Αφηρημένο

πρόσφατη μελέτη μας έδειξε ότι υψηλότερη έκφραση του Ν-myc μειωτικά γονίδιο 1 ( NDRG1) συσχετίζεται στενά με κακή πρόγνωση σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου. Σε αυτή τη μελέτη, αναρωτηθήκαμε εάν NDRG1 έχει καθοριστικό ρόλο στην κακοήθη εξέλιξη συμπεριλαμβανομένης μετάστασης του γαστρικού καρκίνου κύτταρα. Με την έκφραση γονιδίων ανάλυση μικροσυστοιχιών έκφραση NDRG1 έδειξε την μεγαλύτερη αύξηση μεταξύ των συνολικά 3691 μέχρι ρυθμιζόμενα γονίδια σε ένα εξαιρετικά μεταστατικό γαστρικό καρκίνο κυτταρική σειρά (58As1) από τη γονική χαμηλό μεταστατικό ομόλογό τους (HSC-58). Οι ιδιαίτερα μεταστατικές κυτταρικές γραμμές έδειξαν μειωμένη έκφραση της Ε-καδερίνης, μαζί με ενισχυμένη έκφραση του βιμεντίνη και σαλιγκάρι. Αυτή η μειωμένη έκφραση της Ε-καδερίνης αποκαταστάθηκε από σαλιγκάρι knockdown σε ιδιαίτερα μεταστατικές κυτταρικές γραμμές. Έχουμε καθιερώσει σταθερές επόμενη NDRG1 knockdown κυτταρικές γραμμές (AS1 /Sic50 και AS1 /Sic54) από την άκρως μεταστατική κυτταρική γραμμή, και οι δύο από αυτές τις κυτταρικές σειρές παρουσίασαν αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης και μειωμένη έκφραση βιμεντίνη και σαλιγκάρι. Και επίσης, η δραστικότητα λουσιφεράσης υποκινητή καθοδηγείται Ε-καδερίνης βρέθηκε να αυξάνεται κατά NDRG1 knockdown στην άκρως μεταστατική κυτταρική γραμμή. NDRG1 knockdown σε γαστρικό καρκίνο κυττάρων έδειξε κατέστειλε εισβολή των καρκινικών κυττάρων σε ιστούς περιβάλλουν, κατέστειλε μετάσταση στο περιτόναιο και μειωμένη συσσώρευση ασκίτη σε ποντικούς με σημαντικά βελτιωμένη ποσοστά επιβίωσης. Αυτή είναι η πρώτη μελέτη που αποδεικνύει ότι NDRG1 διαδραματίζει καίριο ρόλο της στην κακοήθη εξέλιξη του καρκίνου του στομάχου μέσω επιθηλιακών μετάβαση μεσεγχυματικά

Παράθεση:. Ureshino Η, Murakami Υ, Watari Κ, Izumi Η Kawahara Α, Kage Μ , et al. (2012) Ν-myc μεταγενέστεροι Ρυθμιζόμενη Gene 1 (NDRG1) Προωθεί μετάσταση των κυττάρων του Ανθρώπου σκιρώδης γαστρικός καρκίνος μέσω επιθηλιακών μεσεγχυματικά μετάβαση. PLoS ONE 7 (7): e41312. doi: 10.1371 /journal.pone.0041312

Επιμέλεια: Rakesh Κ Srivastava, Το Πανεπιστήμιο του Κάνσας Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8 Δεκ 2011? Αποδεκτές: 22 του Ιούνη 2012? Δημοσιεύθηκε: 23 Ιούλ 2012

Copyright: © 2012 Ureshino et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση-in-ενισχύσεις για την Έρευνα του Καρκίνου από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας (με τον Δρ Ono), και από το Ερευνητικό 3ο Τρίμηνο ολοκληρωμένο έλεγχο για τον καρκίνο από το Υπουργείο Υγείας, εργασίας, και Πρόνοιας της Ιαπωνίας (Δρ Kuwano). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο του στομάχου είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθειες στην Ιαπωνία και άλλες ασιατικές χώρες. Η πρόγνωση της σκιρώδης γαστρικού καρκινώματος του ασθενούς είναι ιδιαίτερα κακή. Σκιρώδης γαστρικό καρκίνωμα συχνά συνοδεύεται από περιτοναϊκή διάχυση και μετάσταση στους λεμφαδένες και ήπαρ, το οποίο είναι σοβαρά προβλήματα τα οποία πρέπει να ελέγχονται. Η γονιδιακή έκφραση του προφίλ αποκάλυψε γονίδιο ενισχύσεις του Κ-SAM και c-Met σε 30-40% των σκιρώδης γαστρικών καρκίνων, και ότι η υπερέκφραση διαφόρων αυξητικών παραγόντων, όπως ο αυξητικός παράγοντας μεταμόρφωσης β (ΤΟΡ-β), που προέρχεται από αιμοπετάλια ανάπτυξη παράγοντα (PDGF), ινσουλίνη αυξητικός παράγοντας (IGF) και αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών-2 (FGF-2) [1]. Πρόσφατη ανάλυση μικροσυστοιχιών DNA κατέδειξε ειδική διέγερση πολλών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων

SPARC

,

RGEIII

,

S100A10

και κολλαγόνου τύπου Ι [2] – [4].

τα ζωικά μοντέλα που αντικατοπτρίζουν τα χαρακτηριστικά των καρκινικών περιτονίτιδας και μετάσταση στο περιτόναιο είναι σημαντική για την κατανόηση της ανάπτυξης των κακοηθών εξέλιξη από καρκίνο του στομάχου. Yanagihara

et al.

[5], θεσπίστηκε για πρώτη φορά την κυτταρική σειρά HSC-58 από ανθρώπινα σκιρώδης γαστρικού καρκίνου, και στη συνέχεια να δημιουργήσει δύο sublines, 58As1 και 58As9, με υψηλό δυναμικό για περιτοναϊκή διάδοση και τη μετάσταση στους λεμφαδένες από επανειλημμένες ορθοτοπική εμβολιασμό HSC-58 κυττάρων εντός του γαστρικού τοιχώματος αθυμικούς ποντικούς [6], [7]. Αυτές οι υποσειρές συχνά προκαλούν συσσώρευση ασκίτη μετά ορθοτοπική εμφύτευση και δείχνουν αυξημένη έκφραση των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεάσες και πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην κυτταρική προσκόλληση, κυτταρική κινητικότητα, τον πολλαπλασιασμό και την αγγειογένεση [6]. Μπορούν επίσης να αναπτυχθούν επιλεκτικά στο γαστρικό υποβλεννογόνο, και εισβάλλουν στο βαθύτερο στρώμα για να φτάσει το επίπεδο του χορίου του στομάχου [7]. Ωστόσο, παραμένει ασαφές γιατί έχουν αποκτήσει ένα τέτοιο υψηλό δυναμικό μετάστασης κατά τη διάρκεια της επιλογής.

Στην παρούσα μελέτη μας, χρησιμοποιήσαμε αυτές τις ιδιαίτερα μεταστατικές κυτταρικές σειρές για να διερευνήσουν πώς τα ανθρώπινα γαστρικά καρκινικά κύτταρα θα μπορούσαν να αποκτήσουν μεταστατικό δυναμικό. Πρέπει πρώτα σύγκριση της έκφρασης των γονιδίων μεταξύ πολύ μεταστατικός και χαμηλού μεταστατικού γονικές κυτταρικές σειρές με ανάλυση μικροσυστοιχιών. Εμείς επικεντρώθηκε σε ένα γονίδιο που ονομάζεται Ν-myc κατάντη ρυθμίζονται γονίδιο 1 (NDRG1) επειδή βρέθηκε να ρυθμίζεται αυξητικά σημαντικά στους ιδιαίτερα μεταστατικές κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου σε σύγκριση με τον ομόλογό τους κύτταρα. Επίσης έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ότι η έκφραση NDRG1 ήταν ένα κατηγορηματικό δείκτης για κακοήθη εξέλιξη και κακή πρόγνωση σε ασθενείς με γαστρικό [8]. Σύμφωνα με αυτή τη μελέτη, παρατηρήσαμε ότι η έκφραση υψηλού NDRG1 συσχετίστηκε σημαντικά με την αγγειογένεση όγκων και κακοήθη εξέλιξη μαζί με κακή πρόγνωση σε γαστρικό καρκίνο [9]. Μπορούμε επίσης αναφερθεί ότι NDRG1 knockdown επάγει μειωμένη παραγωγή ισχυρών αγγειογόνων παραγόντων και αγγειογένεση όγκου από καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων, και επίσης ότι είναι ένας NDRG1 προγνωστική δείκτης για την αγγειογένεση των όγκων και την κακή πρόγνωση σε ασθενείς με μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [10]. NDRG1, ένα από τα τέσσερα γονίδια της οικογένειας NDRG, δείχνει έτσι ποικίλες λειτουργίες [11], και τις λειτουργίες NDRG1 είτε ως μετάσταση καταστολέας ή ως ογκογόνο και κακοήθεις προαγωγό, ανάλογα με τον τύπο του όγκου [11], [12]. Επιπλέον, η έκφραση του γονιδίου NDRG1 ελέγχεται στενά από τη Ν-Myc και συναφείς πρωτεΐνες οικογένειας Myc [13] και η υπερέκφραση του c-myc που επάγεται επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) σε επιθηλιακά κύτταρα του μαστού [14]. Ο σημαντικός ρόλος του ΕΜΤ αναφέρεται συχνά σε στενή πλαίσιο της ανάπτυξης και εξέλιξης του όγκου συμπεριλαμβανομένης της μετάστασης του καρκίνου [15], [16]. Ωστόσο, σε αυτές τις μελέτες, ο ρυθμιστικός ρόλος του NDRG1 δεν μελετήθηκε. Στην παρούσα μελέτη μας, ερευνήσαμε την μεταστατικό δυναμικό των γαστρικών καρκινικών κυττάρων από τον συσχετισμό της με EMT-based ρόλο της NDRG1.

Αποτελέσματα

Σύγκριση της ανάπτυξης των κυττάρων, κυττάρων Μορφολογία, ανάπτυξη όγκου, Διάδοση και της έκφρασης των γονιδίων μεταξύ των άκρως μεταστατικού καρκίνου του στομάχου γραμμές κυττάρων και χαμηλή μεταστατική τους ομολόγους τους

Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες [6], [7], οι εξαιρετικά μεταστατικό καρκίνο κυτταρικές σειρές 58As1 και 58As9 κατέγραψε υψηλότερους ρυθμούς ανάπτυξης από τη γονική τους ομόλογό του, HSC-58, με χρόνους διπλασιασμού 23-26 ώρες σε σύγκριση με 30 ώρες για γονικών κυττάρων (Εικόνα 1Α). 58As1 κύτταρα αποσπώνται εύκολα και έδειξε κυτταρική ανάπτυξη εναιώρημα τύπου με στρογγυλή μορφολογία, ενώ HSC-58 και 58As9 κύτταρα συνδέθηκαν και έδειξε στρώσεις ανάπτυξη των κυττάρων με ένα ινοβλαστική μορφολογία (Σχήμα 1Β). Αμφότερα τα κύτταρα 58As1 και 58As9 έδειξε πολύ υψηλότερους ρυθμούς ανάπτυξης όγκου σε ένα υποδόριο μοντέλο ξενομοσχεύματος σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα HSC-58 (Σχήμα 1 C). Προηγούμενες μελέτες απέδειξαν ότι η ορθοτοπική μεταμόσχευση κυττάρων που επάγεται 58As1 πολύ υψηλότερη συσσώρευση περιτοναϊκή διάχυση και ασκίτη από εκείνη του HSC-58 κύτταρα [6], [7]. Επιβεβαιώσαμε περαιτέρω την περιτοναϊκή διάχυση των κυττάρων με εμφύτευση τους μέσα στην περιτοναϊκή κοιλότητα των ποντικών. Ποντίκια εμφυτεύθηκαν με κύτταρα 58As1 έδειξε την εμφάνιση μέσο όρο 8 ± 3 ορατή όζους στο μεσεντέριο κάθε ποντικού και τη συσσώρευση του ασκίτη (που κυμαίνονται από 0.7-2.5 ml /ποντικό) (Σχήμα 1 D, Ε). Αντίθετα, τα ποντίκια εμφυτευμένα με γονικά κύτταρα HSC-58 έδειξε το σχηματισμό λίγα, εάν υπάρχουν μικροσκοπικά οζίδια, και καμία εμφανή συσσώρευση ασκίτη.

(Α) Σύγκριση των ποσοστών πολλαπλασιασμού των κυττάρων

in vitro

. Τα κύτταρα σπάρθηκαν την ημέρα 0 (5 × 10

4 κύτταρα /τρυβλίο) και ο πολλαπλασιασμός μετρήθηκε σε RPMI 1640 που περιέχει 10% FBS. χρόνοι διπλασιασμού ήταν 34, 27, και 23 ώρες για την HSC-58 (μαύρο), 58As1 (γκρι) και 58As9 κύτταρα (λευκό), αντίστοιχα. (Β) Μορφολογία του γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή

in vitro

. HSC-58 και την ανάπτυξη των κυττάρων 58As9 ήταν ορατή ως συνημμένο στρώματα με ινοβλαστική μορφολογία. 58As1 κύτταρα έδειξαν την ανάπτυξη των κυττάρων ανάρτησης τύπου με στρογγυλή μορφολογία. (Γ) Η ανάπτυξη του όγκου του γαστρικού καρκίνου κυτταρικών γραμμών κατά την ημέρα 14 και 28. HSC-58 (μαύρο), 58As1 (ανοιχτό γκρι), και 58As9 (σκούρο γκρι) εμφυτεύθηκαν υποδορίως με 1 χ 10

7 κύτταρα κατά την ημέρα 0 . 58As1 ή κύτταρα 58As9 έδειξε σημαντικά (*

σ

& lt? 0,01) υψηλότερα ποσοστά αύξησης του όγκου των HSC-58 κύτταρα. (D, E) Περιτοναϊκή διάδοση και σχηματισμό ασκίτη

in vivo

. Τυπικά στοιχεία δείχνουν υψηλή και χαμηλή περιτοναϊκή διάχυση και τη συσσώρευση ασκίτη κατά την ημέρα 55 μετά τον εμβολιασμό του 1 × 10

6 κυττάρων σε περιτοναϊκή κοιλότητα. Κάθε ποντικός έδειξε ασκίτη συσσώρευση 0.7-2.5 ml και 5-12 οζίδια στο μεσεντέριο εξής 58As1 τον εμβολιασμό, αλλά αυτό δεν ήταν εμφανές με HSC-58 κύτταρα. Ν.Ο., δεν είναι ανιχνεύσιμη. (F) ανάλυση μικροσυστοιχιών στην έκφραση των γονιδίων τα οποία είναι άνω ή κάτω ρυθμίζονται σε άκρως μεταστατική κυτταρική γραμμή, 58Asl, σε σύγκριση με HSC-58. Τα ποσοστά σχετικής έκφρασης παρουσιάζονται σε γονίδια που ανήκουν σε τρεις βιολογικές λειτουργίες.

Η

Είμαστε δίπλα σύγκριση της έκφρασης των γονιδίων μεταξύ των κυττάρων 58As1 και γονικής ομόλογό τους, HSC-58, με τη χρήση ανάλυσης μικροσυστοιχιών DNA. Από τους 41.000 μεταγραφές RNA και παραλλαγές, προσδιορίσαμε 3691 διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια που ρυθμίζεται προς τα πάνω σε 2-πλάσια, και 3.536 γονίδια που ρυθμίστηκαν προς τα κάτω σε 0,5 φορές ή λιγότερο σε κύτταρα 58As1 σύγκριση με HSC-58 κύτταρα. Το σχήμα 1F παρουσιάζονται γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά στα κύτταρα 58As1 σύγκριση με HSC-58 κύτταρα, περιορίζονται σε εκείνες που ανήκουν στην οικογένεια NDRG, και τα γονίδια που σχετίζονται με την μετάσταση, συμπεριλαμβανομένων μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (MMPs) /καθεψίνες, προσκόλληση και επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάπτωσης ( EMT). Από τα τέσσερα γονίδια στην οικογένεια NDRG [17], η έκφραση NDRG1 και NDRG4 ρυθμίζεται αυξητικά στην άκρως μεταστατική κυτταρική γραμμή (58As1) σε σύγκριση με το γονικό κυτταρική γραμμή (HSC-58). Η έκφραση της EMT που σχετίζονται με γονίδια στα κύτταρα 58As1 επηρεάστηκε ιδιαίτερα από την απόκτηση ενός υψηλού μεταστατικού δυναμικού. Η έκφραση του επιθηλίου-ειδικών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των E-cadherin (

Cdh1

), Ρ-καντερίνη (

CDH3

) και β-κατενίνης (

CTNNB1

), ήταν μειωτικά . Αντίθετα, μόνο MMP1 (

MMP1

) έκφραση ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω? η έκφραση της καθεψίνης L (

CTSL1

) αυξήθηκε, αλλά εκείνη της καθεψίνης Β (

CTSB

) δεν ήταν. Η έκφραση της μεσέγχυμα-ειδικών γονιδίων, βιμεντίνη (

VIM

) και σαλιγκάρι (

SNAI1

), ένας βασικός παράγοντας μεταγραφής για την καταστολή της έκφρασης Ε-καδερίνης, ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω.

Ενισχυμένη NDRG1 Gene Expression σε ιδιαίτερα μεταστατικές κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου

περαιτέρω σύγκριση της πρωτεΐνης έκφραση αρκετών γονιδίων σε HSC-58, τα κύτταρα 58As1 και 58As9 (Σχήμα 2Α). Η έκφραση του NDRG1 αξιοσημείωτα επαυξημένης, και ότι από βιμεντίνη, σαλιγκάρι, ρ-ERK1 /2, π-Akt, και ρ-GSK-3β αυξήθηκε επίσης, τόσο 58As1 και κυττάρων 58As9 σύγκριση με HSC-58 κύτταρα. Δεν υπήρχε εμφανής έκφραση του Wnt3A και Wnt5a σε αυτές τις κυτταρικές σειρές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αντιθέτως, παρατηρήσαμε μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης και β-κατενίνης σε κύτταρα 58As1 και 58As9 σύγκριση με HSC-58 κύτταρα (Σχήμα 2Α). Η φωσφορυλίωση του β-κατενίνης Ser33 /37 και Ser552 βρέθηκε να είναι πολύ λιγότερο σε 58As1 και 58As9 από HSC58. Συνεπής με τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης, τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της NDRG1, βιμεντίνη, σαλιγκάρι και ΜΜΡ-1 ήταν υψηλότερες σε αμφότερες τις ιδιαίτερα μεταστατικές κυτταρικές γραμμές από τη γονική ομόλογό τους (Σχήμα 2Β). Υπήρχε πολύ λιγότερο mRNA έκφραση Ε-καδερίνης και β-κατενίνης τόσο 58As1 και 58As9 από HSC-58.

(Α) ανάλυση κηλίδας Western των συνολικά κυτταρολύματα δείχνει τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης του NDRG1, παράγοντα ανάπτυξης υποδοχέα , πρωτεΐνες EMT που σχετίζονται με Wnt /β-κατενίνης συνδέονται με πρωτεΐνες, και άλλους παράγοντες στην HSC-58, και τα κύτταρα 58As1 58As9. (Β) Σύγκριση των επιπέδων έκφρασης του mRNA του NDRG1, Ε-καδερίνης, βιμεντίνη, σαλιγκάρι, ΜΜΡ-1 και β-κατενίνης σε HSC-58, 58As1 και 58As9 κύτταρα με ανάλυση qRT-PCR. (Γ) Η ανοσοκυτταροχημική ανάλυση του Ε-καδερίνης και β-κατενίνης σε HSC-58 και 58As9, χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα έναντι Ε-καδερίνης, β-κατενίνης και ϋΑΡ1. Μεγέθυνση × 200. (D) ανάλυση στυπώματος Western δείχνει έκφραση του β-κατενίνης και Σαλιγκάρι στον πυρήνα και κυτοσόλης κλάσμα. CREB, ένα πυρηνικό δείκτη, και α-τουμπουλίνης, ένας κυτοσόλη δείκτη. (Ε, F) Σύγκριση της δραστηριότητας λουσιφεράσης καθοδηγείται από E-cadhrin προαγωγό και β-κατενίνης (TopFlash) οδηγείται υποκινητή μεταξύ ιδιαίτερα μεταστατικές κυτταρικές γραμμές του HSC-58 και. Η δραστηριότητα σχετική υποκινητή παρουσιάζεται όταν ομαλοποιηθεί η δραστηριότητα HSC-58. * Ρ & lt?. 0.01

Η

Η ανοσοκυτταροχημική ανάλυση αποκάλυψε ότι εντόπιση της Ε-καδερίνης τόσο στο κυτταρόπλασμα και μεμβράνη, και β-κατενίνη ως επί το πλείστον σε εντοπισμένη κυτταρόπλασμα στα δύο κύτταρα HSC-58 και 58As9 (Σχήμα 2C) . Η ανοσοκυτταροχημική ανάλυση για 58As1 δεν μπορούσε να πραγματοποιηθεί όπως 58As1 μεγαλώνει σε εναιώρημα. Επιπλέον, η έκφραση της β-κατενίνης ήταν σχετικά χαμηλότερη τόσο κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα, αλλά εκείνο του σαλιγκαριού βρέθηκε να είναι πολύ υψηλότερη στον πυρήνα του 58As1 και 58As9 από HSC-58 (Σχήμα 2D). Εξετάσαμε επίσης δράση προαγωγού Ε-καδερίνης (Εικόνα 2Ε) και δραστηριότητα που επάγεται ανταποκριτή β-κατενίνης με δοκιμασία ανταποκριτή TopFlash (Σχήμα 2F) και διαπίστωσε ότι υπήρχε σημαντική μείωση στην δραστικότητα λουσιφεράσης καθοδηγείται από προαγωγό Ε-καδερίνης και από β-κατενίνης τόσο 58As1 και 58As9 σύγκριση με HSC-58, σύμφωνα με τα επίπεδα του mRNA και των δύο γονιδίων.

NDRG1 Knockdown Προκαλεί ανιούσα ρύθμιση της Ε-καδερίνης και μειορύθμιση βιμεντίνης και σαλιγκάρι σε ιδιαίτερα μεταστατικά κύτταρα

στη συνέχεια εξετάσαμε εάν NDRG1 knockdown επηρεάζονται ειδικά την έκφραση του ΕΜΤ-σχετικών γονιδίων στο άκρως μεταστατική κυτταρική γραμμή, 58As1. Ιδρύσαμε δύο σταθερές NDRG1 νοκ ντάουν κλώνους κυττάρων, AS1 /Sic50 και AS1 /Sic54 με επιμόλυνση NDRG1 shRNA σε κύτταρα 58As1. Τόσο AS1 /Sic50 και AS1 /Sic54 κύτταρα έδειξαν παρόμοιους ρυθμούς ανάπτυξης προς το άλλο και τη γονική ομόλογό AS1 /Mock3 τους, με χρόνους διπλασιασμού 25-27 ώρες σε καλλιέργεια (Σχήμα 3Α). Αμφότερες NDRG1 σιγήσει κυτταρικές γραμμές έδειξαν σφιχτή πρόσφυση των κυττάρων στο δίσκο καλλιέργειας και ινοβλαστική μορφολογία, ενώ τα κύτταρα AS1 /Mock3 έδειξαν ανάπτυξη κυττάρου εναιώρημα τύπου με τις κυτταρικές μορφολογία γύρο (Σχήμα 3Β). Στη συνέχεια εξετάσαμε την επίδραση της αποσιώπησης NDRG1 για την ογκογόνο δράση των κυττάρων 58As1 χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία αύξησης αγκύρωση-ανεξάρτητη. Και οι δύο NDRG1 σιγήσει κυτταρικές σειρές έδειξαν σημαντική μείωση της αγκύρωσης ανεξάρτητη ανάπτυξή τους, όπως φαίνεται από τον αριθμό των αποικιών σε μαλακό άγαρ (

*

p & lt?

0.01). (Σχήμα 3C)

( Α) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων σε RPMI 1640 που περιέχει 10% FBS ακολουθήθηκε μετά την σπορά 5 × 10

4 κύτταρα /τρυβλίο την ημέρα 0. οι χρόνοι διπλασιασμού ήταν παρόμοια για AS1 /Mock3 (μαύρο), AS1 /Sic50 (γκρι) και AS1 /Sic54 (λευκό) κύτταρα (26-30 ώρες). (Β) κυττάρων μορφολογία του AS1 /Mock3, AS1 /Sic50 και AS1 /Sic54. Τυπικό μορφολογία των κυττάρων στην καλλιέργεια παρουσιάζει AS1 /Mock3 ανάπτυξη των κυττάρων ανάρτησης τύπου και των συνημμένων ανάπτυξη των κυττάρων στρώμα τύπου των δύο NDRG1 knockdowned κυτταρικές σειρές. (Γ) Αντιπροσωπευτικές εικόνες αποικιών του AS1 /Mock3, AS1 /Sic50 και AS1 /Sic54 όταν επωάζεται για 14 ημέρες σε μαλακό άγαρ (αριστερό πάνελ). Ποσοτική ανάλυση της δραστηριότητας σχηματισμού αποικιών από τρεις κυτταρικές σειρές, όταν 5 πιάτα για κάθε γραμμή βαθμολογήθηκαν (δεξιά πλευρά). Σημαντικές διαφορές (*

σ

& lt? 0.01). Σε αριθμό αποικιών μεταξύ 58As1 και NDRG1 νοκ ντάουν κυτταρικές σειρές του

Η

Στη συνέχεια, συγκρίναμε τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης μεταξύ AS1 /Mock3 και AS1 /Sic50 κύτταρα χρησιμοποιώντας ανάλυση μικροσυστοιχιών DNA (Σχήμα 4Α). NDRG1 νοκ ντάουν οδήγησε σε αυξημένη έκφραση της E-cadherin (

Cdh1

) και Ρ-καντερίνη (

CDH3

) αλλά μειωμένη έκφραση της βιμεντίνης (

VIM

) και σαλιγκάρι (

SNAI1

). Εμείς επόμενη εκτελούνται western blot και αναλύει qRT-RCR για πολλά μόρια που διαμορφώνονται από NDRG1 knockdown στην ανάλυση μικροσυστοιχιών (Σχήμα 4Β, C). Αυτές οι δύο κυτταρικές σειρές παρουσίασαν πολύ χαμηλότερη έκφραση τόσο του mRNA και της πρωτεΐνης NDRG1 σε σύγκριση με τα κύτταρα AS1 /Mock3. Ενισχυμένη έκφραση της Ε-καδερίνης παρατηρήθηκε στις AS1 /Sic50 και κυττάρων AS1 /Sic54 σύγκριση με τα κύτταρα AS1 /Mock3 με ανάλυση κηλίδος Western. Σε κύτταρα AS1 /Sic50 και AS1 /Sic54, τόσο Western Blot και αναλύσεις qRT-PCR επιβεβαίωσε μειωμένη έκφραση της βιμεντίνης και σαλιγκάρι χωρίς να επηρεάζει την έκφραση της p-ERK1 /2, ERK1 /2, π-Ακί, Akt, π-GSK-3β και GSK-3β (Σχήμα 4Β, C).

(Α) ανάλυση μικροσυστοιχιών για την επίδραση των NDRG1 νοκ ντάουν στην έκφραση των γονιδίων που είναι άνω ή κάτω ρυθμίζονται σε ASL /Sic50 έναντι AS1 /Mock3. Οι σχετικές τιμές έκφρασης που παρέχονται σε γονίδια που ανήκουν σε τρεις βιολογικές λειτουργίες. (Β) Σύγκριση των επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης του NDRG1, ΕΜΤ-σχετικές πρωτείνες, β-κατενίνης, Akt, ρ-Akt, ERK1 /2, π-ERK1 /2, η GSK-3β, ρ-GSK-3β και EGFR με western blot ανάλυσης με συνολικό προϊόν κυτταρικής λύσης. (Γ) Η έκφραση του mRNA του NDRG1, Ε-καδερίνης, βιμεντίνη, σαλιγκάρι, ΜΜΡ-1 και β-κατενίνης προσδιορίστηκε με ανάλυση qRT-PCR. (D) Σύγκριση της λουσιφεράσης δραστηριότητα καθοδηγείται από β-κατενίνης (TopFlash) μεταξύ AS1 /Mock3 και NDRG1 της knockdowned κυτταρικές σειρές. Σχετική φωτεινότητα φορές παρουσιάζεται όταν ομαλοποιηθεί η τιμή στο AS1 /Mock3. Κάθε στήλη είναι η μέση τριπλών δοκιμών ± SD.

Η

Από την άλλη πλευρά, NDRG1 είναι καλά γνωστό ότι καταστέλλει τη μετάσταση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων από καρκίνο του προστάτη και του παχέος εντέρου κύτταρα. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι NDRG1 διαμορφώνει σηματοδότηση Wnt μονοπάτι-β-κατενίνης με αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης σε ανθρώπινο προστάτη και καρκίνου του κόλου κυττάρου [18], [19]. Ωστόσο, NDRG1 knockdown σε κύτταρα 58As1 δεν επηρέασε την έκφραση β-κατενίνης τόσο σε πρωτεΐνη και το επίπεδο mRNA (Σχήμα 4Β, C). Και, επίσης, β-κατενίνης οδηγείται δράση προαγωγού με τη δοκιμασία ρεπόρτερ TopFlash αποκάλυψε καμία διαφορά στη δράση του προαγωγού μεταξύ AS1 /Mock και NDRG1 σιγήσει κυτταρικές σειρές. Ως εκ τούτου, η έκφραση β-κατενίνης δεν επηρεάστηκε από NDRG1 knockdown. NDRG1 knockdown έτσι αυξάνεται σταθερά έκφραση της Ε-καδερίνης και μειωμένη έκφραση σαλιγκάρι και βιμεντίνης στο άκρως μεταστατική κυτταρική γραμμή. Ωστόσο, δεν υπήρχε καμία εμφανής αλλαγή στην έκφραση της β-κατενίνης από NDRG1 νοκ ντάουν.

Enhanced E-cadherin υποστηρικτής Δραστηριότητα από NDRG1 Νοκ ντάουν μέσω σαλιγκάρι στο γαστρικός καρκίνος κύτταρα

Από διάφορους μεταγραφικούς παράγοντες που καταστέλλουν έκφραση της Ε-καδερίνης συμπεριλαμβανομένων σαλιγκάρι, Slug, Twist, TCF4 και SIP1 [20], η έκφραση του σαλιγκαριού διαμορφωνόταν ειδικά από NDRG1 στο γαστρικό καρκινικά κύτταρα. Εξετάσαμε αν η έκφραση της Ε-καδερίνης ή /και βιμεντίνης θα μπορούσε να ρυθμίζεται από σαλιγκάρι σε HSC-58 κύτταρα. Παροδικά θεραπεία με Σαλιγκάρι siRNA είχε σαν αποτέλεσμα αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης, αλλά όχι εκείνη της βιμεντίνης και NDRG1, σε χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 5Α). Υπήρχε μόνο μια μικρή εάν υπάρχει αύξηση στην έκφραση της β-κατενίνης από σαλιγκάρι νοκ ντάουν. Επιπλέον, η δραστικότητα λουσιφεράσης υποκινητή καθοδηγείται Ε-καδερίνης ήταν σημαντικά καταστέλλεται με επιμόλυνση του σαλιγκαριού συμπληρωματικού DNA σε δύο καρκινικές κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν (Σχήμα 5Β). Είμαστε δίπλα σε σύγκριση δράση προαγωγού Ε-cadherin μεταξύ NDRG1 σιγήσει κυτταρικές σειρές του AS1 /Mock3 και. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5C, υπήρξε σημαντική (*

ρ

& lt? 0,05). Ενίσχυση της δραστικότητας προαγωγού Ε-καδερίνης με NDRG1 knockdown

(Α) Σύγκριση των επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης του Ε- καντερίνης, β-κατενίνης, NDRG1 και βιμεντίνη όταν παροδικά σε επεξεργασία με siRNA σαλιγκάρι για 0, 48 και 96 ώρες με ανάλυση Western blot σε HSC-58 κυττάρων. (Β) δραστικότητα λουσιφεράσης υποκινητή καθοδηγείται Ε-καδερίνης με την απουσία ή παρουσία της έκφρασης σαλιγκάρι σε HSC-58 και BxPC-3 κύτταρα. E-cadherin-Luc επιμολύνθηκε με ή χωρίς pcDNA3-σαλιγκάρι, και η δράση της λουσιφεράσης μετρήθηκε. Κάθε στήλη είναι μέσος όρος των τριπλών δοκιμών (*

σ

& lt? 0,05). (C) Σύγκριση της δραστικότητας λουσιφεράσης υποκινητή καθοδηγείται Ε-καδερίνης (Ε-καντερίνης-Luc) σε AS1 /Mock3, AS1 /Sic50 και AS1 /Sic54. Κάθε στήλη είναι μέσος όρος των τριπλών δοκιμών (*

σ

& lt? 0,05). (D) Η επίδραση της CT99021 επί πρωτεΐνης έκφραση NDRG1 και διάφορα ΕΜΤ-σχετιζόμενα μόρια με ανάλυση κηλίδας Western. 58Asl κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενες δόσεις του φαρμάκου για 24 ώρες. (Ε) Η επίδραση της β-κατενίνης knockdown με siRNAs της για έκφραση της Ε-καδερίνης. HSC-58 κύτταρα επιμολύνθηκαν με τα siRNA για 24 ώρες, και η συνολική κυτταρολύματα αναλύθηκαν με ανάλυση στυπώματος Western.

Η

GSK-3β είναι ένα ένζυμο κλειδί για την ενεργοποίηση της οδού ΕΜΤ [20], [21 ], καθώς επίσης και για την φωσφορυλίωση της NDRG1 [22], [23]. Η έκφραση του ρ-GSK-3β αυξήθηκε στην άκρως μεταστατική κυτταρική γραμμή, 58As1 (βλέπε Σχήμα 2Α). Εξετάσαμε αν η GSK-3β είχε εμπλακεί σε επαγόμενη NDRG1 αλλαγμένη έκφραση Ε-καδερίνης και βιμεντίνη. Η θεραπεία με έναν αναστολέα (CT99021) της GSK-3β οδήγησε σε μειωμένη έκφραση του ρ-NDRG1 και π-GSK-3β, και επίσης αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης και β-κατενίνης σε κύτταρα 58As1 (Σχήμα 5D). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Ε, β-κατενίνης knockdown δεν επηρέασε την έκφραση της Ε-καδερίνης, βιμεντίνη και σαλιγκάρι.

NDRG1 Knockdown Προκαλεί μεσεγχυματικά Επιθηλιακά Μετάβασης και καταστέλλει μετάσταση στο περιτόναιο από εξαιρετικά Κύτταρα μεταστατικού καρκίνου του στομάχου

σύγκριση των ποσοστών ανάπτυξης του όγκου του AS1 /Mock3, AS1 /Sic50 και κυττάρων AS1 /Sic54 σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος αποκάλυψε βραδύτερους ρυθμούς ανάπτυξης όγκου και των δύο AS1 /Sic50 και AS1 /Sic54 με NDRG1 knockdown (Σχήμα 6Α, Β). NDRG1 knockdown κατέστειλε την τοπική εισβολή των καρκινικών κυττάρων AS1 /Mock3 στον περιβάλλοντα στρώμα και παρακείμενα λιπώδη και /ή μυϊκό ιστό, και την ανάπτυξη του όγκου έγκλειστα (Σχήμα 6C). Υψηλή έκφραση της Ε-καδερίνης παρατηρήθηκε σε AS1 /Sic50 και AS1 /όγκους Sic54, ενώ η υψηλή έκφραση του βιμεντίνης παρατηρήθηκε σε καρκινικά κύτταρα του AS1 /Mock3 όγκοι (Σχήμα 6D). Αντίθετα, δεν υπήρχε σχεδόν καμία αλλαγή στην έκφραση του β-κατενίνης σε AS1 /Sic50 και όγκων AS1 /Sic54 σε σύγκριση με AS1 /Mock3 όγκου.

(Α) Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε μετά υποδόριο εμβολιασμό των 5 × 10

6 AS1 /Mock3 (♦), AS1 /Sic50 (▪) και AS1 /Sic54 κύτταρα (▴). Εισόδου δεν δείχνει εμφανή έκφραση NDRG1 είτε AS1 /Sic50 ή όγκους AS1 /Sic54. (Β) Το μέγεθος του όγκου για AS1 /Sic50 (

σ

= 0,87) και τα κύτταρα AS1 /Sic54 ήταν ελαφρώς μικρότερη από ό, τι για AS1 /Mock3 (day28). Κάθε στήλη είναι κατά μέσο όρο τέσσερα ζώα (± SD) (*

σ

& lt? 0,05). (C) Αντιπροσωπευτική Η &? Ε χρώση των δειγμάτων όγκου. Οι διακεκομμένες γραμμές δείχνουν τα περιθώρια του όγκου, κλειστά τρίγωνα υποδεικνύουν εισβολή των καρκινικών κυττάρων σε φυσιολογικό ιστό. «Τ» υποδηλώνει καρκινικά κύτταρα. (D) IHC εικόνες της E-cadherin, βιμεντίνη, β-κατενίνης και Ki-67 έκφρασης σε AS1 /Mock3, AS1 /Sic50 και AS1 /Sic54 όγκους.

Η

Για να εξεταστεί αν NDRG1 νοκ ντάουν θα μπορούσαν να επηρεάσουν μετάσταση στο περιτόναιο και τη συσσώρευση του ασκίτη, συγκρίναμε την μεταστατικό δυναμικό των κυττάρων AS1 /Sic50 και AS1 /Mock3 μετά ορθοτοπική μεταμόσχευση. Το Σχήμα 7Α δείχνει αντιπροσωπευτικές εικόνες της διευρυμένης κοιλιακή κοιλότητα και την παρουσία όζων καρκίνου στο περιτόναιο. Μετά από ορθοτοπική εμβολιασμό των κυττάρων AS1 /Sic50, ο αριθμός των οζιδίων που εμφανίζονται στο περιτόναιο ήταν περίπου 30% λιγότερο από ό, τι εκείνα που προκύπτουν από κύτταρα AS1 /Mock3, αλλά η μείωση αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική (

σ

= 0,21) (Σχήμα 7Β). Ωστόσο οζίδια που προκύπτουν από κύτταρα AS1 /Sic50 έδειξε πολύ μικρότερα μεγέθη από εκείνα τα κύτταρα AS1 /Mock3 (Σχήμα 7Α). Η συσσώρευση ασκίτη από κύτταρα AS1 /Sic50 ήταν σημαντικά (* ρ & lt? 0,01) μειώθηκε, σε περίπου 10% εκείνης που προκαλείται από τα κύτταρα AS1 /Mock3 (Σχήμα 7C). Επιπλέον, υπήρχε μια σημαντική (*

ρ

& lt? 0,01) αύξηση του ποσοστού επιβίωσης ποντικών που εμβολιάστηκαν με κύτταρα AS1 /Sic50 (51 ± 16 ημέρες) σε σύγκριση με 35 ± 14 ημέρες για τα ποντίκια που εμβολιάστηκαν με AS1 /Mock3 κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι NDRG1 νοκ ντάουν παρατείνει την επιβίωση (Σχήμα 7D).

(Α) μακροσκοπική εικόνες δείχνουν διευρυμένη περιτοναϊκή κοιλότητα και μεταστατικά οζίδια από AS1 /Mock3 και AS1 /Sic50. Αιχμές βελών δείχνουν οζίδια. (Β) Αριθμός μεταστατικών οζιδίων στο μεσεντέριο ήταν 51 ± 16 (AS1 /Mock3) και 35 ± 14 (AS1 /Sic50) (

σ

= 0.21), αλλά το μέγεθος οζίδιο AS1 /Mock3 ήταν 3- 4 φορές μεγαλύτερες από εκείνες του AS1 /Sic50. (Γ) σύγκριση του όγκου των ασκιτών μεταξύ AS1 /Mock3 (3.9 ± 1.0 ml) και τα κύτταρα AS1 /Sic50 (0.5 ± 0.6 ml) μετά ορθοτοπική εμφύτευση (η = 7) (*

ρ

& lt? 0,01 ). καμπύλες (D) Survival δείχνουν ότι το ποσοστό επιβίωσης σε AS1 /Sic50 ποντικούς που φέρουν όγκο ήταν σημαντικά (*

ρ

& lt? 0,01) μεγαλύτερη από εκείνη του AS1 /Mock3 ποντικούς που φέρουν όγκο (n = 6). (Ε) υποθετικό μοντέλο μας πώς NDRG1 υπερέκφραση προωθεί μετάσταση συμπεριλαμβανομένων περιτοναϊκή διάχυση μέσω της αλλοίωσης της EMT από σκιρώδης γαστρικά καρκινικά κύτταρα, πιθανόν μέσω τροποποίησης της έκφρασης σαλιγκάρι.

Η

Συζήτηση

Έχουμε στο παρελθόν ανέφεραν ότι NDRG1 συσχετίζεται στενά με την αγγειογένεση του όγκου και κακή επιβίωση σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου, γεγονός που υποδηλώνει ότι NDRG1 είναι μια προγνωστική βιοδείκτης για κακοήθη εξέλιξη του γαστρικού καρκίνου [9]. Από την παρούσα μελέτη μας, παρατηρήσαμε οι ακόλουθες ιδιότητες που διέπει την αγορά ενός υψηλού μεταστατικού δυναμικού σε καρκίνο του στομάχου: μικροσυστοιχιών, Western Blot και RT-PCR αναλύσεις μαζί αποκάλυψε ρύθμιση προς τα άνω των NDRG1 στις ιδιαίτερα μεταστατικές κυτταρικές σειρές, 58As1 και 58As9, σε σύγκριση με τους χαμηλού μεταστατικού γονική ομόλογό του, HSC-58? υψηλότερη έκφραση του βιμεντίνης, σαλιγκάρι, και ΜΜΡ-1, και χαμηλότερη έκφραση Ε-καδερίνης και β-κατενίνης ήταν εμφανής στις ιδιαίτερα μεταστατικές κυτταρικές γραμμές σε σύγκριση με τη γονική ομόλογό τους? των γονιδίων μειωτικά στην άκρως μεταστατική κυτταρική γραμμή, NDRG1 knockdown είχε σαν αποτέλεσμα προς τα πάνω ρύθμιση της Ε-καδερίνης, και προς τα κάτω ρύθμιση βιμεντίνης και σαλιγκάρι, αλλά σχεδόν καμία επίδραση στην έκφραση της β-κατενίνης? δράση προαγωγού Ε-cadherin σημαντικά αυξηθεί από NDRG1 νοκ ντάουν? NDRG1 knockdown κατέστειλε επίσης περιτοναϊκή διάχυση και τη συσσώρευση του ασκίτη, και εισβολή των άκρως μεταστατικών κυττάρων στους περιβάλλοντες κανονικούς ιστούς.

Στην παρούσα μελέτη, NDRG1 knockdown είχε ως αποτέλεσμα την καταστολή της μετάστασης από υψηλά μεταστατικού καρκίνου του στομάχου κύτταρα (Σχήμα 6 , 7), γεγονός που υποδηλώνει ότι NDRG1 μπορεί να είναι ένα γονίδιο υποκινητής μετάσταση και όχι ένα γονίδιο καταστολέα μετάστασης σε γαστρικό καρκίνο. παρούσα μελέτη μας υποστηρίζει σθεναρά την ιδέα ότι αν NDRG1 προωθεί ή καταστέλλει την κακοήθη εξέλιξη του καρκίνου του ανθρώπου εξαρτάται από τους τύπους των όγκων ή /και το καθεστώς της διαφοροποίησης [11], [12]. Ωστόσο, παραμένει ασαφές γιατί NDRG1 λειτουργεί ως καταστολέας των όγκων ή υποστηρικτής ανάλογα με τους τύπους όγκων ή ιστολογικών τύπων. προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι NDRG1 καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου και την αγγειογένεση του καρκίνου του παγκρέατος μέσω NDRG1 οδηγείται εξασθένηση του NF-κΒ μονοπάτι [24] σηματοδότησης, [25]. Πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι η έκφραση του γονιδίου μετάσταση καταστολέα,

KAI1

γονίδιο, εμπλέκεται στην καταστολή διαμεσολαβείται NDRG1 μετάσταση του καρκίνου του προστάτη μέσω ATF3-NF-κΒ μονοπάτι [26]. Απαιτείται περαιτέρω μελέτη για να καταλάβουμε ποια ρυθμιστικού μηχανισμού είναι ειδικά υπεύθυνη για NDRG1 με γνώμονα την προώθηση των κακοήθων εξέλιξη από γαστρικά καρκινικά κύτταρα.

EMT είναι μια πρόσφατη highlight που θα μπορούσαν να συνδέονται στενά με τον καρκίνο κακοήθη εξέλιξη συμπεριλαμβανομένης απόκτηση άκρως μεταστατικού δυναμικού [15], [16]. Στην παρούσα μελέτη μας, NDRG1 νοκ ντάουν ενίσχυσε την έκφραση της E-cadherin και κατέστειλε την έκφραση της βιμεντίνης και

in vitro

και

in vivo

. NDRG1 μπορεί να διαδραματίσει καίριο ρόλο στη μετάβαση από ένα πολωμένο επιθηλιακά φαινότυπο σε μια ιδιαίτερα κινητικό μεσεγχυματικά φαινότυπο. Μερική ή πλήρη απώλεια της Ε-καδερίνης παρατηρείται συχνά κατά τη διάρκεια της εξέλιξης προς κακοήθεια σε πολυάριθμες όγκους, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του στομάχου [27], [28]. Oliveira et al. [29] ανέφερε μια στενή σχέση μεταξύ της απώλειας E-cadherin και υψηλού μεταστατικού δυναμικού σε καρκίνο του στομάχου. Chan et al. [30] ανέφεραν επίσης διαλυτή Ε-καδερίνης ως βιοδείκτη για παρατεταμένη επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του στομάχου. NDRG1 knockdown είχε ως αποτέλεσμα σχετικά υψηλότερη έκφραση Ε-καδερίνης σε AS1 /Sic50 όγκους από ό, τι οι όγκοι AS1 /Mock3, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να ελέγχει NDRG1 ειδικά την EMT ενδεχομένως μέσω της σαλιγκάρι παράγοντα μεταγραφής με γαστρικό καρκίνο κύτταρα (Σχήμα 7Ε).

σηματοδότηση Wnt έχει κεντρικό ρόλο στη κακοήθη εξέλιξη και τη μετάσταση με πνεύμονα και του μαστού καρκινικά κύτταρα [31], [32], και σηματοδότηση Wnt επάγει επίσης EMT η οποία περιλαμβάνει την μεταστατική εξέλιξη του επιθηλιακού καρκίνου [31], [33]. NDRG1 είναι γνωστό ως γονίδιο καταστολέας μετάσταση στον προστάτη και του παχέος εντέρου κυττάρου [11], [12]. Liu et al [18], έχει αναφερθεί ότι η NDRG1 καταστέλλει τη μετάσταση μέσω μονοπατιού σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Μια σχετική μελέτη από τους Chen et al [19] απέδειξε επίσης ότι NDRG1 ρυθμίζει ΤΟΡ-β επαγόμενη EMT μέσω αλλαγμένη έκφραση του β-κατενίνης και της Ε-καδερίνης σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρο. παρούσα μελέτη μας έδειξε μειωμένη έκφραση β-κατενίνης σε αμφότερες τις ιδιαίτερα μεταστατικές κυτταρικές γραμμές σε σύγκριση με το γονικό ομόλογό, HSC-58. Ωστόσο, τόσο western blot και qRT-PCR αναλύσεις δεν έδειξαν σημαντική μεταβολή στα επίπεδα έκφρασης του β-κατενίνης και επίσης β-κατενίνης οδηγείται δραστηριότητα υποκινητή μεταξύ άκρως μεταστατικά κύτταρα 58As1 και δύο NDRG1 σιγήσει κυτταρικές σειρές του. Φαίνεται λιγότερο πιθανό ότι β-κατενίνης διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην καταστολή της μετάστασης από NDRG1 knockdown σε ιδιαίτερα μεταστατικά καρκινικά κύτταρα.

Από την άλλη πλευρά, η GSK-3β είναι επίσης γνωστό ότι παίζουν ένα ρόλο στον έλεγχο της EMT [20], [21], και GSK-3β είναι ένα απαραίτητο ένζυμο για την φωσφορυλίωση NDRG1, ένα εξαιρετικό substate της GSK-3β [22], [23]. Η έκφραση του ρ-ΟδΚ3β ήταν σχετικά υψηλότερη στις ιδιαίτερα μεταστατικές κυτταρικές γραμμές από γονική κυτταρική σειρά τους (Σχήμα 2Β). Η θεραπεία με έναν ισχυρό αναστολέα της GSK-3β οδήγησε σε καταστολή της έκφρασης ρ-NDRG1, που συνοδεύεται από αυξητική ρύθμιση του Ε-καδερίνης και β-κατενίνης (Σχήμα 5D). Ωστόσο, δεν υπήρχε σχεδόν καμία διαφορά στην έκφραση της GSK-3β και ρ-GSK-3β από NDRG1 knockdown στα υψηλά μεταστατικά κύτταρα (Σχήμα 4Β), υποδηλώνοντας ότι η GSK-3β δεν μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην επαγωγή της ΕΜΤ μέσω NDRG1 σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα.

σαλιγκάρι είναι ένα αντιπροσωπευτικό παράγοντας μεταγραφής που ελέγχει την έκφραση Ε-καδερίνης [20]. Των διαφόρων ρυθμιστικών παραγόντων που ελέγχουν μεταγραφικά E-cadherin, η έκφραση του σαλιγκαριού διαμορφωνόταν ειδικά από NDRG1 σε γαστρικού καρκίνου κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI.