Αφηρημένο

Η γονιδιακή έκφραση ρυθμίζεται στο επίπεδο της μεταγραφής και μετάφρασης? Έτσι, οι δύο μεταγραφικών παραγόντων (ΤΡ) και microRNAs (miRNA) παίζουν ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Αυτή η μελέτη κατατομής εκφράζονται διαφορικά mRNAs και miRNAs σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς να κατασκευάσει ένα TF και miRNA κοινού ρύθμισης δικτύου προκειμένου να εντοπιστούν τροποποιημένα γονίδια σε γαστρικό εξέλιξης του καρκίνου. Ένα σύνολο 70 περιπτώσεων γαστρικού καρκίνου και αντιστοιχισμένο παρακείμενων φυσιολογικών ιστών υποβλήθηκαν σε cDNA και αναλύσεις miRNA μικροσυστοιχιών. Λάβαμε 887 επάνω ρυθμισμένη και 93 κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια και 41 ρυθμισμένα προς τα κάτω και 4 πάνω ρυθμισμένα miRNAs σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς. Χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων μεταγραφικό ρυθμιστικό στοιχείο, λάβαμε 105 γονίδια που ρυθμίζονται από την E2F οικογένειας γονιδίων και χρησιμοποιώντας Targetscan, Miranda, miRDB και miRWalk εργαλεία, είχαμε προβλέψει πιθανά γονίδια στόχευση αυτών των 45 miRNAs. Στη συνέχεια δημιουργήθηκε το E2F σχετίζονται TF και συν-ρυθμιστικών δικτύων γονιδίων miRNA και προσδιορίζονται 9 hub-γονίδια. Επιπλέον, βρήκαμε ότι τα επίπεδα του E2F1, 2, 3, 4, 5, και 7 mRNAs που σχετίζονται με γαστρικό ικανότητα εισβολής των καρκινικών κυττάρων, και έχει συσχετίσει με τη διαφοροποίηση του όγκου. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν υπερέκφραση της E2F mRNAs που σχετίζονται με γαστρικό εξέλιξης του καρκίνου

Παράθεση:. Zhang X, Ni Ζ, Duan Z, Xin Ζ, Wang Η, Tan J, et al. (2015) Η υπερέκφραση της E2F mRNAs συνδεδεμένων με γαστρικός καρκίνος Εξέλιξη προσδιορίζονται από την μεταγραφή Factor και miRNA Co-Ρυθμιστική Ανάλυση Δικτύων. PLoS ONE 10 (2): e0116979. doi: 10.1371 /journal.pone.0116979

Ελήφθη: 30 Σεπτεμβρίου του 2014? Αποδεκτές: 17 Δεκεμβρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 3, Φεβρουαρίου, 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και. Τα στοιχεία έχουν κατατεθεί στη βάση δεδομένων GEO, κάτω από τον αριθμό GSE63089

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από τις επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (# 81320108025 και # 81472662), Ίδρυμα της επαρχίας Jilin Τμήμα επιστήμης και Τεχνολογίας (# 20130522013JH και # 20140414048GH) και ο Norman Bethune Πρόγραμμα του Πανεπιστημίου Jilin (# 2012219). Οι συγγραφείς επίσης να ευχαριστήσω τον Medjaden Bioscience Limited (Χονγκ Κονγκ, Κίνα) για την επεξεργασία και επιμέλεια αυτό το χειρόγραφο. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

γαστρικού καρκίνου εξακολουθεί να είναι ένα από τα σημαντικότερα προβλήματα υγείας στις αναπτυσσόμενες χώρες, όπως στην Κίνα, αν και η επίδρασή του σταδιακά μειώνεται στις δυτικές χώρες. Συνολικά, γαστρικό καρκίνο είναι λογαριασμούς για την τέταρτη πρόσπτωσης και η δεύτερη των ποσοστών θνησιμότητας μεταξύ όλων των καρκίνων στον κόσμο [1-3]. Γαστρικό παράγοντες κινδύνου καρκίνου περιλαμβάνουν μόλυνση Helicobacter pylori, η συχνή κατανάλωση καπνιστά τρόφιμα, παστά ψάρια και το κρέας, και λαχανικά τουρσί, ο καπνός, η παχυσαρκία, ή χρόνια γαστρίτιδα. Αυτοί οι παράγοντες κινδύνου θα μπορούσαν να συντονίσουν να χειραγωγήσουν την έκφραση του γονιδίου ή μετάλλαξη ή επιγενετικές αλλοιώσεις και τελικά να οδηγήσει σε γαστρική την ανάπτυξη του καρκίνου. Μέχρι σήμερα, ένας μεγάλος όγκος γνώσεων έχει συσσωρευτεί σχετικά με τις μοριακές μεταβολές που συνδέονται με καρκίνο του στομάχου, όπως ARID1A, ΤΡ53 [4], PTGER4, PRKAA1, ZBTB20 [5] και PLCE1 [6]. Ωστόσο, ο υποκείμενος μηχανισμός για διαφορετικά γονίδια με μεσολάβηση γαστρική καρκινογένεση παραμένει να καθοριστεί. Έτσι, είναι σημαντικό να διερευνηθεί περαιτέρω μοριακή παθογένεση του καρκίνου του στομάχου με τη χρήση της συστηματικής προσέγγισης βιολογίας, όπως η κατασκευή του διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων δικτύου ρυθμιστικών να προσδιορίσει το σημαντικό γονίδιο μονοπάτι σηματοδότησης ή κατά τη διάρκεια της γαστρικής ανάπτυξη ή την πρόοδο του καρκίνου.

η γονιδιακή έκφραση ρυθμίζεται στα επίπεδα μεταγραφής και μετάφρασης. Στο επίπεδο μεταγραφής, παράγοντες μεταγραφής του γονιδίου (ΤΡ) διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης ανθρώπινου γονιδίου, ενώ miRNA θα μπορούσαν κατά το επίπεδο μετα-μεταγραφής ρυθμίζουν mRNA μετάφρασης και ημίσειας ζωής. Συγκεκριμένα, ΤΡ είναι πρωτεΐνες που δεσμεύονται με ειδικές αλληλουχίες DNA και με τον τρόπο αυτό τον έλεγχο της γονιδιακής μεταγραφής. MiRNA είναι μια κατηγορία φυσικώς απαντώμενων μικρών μη κωδικοποιητική RNA με 18 έως 22 νουκλεοτίδια σε μήκος και λειτουργικά, miRNA μπορεί μετα-μεταγραφικά έκφραση πρωτεΐνης σιωπή με δέσμευση σε συμπληρωματικές μεταγραφές γονιδίου στόχου, υποβαθμίζοντας έτσι αυτές τις αγγελιοφόρων RNA ή αναστέλλοντας τους από μεταφράζεται σε πρωτεΐνες. Έτσι, και οι δύο TFs και miRNAs μπορούν να ρυθμίζουν τα γονίδια σε διαφορετικά στάδια της γονιδιακής έκφρασης και μπορεί να σχηματίσει ένα βρόγχο ανάδρασης και ένα πολύπλοκο δίκτυο ρυθμιστικών να σφιχτά έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης. Σε αυτό το πλαίσιο, η μελέτη αυτού του κανονιστικού δικτύου γονίδιο θα μπορούσε να μας βοηθήσει να κατανοήσουμε την ομοιόσταση των κυττάρων και φυσιολογική διαδικασία, η βιολογική λειτουργία, και το μηχανισμό των ασθενειών. Μέχρι σήμερα, ένας αριθμός μελετών έχουν δείξει γονιδιακή ρύθμιση των ΤΡ και miRNA σε γαστρικό καρκίνο, όπως πυρηνικό παράγοντα κάππα Β [7], FOXM1 [8], που προκαλείται από υποξαιμία παράγοντα 1 [9], και miR-7 [10] , miR-375 [11], miR-125b, miR-199α, miR-100 [12]. Πράγματι, παρεκκλίνουσα miRNA ή έκφραση TF συμβάλλει στην ανθρώπινη καρκινογένεση [13]. Ως εκ τούτου, σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε το ρόλο των συνδυασμένων miRNA και μεταγραφή παράγοντες στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης σε καρκίνο του στομάχου για σύνδεση με γαστρικό εξέλιξη του καρκίνου. Διαπιστώσαμε πρώτη διαφορική έκφραση των γονιδίων και miRNAs σε δείγματα γαστρικού καρκίνου ιστού και τους ανέλυσε bioinformatically να σχηματίσουν το ρυθμιστικό δίκτυο TF-miRNA να συσχετίσει την έκφραση της E2F οικογένειας mRNAs σε γαστρικό καρκίνο. Στη συνέχεια επιβεβαίωσε E2F έκφρασης για σύνδεση με γαστρικό εξέλιξη του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και δείγματα ιστών

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Σχολής Βασικών Ιατρικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο Jilin και κάθε ασθενής είχε συναινέσει σε γραπτή έντυπο συγκατάθεσης. Μετά από αυτό, θα είναι εγγεγραμμένοι 70 ασθενείς με καρκίνο του στομάχου από το Πανεπιστήμιο Jilin (Changchun, Κίνα) από τον Απρίλιο του 2012 και Οκτωβρίου 2014 Όλοι οι ασθενείς είχαν λάβει καμία θεραπεία προ-χειρουργική επέμβαση, όπως η χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία. Και οι δύο όγκων και μακρινό φυσιολογικούς ιστούς ελήφθησαν από την αίθουσα λειτουργία και αποθηκεύεται σε υγρό άζωτο εντός 10 λεπτών.

απομόνωση RNA και παρασκευή miRNA

Το συνολικό κυτταρικό RNA απομονώθηκε από δείγματα ιστού χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και στη συνέχεια καθαρίζεται περαιτέρω χρησιμοποιώντας ένα RNeasy Mini kit (Qiagen, Düsseldorf, Γερμανία). Η συγκέντρωση του RNA προσδιορίστηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας το Epoch Multi-όγκου Σύστημα Φασματοφωτόμετρο (BioTek, Βερμόντ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Μετά από αυτό, miRNA απομονώθηκε από αυτά τα δείγματα RNA χρησιμοποιώντας το mirVana miRNA Κιτ απομόνωσης (Ambion, Austin, TX, USA).

εξόνιο ανάλυση μικροσυστοιχιών

Στη μελέτη αυτή, η πρώτη μας προφίλ γονιδιακής έκφρασης μεταξύ 45 και γαστρικό καρκίνο ζευγαρωμένα δείγματα παρακείμενο φυσιολογικό ιστό χρησιμοποιώντας την Affymatrix Gene Chip εξόνιο Arrays 1.0 ST (Affymatrix, CA, USA). Συγκεκριμένα, 1 μg δείγμα ΚΝΑ αντίστροφα μεταγράφηκε σε cDNA και αυτά τα δείγματα cDNA στη συνέχεια υπέστησαν πέψη σε θραύσματα cDNA με ενδονουκλεάσες και επισημαίνονται με το αντιδραστήριο σήμανσης DNA χρησιμοποιώντας DNA Labeling Kit (Affymatrix, CA, USA). Τα επισημασμένα πρότυπα cDNA χρησιμοποιήθηκαν ως ανιχνευτές για να υβριδοποιούνται προς το Affymatrix Gene Chip εξόνιο Arrays 1,0 ST σε μία κατάσταση 45 ° C επώαση και την περιστροφή σε 60 στροφές ανά λεπτό για 17 ώρες. Μετά από αυτό, οι συστοιχίες πλύθηκαν και σαρώνονται χρησιμοποιώντας Gene Chip Scanner 3000 με τον Gene Chip Λογισμικό Λειτουργικό (GCOS).

Mirna ανάλυση μικροσυστοιχιών

προφίλ και τα διαφορικά εκφρασμένων miRNAs σε 15 γαστρικό καρκίνο και ζεύγη παρακείμενο φυσιολογικό δείγματα ιστών με τη χρήση συστοιχίας Affymatrix Gene Chip microRNA. Παρόμοια με τα πειράματα μικροσυστοιχιών cDNA, οι ανιχνευτές miRNA χρησιμοποιώντας RNA Labeling Kit (Affymatrix, CA, USA) υβριδοποιήθηκαν σε συστοιχία Affymatrix Gene Chip microRNA στους 45 ° C και περιστράφηκε στις 60 rpm για 17 ώρες. Μετά από αυτό, οι συστοιχίες σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας GCOS.

Microarray ανάλυση δεδομένων

Τα ακατέργαστα δεδομένα μικροσυστοιχιών αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας αλγόριθμο Limma για τον προσδιορισμό των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων και miRNAs και στη συνέχεια αναλύθηκαν με τη χρήση των γραμμικών μοντέλων και εμπειρικές μεθόδους Bayes. Ένα

t-test

και διόρθωση Bonferroni χρησιμοποιήθηκαν για την εκτίμηση της στατιστικής σημασίας της κάθε διαφορικής έκφρασης. Γονίδια και miRNA θεωρήθηκαν σημαντικά διαφορικά εκφρασμένων εάν

p-τιμές

& lt? 0.05 και γονιδιακή έκφραση έδειξαν τουλάχιστον 1,5 φορές αλλαγές μεταξύ του καρκίνου και των φυσιολογικών ιστών τους. QUBIC πρόγραμμα (Ποιοτική BI-Clustering) χρησιμοποιήθηκε για να συγκεντρωθούν, να αναλύσει διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων. Η βασική ιδέα του αλγορίθμου είναι η εύρεση όλες τις υποομάδες των γονιδίων με παρόμοια πρότυπα έκφρασης μεταξύ ορισμένων υποσυνόλων των ιστών του καρκίνου, και ως εκ τούτου τα γονίδια που εμπλέκονται σε κάθε τέτοιο πρότυπο μπορεί πιθανώς να χρησιμοποιηθεί ως υπογραφές για τον καρκίνο του υπο-πληκτρολόγηση ή στάσης. Για την ανάλυση bi-cluster μας, έχουμε χρησιμοποιήσει τις ακόλουθες παραμέτρους: r = 1, q = 0,06, c = 0,95, o = 100, f = 1 [14,15]. Βάση δεδομένων για το σχολιασμό, την απεικόνιση και την Ολοκληρωμένη Discovery (David) και του Κιότο Εγκυκλοπαίδεια γονιδίων και γονιδιωμάτων (KEGG) εργαλεία που χρησιμοποιούνται για τη λειτουργική ανάλυση και ταξινόμηση μονοπάτι αυτών των διαφορετικών γονιδίων.

qRT-PCR

Ολικό κυτταρικό RNA από καρκινικό και φυσιολογικό γαστρικό ιστοί αντίστροφα μεταγράφονται σε cDNA χρησιμοποιώντας 1

st κλώνου cDNA Synthsis Kit (Takara, Dalian, Κίνα) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Έκφραση των E2F1, E2F2, και E2F4) mRNA αναλύθηκε σε 10 γαστρικό καρκίνο και αντιστοιχισμένο γειτονικό φυσιολογικό δείγματα ιστών από την Q-PCR χρησιμοποιώντας SYBR Πρόμιγμα Εχ Taq (Takara) και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Οι εκκινητές που παρατίθενται στον Πίνακα 1. Τα στοιχεία qPCR ήταν για ποσοτικά με τη χρήση 2 μεθόδους

ΔΔCt.

Η

Η κατασκευή του TF-miRNA από κοινού ρύθμισης δικτύου

Μετά μικροσυστοιχιών ανάλυση των δεδομένων, που ελήφθησαν TFs και τις λανθάνουσες γονιδίων-στόχων που ρυθμίζονται από την οικογένεια E2F μέσω της αναζήτησης των μεταγραφικό ρυθμιστικό στοιχείο βάσης δεδομένων (TRED). Επιπλέον, τα miRNAs στοχεύουν E2F οικογένειας προσδιορίστηκε βάσεις δεδομένων πρόβλεψη τέσσερις στόχους, βάση δεδομένων δηλαδή, Targetscan, Miranda, miRDB και miRWalk [16-18]. Εμείς στη συνέχεια συνδυάζονται αυτά τα διαφορική εκφράζονται τα γονίδια και miRNAs να κατασκευάσει αυτό το συν-ρυθμιστικών δίκτυο TF-miRNA που σχετίζονται με την οικογένεια E2F χρησιμοποιώντας το λογισμικό Cytoscape. Στο συν-ρυθμιστικών δίκτυο TF-miRNA, ορίσαμε κόμβο ως ένα γονίδιο διανομέα ή miRNA όταν συνδέονται άμεσα με περισσότερες από δύο συνολικών κόμβων στο δίκτυο.

Ανάλυση της E2F οικογένειας mRNAs σύνδεσης με την κλινική παθολογική χαρακτηριστικά από ασθενείς με καρκίνο του στομάχου

Χρήση του λειτουργικού χαρακτηριστικού δέκτη (ROC) καμπύλη, αναλύσαμε διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων που ρυθμίζονται από τον E2F mRNAs μεταξύ καρκίνο του στομάχου και σε συνδυασμό παρακείμενο φυσιολογικό γονίδιο ιστούς. Στη συνέχεια επιλέγονται και διακρίνονται τα καλύτερα συμφωνημένα γονίδια για σύνδεση με κλινική παθολογική χαρακτηριστικά χρησιμοποιώντας τη δυαδική ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης.

Η στατιστική ανάλυση

Η καμπύλη ROC και δυαδική λογιστική ανάλυση παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκαν για διαφορικά εκφρασμένα γονίδια που ρυθμίζονται από τον E2F mRNAs μεταξύ καρκίνο του στομάχου και σε συνδυασμό παρακείμενων φυσιολογικών ιστών. Η μονόδρομη ANOVA χρησιμοποιήθηκε για να συνδέσει μεταξύ E2F οικογένειας και ο βαθμός της εισβολής καρκινικών κυττάρων. λογισμικό GraphPad Prism 6 διεξήχθη για να ληφθεί καμπύλη ROC και τον υπολογισμό της ευαισθησίας, ειδικότητας και περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC). SPSS 18.0 λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για One-way ANOVA και δυαδική λογιστική ανάλυση παλινδρόμησης. Μία τιμή ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Ανίχνευση των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων και miRNAs μεταξύ καρκίνου του στομάχου και των αντίστοιχων φυσιολογικών ιστών τους

πρώτα εκτελεστούν. η ανάλυση Affymatrix εξόνιο Arrays να ανιχνεύσει διαφορικά εκφρασμένα γονίδια μεταξύ γαστρικού καρκίνου και αντιστοιχισμένο παρακείμενο φυσιολογικό ιστό σε 45 ασθενείς (τα δεδομένα των ασθενών φαίνεται στον πίνακα S1). Το GEO σύνολα δεδομένων NCBI αριθμό προσχώρησης της μελέτης αυτής ήταν GSE63089. Χρησιμοποιώντας & gt? 1,5 φορές αλλαγές ως-off-τιμή αποκοπής, εντοπίσαμε 887 έως ρυθμιζόμενα και 93 κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια (S2 Πίνακας). Λειτουργική ανάλυση έδειξε ότι αυτά τα γονίδια απόκλιση σχηματίστηκε κυρίως μονοπατιών γονιδίου, όπως ο έλεγχος του κυτταρικού κύκλου, μονοπάτι σηματοδότησης ρ53, οδός καρκίνος, η αλληλεπίδραση εξωκυτταρική μήτρα-υποδοχέα, κυτταρικής προσκόλλησης, γλυκόλυση /γλυκονεογένεση, και την αλληλεπίδραση υποδοχέα κυτοκίνης (Εικ. 1). μελών της E2F οικογένειας παίζουν σημαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια G1 του κυτταρικού κύκλου /S μετάβαση σε κύτταρα και η γονιδιακή έκφραση του E2F1, 2, 3, 4, 5, και 7 βρέθηκαν όλα να είναι υπερέκφραση (ρ & lt? 0,01) σε γαστρικό καρκίνο σε αυτό μελέτη

Ένα, Gene ανάλυση οντολογία.? Β, KEGG ανάλυση.

Η

Στη συνέχεια, θα πραγματοποιηθεί επίσης την ανάλυση της σειράς Affymatrix Gene Chip microRNA σε 15 περιπτώσεις καρκίνου του στομάχου και σε συνδυασμό παρακείμενων φυσιολογικών ιστών (Τα δεδομένα των ασθενών φαίνονται στον Πίνακα S1). Το GEO σύνολα δεδομένων NCBI αριθμό προσχώρησης της μελέτης αυτής ήταν GSE63121. Βρήκαμε 41 κάτω-ρυθμίζονται και 4 up-ρυθμίζονται miRNAs (S3 Πίνακας). Σύκο. 2 απεικονίζεται η ανάλυση διασποράς bi-clusters αυτών των 45 διαφορική miRNAs σε καρκίνο του στομάχου εναντίον φυσιολογικούς ιστούς. Λειτουργικά, αυτά τα διαφορικά εκφρασμένων miRNAs θα μπορούσε να ρυθμίσει διαφορετικές οδούς γονίδιο, όπως δραστηριότητα ενεργοποιητής της μεταγραφής, η δέσμευση του DNA, η δραστηριότητα του παράγοντα μεταγραφής, μετα μεταγραφική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, και G1 /S μετάβαση της μιτωτικής κυτταρικού κύκλου.

Κάθε σειρά αντιπροσωπεύει μια miRNA και κάθε στήλη αντιπροσωπεύει ένα δείγμα. Οι «C» στήλες στο κάτω μέρος αντιπροσωπεύουν καρκινικούς ιστούς, ενώ το «Ν» αντιπροσωπεύει φυσιολογικούς ιστούς. Κόκκινο σημαίνει υψηλή έκφραση σε καρκίνο σε σύγκριση με το φυσιολογικό ιστό, ενώ το πράσινο για χαμηλή έκφραση σε καρκίνο σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς.

Η

Building-up και ανάλυση της E2F οικογένειας που σχετίζονται με TF-miRNA συν-ρυθμιστικών δίκτυο

για να εμφανίσετε την οικογένεια που σχετίζονται με TF-miRNA από κοινού ρύθμισης δικτύου E2F, χρησιμοποιήσαμε TRED να ρωτήσετε TF και λανθάνουσα γονιδίων στόχων ρυθμίζεται από E2F οικογένειας και στη συνέχεια να επιλεγεί η διαφορικά εκφρασμένων ΤΡ και λανθάνουσα γονιδίων-στόχων σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς. Βρήκαμε συνολικά 105 ΤΡ και λανθάνουσας γονίδια στόχους που θα μπορούσαν δυνητικά ρυθμίζεται από E2F οικογένειας στο γαστρικό καρκίνο (5 ρυθμίζεται προς τα κάτω και 100 ρυθμισμένα προς τα πάνω γονίδια? Βλέπε Πίνακα S4), η οποία θα μπορούσε να σχηματίσει ένα δίκτυο 105 γονίδιο μετά την δι- συστάδες σύμπλεγμα ανάλυση (Εικ. 3) Η ανάλυση έδειξε DAVID αυτά τα 105 γονίδια είναι πιο γονίδια συνδέονται με τον κύκλο των κυττάρων (Εικ. 4).

κάθε σειρά αντιπροσωπεύει μια miRNA και κάθε στήλη αντιπροσωπεύει ένα δείγμα. Οι «C» στήλες στο κάτω μέρος αντιπροσωπεύουν καρκινικούς ιστούς, ενώ το «Ν» αντιπροσωπεύει φυσιολογικούς ιστούς. Κόκκινο σημαίνει υψηλή έκφραση σε καρκίνο συγκριτικά με φυσιολογικό ιστό, ενώ τα πράσινα για χαμηλή έκφραση σε καρκίνο σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς

Η

Α, ανάλυση Gene οντολογία.? Β, KEGG ανάλυση.

Η

Στη συνέχεια, θα χρησιμοποιηθεί online εργαλεία Targetscan, Miranda, miRDB και τη βάση δεδομένων miRWalk να προβλέψουμε πιθανά γονίδια στόχευση αυτών των 45 miRNA και στη συνέχεια συγχωνεύθηκαν αυτά τα γονίδια που στοχεύουν με αυτά τα 105 διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων. Βρήκαμε 7 κάτω ρυθμιζόμενα και 2 up-ρυθμίζονται miRNAs (S3 Πίνακας). Μετά από αυτό, έχουμε δημιουργήσει το E2F σχετίζονται TF-miRNA κανονιστικού δικτύου (Εικ. 5).

Το δίκτυο αυτό περιλαμβάνει 105 διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων και 9 διαφορικά εκφρασμένων miRNAs. Μπλε κύκλοι εκφράζονται διαφορικά γονίδια και τα κόκκινα διαμάντια εκφράζονται διαφορετικά miRNAs. Τα κίτρινα ρόμβους είναι TFs και το μέγεθός του αντιπροσωπεύει τον αριθμό των γονιδίων στόχων. Η κατεύθυνση του βέλους είναι από την πηγή στον στόχο.

Η

Μετά από αυτό, αναλύσαμε αυτό E2F που σχετίζονται με ρυθμιστικό δίκτυο TF-miRNA και διαπίστωσε ότι E2F1, E2F2 και E2F4 στην οικογένεια E2F διαδραματίσει σημαντικό ρόλο σε αυτό το TF και miRNA κοινού ρύθμισης δικτύου. Τρεις υπερβολικές ρυθμίσεις mRNAs (E2F1, E2F2 και E2F4) από τα διαφορικά εκφρασμένων mRNAs επικυρώθηκαν με τη χρήση πραγματικού χρόνου PCR (RT-PCR). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι E2F1, E2F2 και E2F4 είχαν υπερβολικής νομικής ρύθμισης στα γαστρικά δείγματα καρκίνου, σε σύγκριση με τα κανονικά δείγματα. Τα αποτελέσματα RT-PCR και τα δεδομένα των μικροσυστοιχιών είναι συνεπή (ρ & lt? 0,05, Εικ. 6). Επιπλέον, προσδιορίσαμε 9 hub-γονιδίων από E2F-σχετικές κανονιστικές δίκτυο TF-miRNA, η οποία μπορεί να συν-ρυθμίζονται από την TFS (Εικ. 7). Η ανάλυση αυτών των DAVID 9 γονιδίων πλήμνη και λειτουργιών παρουσιάζεται στον Πίνακα 2.

Η γονιδιακή έκφραση αναλύθηκε σε 10 ζεύγη γαστρικά καρκινικά και φυσιολογικούς ιστούς και σε σύγκριση με τα αποτελέσματα μικροσυστοιχιών. Οι στήλες στον πίνακα αντιπροσωπεύουν τις log-μετασχηματιστεί μέση αλλαγές φορές (καρκίνος /ελέγχου) στην έκφραση σε δέκα δείγματα (p & lt? 0,05).

Η

Κύκλοι είναι γονίδια κόμβο που συν-ρυθμίζονται από την TFS και miRNAs , ενώ τα κόκκινα διαμάντια είναι διαφορικά εκφρασμένων miRNAs. Τα κίτρινα ρόμβους είναι TFs και το μέγεθός του αντιπροσωπεύει τον αριθμό των γονιδίων στόχων. Η κατεύθυνση του βέλους είναι από την πηγή στον στόχο.

Η

Σύλλογος των επιπέδων mRNA E2F οικογένειας με κλινική παθολογική χαρακτηριστικά από ασθενείς με καρκίνο του στομάχου

αναλύονται περαιτέρω έκφραση της E2F mRNAs και στη συνέχεια να σχετίζονται με την κλινική παθολογική χαρακτηριστικά από ασθενείς με καρκίνο του στομάχου. Η ανάλυση καμπύλες ROC έδειξε ότι E2F1, 2, 3, 4, 5, και 7 μπορούν να είναι οι λανθάνουσες στόχοι για τη διάκριση γαστρικό καρκινικό ιστό και τα κανονικά (Εικ. 8). Συνδυασμός διαφόρων E2F οικογένειας mRNAs μπορεί να βελτιώσει περαιτέρω την ειδικότητα και ευαισθησία της διακρίσεως τους μεταξύ γαστρικού καρκίνου και κανονικούς ιστούς μετά την υποχώρηση του δυαδικού παλινδρόμηση (Εικ. 8). Επιπλέον, βρήκαμε επίπεδο του E2F1, 2, 3, 4, 5, και 7 mRNA που σχετίζεται με το βάθος του γαστρικού εισβολής καρκίνου (Εικ. 9). Έχουμε, επίσης, διαπίστωσε ότι η E2F έκφραση έχει συνδέονται με τη διαφοροποίηση του όγκου (Εικ. 10)

AUC, περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC.? Όλα δείχνουν το συνδυασμό των E2F1, E2F2, E2F3, E2F4, E2F5, και E2F7.

Η

μικροσυστοιχιών δεδομένα από 45 γαστρικό περιπτώσεις καρκίνου χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση συσχέτιση μεταξύ της E2F οικογένειας και του γαστρικού καρκίνου εισβολή. Γαστρικό εισβολή καρκίνου που αναφέρεται στη Διεθνή Ένωση κατά του Καρκίνου (UICC) σύστημα TNM στάσης. Τ1, όγκου εισβάλλει lamina propria, μυϊκού χιτώνα του βλεννογόνου, ή υποβλεννογόνιο χιτώνα? Τ2, όγκου εισβάλλει muscularispropria? Τ3, Tumor διεισδύει υπορρογόνια συνδετικού ιστού, χωρίς την εισβολή του σπλαχνικού περιτοναίου ή παρακείμενες δομές? Τ4, όγκου εισβάλλει ορογόνο (σπλαχνικό περιτόναιο) ή παρακείμενες δομές.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε ένα cut-off τιμή του 1,5 φορές αλλαγή στο προφίλ διαφορικά εκφράζεται mRNAs και miRNAs στο γαστρικό καρκινικούς ιστούς, η οποία είναι συνεπής με τα περισσότερα από προηγούμενη μελέτη του cDNA ή μικροσυστοιχιών miRNA [19]. Αυτά τα διαφορικά εκφρασμένων mRNAs και miRNAs στο γαστρικό καρκινικούς ιστούς ήταν ως επί το πλείστον σχετίζονται με την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, ιδιαίτερα E2F οικογένειας. Μέχρι σήμερα, τα μέλη των πρωτεϊνών E2F περιλαμβάνουν E2F1- E2F8 και μεταξύ τους, E2F1, 2, 3, 4, 5, και 7 οι πρωτεΐνες ήταν όλα σημαντικά υπερεκφράζεται σε καρκίνο του στομάχου στην παρούσα μελέτη. Έτσι, είχαμε προβλέψει ότι η οικογένειά E2F έχει σημαντικές ρυθμιστικές λειτουργίες σε καρκίνο του στομάχου. Έτσι, κατασκευάσαμε αυτό το E2F σχετίζονται TF-miRNA από κοινού ρύθμισης δικτύου για καρκίνο του στομάχου με βάση τα δεδομένα μικροσυστοιχιών προφίλ μας. Το δίκτυο αυτό περιλαμβάνει 105 TFs και οργανωμένη λανθάνουσα γονιδίων-στόχων τους (5 κάτω-ρυθμίζονται και 100 up-ρυθμιζόμενα γονίδια) που σχετίζονται με την οικογένεια E2F και 9 απόκλιση miRNAs (7 κάτω ρυθμιζόμενα και 2 up-ρυθμίζονται miRNAs) (Εικ. 5) . Με άλλα λόγια, η E2F οικογένειας γονιδίων θα μπορούσαν να δράσουν επί αυτών των 105 γονιδίων και 9 miRNAs να ρυθμίζουν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου του γαστρικού καρκίνου. Πράγματι, βρήκαμε ότι τα γονίδια-στόχους που ρυθμίζονται από E2F1 και E2F4 εμφανίστηκε ποσότητες της διαφορικής έκφρασης σε καρκίνο του στομάχου, γεγονός που δείχνει ότι E2F1 και E2F4 είναι πολύ πιθανόν να καταλάβει ένα σημαντικό μερίδιο στην ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου. Επιπλέον, miRNAs εκφράζονται διαφορικά σε καρκίνο του στομάχου ήταν σε θέση να ρυθμίζουν την έκφραση του E2F1, E2F2, E2F5 και E2F7, υποδεικνύοντας ότι miRNAs-αλλοιωμένη έκφραση των πρωτεϊνών E2Fs είναι σημαντικοί παράγοντες σε γαστρικό ανάπτυξη ή την πρόοδο του καρκίνου.

Πράγματι, E2F τα μέλη της οικογένειας παίζουν σημαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου μετάβαση G1 /S σε κύτταρα και αλλαγμένη έκφραση τους συνέβαλαν έναν αριθμό ανθρώπινων ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [20]. Για παράδειγμα, κατά τη διάρκεια της γαστρικής ανάπτυξη και την εξέλιξη του καρκίνου, τα καρκινικά κύτταρα θα προάγουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, αλλά αναστέλλουν την απόπτωση. Στο επίπεδο του γονιδίου, του μεταγραφικού παράγοντα E2F οικογένειας γονιδίων παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου διαδικασία προωθώντας την έγκαιρη έκφραση των γονιδίων που απαιτούνται για τη σύνθεση του DNA κατά τη μετάβαση φάσης G1 /S. ίδια η E2F δραστηριότητα ελέγχεται από πρωτεΐνη ρετινοβλαστώματος (RB) και οι ρ107 pocket πρωτεΐνες και ρ130. Μέχρι σήμερα, τα μέλη σε E2F πρωτεΐνες είναι E2F1-E2F8, συμπεριλαμβανομένης της μεταγραφής-ενεργοποιημένων παραγόντων E2F1-3a, οι οποίες ρυθμίζουν κυρίως μετάβαση του κυτταρικού κύκλου από G0 προς την φάση S, και η μεταγραφή ανέστειλε παράγοντες E2F3b-E2F8, τα οποία εκφράζονται σε αδρανή ή διαφοροποιημένα κύτταρα και εμποδίζουν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [21]. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η τροποποιημένη έκφραση της E2F οικογένειας γονιδίων ήταν στενά συνδεδεμένη με την ανάπτυξη του καρκίνου του μαστού [22], τον καρκίνο των ωοθηκών [23], καρκίνος της ουροδόχου κύστης [24], του παχέος εντέρου και του καρκίνου του παγκρέατος. [25] Σε γαστρικό καρκίνο, προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η E2F ήταν ασυνήθιστα εκφράζεται και E2F έκφραση ρυθμίζεται από miRNAs συνδέθηκε με την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης καταστολή του γαστρικού καρκινικά κύτταρα για την καταστολή της ΤΟΡβ ογκοκατασταλτικά μονοπάτι [26]. E2F γονιδιακή μετάλλαξη είναι επίσης μια από τις αιτίες της πρόωρης γαστρικού εμφάνισης καρκίνου [27]. Τα τρέχοντα δεδομένα μας υποστήριξε αυτό το εύρημα.

Ωστόσο, εκτός από την οικογένειά E2F, TP53, BRCA1, και STAT3 διαδραματίζουν επίσης σημαντικό ρόλο σε αυτό το TF και miRNA κοινού ρύθμισης του δικτύου (Εικ. 5). Για παράδειγμα, TP53is ένα από τα πιο ευρέως μελετηθεί τα γονίδια και παίζει ένα ρόλο στην ρύθμιση της απόπτωσης, γονιδιωματική σταθερότητα, και την αγγειογένεση [28]. Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι

p53

μετάλλαξη που συνδέονται άμεσα με την ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου [4] και μια άλλη μελέτη έδειξε ότι η αποκατάσταση της δραστηριότητας ρ53 επαγόμενης την ευαισθησία του γαστρικού καρκίνου σε χημειοθεραπεία [29]. BRCA1 είναι το γονίδιο ευαισθησίας του καρκίνου του μαστού και ρυθμίζει την κυτταρική απόπτωση και επισκευές βλάβη του DNA. BRCA1 παίζει ρόλο στη δραστικότητα επισκευής ρύθμιση του DNA και

BRCA1

μετάλλαξη συνέβαλε στην ανάπτυξη του καρκίνου του μαστού, τον καρκίνο των ωοθηκών [30], του καρκίνου του παγκρέατος [31], και γαστρικού καρκίνου [32]. Lost έκφραση της πρωτεΐνης BRCA1 συσχετίστηκε με κακή ποσοστό επιβίωσης των ασθενών με γαστρικό καρκίνο [33]. τρέχουσα μελέτη μας έδειξε ότι BRCA1 mRNA συνδέθηκε με γαστρικό καρκίνο διαφοροποίηση. Επιπλέον, STAT3 είναι ένας παράγοντας μεταγραφής που ενεργοποιείται σε απόκριση σε αυξητικούς παράγοντες και κυτοκίνη, και συμβάλλει στην ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της απόπτωσης, και κινητικότητα σε κύτταρα. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η STAT3 ήταν ένας βασικός ρυθμιστικός παράγοντας [34] σε γαστρικό ανάπτυξη καρκίνου και ότι η ενεργοποίηση STAT3 προωθείται επιβίωση των κυττάρων του όγκου και τη μετανάστευση [35]. Μια προηγούμενη μελέτη που χρησιμοποιείται αναστολέας STAT3 για τη θεραπεία του καρκίνου του στομάχου και έδειξε την αποτελεσματικότητα [36].

Επιπλέον, miRNAs (miR-125a-5P, miR-331-3p, miR-17, miR-150, το miR-155 , miR-27β, miR-31, miR-92a και miR-509-5p), που εκφράζονται διαφορικά σε καρκίνο του στομάχου, βρέθηκαν να ρυθμίζουν την έκφραση του E2F1, E2F2, E2F5 και E2F7 σε αυτή τη μελέτη (S3 πίνακα). Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η έκφραση miR-125a-5P συνδέθηκε με γαστρικό καρκινογένεση με τη στόχευση του E2F3 [37]. MiRNA-331-3p στοχεύει άμεσα E2F1 και προκάλεσε διακοπή της ανάπτυξης των ανθρώπινων γαστρικών καρκινικών κυττάρων [38]. Επιπλέον, η έκφραση του miR-155 ήταν σε θέση να εμποδίσει ΤΟΡ-β1 με τη μεσολάβηση της ενεργοποίησης του Rb και με τη σειρά για να μειωθεί η αφθονία του ανασταλτικού pRB-E2F1 πολύπλοκες και ανελκυστήρα G0 /G1 σύλληψης [39]. Οι MiR-17 οικογένεια clusters αναδύεται ως βασικό ρυθμιστές του ΤΟΡ-βtumor σηματοδότησης καταστολέα στο γαστρικό καρκίνο, μέσω της ρύθμισης του p21, E2F1-3 και E2F5 έκφραση του γονιδίου-στόχου [40-42]. Επιπλέον, miR-150, miR-31, και miR-92a είχαν επίσης δείξει στενή σχέση με τον καρκίνο του στομάχου [43-46]. Παρά το γεγονός ότι δεν υπήρξαν αναφερθεί σχετικά με miR-509-5p που σχετίζονται με τον καρκίνο του στομάχου, του miR-509-5p εντάχθηκε στο βρόχο ανάδρασης Mdm2 /p53 και ρυθμίζει τον καρκίνο κυτταρική ανάπτυξη [47]. Αυτές οι μελέτες ήταν σύμφωνες με τρέχοντα αποτελέσματα μας.

Επιπλέον, η ρυθμιστική σχέση μεταξύ TF-γονιδίων και miRNA-ΤΡ μπορεί να έχουν οι συνεργιστικές επιδράσεις. Με βάση την νεοσύστατη E2F σχετίζονται TF-miRNA από κοινού ρύθμισης του δικτύου μας, εντοπίσαμε 9 hub-γονίδια τα οποία αφορούν κυρίως σε κυτταρικό κύκλο και την οργάνωση των χρωμοσωμάτων (Εικ. 7). Λαμβάνονται όλα τα στοιχεία μαζί, τρέχουσα μελέτη μας δείχνουν ότι η γαστρική ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου εμπλέκονται πολλαπλά γονίδια και περαιτέρω μελέτες θα επικεντρωθούν σε αυτά τα γονίδια ως νέων στόχων για τον έλεγχο του καρκίνου του στομάχου.

Ωστόσο, η τρέχουσα μελέτη μας απλά παρέχεται προκαταρκτικά στοιχεία και περαιτέρω μελέτη επιβεβαίωση είναι απαραίτητη για την επαλήθευση των δεδομένων μας σε ex vivo και in vitro. Αυτή η συστηματική προσέγγιση μπορεί να μας βοηθήσει να εξερευνήσετε την παθογένεια του καρκίνου και να παρέχει τη θεωρητική βάση για την αναζήτηση νέα στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου του στομάχου στο μέλλον.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1. Χαρακτηριστικά των ασθενών

doi:. 10.1371 /journal.pone.0116979.s001

(DOC)

Πίνακας S2. . Σύνοψη των 980 διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τους μακρινούς φυσιολογικούς ιστούς

επίπεδα γονιδιακής έκφρασης σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς εναντίον τους μακρινούς φυσιολογικούς ιστούς ήταν τουλάχιστον 1,5 φορές διαφορετικά, με τιμή p & lt?. 0.05

doi: 10.1371 /journal.pone.0116979.s002

(XLSX)

S3 πίνακα. . Σύνοψη των 45 διαφορικά εκφρασμένων miRNAs στο γαστρικό καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τους μακρινούς φυσιολογικούς ιστούς

επίπεδα έκφρασης των miRNAs σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς εναντίον τους μακρινούς φυσιολογικούς ιστούς ήταν τουλάχιστον 1,5 φορές διαφορετικά, με τιμή p & lt? 0,05.

doi: 10.1371 /journal.pone.0116979.s003

(XLSX)

S4 πίνακα. Περίληψη των 105 διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων στα ΤΡ-ρυθμιστικό δίκτυο στο γαστρικό καρκινικούς ιστούς

doi:. 10.1371 /journal.pone.0116979.s004

(DOCX)

Ευχαριστίες

ευχαριστούμε την Medjaden Bioscience Limited (Χονγκ Κονγκ, Κίνα) για την επεξεργασία και επιμέλεια αυτό το χειρόγραφο.