Αφηρημένο

καρκίνο των ωοθηκών Αναμφίβολα είναι ένα εξοργιστικό, ανίατη ασθένεια για τους ασθενείς με υποτροπιάζοντα καρκίνο και θεραπευτικές επιλογές είναι περιορισμένες. Αν και το γονίδιο ομάδα Polycomb,

Bmi-1

που ρυθμίζει την αυτο-ανανέωση των φυσιολογικών αρχέγονων και προγονικών κυττάρων έχει ενοχοποιηθεί στην παθογένεση πολλών ανθρώπινων κακοηθειών, ακόμη ένας ρόλος για Bmi-1 στον επηρεασμό απόκριση χημειοθεραπεία έχει δεν έχουν αντιμετωπιστεί πριν. Εδώ αποδεικνύουμε ότι αποσιώπηση Bmi-1 μειώνει τα επίπεδα ενδοκυτταρικού GSH και με τον τρόπο αυτό ευαισθητοποιεί χημειοθεραπεία ωοθηκών καρκινικά κύτταρα να χημειοθεραπευτικά όπως η σισπλατίνη. Με επιδεινώνοντας παραγωγή ROS σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη, Bmi-1 σίγηση ενεργοποιεί το μονοπάτι απόκρισης βλάβη του DNA, κασπάσες και διασπά PARP με αποτέλεσμα την απόπτωση επαγωγή σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Σε μια

in vivo

ορθοτοπικό μοντέλο ποντικού της στη χημειοθεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών, νοκ ντάουν της Bmi-1 με την παράδοση nanoliposomal αναστέλλει σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου. Ενώ σισπλατίνη μονοθεραπεία ήταν ανενεργό, ο συνδυασμός των Bmi-1 αποσιώπηση μαζί με σισπλατίνη καταργηθεί σχεδόν εξ ολοκλήρου την ανάπτυξη του όγκου των ωοθηκών. Συλλογικά αυτά τα ευρήματα δημιουργία Bmi-1 ως ένα σημαντικό νέο στόχο για θεραπεία σε χημειοθεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών

Παράθεση:. Wang E, Bhattacharyya S, Szabolcs Α, Rodriguez-Aguayo C, Jennings NB, Lopez-Berestein G, et al. (2011) Ενίσχυση Χημειοθεραπεία Response με Bmi-1 κατασιγάσει στον καρκίνο των ωοθηκών. PLoS ONE 6 (3): e17918. doi: 10.1371 /journal.pone.0017918

Επιμέλεια: Sujit Basu, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 Γενάρη του 2011? Αποδεκτές: 15 του Φεβρουαρίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 21 Μαρτίου 2011

Copyright: © 2011 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το παρόν έργο υποστηρίχθηκε από Marsha Rivkin Pilot Award (RB), CA136494, CA135011 (PM) και Ρ50 CA083639, U54 CA151668 (AS). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών έχει το υψηλότερο ποσοστό θνησιμότητας μεταξύ όλων των γυναικολογικών κακοηθειών [1]. Παρά την αρχική ανταπόκριση σε χειρουργική debulking και front-line πλατίνα /ταξάνη χημειοθεραπεία, οι περισσότεροι όγκοι αναπτύσσουν τελικά μια ανθεκτική στα φάρμακα υποτροπής [2], [3]. Τα στοιχεία δείχνουν ότι η σισπλατίνη αντίσταση μπορεί να είναι το αποτέλεσμα ενός ελαττωματικού αποπτωτικών πρόγραμμα. Στην περίπτωση αυτή, τα αυξημένα επίπεδα της βλάβης του DNA θα πρέπει να επάγει την απόπτωση σήμα για την έναρξη [4], [5].

Bmi-1

, ένα γονίδιο ομάδα Polycomb, ρυθμίζει την πολλαπλασιαστική δραστηριότητα των φυσιολογικών αρχέγονων και προγονικών κυττάρων [6]. Είναι επίσης απαραίτητη για την αυτο-ανανέωση των νευρικών [7], [8] και αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων [9]. Bmi-1 συχνά ρυθμίζεται αυξητικά σε μία ποικιλία καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου των ωοθηκών και συσχέτιση με κλινικού βαθμού /στάδιο, μετάσταση λεμφαδένα και κακή πρόγνωση έχει [10], [11], [12], [13], [14 ανέφεραν ], [15], [16], [17], [18], [19].

Bmi-1

προκαλεί νεοπλαστικό μετασχηματισμό των λεμφοκυττάρων και συνεργάζεται με H-Ras προκαλώντας μεταστατικό καρκίνο του μαστού σε ποντικούς [20], [21], [22], όλα υποδηλώνοντας έντονα την ογκογόνο ρόλο σε επιθηλιακά κακοήθειες. Επιπλέον, απομονωμένες ωοθηκών καρκινικά βλαστικά κύτταρα εμφανίζουν πολύ υψηλότερες-Bmi 1 επίπεδα σε σύγκριση με τα διαφοροποιημένα ή γονικά κύτταρα χύδην όγκου και έχουν αυξημένη αντοχή στη σισπλατίνη και πακλιταξέλη σε σύγκριση με τα κύτταρα του όγκου [23]. Επίσης, η αυξημένη έκφραση του Bmi-1 ήταν ένας από τους βασικούς ρυθμιστικούς παράγοντες προσδιορισμού ενός κυτταρικού φαινοτύπου συλλαμβάνεται από την έκφραση ενός θανάτου από καρκίνο του υπογραφή σε ένα ευρύ φάσμα των κλινικά θανατηφόρου κακοηθειών θεραπεία ανθεκτικών [24]. Παρά αυτόν τον πλούτο των πληροφοριών που ένας πιθανός ρόλος για Bmi-1 στον επηρεασμό απάντηση χημειοθεραπεία δεν έχει αντιμετωπιστεί πριν. Στο πλαίσιο αυτό, ο προσδιορισμός της μηχανισμός με τον οποίο Bmi-1 σίγηση ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα να σισπλατίνη θα είναι σημαντική για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών για την καταπολέμηση του καρκίνου των ωοθηκών.

Οι πιο δραστικοί παράγοντες χημειοθεραπείας στον καρκίνο των ωοθηκών είναι ο λευκόχρυσος ανάλογα, σισπλατίνη και καρβοπλατίνη. Η αντικαρκινική δράση της σισπλατίνης (cis-διαμινοδιχλωρολευκόχρυσος (II) ανακαλύφθηκε από Rosenberg και οι συνεργάτες του το 1961 [25]. Η σισπλατίνη ήταν ο πιο δραστικό φάρμακο για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών για τις τελευταίες 4 δεκαετίες και η πρόγνωση για τις γυναίκες με καρκίνο των ωοθηκών μπορεί να ορίζεται από την ανταπόκριση του όγκου στη σισπλατίνη [26]. Αν και η πλειονότητα των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών ανταποκριθεί στην πρώτη γραμμή συνδυασμός πλατίνα χημειοθεραπεία η πλειοψηφία θα αναπτύξει τη νόσο που καθίσταται ανθεκτική σε σισπλατίνη και τελικά θα υποκύψει στην ασθένεια [26]. Έτσι μεθόδους πρόληψης ή ξεπερνώντας την αντίσταση στην σισπλατίνη θα μπορούσε να έχει σημαντικές επιπτώσεις στην καταπολέμηση της ασθένειας αυτής.

Εδώ έχουμε αποδείξει ότι

Bmi-1

παίζει σημαντικό ρόλο στην ευαισθητοποίηση του στη χημειοθεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών κυττάρων σε σισπλατίνη. Δείχνουμε επίσης ότι αυτή η ευαισθητοποίηση είναι μέσω μιας νέας οδού που ρυθμίζεται από Bmi-1, δηλαδή αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) επαγωγή προκαλώντας εμπλοκή της απόκρισης βλάβη του DNA (DDR) μονοπάτι που οδηγεί σε απόπτωση. Μπορούμε επίσης να καθιερώσουν Bmi-1 ως έγκυρο θεραπευτικό στόχο

in vivo

χρησιμοποιώντας εύκολα μεταφράσιμο προσέγγιση της παράδοσης nanoliposomal του siRNA σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο ποντικού για καρκίνο των ωοθηκών.

Αποτελέσματα

εξόντωση Bmi-1 ενισχύει την ευαισθησία cisplatin in vitro

Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι η μείωση των επιπέδων Bmi-1 πρωτεΐνης σε κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών χρησιμοποιώντας microRNA 15α /16 μειώνει κλωνική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό [27]. Εδώ, θα ήθελε να δοκιμάσει αν νοκ ντάουν της Bmi-1 επηρεάζονται σισπλατίνη απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Αποτελεσματική knockdown του Bmi-1 σε ένα-2780 και CP-70 κύτταρα επιβεβαιώθηκε με σύγκριση με τα κωδικοποιημένα ελέγχου επιμολυσμένα κύτταρα μετά από 48 ώρες (Εικ. 1). Τα siRNA επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σισπλατίνη για 48 ώρες και την απόπτωση προσδιορίζεται με τη μέθοδο Annexin /FITC. Απόπτωση στην νόσο ευαίσθητη Α-2780 siRNA ελέγχου επιμολυσμένα κύτταρα ήταν -35 και 55% όταν υφίσταται κατεργασία με 5 ή 10 μΜ cisplatin μόνο του, αντίστοιχα. Σε αντίθεση, η απόπτωση στη χημειοθεραπεία CP-70 ήταν ~ 17 και το 40% όταν υφίσταται κατεργασία με 10 ή 20 μΜ cisplatin μόνο του, υποδηλώνοντας αντίσταση αυτών των κυττάρων προς επάγεται σισπλατίνη απόπτωση (Εικ. 1). Είναι σημαντικό ότι κατεργασία των Bmi-1 σιγήσει κυττάρων με σισπλατίνη ενισχυμένη με συνέπεια την απόπτωση σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές με ~15-20% (Εικ. 1). Για αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, το βασικό επίπεδο απόπτωσης προσδιορίζεται χωρίς καμία θεραπεία ήταν ~ 10%. πειράματα απόπτωσης με τρεις επιπλέον κυτταρικές σειρές όπως OVCAR-5, OV-202 και OV-167 απέδωσε παρόμοια αποτελέσματα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα δεδομένα επιβεβαίωσαν ότι το knockdown του Bmi-1 θα μπορούσε να ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών στη σισπλατίνη που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο.

Το επάνω πάνελ επιδεικνύει αποτελεσματική knockdown του Bmi-1 με siRNA στις κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών (SC = ομελέτα siRNA ελέγχου ) όπως προσδιορίζεται με κηλίδα Western. Ο κάτω πίνακας δείχνει τοις εκατό απόπτωσης όπως καθορίζεται από Αννεξίνη χρώση /FITC-PI. Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα επιμολυσμένα με περιπλεγμένο έλεγχο ή ΔΜΣ-1 siRNA υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς σισπλατίνης για 48 ώρες. NAC προεπεξεργασίας έγινε για 1 ώρα πριν από την προσθήκη της σισπλατίνης, όπου ενδείκνυται.

Η

Πρόσφατα, έχει αναφερθεί ότι οι νευρώνες, θυμοκύτταρα και τα κύτταρα του μυελού των οστών απομονώθηκαν από Bmi 1-null ποντίκια έχουν αυξημένα επίπεδα ROS από τα αντίστοιχα άγριου-τύπου τους [28], [29]. Επιπλέον, μελέτες έχουν αναφέρει την εμπλοκή της παραγωγής ROS σε σισπλατίνη απόπτωση που διαμεσολαβείται [30], [31]. Ως εκ τούτου, για να καθορίσουν τον τρόπο αποσιώπηση των Bmi-1 ευαισθητοποιεί ανθεκτικών στα φάρμακα του καρκίνου των ωοθηκών κυττάρων στη σισπλατίνη απόπτωση που επάγεται, διερευνήθηκε η πιθανή συμμετοχή των ROS. Ως εκ τούτου, ο ΔΜΣ-1 ή ομελέτα ελέγχου siRNA επιμολυσμένα κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών προ-επεξεργασία με Ν-ακετυλο κυστεϊνη (NAC) στο 1 mg /ml για 1 h ακολουθούμενη από επεξεργασία σισπλατίνη για 48 ώρες. Σημαντική αναστολή της σισπλατίνης απόπτωσης που διαμεσολαβείται τόσο τον έλεγχο και Bmi-1 κύτταρα knockdown παρατηρήθηκε παρουσία ROS καθαριστή NAC (Εικ. 1). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο επαυξημένος απόπτωση παρατηρείται στην σισπλατίνη αγωγή Bmi-1 σιγήσει κυττάρων ήταν λόγω της συμμετοχής των ROS και μας οδήγησε να καθορίσει την παραγωγή ROS ως επόμενο λογικό βήμα.

εξόντωση Bmi-1 αυξάνει σισπλατίνη μεσολάβηση ROS παραγωγή

επόμενο καθορίζεται παραγωγή ROS σε ομελέτα ελέγχου ή ΔΜΣ-1 siRNA επιμολυσμένα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ή χωρίς σισπλατίνη με τη μέτρηση φθορισμού χρησιμοποιώντας DCFDA. θεραπεία Cisplatin μόνο του αύξησε σημαντικά την παραγωγή ROS σε 10 μΜ σε Α-2780 κύτταρα και στα 10 και 20 μΜ σε CP-70 κύτταρα. Σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, knockdown του Bmi-1 ακολουθούμενο από οποιαδήποτε θεραπεία σισπλατίνης αύξησε σημαντικά την παραγωγή ROS (Σχ. 2). Τα στοιχεία αυτά επιβεβαιώνουν προηγούμενες παρατηρήσεις μας επί της απόπτωσης και προϋποθέτει ROS ως ο κύριος λόγος για την αυξημένη ευαισθητοποίηση των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα με σισπλατίνη. Για να προσδιοριστεί μια αιτία για την επιδεινώνονται ROS απόπτωση που παρατηρείται από την επόμενη προσδιορίζεται συνολικά επίπεδα κυτταρικής γλουταθειόνης (GSH).

Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα επιμολυσμένα με περιπλεγμένο έλεγχο ή ΔΜΣ-1 siRNA υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς σισπλατίνη για 24 h. Ακολούθως τα κύτταρα επωάστηκαν με 5 μΜ καρβοξυ-H2DCFDA σε φρέσκο ​​HBSS για 30 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψίνη και φθορισμού των επισημασμένων κυττάρων μετρήθηκε σε μήκος κύματος διέγερσης 485 nm και μήκος κύματος εκπομπής 530 nm με τη χρήση Fluorolog 3 (Jobin-Yvon Horiba). Αναλογία μέση ένταση φθορισμού (MFI) σε σχέση με το μη επεξεργασμένο ανακατωμένο έλεγχο εκπροσωπείται.

Η

Bmi-1 ρυθμίζει GSH παραγωγής

Η μειωμένη GSH είναι ένα κρίσιμο συστατικό του αντιοξειδωτικού δίκτυο του κυττάρου , που εμπλέκονται άμεσα στην σάρωσης ROS και στη διατήρηση θειόλη πρωτεΐνες σε κατάσταση μειωμένης τους [32], [33], [34]. Έτσι, για να καθορίσουν μια αιτία για την αύξηση της ROS απόπτωση παρατηρείται σε Bmi-1 σιγήσει κύτταρα, είμαστε δίπλα προσδιορίζεται συνολικά ενδοκυτταρικά επίπεδα GSH. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν από κωδικοποιημένα ελέγχου ή ΔΜΣ-1 siRNA επιμολυσμένα κύτταρα κατεργασμένα με ή χωρίς σισπλατίνη. Εξόντωση Bmi-1 μειώθηκαν σημαντικά και μόνο κυτταρικά επίπεδα GSH (-30% σε Α-2780 και -40% σε CP-70) και αυτό περαιτέρω μειώθηκε όταν συνδυάζεται με θεραπεία σισπλατίνη (-45% σε Α-2780 και ~56% σε CP-70) (Εικ. 3). θεραπεία Cisplatin μόνο του όμως δεν είχε καμία επίδραση στα επίπεδα GSH. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τουλάχιστον μερικά από τα οξειδωτικού στρες προκαλούμενα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στους Bmi-1 knockdown ωοθηκών καρκινικά κύτταρα οφείλεται σε μειωμένη ενδοκυτταρικά επίπεδα GSH.

Το πινάκιο κορυφής αντιπροσωπεύει συνολικό κυτταρικό GSH μετρήθηκε (Υλικά και μέθοδοι) σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών επιμολυσμένα με περιπλεγμένο έλεγχο ή ΔΜΣ-1 siRNA σε επεξεργασία με ή χωρίς σισπλατίνη για 24 ώρες. Ο κάτω πίνακας παριστά φορές αλλαγή στην έκφραση γονιδίου (ομαλοποιήθηκε με βήτα ακτίνης και σε σύγκριση με το κωδικοποιημένο έλεγχος) όπως προσδιορίζεται με ποσοτική RT-PCR καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών επιμολυσμένα με περιπλεγμένο έλεγχο ή ΔΜΣ-1 siRNA για 48 ώρες.

Η

Για να διερευνηθεί περαιτέρω η αιτία της μειωμένης περιεκτικότητας σε GSH σε Bmi-1 σιγήσει κύτταρα εμείς επόμενη προσδιοριστεί αν μεταβλήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης των βασικών ενζύμων που εμπλέκονται στην οδό βιοσύνθεσης GSH. Πραγματοποιήσαμε ποσοτική RT-PCR για να προσδιοριστεί το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου του γλουταμικού-κυστεΐνη λιγάση (GCLM) και συνθάσης γλουταθειόνη (GSS), στα επιμολυσμένα κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών Bmi-1 siRNA. Γλουταμινικό-κυστεΐνη λιγάση (GCLM) είναι το πρώτο περιοριστικό του ρυθμού ένζυμο της οδού βιοσύνθεσης της γλουταθειόνης [35]. Στο δεύτερο στάδιο, η συνθετάση της γλουταθειόνης (GSS), μετατρέπει γάμμα-L-γλουταμυλ-L-κυστεΐνη σε γλουταθειόνη [35]. Ενώ η έκφραση του mRNA του Bmi-1 μειώθηκε όπως αναμένεται σε Bmi-1 σιγήσει κυττάρων, έχει ενδιαφέρον η έκφραση του mRNA του GCLM μειώθηκαν σημαντικά ενώ εκείνη του GSS αυξήθηκαν (Εικ. 3). Η τάση ήταν παρόμοια σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η διαταραχή του GCLM, το ένζυμο περιορισμού του ρυθμού είναι αρκετή για να μειώσει το συνολικό κυτταρικό επίπεδα GSH και την επακόλουθη αύξηση φορές στα επίπεδα GSS mRNA πιθανότατα αντιπροσωπεύουν ένα μηχανισμό άμυνας για τα κύτταρα που προσπαθεί να ανακουφίσει το οξειδωτικό στρες.

Bmi -1 διαμορφώνει το DDR οδός

για να διερευνηθεί περαιτέρω ο μηχανισμός της ROS ενισχυμένη τη μεσολαβήσει απόπτωσης από σισπλατίνη σε Bmi-1 σιγήσει ωοθηκών καρκινικά κύτταρα θα ήθελαν να δοκιμάσουν τη συμμετοχή της βλάβης του DNA και επιδιόρθωση (DDR) μονοπάτι. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι το οξειδωτικό στρες μπορεί να προκαλέσει ενεργοποίηση του μονοπατιού DDR [36]. Προκειμένου να δοκιμαστεί αυτή η προσδιορίσαμε τα επίπεδα φωσφορυλίωσης Chk2 και Η2ΑΧ δύο σημαντικές βιοδείκτες για βλάβες του DNA και η ενεργοποίηση του μονοπατιού DDR [37]. θεραπεία Cisplatin μόνο του επαγόμενη φωσφορυλίωση του Η2ΑΧ Chk2 και εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο και knockdown του Bmi-1 επιδεινώνεται περαιτέρω αυτό το αποτέλεσμα (Σχ. 4Α). Στην επιβεβαίωση, αυξημένο σχηματισμό πυρηνική εστιών παρατηρήθηκε κατά 53 ΒΡ1 ανοσοφθορισμού σε κύτταρα CP-70 Bmi-1 νοκ ντάουν που έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη (Εικ. 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι παρατεταμένη επίπεδα των ROS που δημιουργούνται κατά Bmi-1 knockdown σε συνδυασμό με σισπλατίνη θεραπείας είναι αρκετή για να βλάψει άμεσα το DNA και εμπλέκουν το μονοπάτι DDR. Ένα μεγάλο σώμα της βιβλιογραφίας υποστηρίζει ότι η βλάβη του DNA μπορεί να οδηγήσει σε απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης των κασπασών [38], [39]. Ως εκ τούτου, είμαστε δίπλα προχώρησε τον προσδιορισμό της ενεργοποίησης των κασπασών σε Bmi-1 σιγήσει καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών που έλαβαν θεραπεία με ή χωρίς σισπλατίνη.

(Α) ωοθηκών καρκινικά κύτταρα επιμολυσμένα με ομελέτα ελέγχου ή ΔΜΣ-1 siRNA υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ή χωρίς σισπλατίνη για 48 ώρες. κηλίδα Western διεξήχθη για φωσφο Chk-2, η συνολική Chk-2, φωσφο-Η2ΑΧ, σύνολο Η2ΑΧ και ακτίνης βήτα χρησιμοποιώντας αντίστοιχα αντισώματα. (Β) Κωδικοποιημένα ελέγχου ή ΔΜΣ-1 siRNA επιμολυσμένα CP-70 κύτταρα υποβλήθηκαν σε συνεστιακή μικροσκοπία χρησιμοποιώντας αντίσωμα 53BP1 (κόκκινο) και DAPI (μπλε πυρηνική χρώση) να αποδείξουν το σχηματισμό των πυρηνικών εστιών.

Η

Bmi- 1 ρυθμίζει τελεστές απόπτωσης

Ιδρύθηκε μεσολαβητές απόπτωσης περιλαμβάνουν κασπασών [40]. Είμαστε δίπλα καθορίζεται διάσπαση της κασπάσης 8 και κασπάσης 9 στον έλεγχο ομελέτα ή ΔΜΣ-1 siRNA επιμολυσμένα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ή χωρίς σισπλατίνη. θεραπεία Cisplatin μόνη προκάλεσε διάσπαση της κασπάσης 8, αλλά όχι κασπάσης 9. Είναι εύλογο ότι με υψηλότερες συγκεντρώσεις της διάσπασης σισπλατίνης κασπάσης 9 θα μπορούσε να παρατηρηθεί. Είναι σημαντικό ωστόσο, ο συνδυασμός του Bmi-1 knockdown και σισπλατίνη θεραπεία σημαντικά και η δόση εξαρτώμενο αυξημένη διάσπαση της κασπάσης 8 και κασπάσης 9 και στις δύο κυτταρικές σειρές (Εικ. 5).

Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα επιμολυσμένα με περιπλεγμένο έλεγχο ή ΔΜΣ -1 siRNA υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς σισπλατίνης για 48 ώρες. κηλίδα Western διεξήχθη για κασπάση-8, κασπάσης-9 και PARP χρησιμοποιώντας αντίστοιχα αντισώματα.

Η

PARP είναι ένας από τους κύριους στόχους διάσπαση του ενεργοποιημένου κασπασών και διασπασμένη PARP διευκολύνει την κυτταρική αποσυναρμολόγηση και χρησιμεύει ως δείκτης της κύτταρα που υφίστανται απόπτωση [40]. Σε Bmi-1 κύτταρα knockdown, σαφής διάσπαση της PARP παρατηρήθηκε με δοσοεξαρτώμενο τρόπο σισπλατίνης (Εικ. 5). Όλα αυτά

in vitro

δεδομένα δείχνουν ότι η θεραπεία σισπλατίνης Bmi-1 κύτταρα knockdown ενισχύει την απόπτωση, αυξάνοντας την παραγωγή ROS, προκαλώντας εμπλοκή του μονοπατιού DDR και ενεργοποίηση κασπασών. Είμαστε δίπλα προχώρησε για να προσδιοριστεί η θεραπευτική αποτελεσματικότητα της αποσιώπησης Bmi-1 σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο χημειοθεραπεία ποντίκι του καρκίνου των ωοθηκών.

Νοκ ντάουν της Bmi-1 αυξάνει την ευαισθησία σισπλατίνη in vivo

Επόμενο τις θεραπευτικές δυνατότητες του Bmi-1 ελέγχθηκε με

in vivo

παράδοση ΒΜΙ-1 siRNA χρησιμοποιώντας DOPC (1,2-διολεοϋλ-sn-γλυκερο-3-φωσφατιδυλχολίνη) nanoliposomes στον ορθοτοπικό μοντέλο ποντικού CP-20. Αυτή η μέθοδος παράδοσης έχει χαρακτηριστεί εκτενώς στο παρελθόν για τη διάρκεια της εξουδετέρωσης και έχει δειχθεί ότι στερούνται μη ειδικές φλεγμονώδεις αντιδράσεις [41], [42]. Για την προσομοίωση θεραπεία της νόσου σε προχωρημένο στάδιο μικρού όγκου, η αγωγή άρχισε 1 εβδομάδα μετά την ένεση των κυττάρων του όγκου. Τα ποντίκια χωρίστηκαν σε στις ακόλουθες τέσσερις ομάδες (η = 10 ποντίκια ανά ομάδα): (α) τον έλεγχο siRNA-DOPC (150 μg /kg ΙΡ δύο φορές την εβδομάδα), (β) τον έλεγχο siRNA-DOPC + σισπλατίνη (160 μg /ip ποντίκι δόσεις εβδομαδιαίως), (γ) Bmi-1 siRNA-DOPC (150 μg /kg ΙΡ δύο φορές την εβδομάδα), και (δ) Bmi-1 siRNA-DOPC + σισπλατίνη (ίδιο άτομο αγωγές). Όλα τα ζώα θυσιάστηκαν μετά από 4 εβδομάδες θεραπείας. Αποτελεσματική knockdown του Bmi-1 (~ 85%) επιβεβαιώθηκε πρώτα με RT-PCR (Σχ. 6Α). Η θεραπεία με Bmi-1 siRNA μόνος είχε σαν αποτέλεσμα σημαντική (-60%) μείωση στο βάρος του όγκου σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου siRNA. Η συνδυασμένη θεραπεία με Bmi-1 siRNA και cisplatin είχε ως αποτέλεσμα ακόμη μεγαλύτερη (~ 80%) μείωση στο βάρος του όγκου σε σύγκριση με την σισπλατίνη ομάδα μόνο θεραπεία (Εικ. 6Β). Για να αξιολογηθεί περαιτέρω αυτό το φαινόμενο, ο αριθμός των οζιδίων όγκου που σχηματίζεται σε κάθε ομάδα προσδιορίστηκε. Και πάλι η θεραπεία συνδυασμού έδειξε μεγαλύτερη επίδραση με ~ 70% λιγότερα οζίδια όγκου σε σύγκριση με την σισπλατίνη ομάδα μόνο θεραπεία (Εικ. 6Β). Δεν προφανής τοξικότητα παρατηρήθηκε στα ζώα κατά τη διάρκεια πειραμάτων θεραπεία όπως αξιολογείται από τις αλλαγές στη συμπεριφορά, διατροφικές συνήθειες, και την κινητικότητα. Το μέσο σωματικό βάρος ήταν επίσης παρόμοια μεταξύ των ομάδων θεραπείας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Για να εκτιμηθούν τα αποτελέσματα της θεραπείας με siRNA επί της ανάπτυξης όγκου, η αγωγή άρχισε την 1η εβδομάδα μετά i.p. ένεση (1.0 × 10

6 CP20) των καρκινικών κυττάρων. Τα ποντίκια χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες (η = 10 ποντίκια ανά ομάδα): (α) τον έλεγχο siRNA-DOPC (150 μg /kg ΙΡ δύο φορές την εβδομάδα), (β) τον έλεγχο siRNA-DOPC + σισπλατίνη (160 μg /IP εβδομαδιαία ποντικό), (δόσεις ίδιο ως μεμονωμένα αγωγές) (γ) Bmi-1 siRNA-DOPC (150 μg /kg ΙΡ δύο φορές την εβδομάδα), και (δ) Bmi-1 siRNA-DOPC + σισπλατίνη. Η θεραπεία συνεχίστηκε μέχρι 4 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό του όγκου πριν από τη θυσία. (Α) ολικό RNA απομονώθηκε από ένα μέρος των ιστών του όγκου και υποβλήθηκαν σε RT-PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές για Bmi-1 και βήτα ακτίνης. Η συγκριτική C

t μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της σχετικής αφθονίας του mRNA σε σύγκριση με εκείνη της έκφρασης βήτα ακτίνης. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και σημαντικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας t τεστ δύο όψεων του Student, Ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. (Β) ποντίκι και όγκου βάρη και (γ) ο αριθμός των οζιδίων όγκου για κάθε ομάδα συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία t του Student (για συγκρίσεις δύο ομάδες). Μια two-tailed p ≤ 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Η

Επίδραση των Bmi-1 νοκ ντάουν στον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση in vivo

Για να επιβεβαιωθούν μας

in vitro

δεδομένα από την επόμενη εξετάσαμε την επίδραση της Bmi-1 knockdown στο

in vivo

πολλαπλασιασμό καρκινικών κυττάρων και την απόπτωση χρησιμοποιώντας χρώση Κί67 και TUNEL. Η συνδυασμένη θεραπεία με Bmi-1 siRNA και σισπλατίνη έδειξε τη μεγαλύτερη επίδραση με περίπου 50% μείωση του πολλαπλασιασμού συγκριτικά με τον έλεγχο χωρίς θεραπεία ομάδα (Εικ. 7). Ομοίως, μια αύξηση περίπου 80% στην απόπτωση παρατηρήθηκε στην ομάδα θεραπείας συνδυασμού σε σύγκριση με την ομάδα που έλαβε αγωγή ελέγχου (Εικ. 7). Συνεπώς, καταδεικνύουν ότι η αποσιώπηση του Bmi-1 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών αν

in vitro

ή

in vivo

αυξάνει απόπτωση σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη.

(Α) Ανοσοϊστοχημική χρώση για Κί67 και (Β) TUNEL διεξήχθη για την εκτίμηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και απόπτωσης. Αρχική μεγέθυνση 200Χ. Η ποσοτικοποίηση φαίνεται γραφικά στα δεξιά. σκέλη θεραπείας συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία t του Student και p ≤ 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Η

Συζήτηση

καρκίνο των ωοθηκών Αναμφίβολα είναι ένα εξοργιστικό, ανίατη ασθένεια για τους ασθενείς με υποτροπιάζοντα καρκίνο και θεραπευτικές επιλογές περιορίζονται [1], [43]. Εδώ δείχνουμε Bmi-1 γονιδιακή σίγηση ως ένα αποτελεσματικό επιλογή, η οποία σε συνδυασμό με σισπλατίνη ενισχύει περαιτέρω θεραπευτική αποτελεσματικότητα. Επιπλέον έχουμε σκιαγραφήσει ο μηχανισμός της αυξημένης ευαισθησίας για να είναι κατά κύριο λόγο μέσω της παραγωγής ROS. Frontline χημειοθεραπεία για τον καρκίνο των ωοθηκών περιλαμβάνει τη χρήση του δοσολογικού πλατίνας /ταξάνιο, που είναι γνωστό ότι επάγουν την παραγωγή ROS. Έχουμε υποθέσει ότι knockdown του Bmi-1 θα αποδειχθεί αποτελεσματική στην θεραπεία συνδυασμού με αυτή την αγωγή. Στο πλαίσιο αυτό, μια πρόσφατη έκθεση έδειξε Bmi-1 να προσληφθούν από νωρίς στην ιστοσελίδα διπλό σκέλος διάλειμμα μετά από ιονίζουσα ακτινοβολία βλάβη [44]. Τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν και επεκτείνουν αυτή την ιδέα και να αποδείξει

in vitro

και

in vivo

που Bmi-1 αποσιώπηση συνεργεί με αυξημένο οξειδωτικό στρες που οδηγεί στην συσσώρευση της βλάβης του DNA και της απόπτωσης.

τουλάχιστον δύο προηγούμενες δημοσιεύσεις έδειξαν αυξημένα επίπεδα ROS σε νευρώνες, θυμοκύτταρα και τα κύτταρα του μυελού των οστών απομονώθηκαν από Bmi-1 null ποντίκια [28], [29]. Ωστόσο, η αιτία γι ‘αυτή την παραγωγή ROS έχει ποικιλοτρόπως αποδοθεί σε εξαρτημένα και ανεξάρτητα ρ53 καταστολή της γονιδιακής έκφρασης αντι-οξειδωτικό ή μειωμένη μιτοχονδριακή ενεργητική [28], [29]. Δείχνουμε εδώ ότι εκτός από αυτές τις οδούς Bmi-1 ελέγχει επίσης κυτταρικά επίπεδα GSH ρυθμίζοντας μεταγραφή των ενζύμων που εμπλέκονται στην οδό βιοσύνθεσης GSH. Αξίζει να σημειωθεί ότι η μεταγραφή του GCLM ρυθμίζεται θετικά από παράγοντες μεταγραφής όπως NRF-1 και του ΝΡκΒ. Στο πλαίσιο της Bmi-1 knockdown, και οι δύο από αυτούς τους παράγοντες μεταγραφής προς τα κάτω σε νευρώνες και κύτταρα γλοιώματος αντίστοιχα [28], [45]. Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι Bmi-1 σίγησης οδηγεί σε ρύθμιση προς τα κάτω της NRF-1 και ή ΝΡκΒ σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, μειώνοντας έτσι την μεταγραφή του GCLM αποτέλεσμα μειωμένη σύνθεση GSH. Είναι σημαντικό εδώ δείχνουμε ότι Bmi-1 με τη ρύθμιση των επιπέδων ROS και GSH προστατεύει τα ωοθηκών καρκινικά κύτταρα από χημειοθεραπευτική προσβολές.

Η οδός απόκριση βλάβης του DNA μπορεί να ενεργοποιηθεί από γενοτοξικό στρες, όπως αυτές που προκαλούνται από χημειοθεραπευτικά και οξειδωτική βλάβη του DNA . Πράγματι ενεργοποίηση των ΑΑΕ μπορεί να οδηγήσει σε παύση στον κυτταρικό κύκλο εξέλιξης, γηρασμός ή απόπτωση. Σύμφωνα διαπιστώνουμε ότι η διπλή προσβολή της οξειδωτικής βλάβης που προκαλείται από Bmi-1 knockdown και θεραπεία σισπλατίνη, η οποία είναι γνωστό ότι προκαλεί θραύσεων διπλής έλικος στο DNA μαζί με ROS άκρες παραγωγή του ορίου για τη ωοθηκών καρκινικά κύτταρα προς την απόπτωση μέσω επαγωγής φωσφορυλίωσης του i ) Chk2 και H2AX, ii) προκαλώντας το σχηματισμό των πυρηνικών εστίες από 53BP1 και διάσπαση των αποπτωτικών δεικτών όπως iii) κασπασών και PARP.

όπως δείξαμε στο

in vivo

πειράματά μας, νοκ ντάουν της Bmi-1 θα μπορούσε να είναι χρήσιμη σε κλινικό περιβάλλον οφείλεται στους ακόλουθους λόγους? α) ρύθμιση προς τα κάτω του Bmi-1 ενισχύει σισπλατίνη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. β) Bmi-1 απαιτείται για την αυτο-ανανέωση και συντήρηση των βλαστικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου των ωοθηκών βλαστικά κύτταρα τα οποία, εξ ορισμού, είναι ανθεκτικά σε χημειοθεραπευτικά [23]. γ) Bmi-1 ρυθμίζει πολλαπλές οδούς, σημαντικότερο εκ των οποίων είναι η επαγωγή της τελομεράσης οδηγεί σε αθανατοποίηση των επιθηλιακών κυττάρων μαστού [46]. δ) ρύθμιση προς τα κάτω του Bmi-1 οδηγεί σε απο-καταστολή του ΙΝΚ4 &, το οποίο κωδικοποιεί καταστολείς όγκων p16Ink και p19ARF που ρυθμίζουν τη γήρανση και την απόπτωση [47]. Η ενεργοποίηση αυτών των οδών έχουν προβληθεί ως ένα σημαντικό εμπόδιο ογκοκατασταλτικό, επειδή αυτές οι οδοί δρουν ως ισχυροί αναστολείς του πολλαπλασιασμού ή πολλαπλασιασμού των κατεστραμμένων κυττάρων. ε) Επιπλέον, θα θέτουμε ότι η σισπλατίνη και Bmi-1 πράξης σε παρόμοιες πορείες που επηρεάζουν τη μιτοχονδριακή λειτουργία ή /και μέσω της αύξησης των βλαβών του DNA ROS γενιά αιτία που οδηγεί στην αποτελεσματική επαγωγή της απόπτωσης. Τα αυξημένα επίπεδα της βλάβης του DNA, στη συνέχεια, να αυξήσει το σήμα για την έναρξη της απόπτωσης. Έτσι, Bmi-1 είναι ένας σημαντικός νέος στόχος για τη θεραπεία όχι μόνο στην χημειοθεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών, αλλά και για άλλες κακοήθειες που χαρακτηρίζονται από υπερέκφραση του Bmi-1.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Bmi-1 αντίσωμα ήταν από τη Zymed, CA, USA. siRNA Bmi-1 και κωδικοποιημένα ελέγχου ήταν από την Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ. Φωσφο-Η2ΑΧ, φωσφο-Chk-2, 53 ΒΡ1 διασπασμένη κασπάση-8, κασπάσης-9 και PARP αντισώματα ήταν από τη Cell Signaling Technologies Inc., ΜΑ. Αννεξίνης /FITC-PI κιτ απόπτωση ήταν από Biovision Inc.

Cell Culture

Α-2780 και CP-70 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI με 10% FBS και 1% αντιβιοτικό (πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη ) σύμφωνα με τις συστάσεις του παρόχου. Οι κυτταρικές γραμμές CP-20 αναπτύχθηκαν σύμφωνα με προηγουμένως δημοσιευμένες διαδικασίες μας [48].

siRNA διαμόλυνση

Η ωοθηκών Α2780 κύτταρα ή CP-70 αναπτύχθηκαν σε αντίστοιχο θρεπτικό μέσο τους για μία ημέρα πριν την επιμόλυνση. Χρησιμοποιώντας Oligofectamine τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 25 ηΜ περιπλεγμένο έλεγχο ή ΔΜΣ-1 siRNA. Μετά από 48 ώρες τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για προσδιορισμούς Western Blot ή απόπτωση [49].

Western Blot

Συγκομιδής ωοθηκών καρκινικά κύτταρα, τόσο κατεργασμένα και μη κατεργασμένα, πλύθηκαν σε PBS και λύθηκαν σε παγωμένο ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA) ρυθμιστικό με προσφάτως προστιθέμενη 0,01% κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Sigma) και επωάστηκαν σε πάγο για 30 λεπτά. Τα κυτταρικά υπολείμματα απορρίπτεται με φυγοκέντρηση στις 13.000 rpm για 10 λεπτά στους 4 ° C και το υπερκείμενο (30-50 μg πρωτεΐνης), επί SDS-Page [49].

δοκιμασία ROS

<