Αφηρημένο

Η υποξία παρουσιάζεται σε μια ευρεία ποικιλία των φυσιολογικών και παθολογικών καταστάσεων, συμπεριλαμβανομένης της ογκογένεσης. Τα καρκινικά κύτταρα πρέπει να προσαρμοστούν σε υποξία με μεταβολή έκφρασης γονιδίου τους και την πρωτεϊνική σύνθεση. Εδώ, δείξαμε ότι η υποξία αναστέλλει τη μετάφραση μέσω της ενεργοποίησης του PERK και αδρανοποίηση των mTOR σε ανθρώπινα κύτταρα του παχέος εντέρου καρκίνος HCT116. Η παρατεταμένη υποξία (1% O

2, 16 ώρες) αναστέλλει δραματικά γενική μετάφραση στα κύτταρα HCT116, ακόμη επιλέξει mRNA που παραμένουν αποτελεσματικά μεταφραστεί κάτω από μια τέτοια κατάσταση. Χρησιμοποιώντας ανάλυση μικροσυστοιχιών του συνδέεται polysome- mRNAs, ταυτοποιήσαμε έναν μεγάλο αριθμό γονιδίων υποξίας-ρυθμίζονται σε μεταφραστικό επίπεδο. Αποτελεσματικά μεταφραστεί mRNAs κατά τη διάρκεια της υποξίας επικυρώθηκαν από πολυσώματος προφίλ και ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR. ανάλυση εμπλουτισμός Pathway έδειξε ότι πολλά από τα πάνω ρυθμισμένα γονίδια εμπλέκονται σε λυσόσωμα, γλυκάνη και το μεταβολισμό των λιπιδίων, την παρουσίαση αντιγόνου, κυτταρικής προσκόλλησης, και την αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας μήτρας και του κυτταροσκελετού. Η πλειοψηφία των γονιδίων που ρυθμίζεται προς τα κάτω εμπλέκονται στην απόπτωση, ουβικιτίνη πρωτεόλυση διαμεσολαβείται, και οξειδωτική φωσφορυλίωση. Περαιτέρω έρευνα έδειξε ότι η υποξία επάγει λυσοσωμικής αυτοφαγία και μιτοχονδριακή δυσλειτουργία μέσω μεταφραστική ρύθμιση στα κύτταρα HCT116. Η αφθονία του διάφορους παράγοντες μετάφρασης και η δραστικότητα κινάσης mTOR εμπλέκονται σε υποξία προκαλούμενη μιτοχονδριακή αυτοφαγία στα κύτταρα HCT116. Οι μελέτες μας τονίζουν τη σημασία της μεταγραφικής ρύθμισης για την προσαρμογή των καρκινικών κυττάρων στην υποξία

Παράθεση:. Lai MC, Chang CM, Sun ΕΣ (2016) η υποξία επάγει Autophagy μέσω Μεταγραφική Up-κανονισμός του Λυσοσωμική Πρωτεΐνες στον ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα . PLoS ONE 11 (4): e0153627. doi: 10.1371 /journal.pone.0153627

Συντάκτης: Vladimir Τραΐκοβιτς, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο του Βελιγραδίου, Σερβία

Ελήφθη: 2 Νοέμβρη 2015? Αποδεκτές: 2 Απρίλη, 2016? Δημοσιεύθηκε: 14 Απρίλη του 2016

Copyright: © 2016 Lai et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας, Ταϊβάν (NSC100-2320-B-006-021-my3 να MCL και NSC101- 2627-B-006-005 με HSS) και Chang Gung Memorial Hospital, Ταϊβάν (CMRPD3E0012). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο ορθοκολικός καρκίνος (CRC) είναι μία από τις πιο κοινούς καρκίνους στον άνθρωπο. Κάθε χρόνο, περισσότεροι από 1 εκατομμύριο ασθενείς που διαγιγνώσκονται με CRC στον κόσμο. Η συχνότητα εμφάνισης της CRC έχει αρχίσει να αυξάνεται σταθερά τα τελευταία 20 χρόνια [1]. Μελέτες της CRC έχουν παράσχει πολύτιμες πληροφορίες για την πολλαπλών βημάτων γενετική διαδικασία της καρκινογένεσης [2, 3]. Η πλειοψηφία των CRC ενεργοποιείται από μεταλλάξεις σε αδενωματώδη πολυποδίαση coli (

APC

) γονίδιο [4], η οποία επάγει το σχηματισμό της πρόωρης αδενώματος. Η ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου περαιτέρω προωθείται από μια σειρά από γενετικές μεταλλάξεις, συμπεριλαμβανομένων των

KRAS

,

Smad4

, και

TP53

, οι οποίες επιτρέπουν την ανάπτυξη αδενώματος και καρκινώματος εξέλιξη. Η καλύτερη κατανόηση των μοριακών μηχανισμών στους οποίους βασίζεται CRC εξέλιξης μπορούν να διευκολύνουν την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών αντι-καρκίνου. Κατά την τελευταία δεκαετία, διάφορες νέες μοριακών στόχων επί του παρόντος διερευνάται για τη θεραπεία του CRC [5].

Λόγω της ταχείας διάδοσης και ανώμαλη αγγειογένεση, οι όγκοι περιέχουν περιοχές με διάφορους βαθμούς της υποξίας [6]. Τα καρκινικά κύτταρα πρέπει να προσαρμοστούν σε υποξικό στρες, μεταβάλλοντας γονίδιο έκφραση τους και την πρωτεϊνική σύνθεση [7]. Αυτές οι αλλαγές περιλαμβάνουν το μεταβολισμό της ενέργειας, αγγειογένεση, μετανάστευση κυττάρων, η εισβολή όγκου και η μετάσταση, ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, φλεγμονώδη απόκριση, και ρύθμιση του ρΗ [8-10]. Όγκων υποξία πιστεύεται ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της νόσου, κακοήθειας. Η παρουσία υποξικών κυττάρων σε στερεούς όγκους συσχετίζεται με κακή πρόγνωση σε πολλούς τύπους καρκίνων [6]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι υποξικά καρκινικά κύτταρα είναι πιο ανθεκτικά στην ακτινοθεραπεία [11, 12] και πολλοί χρησιμοποιούνται συνήθως χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [13]. Ως εκ τούτου, αξίζει να διερευνηθεί η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα κάτω από συνθήκες υποξίας.

Σε απάντηση στην υποξία, τα κύτταρα αυξάνουν ταχέως το επίπεδο της υποξίας-διεγέρσιμο παράγοντα 1 (HIF-1) [14, 15], ένα ετεροδιμερές που αποτελείται από οξυγόνο ευαίσθητη υπομονάδα HIF-1α και ένα ιδιοσυστατικά εκφραζόμενο υπομονάδα HIF-1β. HIF-1 ρυθμίζει την ομοιόσταση του οξυγόνου κατά τη διάρκεια της υποξίας από μεταγραφικά στόχευση περισσότερα από 100 γονίδια, τα οποία περιέχουν υποξία-απόκρισης στοιχείων (HREs) μέσα σε υποστηρικτές τους [16, 17]. Εκτός από την μεταγραφή, μετάφραση θεωρείται ως μια σημαντική συμβολή στην γονιδιακή έκφραση υποξία ρυθμίζεται [18, 19]. Μεταβολικές μελέτες επισήμανσης έδειξαν ότι η υποξία αναστέλλει παγκόσμια μετάφραση σε πολλές διαφορετικές κυτταρικές γραμμές [20-23]. Γενικά μετάφραση αναστέλλεται σημαντικά από οξεία ανοξία (& lt? 0,02% O

2) ή παρατεταμένη υποξία (≦ 2% O

2, & gt? 16 ώρες) [21, 22, 24-26]. Έχει αναφερθεί ότι ο στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR) και η κινάση ενδοπλασματικό δίκτυο κάτοικο (PERK) διαδραματίζουν βασικό ρόλο στη μεταφραστική ρύθμιση κατά τη διάρκεια της υποξίας [26-28]. Η υποξία αναστέλλει τη δράση της κινάσης του mTOR και οδηγεί σε αποφωσφορυλίωση των πρωτεϊνών 4Ε δέσμευσης παράγοντα έναρξης μετάφρασης (4Ε-BPs). Αποφωσφορυλίωση 4Ε-ΒΡ αυξάνει την συγγένεια δέσμευσης τους με τον παράγοντα eIF4E έναρξης της μετάφρασης και έτσι καταστέλλει την τάπα-εξαρτώμενη μετάφραση διακόπτοντας ένωση eIF4E με eIF4G. Από την άλλη πλευρά, η υποξία επάγει την ξεδιπλωμένη απόκριση πρωτεΐνης (UPR), η οποία εμφανίζεται ως συνέπεια της ενδοπλασματικού δικτύου (ER) άγχος, και οδηγεί στην ενεργοποίηση του PERK [21, 24, 27]. Ενεργοποιημένος PERK φωσφορυλιώνει ευκαρυωτικό παράγοντα έναρξης της μετάφρασης 2 υπομονάδας α (eIF2α) και έτσι αναστέλλει έναρξης μετάφρασης εμποδίζοντας το σχηματισμό του eIF2-GTP-tRNA (i) Met τριμερούς συμπλόκου [29].

Αν και γενική μετάφραση είναι σε μεγάλο βαθμό αναστέλλεται κατά τη διάρκεια της υποξίας, επιλέγεται mRNA που παραμένουν αποτελεσματικά μεταφραστεί κάτω από μια τέτοια κατάσταση. Μετάφραση της υποξίας-γονιδίων που αποκρίνονται απαιτεί εναλλακτικοί μηχανισμοί, όπως εσωτερική θέση ριβοσώματος εισόδου (IRES) [30, 31] και ανάντη ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (uORF) [32]. IRES είναι ένα σύνθετο δομικό στοιχείο RNA που εκκινεί τη μετάφραση από απ ‘ευθείας πρόσληψη ριβοσώματα για να βρείτε το κωδικόνιο έναρξης σε ένα mRNA. Θεωρείται ότι η υποξία καταστέλλει cap-εξαρτώμενη, αλλά δεν έναρξη της μετάφρασης IRES μεσολάβηση [29]. Η υποξία-γονιδίων που αποκρίνονται HIF-1α και VEGFA έχουν δειχθεί να διατηρούν μετάφραση μέσω IRES κατά την υποξία [33, 34]. Ωστόσο, ο μηχανισμός του μεταφραστική ρύθμιση κατά την υποξία δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητός, και μπορεί να ποικίλουν ανάλογα με τους τύπους κυττάρων και υποξικές συνθήκες.

Autophagy είναι μια βιολογική διεργασία κύτταρο που υποβαθμίζει περιττά ή δυσλειτουργικές πρωτεΐνες και οργανιδίων να διατηρηθεί θρεπτικών συστατικών και ενέργειας ομοιόστασης κατά τη διάρκεια καταστάσεων στρες [35]. Έχει αναφερθεί ότι η υποξία επάγει autophagy σε HIF-1-εξαρτώμενο τρόπο [36, 37]. Ωστόσο, μεταφραστική ρύθμιση παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στην προκαλούμενη από υποξία αυτοφαγία. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε πολυσωμάτων profiling συζευγμένο με ολόκληρη σειρά έκφραση του ανθρώπινου γονιδιώματος για τον εντοπισμό υποψήφιων γονιδίων των οποίων η μετάφραση ρυθμίζεται από υποξία σε ανθρώπινα κύτταρα του παχέος εντέρου καρκίνος HCT116. Λειτουργική σχολιασμό των υποψηφίων γονιδίων υποδεικνύει ότι η υποξία ρυθμίζει μετάφραση μιας παρτίδας των γονιδίων που εμπλέκονται στην λυσόσωμα και διαφορετικές μεταβολικές οδούς. Παρέχουμε αποδείξεις ότι η υποξία προκαλεί αυτοφαγία μέσω μεταφραστική πάνω ρύθμιση των λυσοσωμικών πρωτεϊνών στα κύτταρα HCT116. Οι μελέτες μας τονίζουν τη σημασία της μεταγραφικής ρύθμισης για την προσαρμογή των καρκινικών κυττάρων στην υποξία.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και υποξική θεραπεία

κύτταρα HCT116 (ATCC

® CCL247

™) αναπτύχθηκαν σε μέσο ΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό στους 37 ° C σε 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Για υποξική (1% O

2) θεραπεία, τα κύτταρα μεταφέρονται σε ένα ειδικά σχεδιασμένο θάλαμο υποξίας (NexBiOxy Inc., Hsinchu, Ταϊβάν) το οποίο τροφοδοτήθηκε με 95% Ν

2 και 5% CO

2 στους 37 ° C

πλασμίδια και την διαμόλυνση

Τα πλασμίδια που εκφράζουν FLAG-tagged αγρίου τύπου mTOR ή ουσιαστικά δραστική μεταλλάγματα (L1460P & amp? E2419K). αγοράστηκαν από Addgene (Cambridge, ΜΑ). διαμόλυνση κυττάρων διεξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο μορφομετατροπής Lipofectamine

® 2000 (Thermo Fisher Scientific), ουσιαστικά σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

μεσολάβηση RNAi knockdown

Όλα τα πλασμίδια που απαιτούνται για την RNAi μεσολάβηση νοκ ντάουν δόθηκαν από τη διευκόλυνση Εθνική RNAi πυρήνα (Academia Sinica, Ταϊβάν). Οι φορείς δύο pLKO.1-shRNA που χρησιμοποιούνται για την knockdown PSAP και LAMP2 ήταν ως εξής: TRCN0000217974 (shPSAP), και TRCN0000029263 (shLAMP2). Το αντιδραστήριο επιμόλυνσης Lipofectamine

® 2000 (Thermo Fisher Scientific) χρησιμοποιήθηκε για τη μεταφορά πλασμιδιακού DNA σε κύτταρα HCT116. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 3 ημέρες μετά την επιμόλυνση για ανάλυση.

σακχαρόζης κλίση καθίζηση και πολυσωμάτων προφίλ

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε ψυχρό PBS που περιέχει 100 μg /ml κυκλοεξιμιδίου. Ολες οι επόμενες βαθμίδες διεξήχθησαν στους 4 ° C. Τα κυτταρικά ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε RSB-150 (10 mM Tris-HCl (ρΗ 7.4), 3 mM MgCl

2, και 150 mM NaCl) που περιέχει 100 μg /ml κυκλοεξιμιδίου, 40 μg /ml διγιτονίνη (Calbiochem), 20 U /ml RNasin (Promega), και 1Χ κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Thermo Fisher Scientific). Μετά την επώαση σε πάγο για 5 λεπτά, τα κύτταρα διασπάστηκαν με διαβίβαση μέσω βελόνης 26-gauge πέντε φορές. Κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 3000 χ g για 2 λεπτά, και διασαφηνίζονται με περαιτέρω φυγοκέντρηση στα 11.000 χ g για 15 λεπτά. Τα δείγματα φορτώθηκαν σε μια γραμμική κλίση σακχαρόζης 15-40% και φυγοκεντρήθηκε στις 38.000 rpm για 3 ώρες σε έναν ρότορα Beckman SW41. Μετά από φυγοκέντρηση, το συνολικό RNA εκχυλίστηκε από κάθε κλάσμα χρησιμοποιώντας εκχύλιση φαινόλης /χλωροφορμίου, παρουσία 1% SDS και 0.25 Μ NaCl, που ακολουθήθηκε από καθίζηση αιθανόλης. Για πολυσώματος ανάλυση του προφίλ, οι κλίσεις παρακολουθήθηκαν στα 254 nm χρησιμοποιώντας ένα σύστημα κλασματοποίησης ISCO (Lincoln, ΝΕ).

ανοσοαποτύπωσης

Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF Transfer (PerkinElmer). Κηλίδες πρωτεΐνης φράχθηκαν με 3% αποβουτυρωμένο γάλα σε ρυθμιστικό TBST (100 mM Tris-HCl (ρΗ 7.6), 150 mM NaCl, και 0,05% Tween 20) σε RT για 1 ώρα. Τα πρωτογενή αντισώματα περιελάμβαναν αντι-φωσφο-eIF2α (ser51) (1: 1000 αραίωση? Cell Signaling), ποντικού αντι-eIF2α (0,4 μg /ml? Santa Cruz Biotechnology), αντι-φωσφο-4E-BP1 κουνελιού (Thr37 /46 ) (1: 1000 αραίωση? Cell Signaling), αντι-4E-BP1 (0,4 μg /ml ποντίκι? Santa Cruz Biotechnology), ποντικού αντι-β-ακτίνης (1: 2500 αραίωση? Sigma-Aldrich), ποντικού αντι-HIF- 1α (0,2 μg /ml? BD Transduction Laboratories), κατσίκα αντι-GLUT1 (1 μg /ml? Santa Cruz Biotechnology), κουνελιού αντι-VEGF (0.4 μg /ml? Santa Cruz Biotechnology), κουνελιού αντι-LC3B (1: 1000 αραίωση? Cell Signaling), κουνελιού αντι-Ρ62 (1: 2000 αραίωση? MBL), κουνελιού αντι-α-τουμπουλίνης (1: 2000 αραίωση? Cell Signaling), κουνελιού αντι-GNS (αραίωση 1: 200? GeneTex), αντι κουνελιού -PSAP (αραίωση 1: 1000? GeneTex), ποντικού αντι-TPP1 (1 μg /ml? Abcam), ποντικού αντι-ATPB (0,5 μg /ml? Abcam), αντι-LAMP2 κουνελιού (1: 1000 αραίωση? GeneTex), κουνελιού αντι-eIF4E (1 μg /ml? Abcam) και κουνελιού αντι-eIF4A1 (1 μg /ml? Abcam). Οι κηλίδες επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα σε ρυθμιστικό αποκλεισμού σε RT για 2 ώρες, που ακολουθείται από επώαση με συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα σε RT για 2 h. Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Immobilon Western χημειοφωταύγειας HRP Substrate (Millipore) για την έκθεση φιλμ ακτίνων Χ.

Microarray ανάλυση

Για την ανάλυση μικροσυστοιχιών, απομονωμένο RNA καθαρίστηκε με το κιτ RNeasy Mini (Qiagen) . Περίπου 6 μα ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας έναν εκκινητή ολίγο d (T) που περιέχει την αλληλουχία υποκινητή Τ7 RNA πολυμεράσης στο άκρο 3 ‘. Βιοτίνη σημασμένο συμπληρωματικό RNA (cRNA) παρήχθη με

in vitro μεταγραφή

που ακολουθείται από υδρόλυση που προκαλείται από μέταλλο σε 94 ° C. Στη συνέχεια, αποσπασματικές cRNA υβριδίστηκε σε Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array στους 45 ° C για 16 ώρες. Μεταγενέστερες πλύσιμο και χρώση έγιναν με ένα ρευστό Σταθμός-450 και GeneChips σαρωθεί με Affymetrix GeneChip Scanner 7G. Δεδομένα πρωτογενών μικροσυστοιχιών αναλύθηκαν περαιτέρω χρησιμοποιώντας GeneSpring GX 10 λογισμικό (Silicon Genetics).

RT-PCR και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του επιπέδου έκφρασης του mRNA. Εκχυλισμένο RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA με τη χρήση της υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription Kits (Thermo Fisher Scientific) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το προκύπτον cDNA υπεβλήθη σε συμβατική PCR ή ποσοτική ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR. Συμβατική PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας GoTaq DNA πολυμεράση (Promega) και η προς τα εμπρός και αντίστροφοι εκκινητές: β-ακτίνης (προς τα εμπρός εκκινητή (FP): 5’CATCCACGAAACTACCTTCAACT3 »και αντίστροφο εκκινητή (RP): 5’TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG3 ‘), ο HIF-1α (FP : 5’TGGACTCTGATC ATCTGACC3 »και RP: 5’CTCAAGTTGCTGGTCATCAG3»), και VEGFA (FP: 5’CCTGGT GGACATCTTCCAGGAGTACC3 »και RP: 5’GAAGCTCATCTCTCCTATGTGCT GGC3».) [38]

Ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ήταν πραγματοποιείται με τη χρήση StepOnePlus

™ Real Time-Systems PCR σύμφωνα με τις οδηγίες των προμηθευτών (Thermo Fisher Scientific). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου που καταγράφονται στον Πίνακα S1. Τα επίπεδα του mRNA που ανιχνεύτηκαν με Fast SYBR

® Πράσινη Master Mix (Thermo Fisher Scientific). Η ποσοτική ανάλυση έγινε με τη μέτρηση τιμών CT διάρκεια της εκθετικής φάσης της ενίσχυσης. Σχετική τιμές ποσοτικοποίηση υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας την 2

-ΔΔCT μέθοδο [39].

εμπλουτισμό Διαδρομή ανάλυση

Λειτουργική σχολιασμός των γονιδίων υποξία ρυθμίζεται πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της διαθέσιμης στο κοινό DAVID Βιοπληροφορική Πόρων Έκδοση 6.7 λογισμικό (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) με την Εγκυκλοπαίδεια του Κιότο γονιδίων και γονιδιωμάτων (KEGG) βάση δεδομένων μονοπατιού. Η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε με την ακριβή δοκιμή ενός τροποποιημένου Fisher. P-value = 0 αντιπροσωπεύει τέλεια εμπλουτισμού. P-τιμή & lt? 0,05 θεωρείται ότι έχει έντονα εμπλουτισμένο σε κατηγορίες σχολιασμό

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Οι κυτταρικές καλλιέργειες ζωτικής χρωματίστηκαν με πορτοκαλί ακριδίνη. (ΑΟ? Sigma-Aldrich) σε μια συγκέντρωση 5 μg /ml για 15 λεπτά και στη συνέχεια πλένονται με PBS. ΑΟ είναι μία φθορίζουσα χρωστική κατιονικό που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη μέτρηση των επιπέδων των όξινων φυσαλιδώδους οργανίδια (λυσοσώματα) εντός των κυττάρων. Τα επίπεδα των όξινων φυσαλιδώδους οργανίδια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το FACSCalibur (BD Biosciences) με διέγερση ορίζεται στα 488 nm, και εκπομπή από φθορίζουσα AO ανιχνεύθηκε με FL-3 καναλιών (670 nm).

Το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης ήταν προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τετραμεθυλοροδαμίνη μεθυλεστέρας (TMRM). Οι κυτταρικές καλλιέργειες ζωτικής χρωματίστηκαν με 0,5 μΜ TMRM για 30 λεπτά στους 37 ° C και στη συνέχεια πλένονται με PBS. Η ένταση φθορισμού των TMRM αναλύθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής με FL-2 καναλιών (564 ~ 606 nm). Τα δείγματα αναλύθηκαν με τη χρήση CellQuest Pro 4.0.2 λογισμικού (BD Biosciences) και ποσοτικοποίηση έγινε χρησιμοποιώντας WinMDI 2.9 του λογισμικού (Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA).

LysoTracker χρώση

Η LysoTracker Red DND-99 (Thermo Fisher Scientific) χρησιμοποιείται για να ερευνήσει τη βιοσύνθεση και τη συσσώρευση των λυσοσωμάτων σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε HCT116 καλυπτρίδες σημάνθηκαν με LysoTracker Red DND-99 (1: 5000 αραίωση) για 1 ώρα υπό συνθήκες ανάπτυξης. Μετά την επισήμανση, τα κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό PBS και μονιμοποιήθηκαν με 3% φορμαλδεΰδη σε PBS για 30 λεπτά. Μετά από εκτεταμένη πλύση με PBS, τα δείγματα τοποθετήθηκαν αμέσως και παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού (Zeiss Axio Παρατηρητής Α1, Γερμανία) εξοπλισμένο με μια κάμερα CCD.

Στατιστική ανάλυση

παρουσιάστηκαν Όλα τα δεδομένα ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 4.0 λογισμικό (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Διεξήχθη στατιστική ανάλυση χρησιμοποιώντας μη ζευγαρωμένο t-test. P-value & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Γενικά μετάφραση είναι ευπαθή σε υποξία σε κύτταρα HCT116

Έχει αναφερθεί ότι η γενική μετάφραση αναστέλλεται από την υποξία. σε διάφορους τύπους κυττάρων, αλλά υποξία-γονιδίων που αποκρίνονται μπορεί να ξεφύγει από μεταγραφική καταστολή κατά την υποξία [32-34, 40]. Εδώ, εκτελέσαμε πολυσωμάτων προφίλ και RT-PCR για την ανίχνευση διανομή πολυσωματικού συγκεκριμένων mRNAs. Τα σύμπλοκα /ριβοσώματος mRNA διαχωρίστηκαν σε 11 κλάσματα χρησιμοποιώντας γραμμικό 15-40% σακχαρόζη φυγοκέντρηση σε κλίση (Σχήμα 1Α). Η κατανομή του mRNA εντός των κλασμάτων πολυσωματικού είναι αντανακλαστική του μεταφραστική αποτελεσματικότητα του. Πρώτον, χρησιμοποιήσαμε διάφορα ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές να μελετηθούν τα αποτελέσματα της υποξίας για τη μετάφραση και παρατήρησε ότι η παρατεταμένη υποξία (1% O

2, ≧ 16 ώρες) προκάλεσε μια δραματική αναστολή της γενικής μετάφρασης σε κύτταρα HCT116 (S1 Εικ). Μεταφραστικής αποτελεσματικότητας του γονιδίου housekeeping β-ακτίνης αλλαγές από ~ 60% σε ~ 30% εντός 16 ωρών από την έκθεση σε υποξία (Σχήμα 1Β). Επειδή έχουν PERK και mTOR κινάσες έχουν προταθεί ως σημαντικοί παράγοντες για την μεταφραστική ρύθμιση κατά τη διάρκεια της υποξίας [27], μπορούμε, συνεπώς, ανέλυσε την κατάσταση φωσφορυλίωσης των κατάντη υποστρωμάτων τους, eIF2α και 4Ε-BP1, στα κύτταρα HCT116 κάτω από υποξία. Η ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως έδειξε ότι η παρατεταμένη υποξία οδηγεί σε μια μικρή αύξηση στη φωσφορυλίωση eIF2α (Σχήμα 1 C), και 4Ε-ΒΡ1 σταδιακά αποφωσφορυλιώνεται εντός 16 ωρών από την έκθεση σε υποξία σε κύτταρα HCT116. Αυτό δείχνει ότι η υποξία αναστέλλει γενική μετάφραση τουλάχιστον εν μέρει μέσω της ενεργοποίησης του PERK και αδρανοποίηση των mTOR σε κύτταρα HCT116.

A. Κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα φορτώθηκαν σε μια γραμμική υπερφυγοκέντρησης σουκρόζης βαθμίδωσης 15-40%. Μετά από φυγοκέντρηση, το προφίλ πολυσωμάτων απεικονίστηκε γραφικά από την Α

254 τιμές (άνω), και το RNA εκχυλίστηκε από κάθε κλάσμα για ανάλυση. Το καθαρισμένο RNA αναλύθηκε σε μια γέλη φορμαλδεϋδης /αγαρόζης 1%, και rRNA οπτικοποιήθηκε με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου (κατώτερο). Η κατανομή των υπομονάδων ριβοσώματος και πολυσώματα υποδεικνύονται. κύτταρα Β HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με υποξία (1% O

2) για 0, 4, 8, 16, και 24 ώρες. Η κατανομή του mRNA πολυσωματικού β-ακτίνης ανιχνεύθηκε με πολυσωμάτων προφίλ και RT-PCR. Μεταφραστικής αποτελεσματικότητας του mRNA β-ακτίνης υπολογίστηκε και εμφανίζεται ως ποσοστό σε διαφορετικά χρονικά σημεία. C. Η κατάσταση φωσφορυλίωσης του eIF2α και 4Ε-ΒΡ1 προσδιορίστηκε με ανάλυση ανοσοαποτύπωσης σε κύτταρα HCT116 εκτέθηκαν σε υποξία για την υποδεικνυόμενη χρονική περίοδο. Τα επίπεδα του φωσφορυλιωμένη (πιλοτική) και των ολικών πρωτεϊνών ανιχνεύθηκαν με ειδικά αντισώματα έναντι φωσφο-eIF2α (ser51), eIF2α, φωσφο-4E-BP1 (Thr37 /46), και 4Ε-ΒΡ1. Ανίχνευση β-ακτίνης πρωτεΐνη χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. D. Ανάλυση ανοσοκηλίδας του HIF-1α, GLUT1, VEGFA, και β-ακτίνης πρωτεϊνών σε κύτταρα HCT116 εκτέθηκαν σε υποξία για 16 ώρες. Ανίχνευση β-ακτίνης πρωτεΐνη χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. Κύτταρα Ε HCT116 αναπτύχθηκαν υπό φυσιολογική οξυγόνωση (21% O

2) ή υποξία (1% O

2) για 16 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν σε RSB-150 ρυθμιστικού διαλύματος. Κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα φορτώθηκαν σε μια γραμμική υπερφυγοκέντρησης σουκρόζης βαθμίδωσης 15-40% και συλλέγονται σε 11 κλάσματα (1 ml /κλάσμα). RNA απομονώθηκε από κάθε κλάσμα ανιχνεύθηκε με RT-PCR και υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Η περιοχή πολυσωματικού της κλίσης περιλαμβάνει κλάσματα 7-11. Μεταγραφική αποτελεσματικότητα της β-ακτίνης, ο HIF-1α και VEGFA mRNAs υπολογίσθηκε και παρουσιάζεται ως ένα ποσοστό. 28S και 18S rRNAs απεικονίστηκαν άμεσα με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου. Η κατανομή των υπομονάδων ριβοσώματος και πολυσωμάτων υποδεικνύονται.

Η

Για να διερευνήσουν τις αλλαγές στη μετάφραση κατά τη διάρκεια της υποξίας, τα κύτταρα HCT116 αναπτύχθηκαν στο πλαίσιο ορθοξικές (21% O

2) και υποξική (1% O

2) συνθήκες καλλιέργειας για 16 ώρες. Όπως ήταν αναμενόμενο, η υποξία σταθεροποιεί πρωτεΐνη HIF-1α και επάγει την έκφραση του HIF-1 γονιδίων στόχων GLUT1 και VEGFA σε κύτταρα HCT116 (Σχήμα 1 D). Πραγματοποιήσαμε επίσης πολυσωμάτων προφίλ και RT-PCR για την αξιολόγηση μεταφραστικής αποτελεσματικότητας των επιλεγμένων mRNA. Η μετουσίωση ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης του rRNA έδειξε μια μετατόπιση του mRNA από πολυσώματα σε σύμπλοκα έναρξης μετάφρασης (Σχήμα 1Ε, κάτω πίνακας). Η συσσώρευση 18S και 28S rRNAs στα κλάσματα χαμηλού μοριακού βάρους ριβοσωμική (κλάσματα 5-6? Υποξία) έδειξε μεταγραφική καταστολή κατά την υποξία. Η κατανομή του mRNA πολυσωματικού β-ακτίνης προφανώς μειώθηκε σε υποξικά κύτταρα HCT116 σε σύγκριση με νορμοξικές ελέγχου (Σχήμα 1Ε, άνω πίνακας). Ένα μεγάλο τμήμα του mRNA β-ακτίνης (68,7%) συνδέθηκε με πολυσωμάτων σε νορμοξικά κύτταρα HCT116, ενώ μόνο 32,0% του mRNA β-ακτίνης παρέμεινε συνδέονται με πολυσωμάτων σε υποξικά κύτταρα HCT116. Σε αντίθεση, η κατανομή πολυσωματικού του HIF-1α και VEGFA mRNAs ήταν σχετικά ανεπηρέαστα από την υποξία (σχ 1Ε, μεσαίο πάνελ). Περισσότερο από το ήμισυ του HIF-1α (58,1%) και VEGFA (53,8%) mRNAs παρέμεινε συνδεδεμένων με πολυσώματα μετά από έκθεση 16 ωρών σε υποξία. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες [33, 34], HIF-1α και mRNAs VEGFA έχουν τη δυνατότητα να ξεφύγουν μεταγραφική καταστολή κατά τη διάρκεια της υποξίας. Ως εκ τούτου, μπορούμε να υποθέσουμε ότι επιλέγεται mRNA που παραμένουν αποτελεσματικά μεταφραστεί στα κύτταρα HCT116 υπό συνθήκες υποξίας.

Μεταγραφική ρύθμιση των επιλεγμένων mRNAs στα κύτταρα HCT116 κατά τη διάρκεια της υποξίας

Για να διερευνηθεί η επίδραση της υποξίας σε μετάφραση, θα αξιοποιηθεί πολυσωμάτων προφίλ σε συνδυασμό με την ανάλυση μικροσυστοιχιών cDNA για τον έλεγχο των γονιδίων υποξίας-ρυθμίζονται. Και οι δύο mRNAs πολυσωμάτων που σχετίζονται και το ολικό RNA των ορθοξικές και υποξικών κυττάρων HCT116 απομονώθηκαν και υποβλήθηκαν σε υβριδισμό μικροσυστοιχιών. Πολυσωμάτων που σχετίζεται mRNAs απομονώθηκαν από μια δεξαμενή κλασμάτων πολυσωματικού (Σχήμα 1Α, τα κλάσματα 8-11) για την ανάλυση των translatome. Ολικό RNA εκχυλίστηκε από τα ίδια δείγματα για την ανάλυση των μεταγραφικό. Η μεταγραφική αλλαγή ενός mRNA μετρήθηκε από τη μεταβολή της αφθονίας των πολυσωματικού RNA κανονικοποιήθηκαν προς τη μεταβολή της αφθονίας του ολικού RNA για κάθε mRNA (Σχήμα 2, πολυσωματικού /σύνολο). Γονίδια με μεταβολές ≧ 2-φορές μετά από έκθεση σε υποξία θεωρήθηκαν ως υποξία ρυθμίζεται υποψήφια γονίδια. Όλα τα υποψήφια γονίδια χωρίστηκαν σε τέσσερις κατηγορίες: τα επάνω ρυθμισμένη και κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια είτε στο μεταφραστικό ή μεταγραφικό επίπεδο (Σχήμα 2). Ως αποτέλεσμα, 1036 up-ρυθμιζόμενα γονίδια και 480 ρυθμισμένα προς τα κάτω γονίδια ταυτοποιήθηκαν με ανάλυση translatome. Η παράλληλη ανάλυση μεταγραφικό εντοπίστηκαν 144 έως ρυθμιζόμενων γονιδίων και 134 κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια. Ωστόσο, μόνο το ~ 32% των υποξία γονιδίων που ρυθμίζονται στο μεταγραφικό επίπεδο εμφανίζουν σημάδια της μεταφραστικής από κοινού ρύθμισης στα κύτταρα HCT116 κατά τη διάρκεια της υποξίας (Σχήμα 2, διαγράμματα Venn). Αυτό δείχνει ότι η υποξία μπορεί να επηρεάσει διαφορετικά υποσύνολα των γονιδίων στόχων μεταξύ translatome και μεταγραφικό.

Τα αποτελέσματα της ανάλυσης μικροσυστοιχιών αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας GeneSpring GX 10 λογισμικό. Γονίδια με ≧ 2-φορές μεταβολή στην πολυσωματικού συνολικός δείκτης /ΚΝΑ ή ολικό RNA ορίστηκαν ως γονίδια υποξία ρυθμιστεί. Τα αποτελέσματα ελήφθησαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα. γονίδια υποξία ρυθμιζόμενων χωρίστηκαν σε τέσσερις κατηγορίες: τα επάνω ρυθμισμένη και κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια στο μεταφραστικό (translatome) και τα επίπεδα (μεταγραφικό) μεταγραφικό, αντίστοιχα. Διαγράμματα Venn δείχνει την επικάλυψη των γονιδίων υποξία ρυθμίζεται μεταξύ translatome και μεταγραφικό. Οι αριθμοί σε επικαλυπτόμενες περιοχές δείχνουν υποξία γονιδίων που ρυθμίζονται τόσο την μεταφραστική και μεταγραφική επίπεδα σε κύτταρα HCT116.

Η

Επικύρωση υποψηφίων γονιδίων των οποίων η μετάφραση up-ρυθμίζεται από υποξία σε κύτταρα HCT116

Για την επαλήθευση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών, πολλά υποψήφια γονίδια αναλύθηκαν από πολυσωμάτων προφίλ και ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR. Η ένωση πολυσωματικού του mRNA β-ακτίνης προφανώς μειώθηκε σε κύτταρα HCT116 εκτέθηκαν σε υποξία (σχήμα 3Α). Σε αντίθεση, τα πολυσωμάτων που σχετίζεται mRNAs των δύο μεταφραστικά και μεταγραφικά up-ρυθμιζόμενα γονίδια

GLUT1

,

ADM

, και

VEGFA

αυξήθηκαν σε κύτταρα HCT116 κατά τη διάρκεια της υποξίας, σε σύγκριση να νορμοξία (Σχήμα 3Β), δεικνύοντας ότι οι τρεις γονίδια παραμένουν μεταφράζεται αποτελεσματικά κάτω από υποξία. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν από μεταφραστικά αλλά όχι μεταγραφικώς ρυθμισμένα προς τα πάνω γονίδια

HSPA5

,

VCAN

, και

GPR126

(Σχήμα 3C). Μετά τον υπολογισμό, αυτά τα μεταφραστικά up-ρυθμιζόμενα γονίδια έδειξαν αύξηση στην μεταφραστική αποτελεσματικότητα κατά την υποξία, σε σύγκριση με τη φυσιολογική οξυγόνωση (Σχήμα 3D). Τα αποτελέσματα των πειραμάτων επικύρωσης είναι σε μεγάλο βαθμό συνεπής με τις μετρήσεις μικροσυστοιχίας. Αυτό δείχνει ότι πολλά γονίδια μπορεί να ξεφύγει από μεταφραστική καταστολή και παραμένουν μεταφράζεται αποτελεσματικά σε κύτταρα HCT116 κατά την υποξία.

Αρκετές up-ρυθμιζόμενα γονίδια στο μεταφραστικό επίπεδο (translatome) σε υποξικά κύτταρα HCT116 επικυρώθηκαν. RNA που απομονώνεται από σακχαρόζη κλασματοποίηση βαθμίδωσης αναλύθηκε με ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR. Η κατανομή των mRNAs σε κάθε κλάσμα υπολογίσθηκε και εμφανίζεται ως ποσοστό (%). Α πολυσωματικού προφίλ του β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Β πολυσωματικού προφίλ του up-ρυθμιζόμενων γονιδίων τόσο το μεταφραστικό και μεταγραφικό επίπεδο (

GLUT1

,

ADM

, και

VEGFA

). Γ πολυσωματικού προφίλ του up-ρυθμιζόμενων γονιδίων στο μεταφραστικό, αλλά δεν μεταγραφικό επίπεδο (

HSPA5

,

VCAN

, και

GPR126

). Δ Μεταγραφική αποτελεσματικότητα της β-ακτίνης, GLUT1, η ADM, VEGFA, HSPA5, VCAN και GPR126 mRNAs ήταν υπολογίζονται και εμφανίζονται ως ποσοστό (%) σε κύτταρα HCT116 υπό φυσιολογική οξυγόνωση και υποξία. ιστογράμματα δείχνουν μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα (* p & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001)

Η

ανάλυση εμπλουτισμό Διαδρομή της υποξίας. -regulated γονίδια στο μεταφραστικό επίπεδο

για να αποκτήσουν εικόνα για τις βιολογικές λειτουργίες των γονιδίων υποξίας-ρυθμίζονται, ανάλυση εμπλουτισμός της οδού έγινε με τη χρήση του DAVID Βιοπληροφορική Πόρων 6.7 του λογισμικού για χαρτογράφηση γονιδίων σε βιολογικά μονοπάτια, όπως ορίζεται από το KEGG βάση δεδομένων μονοπάτι. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υποξία οδηγεί σε μεταγραφική πάνω ρύθμιση των γονιδίων που λειτουργούν σε λυσόσωμα, γλυκάνη και το μεταβολισμό των λιπιδίων, την επεξεργασία και παρουσίαση αντιγόνων, κυτταρική προσκόλληση, και την αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας ουσίας (ECM) και του κυτταροσκελετού (Πίνακας 1). Σε αντίθεση, η υποξία ρυθμίζει προς τα κάτω τη μετάφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην απόπτωση, ουβικιτίνη πρωτεόλυση διαμεσολαβείται, και οξειδωτική φωσφορυλίωση (Πίνακας 2). Μια σημαντική λειτουργία του λυσοσώματα είναι το πεπτικό αυτοφαγία σε ευκαρυωτικά κύτταρα. Ως εκ τούτου, θεωρούμε ότι η υποξία επάγει λυσοσωμικής αυτοφαγία και μεταβολικές αναδιάταξη για να διατηρήσει την ενεργειακή ομοιόσταση μέσω ενός μεταφραστικού μηχανισμού.

Η

Η υποξία προκαλεί λυσοσωμικής αυτοφαγία και μιτοχονδριακή δυσλειτουργία μέσω μεταφραστική ρύθμιση σε κύτταρα HCT116

Έχουμε εντοπίσει 35 μεταφραστικά up-ρυθμιζόμενα γονίδια που λειτουργούν στην οδό λυσοσωμικής σε κύτταρα HCT116 εκτέθηκαν σε υποξία (Πίνακας 1). Είναι ενδιαφέρον ότι, όλα τα 35 γονίδια λυσοσωματικών ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω κατά την υποξία στο μεταφραστικό επίπεδο ανεξάρτητα μεταγραφής (Πίνακας 3). Αυτό δείχνει ότι μεταφραστική ρύθμιση μπορεί να παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην προκαλούμενη από υποξία αυτοφαγία. Τα λυσοσώματα μπορεί να ποσοτικοποιηθεί μέσω κυτταρομετρίας ροής μετά από χρώση των κυττάρων με πορτοκαλί της ακριδίνης (AO), ένα lysosomotropic ασθενούς βάσης που συσσωρεύεται εντός των όξινων φυσαλιδώδους οργανίδια των ζωντανών κυττάρων. Η ένταση φθορισμού του ΑΟ ήταν σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα HCT116 μετά από έκθεση σε υποξία για 24 ώρες (Εικόνα 4Α), υποδηλώνοντας ότι η υποξία οδηγεί σε αύξηση της περιεκτικότητας των λυσοσωμάτων. Χρησιμοποιήσαμε την επόμενη LysoTracker Red DND-99, μια φθορίζουσα χρωστική acidotropic για την επισήμανση και την παρακολούθηση όξινα οργανίδια σε ζωντανά κύτταρα, να λεκιάσουν λυσοσώματα. Τα λυσοσώματα βάφτηκαν έντονο κόκκινο σε κύτταρα HCT116 και υποξία προκαλεί διευρυμένη λυσοσώματα, σε σύγκριση με τη φυσιολογική οξυγόνωση (Σχήμα 4Β). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η υποξία αυξάνει το μέγεθος του όγκου λυσοσωματικής. Εξετάσαμε περαιτέρω την επαγωγή της αυτοφαγία παρακολουθώντας την αυτοφαγία πρωτεΐνης δείκτη ελαφριά αλυσίδα 3 (LC3) σε κύτταρα HCT116 υπό υποξία σε σύγκριση με τη φυσιολογική οξυγόνωση. Η μετατροπή της LC3-Ι-ΙΙ LC3 και την υποβάθμιση της συνολικής LC3 (LC3-Ι συν LC3-ΙΙ) χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιορισθούν οι μεταβολές στην έκταση της autophagy [41]. Η ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως έδειξε ότι LC3-Ι LC3-ΙΙ μετατροπής (LC3-II /αναλογία LC3-I) αυξήθηκε και το συνολικό ποσό της LC3 μειώθηκε σε κύτταρα HCT116 εκτέθηκαν σε υποξία για 24 ώρες και 48 ώρες (Σχήμα 4C, αριστερό πάνελ ), προτείνοντας υποξία προκαλούμενη αυτοφαγία. Διαπιστώσαμε επίσης την ρ62 πρωτεΐνη δείκτη αυτοφαγία, η οποία αποικοδομείται κατά την διάρκεια autophagy [41]. Σταθερά, η ποσότητα του ρ62 έδειξε επίσης μια αξιοσημείωτη μείωση σε υποξικά HCT116 κύτταρα (σχήμα 4Γ, δεξί πάνελ). Για την επαλήθευση υποξία προκαλούμενη μεταφραστική πάνω ρύθμιση λυσοσωματικών πρωτεϊνών (Πίνακας 3), ανιχνεύσαμε τα επίπεδα τόσο η πρωτεΐνη και mRNA των γονιδίων λυσοσωματικών γλυκοζαμίνης (Ν-ακετυλ) -6-σουλφατάση (

GNS

), προσαποσίνη (

PSAP

), και τριπεπτιδυλική πεπτιδάσης 1 (

TPP1

). Μετά από έκθεση σε υποξία για 24 ώρες, το επίπεδο της GNS και πρωτεϊνών PSAP αυξήθηκε κατά ~ 2-φορές σε σύγκριση με τη φυσιολογική οξυγόνωση (Σχήμα 5Α). Το επίπεδο της TPP1 πρωτεΐνης επίσης ελαφρώς αυξήθηκε κατά τη διάρκεια της υποξίας. Μια ποσοτική ανάλυση έδειξε ότι τα επίπεδα του mRNA της GNS, PSAP, και TPP1 δεν επηρεάζονται σημαντικά από την υποξία (Σχήμα 5Α). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η υποξία εμπλουτίζει λυσοσωμικών πρωτεϊνών μέσω μεταφραστικών μηχανισμών.

Η

Α. κύτταρα HCT116 αναπτύχθηκαν υπό φυσιολογική οξυγόνωση (21% O

2) ή υποξία (1% O

2) για 24 ώρες. Τα κύτταρα βάφτηκαν με πορτοκαλί της ακριδίνης (AO) και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής για τη μέτρηση της περιεκτικότητας των λυσοσωμάτων. Γραφήματα ράβδων δείχνουν μέση ένταση φθορισμού του ΑΟ από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα (** ρ & lt? 0,01). κύτταρα Β HCT116 αναπτύχθηκαν υπό φυσιολογική οξυγόνωση (21% O

2) ή υποξία (1% O

2) για 24 ώρες. Τα λυσοσώματα σημάνθηκαν με LysoTracker Red DND-99 για 1 ώρα σε ζωντανά κύτταρα και παρατηρήθηκαν με ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού. κύτταρα C. HCT116 εκτέθηκαν σε υποξία (H) ή νορμοξία (Ν) για 24 ώρες και 48 ώρες. Σύνολο κυτταρικά εκχυλίσματα αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση με LC3 και αντισώματα β-ακτίνης (αριστερό πάνελ). Οι ζώνες LC3-Ι και LC3-ΙΙ προσδιορίστηκαν ποσοτικά, και autophagy μετρήθηκε με μεταβολές στην αναλογία LC3-II /LC3-Ι και το συνολικό ποσό της LC3 (LC3-Ι συν LC3-ΙΙ) ομαλοποιηθούν σε β-ακτίνη για κάθε κατάσταση. Γραφήματα ράβδων δείχνουν επίπεδο πρωτεΐνης σε σχέση LC3 κανονικοποιημένη σε β-ακτίνη από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα (** ρ & lt? 0,01). Τα παραπάνω δείγματα αναλύθηκαν επίσης με ανοσοκηλίδωση με ρ62 και αντισώματα α-τουμπουλίνης (δεξί πάνελ).