξε μόνο μέτρια δράση κατά των όγκων σε ασθενείς με μεταστατικό UC [37]. Δεδομένα σχετικά με το λειτουργικό ρόλο και το μοριακό μηχανισμό της PI3K /Akt /mTOR και ΜΑΡΚ μονοπατιών σηματοδότησης στο UC είναι πολύ περιορισμένες μέχρι σήμερα και δεν μπορεί να εξηγήσει κλινικά αποτελέσματα. Έτσι, χαρακτηριζόμενη από το μοριακό μηχανισμό του μονοπατιού ΡΙ3Κ /ΑΚΤ /mTOR σηματοδότησης και εγκάρσια ρύθμιση της με την οδό ΜΑΡΚ in vitro σε κυτταρικές γραμμές που φέρουν χαρακτηριστικές μεταλλάξεις για UC. Λειτουργικές συνέπειες στη σηματοδότηση γεγονότων και κυτταρικών ανάπτυξη των κυττάρων μελετήθηκαν μετά φαρμακολογική ή γενετική παρεμβολή με διαφορετικά μοριακά συστατικά αυτής της οδού μέσω μικρών μορίων αναστολέων ή siRNA /shRNA ολιγονουκλεοτίδια. Τα ευρήματά μας παρέχουν νέες γνώσεις σχετικά με το μοριακό δίκτυο των μονοπατιών σηματοδότησης εξέτασε το αποτέλεσμα σε ένα σκεπτικό για τις νέες στρατηγικές θεραπείας και προτείνει υποψήφιο πρωτεΐνες για τη μοριακή διαστρωμάτωση των ασθενών που πάσχουν από μεταστατικό UC.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και τα αντιδραστήρια

Το κυτταρικές σειρές RT4, ΗΤ1376, 647V, 486P, J82, 253J, EJ28, Τ24 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA) και RT112 (γερμανική Συλλογή μικροοργανισμών και καλλιέργειες κυττάρων) διατηρήθηκαν στους 37 ° C εντός RPMI 1640 ή ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FCS σε υγρή ατμόσφαιρα που περιέχει 5% ή 7,5% CO

2. NVP-BEZ235 και RAD001 ευγενικά παρέχεται από τη Novartis Pharma. U0126 αγοράστηκε από την Cell Signaling Technology και LY294002 από την Promega. Αποθεματικά διαλύματα παρασκευάστηκαν σε DMSO. διαλύματα εργασίας παρασκευάστηκαν φρέσκα σε μέσο καλλιέργειας κυττάρων σε απεικονίζεται συγκεντρώσεις.

μορφώματα, επιμόλυνση και η μόλυνση

siRNA ολιγονουκλεοτίδια εναντίον 4E-BP1, S6K1 και ελέγχου έχουν σχεδιαστεί από και αγοράστηκε από την Qiagen GmbH και Akt 1, -2, -3 stealth siRNA ολιγονουκλεοτίδια από την Invitrogen. Παροδικές επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας γονίδιο διαμόλυνση X-treme ή αντιδραστήριο λιποφεκταμίνη (Roche Diagnostics, Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, χρησιμοποιώντας 2 μg /siRNA /6 φρεατίων. Για την τριπλή αδενοϊό επιμόλυνση mTOR shRNA και ελέγχου shRNA αγοράστηκε από SIRION Biotech. 1,5 × 10

5 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων μία ημέρα πριν από τη μόλυνση προστέθηκαν και αδενοϊό σωματίδια σε μία πολλαπλότητα μόλυνσης 30. Η καταστολή της έκφρασης πρωτεΐνης αναλύθηκε με ανοσοκηλιδώσεις 2-6 ημέρες μετά τη διαμόλυνση ή μόλυνση.

Ανοσοκηλίδωση και Αντισώματα

τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl ρΗ 7,2, 1% Triton Χ-100, 0.1% SDS, κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche Diagnostics ), αναστολέα φωσφατάσης Mix (Serva) για 20 λεπτά επί πάγου. το αδιάλυτο υλικό σφαιροποιήθηκε με φυγοκέντρηση για 30 λεπτά στους 4 ° C, 30000 g. η συγκέντρωση της πρωτεΐνης ποσοτικοποιείται με την πρωτεΐνη BCA ™ Assay (Pierce). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης ήταν . υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου 7,5 έως 12% και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF (Zefa) Δια την ανοσοκηλίδωση, τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν περιλάμβαναν: Akt (C67E7), Akt1, Akt2, Akt3, Phospho-Ακί (Ser473), Akt Phospho- (Thr308), ΟδΚ3β, φωσφο-ΟδΚ3β (Ser9), mTOR, φωσφο-mTOR (Ser2448), 4Ε-BP1, φωσφο-4E-BP1 (Thr37 /46), S6K1, φωσφο-S6K1 (Thr389), S6RP, φωσφο- S6RP, ρ44 /42 ΜΑΡΚ, φωσφο-ρ44 /42 ΜΑΡΚ, c-Raf, φωσφο-c-Raf (Ser338) (Cell Signaling Technologies). Δευτερογενής HRPO συζευγμένα αντισώματα αγοράστηκαν από Dianova. Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως ή να τροποποιηθούν σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή [38]. ECL-αντίδραση έγινε ορατή χρησιμοποιώντας Hyperfilm ECL ταινίες αυτοραδιογραφία (GE Healthcare). Για τον ποσοτικό προσδιορισμό, το σήμα χημειοφωταύγειας αναλύθηκε μέσω των XRS ChemiDoc ™ και Ποσότητα One® Software από την Bio-Rad Laboratories, Inc.

Η κυτταρική ανάπτυξη

Για την αξιολόγηση της κυτταρικής ανάπτυξης, τα κύτταρα σπάρθηκαν στα 1000 κύτταρα /96-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία όπως περιγράφεται. Μετά τη συγκομιδή, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με trypane μπλε και ζωντανά κύτταρα μετρήθηκαν σε θάλαμο Neubauer.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε 24 ώρες μετά την επεξεργασία των κυττάρων με RAD001, NVP-BEZ235 και U0126 ή 48-72 ώρες μετά την επιμόλυνση /μόλυνση με τα siRNA /Τα siRNAs. Βρωμοδεοξυουριδίνη (BrdU) ενσωμάτωση για την ανίχνευση του προσφάτως συντεθέντος DNA και 7-αμινο-ακτινομυκίνη D (7-AAD) χρώση για την ανίχνευση του δίκλωνου DNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα APC Kit BrdU Flow (BD Biosciences) με παλμούς τα κύτταρα επί δύο ώρες, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή που ακολουθείται από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.

προσδιορισμός απόπτωσης

η απόπτωση ανιχνεύθηκε με μέτρηση της δραστικότητας της κασπάσης 3/7 χρησιμοποιώντας την κασπάση-Glo 3/7 δοκιμασία από Promega GmbH, σύμφωνα με την πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Η βιωσιμότητα των κυττάρων

τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με RAD001, NVP-BEZ235 και U0126 σε πλάκες 96 φρεατίων. Σε 36 ώρες, τα κύτταρα επωάστηκαν για 3 ώρες με ΧΤΤ. Η ενζυματική αντίδραση αναλύθηκε στα 450 και 650 nm με συσκευή ανάγνωσης ELISA.

Στατιστική ανάλυση

Student t-test χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τα μέσα σε διαφορετικές ομάδες. Στατιστικοί υπολογισμοί έγιναν χρησιμοποιώντας το Microsoft Office Excel.

Αποτελέσματα

Έκφραση και την κατάσταση ενεργοποίησης του PI3K /Akt /mTOR μονοπάτι σε κυτταρικές σειρές καρκινώματος ουροφόρων

Αναλύσαμε την έκφραση και ενεργοποίηση κατάσταση των μοριακών βασικά συστατικά στην οδό ΡΙ3Κ σε ένα πάνελ 9 UC προέρχονται κυτταρικές γραμμές. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν για ανάλυση πρωτεΐνης σε ένα στάδιο υποσυρρέοντα. Έκφραση των Akt, mTOR, S6K1, S6RP, 4Ε-ΒΡ1 και ΡΤΕΝ ανιχνεύθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1Α). Η φωσφορυλίωση της Akt σε T308 και S473 και mTOR, 4Ε-ΒΡ1, S6K1 και S6RP παρατηρήθηκε σε 7 από 9 κυτταρικές σειρές. Αριθ ενεργοποίηση της Akt μπορούσε να ανιχνευθεί σε κύτταρα RT4 και 647V. Σε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές mTOR, S6K1 και φωσφορυλίωση S6RP μειώθηκε σημαντικά, ενώ 4E-BP1 ήταν ακόμα φωσφορυλιωμένη σε κύτταρα RT4. Έτσι, η πλειονότητα των εξεταζόμενων κυτταρικών σειρών παρουσίασαν συντακτικά ενεργοποιημένο μονοπάτι ΡΙ3Κ /Akt /mTOR σηματοδότησης. Η έκφραση του ΡΤΕΝ δεν εμποδίζει αυτήν την ενεργοποίηση υπό τις συνθήκες ανάπτυξης που εξετάστηκαν. Για περαιτέρω πειράματα αποφασίσαμε να συνεργαστούμε με τις δύο κυτταρικές σειρές UC RT112 (υπερεκφράζουν FGFR3) και Τ24 (ογκογόνο H-Ras, ομόζυγη μετάλλαξη ΡΤΕΝ), και οι δύο παρουσιάζουν συχνά βρίσκονται γονιδιωματικής αλλοιώσεις στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης [39], [40], [41 ]

Α:. για την ανάλυση πρωτεϊνών, τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA που εφαρμόζονται σε SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF. Η φωσφορυλίωση και η έκφραση των πρωτεϊνών κατάσταση αναλύθηκαν σε ανοσοστυπώματα. B, C: Οι κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 1 ώρα με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις RAD001 και ΝνΡ-BEZ235. Ο έλεγχος (0) περιείχε ίδιες συγκεντρώσεις DMSO και σε δείγματα με χημικές ενώσεις. Ένα αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα από 3 ανεξάρτητα πειράματα. D: Η ανασταλτική συγκέντρωση 50% (IC50) προσδιορίστηκε για τις πρωτεΐνες-στόχους του ΡΙ3Κ και mTORC1. σήματα Χημειοφωταύγεια ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα απεικόνισης ChemiDoc (BioRad Laboratories) και ομαλοποιήθηκε ως προς το επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης. Οι μέσες τιμές από τρία ή περισσότερα ανεξάρτητα πειράματα φαίνεται

Η

RAD001 /CCI-779 και NVP-BEZ235 μπλοκ ΡΙ3Κ και mTOR κατάντη στόχους με δοσοεξαρτώμενο τρόπο -. MTORC1 ανεξάρτητη ρύθμιση του 4Ε-ΒΡ1

για να χαρακτηριστεί η λειτουργική σημασία αυτής της οδού σε UC χρησιμοποιήσαμε τα παράγωγα ραπαμυκίνης RAD001 και CCI-779 και η PI3K-αναστολέας NVP-BEZ235. Από επιπτώσεις της CCI-779 και θεραπεία RAD001 ήταν πανομοιότυπα είμαστε απεικονίζουν μόνο τα αποτελέσματα RAD001. Πρώτον, οι προσδιορισμοί δόσης απόκρισης διεξήχθησαν για να αξιολογηθεί η δραστικότητα του RAD001 και NVP-BEZ235 1 ώρα μετά την κυτταρική θεραπεία. Η δραστικότητα των ενώσεων χαρακτηρίστηκε από το πρότυπο φωσφορυλίωσης της S6K1 /S6RP /4E-BP1 και για τις δύο ουσίες και, επιπλέον, για Akt όταν χρησιμοποιούν NVP-BEZ235. εντάσεις σήματος μετρήθηκαν με σύστημα απεικόνισης χημειοφωτισμού και ανασταλτικές συγκεντρώσεις 50% (IC50) για το επίπεδο φωσφορυλίωσης κανονικοποιημένη προς το επίπεδο πρωτεΐνης υπολογίστηκαν (Σχήμα 1Β, D). RAD001 ανέστειλε φωσφορυλίωση των S6K1 και S6RP αλλά όχι από 4Ε-ΒΡ1 (Εικόνα 1Β). Όταν έκθεση των κυττάρων σε NVP-BEZ235, η αναστολή της S6K1 /S6RP παρατηρήθηκε σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις IC50 από αυτές που απαιτούνται για την αναστολή της φωσφορυλίωσης Akt στο T308 /S473 (Σχήμα 1 C, D). φωσφορυλίωση 4E-BP1 ήταν πολύ μειωμένη σε συγκεντρώσεις που συσχετίζονται με εκείνες που είναι αναγκαίες για την αναστολή Akt. Έτσι, η αναστολή της mTORC1 από παραγώγων ραπαμυκίνης ρυθμίζονται μόνο S6K1 /S6RP φωσφορυλίωση ενώ η αναστολή των PI3K και mTORC1 /2 ανέστειλε τόσο, S6K1 και 4Ε-BP1 /S6RP φωσφορυλίωση. κύτταρα Τ24 απάντησε σε παρόμοια συγκέντρωση στη θεραπεία RAD001 ως RT112 αλλά 3 φορές ως ευαίσθητα στη θεραπεία NVP-BEZ235.

Η μακροχρόνια θεραπεία με RAD001 και NVP-BEZ235 αποτελέσματα S6K1 μεσολάβηση hyperactivation της PI3K /Akt

έχει περιγραφεί ότι τα αποτελέσματα της ενεργοποίησης S6K1 σε μια αρνητική αλληλεπίδραση που ρυθμίζουν όχι μόνο δράση ΡΙ3Κ η οποία είναι πιθανόν να ευθύνεται για την περιορισμένη επιτυχία των παραγώγων της ραπαμυκίνης στην κλινική χρήση [17]. Έτσι, εξέτασε το αποτέλεσμα των ενώσεων που χρησιμοποιούνται σε αυτό το βρόχο ανάδρασης. Χρησιμοποιήσαμε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις του RAD001 και NVP-BEZ235 που κατέληξε σε περίπου 50% έως 100% αναστολή της μοριακής τους στόχους και αναλύθηκαν αποτελέσματα επί της ΡΙ3Κ σηματοδότησης ενεργοποίηση μονοπατιού σε μια περίοδο 72 ωρών. θεραπεία RAD001 οδήγησε σε αποφωσφορυλίωση S6K1 και επαγόμενη υπερφωσφορυλίωση της Akt σε T308 και S473 εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο σε όλη τη διάρκεια της περιόδου παρατήρησης (1-72 h) σε κύτταρα RT112 ενώ σε κύτταρα Τ24 Akt υπερενεργοποίηση προκλήθηκε μόνο 24-72 ώρες μετά την κατεργασία (Σχήμα 1B /C, 2Α, τα δεδομένα για 72 ώρες δεν φαίνεται). Η κατάσταση ενεργοποίησης του Akt κατάντη στόχου GSK3-β συσχετίζεται με το επίπεδο φωσφορυλίωσης της Akt σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2Α). φωσφορυλίωση ή πρωτεΐνη επίπεδο 4E-BP1 δεν επηρεάστηκε από τη θεραπεία RAD001. Κατά τη χρήση NVP-BEZ235 η αρχική αποφωσφορυλίωση της Akt 1 ώρα μετά τη θεραπεία αντιστραφεί μετά από 24 ώρες και ακόμη και συγκεντρώσεις 100 φορές πάνω από το IC50 δεν ήταν επαρκείς για την πρόληψη της φωσφορυλίωσης επί T308 και μόνο εν μέρει σε S473 (Σχήμα 2Β). Αντιστοιχεί στην κατάσταση ενεργοποίησης της Akt, παρατηρήθηκε φωσφορυλίωση του υποστρώματος Akt GSK3-β. Αξίζει να σημειωθεί ότι, επαναλαμβανόμενη θεραπεία με φρεσκοπαρασκευασμένο NVP-BEZ235 1 ώρα πριν την συλλογή των κυττάρων δεν κατάφερε να αποφευχθεί αυτό υπερενεργοποίηση του Akt (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Φωσφορυλίωση της 4Ε-BP1 παρέμεινε καταστέλλεται καθ ‘όλη τη διάρκεια της περιόδου παρατήρησης (Σχήμα 2C)

Α, Β:. Επίδραση της RAD001 ή NVP-BEZ235 θεραπεία πάνω από 24 ώρες σε επίπεδο φωσφορυλίωσης της Akt, S6K1, 4Ε-BP1 και GSK3 -β στα κύτταρα RT112 και Τ24. Λύματα ολόκληρων κυττάρων εφαρμόστηκαν σε SDS-PAGE και στυπώθηκαν σε μεμβράνες PVDF που ακολουθείται από ανοσοστυπώματα για την ανίχνευση της έκφρασης και φωσφορυλίωσης επίπεδο απεικονίζονται πρωτεϊνών. Ο έλεγχος (0) περιείχε ίδια συγκέντρωση DMSO όπως σε δείγματα με χημικές ενώσεις. C: κύτταρα RT112 επιμολύνθηκαν με δύο ανεξάρτητες ειδικές siRNA ολιγονουκλεοτίδια S6K1 ένα τυχαία siRNA ολιγονουκλεοτίδιο ως έλεγχος (CTR siRNA). Τρεις ημέρες μετά την επιμόλυνση, η έκφραση και το επίπεδο της φωσφορυλίωσης S6K1, Akt και GSK3-β αναλύθηκαν σε ανοσοστυπώματα.

Η

Είτε S6K1 άμεσα επάγεται ΡΙ3Κ Akt δραστηριότητα /αντιμετωπίστηκε με αποσιώπηση της έκφρασης S6K1 χρησιμοποιώντας δύο ειδικούς siRNAs που κατευθύνονται κατά S6K1. Δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση, αναλύσεις κηλίδος western έδειξε μια μείωση 90-96% στο επίπεδο πρωτεΐνης S6K1 (Σχήμα 2C). Η προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης S6K1 συσχετίζεται με υπερφωσφορυλίωση της Akt σε S473 και T308 και GSK3-β, υποστηρίζοντας την περιγράφεται S6K1-ΡΙ3Κ /Ακί βρόχος ανάδρασης.

ρυθμίζει Αναστολή της ΡΙ3Κ /mTOR αλλά ούτε αποσιώπηση του mTOR ούτε Akt έκφραση 4Ε-BP1 φωσφορυλίωση

Αυτά τα αποτελέσματα μας ώθησε να χαρακτηρίζουν το κύκλωμα σηματοδότησης της PI3K, mTOR, Akt και 4E-BP1 με μεγαλύτερη λεπτομέρεια. Στις περισσότερες προτεινόμενες μοντέλα, S6K1 και 4Ε-BP1 είναι προς τα κάτω τους στόχους της Akt και mTORC1 και η φωσφορυλίωση στις περισσότερες εκθέσεις ταυτόχρονα ρυθμίζεται [14], [15]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι μόνο τα κύτταρα UC αντιμετωπίζονται με NVP-BEZ235 αλλά δεν RAD001 εμφάνισαν καταστολή και των δύο S6K1 και φωσφορυλίωση 4E-BP1 γεγονός που υποδηλώνει ότι 4E-BP1 ρυθμίζεται με διαφορετικό τρόπο από ό, τι S6K1. Δεδομένου ότι οι στόχοι NVP-BEZ235 μέλη της οικογένειας πρωτεϊνών PI3K, PI3K ή προς τα κάτω το στόχο της Akt ή mTOR μπορεί να εμπλέκεται στη ρύθμιση της φωσφορυλίωσης 4Ε-BP1. Εμείς δοκιμάστηκε για πρώτη φορά, αν θα μπορούσαμε να ελέγξει τις επιπτώσεις της NVP-BEZ235 χρησιμοποιώντας την καλά χαρακτηρίζεται LY293002 αναστολέα της κινάσης η οποία είχε σχεδιαστεί αρχικά ως ειδικός αναστολέας ΡΙ3Κ, αλλά εμφανίζει επίσης δραστικότητα έναντι άλλων PI3K μη σχετίζεται κινασών [42], [43]. φωσφορυλίωση S6K1 μειώθηκε με IC50 3 ηΜ ενώ η IC50 διπλασιαστεί έως 7 ηΜ ώστε να προκαλέσουν μείωση της Akt (S473 /T308) και 4Ε-BP1 φωσφορυλίωση, που μοιάζει με τον τρόπο αυτό την κινητική της NVP-BEZ235 δραστικότητα επί της φωσφορυλίωσης Akt /4E-BP1 (Σχήμα 3Α και 1Β)

Α:. δοκιμασία δόσης απόκρισης με κύτταρα επεξεργασμένα 24 ώρες με τον αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002. Τα κυτταρικά λύματα αναλύθηκαν σε ανοσοστυπώματα που δείχνει δοσοεξαρτώμενη επιδράσεις στην έκφραση και την φωσφορυλίωση της Akt επίπεδο, S6K1 και 4Ε-ΒΡ1 σε κύτταρα RT112. Β: Η σίγαση της έκφρασης mTOR 3 ημέρες μετά τη μόλυνση με αδενοϊικούς mTOR shRNA ή τον έλεγχο shRNA (CTR shRNA). Λύματα ολόκληρων κυττάρων αναλύθηκαν σε ανοσοστυπώματα για φωσφορυλίωση και έκφραση επίπεδο S6K1, S6RP, Akt και 4Ε-ΒΡ1. C: Akt έκφραση ρυθμίζει φωσφορυλίωση S6K1 αλλά όχι 4E-BP1. Επιμόλυνσης κυττάρων με συγκεκριμένες stealth siRNA ολιγονουκλεοτίδια ή ελέγχουν siRNA σιγήσει έκφραση και των τριών ισομορφών του Akt. 3 ημέρες μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα λύθηκαν εφαρμόζονται σε SDS-PAGE κηλιδώθηκαν σε PVDF μεμβράνη και το επίπεδο έκφρασης των ισομορφών Akt και της έκφρασης και το επίπεδο φωσφορυλίωσης 4Ε-ΒΡ1 και S6K1 αναλύθηκαν.

Η

Για να εξεταστεί περαιτέρω η παρατήρηση αυτή, χρησιμοποιήσαμε ένα αδενοϊικό προσέγγιση shRNA να φιμώσουν την έκφραση της πρωτεΐνης mTOR που θα πρέπει να οδηγήσει σε συγκεκριμένες απενεργοποίηση των δύο, mTORC1 και mTORC2 συμπλέγματα πρωτεϊνών. Δύο ημέρες μετά τη μόλυνση, κηλίδα western αναλύσεις επιβεβαίωσαν μια knockdown 85-96% σε επίπεδο πρωτεΐνης mTOR που παρέμεινε σταθερό για 5 ημέρες (Σχήμα 3Β). Το νοκ ντάουν οδήγησε σε αποφωσφορυλίωση S6K1 και S6RP χωρίς να επηρεάζει το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης. ανιχνεύθηκε μικρές μόνο επιπτώσεις στην 4E-BP1 φωσφορυλίωση σε σχέση με το επίπεδο της πρωτεΐνης 4E-BP1. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η φωσφορυλίωση της Akt μειώθηκε κατά 40-60% σχετικά με τα κατάλοιπα T308 και S473.

Τέλος, η επίδραση της Akt στην φωσφορυλίωση 4Ε-ΒΡ1 χαρακτηρίστηκε χρησιμοποιώντας siRNAs που κατευθύνονται έναντι των τριών διαφορετικών ισομορφών της Akt. Τρεις ημέρες μετά την επιμόλυνση, η συνδυασμένη γκρεμίζω και των τριών ισομορφών οδήγησε σε & gt? 90% μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης και των τριών ισομορφών Akt (Σχήμα 3C). Μόνο S6K1 φωσφορυλίωση, αλλά δεν επίπεδο φωσφορυλίωσης 4Ε-BP1 μειώθηκαν χωρίς να επηρεάζουν το επίπεδο της πρωτεΐνης που δείχνει ότι 4E-BP1 αντίθεση S6K1 δεν είναι μεταγενέστερος από Akt στις εξετάζονται κυτταρικές σειρές.

Παρεμβολή μεταξύ του μονοπατιού σηματοδότησης ΡΙ3Κ και ΜΑΡΚ εμφανίζεται σε πολλαπλά βήματα

Δεδομένης της σημασίας της PI3K και ΜΑΡΚ μονοπατιού βιολογία, εξετάσαμε την αλληλεπίδραση των δύο οδών στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με RAD001, NVP-BEZ235 ή με την ΜΕΚ1 /2 αναστολέα U0126 και ενεργοποίηση κατάσταση των βασικών πρωτεϊνών σε δύο οδούς 1-72 ώρες μετά τη θεραπεία αναλύθηκαν σε κηλιδώσεις Western. Αναστολή της mTORC1 με RAD001 επαγόμενη ενεργοποίηση /2 φωσφορυλίωση ERK1 24-72 ώρες μετά την αγωγή (Σχήμα 4Α, άνω πάνελ). Το ίδιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε όταν φίμωση έκφρασης πρωτεΐνης S6K1 που οδήγησε σε αυξημένη Raf1 /ERK1 /2 φωσφορυλίωση (Σχήμα 4Β). Ωστόσο, η αναστολή των δύο PI3K και mTOR από NVP-BEZ235 που προκαλείται από την ταχεία /2 φωσφορυλίωση ERK1 σε όλη την παρατηρούμενη περίοδο 1-72 h (Σχήμα 4Α, κάτω πάνελ). Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η καταστολή της δραστηριότητας ΡΙ3Κ /mTOR /Akt γενικά οδηγεί σε ενεργοποίηση της οδού Raf /MEK /ERK σηματοδότηση, αλλά η κινητική της διαδικασίας εξαρτάται από το μοριακό στόχο στην πρώην μονοπάτι παρεμποδίζεται

Α.: RT112 και Τ24 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με RAD001 ή NVP-BEZ235 για 1 ώρα ή 24 ώρες. Έκφραση και φωσφορυλίωση κατάσταση της ERK1 /2 αναλύθηκε σε ανοσοκηλιδώσεις επί προϊόντων λύσης ολικού κυττάρου. Β: Δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση με siRNA ολιγονουκλεοτίδια κατά S6K1 ή ελέγχου siRNA (CTR siRNA), τα κύτταρα λύθηκαν και το καθεστώς φωσφορυλίωσης και έκφραση Raf και ERK1 /2 αναλύθηκε σε ανοσοστυπώματα. C: Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24 ώρες με RAD001, NVP-BEZ235 και U0126 μόνα τους ή σε συνδυασμό και επιδράσεις στην έκφραση και την φωσφορυλίωση της Akt επίπεδο, S6K1 και ERK1 /2 αναλύθηκε σε ανοσοκηλιδώσεις

Η

. στη συνέχεια ανέλυσε τις βιοχημικές συνέπειες όταν αναστέλλοντας τόσο την PI3K /AKT /mTOR και η οδός ΜΑΡΚ, χρησιμοποιώντας RAD001, NVP-BEZ235 ή U0126 σε συνδυασμό ή U0126 μόνο. Όταν κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με U0126 μόνο, φωσφορυλίωση ERK1 /2 καταργήθηκε πλήρως ενώ Akt φωσφορυλίωση επί S473 και T308 ρυθμίζεται αυξητικά (Σχήμα 4C). Είναι ενδιαφέρον, δεν θα μπορούσαμε να αποδείξει τις αλλαγές στην φωσφορυλίωση S6K1. Όταν συνδυάζοντας U0126 είτε με RAD001 ή NVP-BEZ235, Akt υπερφωσφορυλίωση ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με τη θεραπεία είτε με ενιαία ουσία στα κύτταρα Τ24.

PI3K /AKT /mTOR και ΜΑΡΚ σηματοδότησης ρυθμίζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη βιωσιμότητα και την απόπτωση

στη συνέχεια καθορίζεται το πώς επηρεάζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε UC χειραγώγηση της PI3K και ΜΑΡΚ σηματοδότησης. Πρώτον, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με RAD001, NVP-BEZ235 και U0126 μόνα τους ή σε συνδυασμό και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων παρακολουθήθηκε με το χρόνο. Τρεις ημέρες μετά την επεξεργασία, RAD001 ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό κατά 62% σε RT112 και 40% σε κύτταρα T24 σε σχέση με τον έλεγχο διαλύτη (Σχήμα 5Α). Η θεραπεία με NVP-BEZ235 πλήρως ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα RT112 και μείωσε κατά 66% στα κύτταρα Τ24. θεραπεία U0126 ανέστειλε πολλαπλασιασμό κατά 70% και 76% σε RT112 ή Τ24 κύτταρα, αντίστοιχα. Συνδυάζοντας RAD001 ή NVP-BEZ235 με U0126 έδωσαν αθροιστικά αποτελέσματα, με τον συνδυασμό του NVP-BEZ235 /U0126 είναι πιο αποτελεσματική (Σχήμα 5Α). Για να χαρακτηριστεί αυτά τα αποτελέσματα με μεγαλύτερη λεπτομέρεια, ανάλυση κύκλου κυττάρου μετρήθηκε με συνδυασμό ενσωμάτωση BrdU και χρώση 7-AAD, την αποπτωτική απόκριση με μέτρηση της δραστικότητας κασπάσης και βιωσιμότητα /μεταβολισμό από ΧΤΤ-δοκιμασίες. Όσον αφορά την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, η θεραπεία RAD001 μειωθεί το κλάσμα των κυττάρων που υφίστανται S-φάση κατά 11% και στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 5Β). NVP-BEZ235 μειωμένη κυττάρων S φάσης κατά 84% σε RT112 και κατά 22% σε Τ24, ενώ U0126 μειωμένη κυττάρων σε S-φάση κατά 97% σε Τ24, αλλά μόνο κατά 52% σε κύτταρα RT112. Ο συνδυασμός των αναστολέων σηματοδότησης ΡΙ3Κ και ΜΑΡΚ είχαν προσθετικά αποτελέσματα επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων με το συνδυασμό του NVP-BEZ235 /U0126 είναι πιο αποτελεσματική στη μείωση των αριθμών των κυττάρων στη φάση S κατά 94-98%. Όλες οι ουσίες προκάλεσε μια αύξηση στα κύτταρα συνελήφθη στη G1 φάση που σχετίζεται με την ελάττωση των κυττάρων που εισέρχονται S-φάση, υποδεικνύοντας ότι η αναστολή της οδού είτε οδηγεί σε G1 σύλληψη σε κυτταρικές σειρές UC (Σχήμα 5Β). Η απόπτωση μετρήθηκε με δραστικότητα κασπάσης (Σχήμα 5C) [11]. Τόσο, RAD001 και θεραπεία NVP-BEZ235 μειωμένη ενεργοποίηση της κασπάσης στα κύτταρα RT112 κατά 32-45%. Σε κύτταρα Τ24, RAD001 και NVP-BEZ235 μειωμένη δραστηριότητα κασπάσης κατά 43-48%. U0126 δεν είχε σημαντική επίδραση στη δραστηριότητα της κασπάσης και δεν αυξάνουν τη δραστηριότητα των RAD001 ή NVP-BEZ235 όταν συνδυάζονται μεταξύ τους. Για τη μέτρηση της βιωσιμότητας των κυττάρων, ίδιοι αριθμοί κυττάρων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία ΧΤΤ. Εξαρτάται από την κυτταρική φόντο, παρατηρήσαμε μια μείωση της τάξης του 30-50%, με RAD001 και 70-85% με NVP-BEZ235 (Σχήμα 5D). Είναι ενδιαφέρον, δεν θα μπορούσαμε να ανιχνεύσει αθροιστικά αποτελέσματα από τη συνδυασμένη αναστολή των PI3K /Akt /mTOR και μονοπάτια ΜΑΡΚ. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι PI3K /mTOR και ΜΑΡΚ μονοπάτι δραστηριότητα στο UC πολλαπλασιασμό των κυττάρων του ελέγχου, την απόπτωση και την κυτταρική ζωτικότητα και ότι δύο οδοί μπορούν να αντικαταστήσουν εν μέρει για την απώλεια του άλλου σε σχέση με τον πολλαπλασιασμό.

RT112 και Τ24 κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με RAD001 (5 ηΜ), NVP-BEZ235 (100 ηΜ για Τ24, 500 ηΜ για RT112) και U0126 (25 ηΜ) μόνη ή ο συνδυασμός ενδείκνυται και ένας μάρτυρας DMSO (CTR). Α: Για μετρήσεις κυττάρων, τα κύτταρα βάφτηκαν με trypan blue και οι αριθμοί ζωντανών κυττάρων προσδιορίστηκαν. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου μετά από αγωγή 24 ώρες με χημικές ενώσεις με ενσωμάτωση BrdU σε συνδυασμό με χρώση 7-AAD: Β. C: Μέτρηση της δραστικότητας κασπάσης 3/7 ως παράμετρος για την απόπτωση και D: ΧΤΤ-test για την ανίχνευση της βιωσιμότητας των κυττάρων πραγματοποιήθηκε 24 ώρες μετά την αγωγή. Οι τιμές που παρουσιάζονται είναι ο μέσος όρος ± τυπική απόκλιση από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Student t-test εκτελέστηκε για στατιστική ανάλυση. (*: P & lt? 0,05)

Η

Η συνδυασμένη δράση των S6K1 και 4Ε-BP1 ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε ουροφόρων καρκίνωμα

Τέλος, , ασχοληθήκαμε με το ερώτημα γιατί ΚΠΑ-BEZ235 επηρεάζει την κυτταρική ανάπτυξη πιο αποτελεσματικότερη από RAD001. Έχουμε αποδείξει ότι NVP-BEZ235 σε αντίθεση με RAD001 επηρεάζει τόσο, S6K1 και φωσφορυλίωση 4E-BP1. Έτσι, χρησιμοποιείται είτε siRNA ολιγονουκλεοτίδια που κατευθύνονται εναντίον S6K1 ή 4E-BP1 ή σε συνδυασμό RAD001 με 4Ε-BP1 siRNAs να μιμηθεί την υποτιθέμενη πρόσθετη επίδραση του NVP-BEZ235. Δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση siRNAs κατά 4Ε-BP1 ή S6K1 μειωμένη έκφραση πρωτεΐνης με 80-96% (Σχήμα 6Α, 2C). Κύτταρα σιγήσει για S6K1 ή έκφραση 4Ε-ΒΡ1 παρουσίασαν σημαντικά μειωμένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων κατά 40% (RT112) έως 60% (Τ24) σε σύγκριση με τους μάρτυρες (Εικ. 6Β), αποδίδοντας συγκρίσιμα αποτελέσματα με εκείνα που παρατηρούνται μετά τη θεραπεία everolimus (Σχήμα 5Α). Ωστόσο, ο συνδυασμός του 4Ε-ΒΡ1 siRNA και θεραπεία everolimus μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων κατά 80-85%, τον ίδιο βαθμό, όπως παρατηρείται με ΝνΡ-BEZ235. Ανάλυση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού έδειξαν ότι η επίδραση ήταν και πάλι διαμεσολαβείται από διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην φάση G1 /Ο0 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συνοπτικά, τόσο ο μεταγενέστερος στόχος mTORC1 S6K1 και 4Ε-BP1 είναι σε μια παρόμοια εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού UC με τον έλεγχο της προόδου του κυτταρικού κύκλου από G1 /0 έως φάση και κυτταρική βιωσιμότητα S βαθμό

Α:. Δύο ημέρες μετά από επιμόλυνση με τα siRNA κατά 4Ε ΒΡ-1, η έκφραση της πρωτεΐνης σε κύτταρα RT112 και Τ24 ανιχνεύθηκε σε ανοσοστυπώματα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Β: Η ανάπτυξη των ζωντανών κυττάρων, σιγήσει για S6K1 ή έκφραση 4Ε-BP1 ή κύτταρα σιγήσει για έκφραση 4Ε-ΒΡ1 και επωάστηκαν με everolimus (RAD001) παρακολουθήθηκαν με τον χρόνο. Οι μέσες τιμές ± τυπικές αποκλίσεις εμφανίζονται? στατιστικές συγκρίσεις έγιναν με τη χρήση του t-test σπουδαστών. (*: p & lt? 0,05)

Η

Συζήτηση

Παρά την καλύτερη κατανόηση της βιολογίας του καρκίνου της ουροδόχου κύστης κατά τα τελευταία χρόνια, μόνο μικρές οι βελτιώσεις στην θεραπευτική αντιμετώπιση της νόσου αυτής έχουν επιτευχθεί κατά τη διάρκεια των δύο τελευταίων δεκαετιών. Οι /Akt /mTOR και ΜΑΡΚ μονοπάτια σηματοδότησης ΡΙ3Κ είναι επιρρεπείς σε μεταλλάξεις και ανώμαλη ενεργοποίηση σε αυτήν την οντότητα του όγκου και μπορεί να παρέχει κατάλληλους στόχους για πιο αποτελεσματικές θεραπείες [44]. Κατά συνέπεια, χαρακτηρίζεται και τα δύο μονοπάτια σηματοδότησης σε σχέση με την κατάσταση ενεργοποίησης, μοριακός μηχανισμός και ενδιαφέρον για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε UC. Θα μπορούσαμε να επιβεβαιώσει περιγράφηκε προηγουμένως ρυθμιστικές κυκλωματικούς που ελέγχουν την ενεργοποίηση αυτών των οδών. Τα δεδομένα μας υποδεικνύουν έντονα ένα νέο μηχανισμό που ελέγχει την ενεργοποίηση του κατάντη στοιχείου 4E-BP1 μέσα σε αυτό το δίκτυο σηματοδότησης.