Αφηρημένο

Σκοπός

Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να αξιοποιήσει την πρωτεομική με βάση Συνεργατική ένζυμο Ενισχυμένη Αντιδραστική (CEER) ανοσολογική δοκιμή για τη διερεύνηση φωσφορυλιώσεις τυροσίνης των πρωτεϊνών ως διαγνωστικοί δείκτες στην γαστρικών καρκίνων (GCS).

Πειραματικός Σχεδιασμός

η πρωτεΐνη λύματα από φρέσκο-κατεψυγμένο 434 προχωρημένο στάδιο GCs αναλύθηκαν για φωσφορυλίωση της HER1, HER2, p95HER2, HER3, cMet, IGF1R και PI3K. Τα μοτίβα ενεργοποίησης οδού διαχωρίστηκαν με βάση τον όγκο κατάσταση HER2. Ιεραρχική ομαδοποίηση χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό coactivations μονοπάτι στο GCs. Προγνωστική αξία της μοτίβα ενεργοποίησης οδού προσδιορίστηκε συσχετίζοντας ελεύθερη νόσου χρόνους επιβίωσης των διαφόρων υποομάδων GC χρησιμοποιώντας ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier. CEER χρησιμοποιήθηκε επίσης για να προσδιοριστεί η παρουσία φωσφορυλιωμένη τυροσίνη καταρράκτες σηματοδότησης στα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (ΚΜΑ) και τα κύτταρα ασκίτη όγκου (ενεργοποιημένα Τ-λεμφοκύτταρα).

Αποτελέσματα

Χρησιμοποιώντας μια ανοσολογική δοκιμή νέων διαγνωστικών, CEER, εμείς αποδειχθεί η παρουσία p95HER2 και ταυτόχρονα ενεργοποιείται μονοπατιών σηματοδότησης σε ιστούς όγκων GC, ΚΜΑ και ενεργοποιημένα Τ-λεμφοκύτταρα που απομονώθηκαν από ασθενείς GC για πρώτη φορά. p95HER2 εκφράζεται σε ~77% του HER2 (+) GCs. Περίπου το 54% των GCs έχουν ενεργοποιηθεί HER1, HER2, HER3, cMet ή IGF1R και να επιδείξουν μια χειρότερη πρόγνωση από εκείνους όπου δεν ενεργοποιούνται αυτές οι κινάσες τυροσίνης (RTK). Ιεραρχική ομαδοποίηση των RTK αποκαλύπτει συν-ομαδοποίησης των φωσφορυλιωμένη HER1: cMet, HER2: HER3 και IGF1R-PI3K. Συνενεργοποίησης της HER1 με cMet καθιστά GCs με βραχύτερη ελεύθερης νόσου επιβίωση σε σύγκριση με μόνο cMet ενεργοποιηθεί GCs.

Συμπεράσματα

Η μελέτη μας υπογραμμίζει την χρησιμότητα μιας νέας τεχνολογίας διαγνωστικών τεστ, CEER που έχει ισχυρές επιπτώσεις για την ανάπτυξη φαρμάκων και θεραπευτικών παρακολούθησης. CEER χρησιμοποιείται για να παρέχει μια αυξημένη κατανόηση των ενεργοποιημένων οδών σηματοδότησης στην προηγμένη GCs που μπορεί να βελτιώσει σημαντικά την κλινική διαχείριση τους μέσω ακριβή επιλογή των ασθενών για στοχευμένη θεραπευτική

Παράθεση:. Lee J, Kim S, Kim P, Liu Χ, Lee T, Kim KM, et al. (2013) A Novel Πρωτεομική-Based Clinical Diagnostics Technology Αναγνωρίζει ετερογένεια σε ενεργοποιημένα τα μονοπάτια σηματοδότησης σε γαστρικών καρκίνων. PLoS ONE 8 (1): e54644. doi: 10.1371 /journal.pone.0054644

Επιμέλεια: Αντώνης W. I. Lo, το Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 20 του Σεπτέμβρη 2012? Αποδεκτές: 13 του Δεκέμβρη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 25 Γενάρη 2013

Copyright: © 2013 Lee et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Ενώ PK, XL, TL, ΝΗ, GH, AK, AJ, GM, GL και SS απασχολούνται από τον Προμηθέα Laboratories, αυτό δεν μεταβάλλει οι συγγραφείς » τήρηση όλων των PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

μοριακά στοχευμένες παράγοντες που επιτάχυναν το πεδίο της ογκολογίας. Δεδομένου ότι περίπου το ήμισυ του συστατικού της κινάσης της τυροσίνης του ανθρώπινου kinome εμπλέκεται σε καρκίνους του ανθρώπου, δεν αποτελεί έκπληξη ότι ένα μεγάλο ποσοστό των σημερινών θεραπευτικών στοχεύουν διάφορες κινάσες [1], [2]. Συνενεργοποίησης των κινασών τυροσίνης υποδοχέα (RTKs) έχει παρατηρηθεί σε υποσύνολα των πολλαπλών καρκίνων όπως πολύμορφο γλοιοβλάστωμα [3], ο καρκίνος του μαστού [2], [4], [5], [6], [7], ο καρκίνος του πνεύμονα [8 ], [9], καρκίνο κεφαλής και τραχήλου [7] και γαστρικού καρκίνου [4], [5], [6] ενοχοποιώντας έτσι τους όπως είναι απαραίτητο για την εξέλιξη του όγκου και την επιβίωση. Οι παρατηρήσεις αυτές παρέχουν επαρκή κλινική αιτιολογία για τη διαλογή ενεργοποιηθεί RTKs σε καρκίνους που μπορούν στη συνέχεια κατευθύνει τις θεραπευτικές στόχευση και ενδεχομένως να προσφέρουν γνώση για την ορθολογική συνδυαστικές θεραπευτικές στρατηγικές. Εντούτοις, η απλή ανάλυση της έκφρασης ή ενεργοποίησης κατάστασης ενός ενιαίου RTK που μπορεί να είναι η ειδική πρωτείνη στόχος για ένα συγκεκριμένο θεραπευτικό είναι ανεπαρκής για την επιλογή των ασθενών όσο συχνά φορές οι ασθενείς αδυνατούν να ανταποκριθούν στις θεραπείες, παρά την έκφραση του στόχου. Αρκετά πιθανά ζητήματα θα μπορούσε να είναι υπεύθυνος για μια τέτοια έλλειψη θεραπευτικού οφέλους από στοχευμένες παράγοντες, π.χ., 1) η ταυτόχρονη ενεργοποίηση των παράλληλων ή εναλλακτικές οδούς που παρακάμπτουν την αρχικά προβλεφθεί πρωτεΐνη (ες), και 2) η συνεχής μεταβολή της μοριακής και παθολογικά χαρακτηριστικά των νεοπλασματικών ιστούς κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου. Ως εκ τούτου, θα ήταν ιδανικό να έχουμε ένα διαγνωστικό εργαλείο σύντροφος που θα μπορούσε να εφαρμοστεί σε περιορισμένες ποσότητες των κλινικών δειγμάτων για να συλλάβει την συνολική πολυπλοκότητα της φωσφορυλιωμένης δικτύων σηματοδότησης στο νεοπλασματικό ιστό εκτός από τον άμεσο στόχο RTK πρωτεΐνη για την παρακολούθηση της «εξελισσόμενη» ασθένεια .

Στοχευμένη φωσφορυλίωση ανάλυση κλινικών δειγμάτων έχει παρεμποδιστεί λόγω της έλλειψης των άμεσα χρησιμοποιήσιμη κλινική δοκιμασίες που είναι αρκετά ευαίσθητη ώστε να λειτουργεί με περιορισμένες ποσότητες των κλινικών ιστών. Έχουμε αναφέρει προηγουμένως την ανάπτυξη ενός νέου ανοσοπροσδιορισμού με βάση την εγγύτητα, Collaborative Enzyme Ενισχυμένη Reactive-ανοσοδοκιμασία (CEER? Σχήμα S1) [6], η οποία είναι κατάλληλη για την ανάλυση τόσο της συνολικής έκφρασης και την κατάσταση ενεργοποίησης των καταρρακτών σηματοδότησης πρωτεΐνης. CEER μπορεί να πραγματοποιηθεί σε ένα πολυπλεγμένο τρόπο απευθείας επί κλινικών δειγμάτων που μπορεί να είναι διαθέσιμη σε περιορισμένες ποσότητες. Η δοκιμασία CEER χρησιμοποιεί το σχηματισμό ενός μοναδικού ανοσο-σύμπλεγμα που απαιτούν την συν-εντοπισμό του ενζύμου συζευγμένου με αντισώματα δύο ανιχνευτής μόλις τα πρωτεΐνες-στόχους έχουν συλληφθεί σε ένα μικροσυστοιχίας. Αυτή η μορφή επιτρέπει την αποτελεσματική και ευαίσθητη ανίχνευση των RTKs, καθώς και τα κατάντη οδός πρωτεΐνες προς τα κάτω στο επίπεδο απλού κυττάρου (α ευαισθησίας περίπου 100 zeptomoles). Σε αυτή τη μελέτη έχουμε χρησιμοποιήσει την δοκιμασία CEER να μελετήσει την πολυπλοκότητα σηματοδότηση και γαστρικών καρκίνων (GC).

GCs είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως με συχνότητα 18,9 /100.000 περιπτώσεις ανά έτος και θνησιμότητας ποσοστό 14,7 /100.000 ανά έτος [10] και είναι η πιο συχνή κακοήθεια στην Κορέα [11]. Μεταστατικό GC παραμένει μια θεραπευτική πρόκληση για την ιατρική ογκολόγους που οφείλονται στην κακή πρόγνωση της. Επί του παρόντος, η τραστουζουμάμπη είναι ο μόνος ενεργός παράγοντας στόχος που έχει αποδειχθεί ότι είναι αποτελεσματική για GC σε μια τυχαιοποιημένη μελέτη φάσης ΙΙΙ [12]. Ενώ η ενεργοποίηση αρκετών RTKs έχει αναφερθεί σε GCs, τις επιπτώσεις τους στην πρόγνωση GC είναι άγνωστη. Αυτό είναι σημαντικό για την ανάπτυξη και την εφαρμογή των θεραπευτικών για την κλινική διαχείριση των GCs.

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε την πολυπλεξία πλατφόρμα CEER για τον προσδιορισμό των επιπέδων του ενεργοποιημένου RTKs (HER1, HER2, συντετμημένες παραλλαγές του HER2, δηλαδή, p95HER2, HER3, cMet, PI3K, και IGF1R) σε 434 φρέσκα ιστούς κατεψυγμένα GC και προσπάθησε να κατηγοριοποιήσει τους ασθενείς GC στο δυναμικό υποομάδες με βάση τα πρότυπα τους, την ενεργοποίηση της οδού της πρωτεΐνης. Έχουμε παρατηρήσει πολλαπλές ενεργοποιήσεις πρωτεΐνη σήματος σε υποομάδες των όγκων GC που συσχετίζονται με την ελεύθερη νόσου επιβίωση (DFS) σε αυτούς τους ασθενείς. Ως εκ τούτου, υποθέτουμε ότι οι είσοδοι ενεργοποίησης περιττή οδού μπορεί να οδηγήσει σε υπολειμματικό κατάντη σηματοδότησης σε GCs, περιορίζοντας έτσι την αποτελεσματικότητα κατά του όγκου των μονοθεραπείες στοχεύουν ενάντια ενιαία RTKs. Τέλος, έχουμε αναπτύξει μια δυνητικά ισχυρό μεθοδολογία η οποία μπορεί να επιτρέψει τους κλινικούς γιατρούς να παρακολουθούν την αρχική τιμή και εξελισσόμενο μεταβολές στα προφίλ ενεργοποίηση RTK όγκου κατά τη διάρκεια μιας θεραπείας χρησιμοποιώντας κυκλοφορούντων κυττάρων όγκου (ΚΜΑ) και κακοήθη κύτταρα που απομονώνονται από το περιτοναϊκό υγρό (κύτταρα όγκου ασκιτών ή ενεργοποιημένα Τ-λεμφοκύτταρα ). Στο σύνολό τους, η μελέτη μας παρέχει στοιχεία για την ταυτόχρονη ενεργοποίηση RTK σε GC ανθρώπινους ιστούς, εκτός από την ίδρυση CEER ως ένα αποτελεσματικό κλινικό εργαλείο για τη διάγνωση και την παρακολούθηση της ενεργοποίησης RTK κατά τη διάρκεια της θεραπείας GC ή εξέλιξη της νόσου.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενής Colson και ιστών δειγμάτων Προμηθειών

Η μελέτη διεξήχθη μετά την έγκριση από το Ιατρικό Κέντρο του Διοικητικού κριτική Θεσμικών Samsung (SMC IRB) για την ενημέρωση παραίτηση συναίνεση χρησιμοποιώντας αρχειακό ιστούς με αναδρομική κλινικά δεδομένα. Τα πρωταρχικά δείγματα όγκων ήταν όλα συλλέγονται από τη Samsung Medical Center. Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε γαστρεκτομή με ριζική λεμφαδένων με θεραπευτική πρόθεση. Από Μάρτιος 2001 – Φεβρουάριος 2005, 447 κατεψυγμένα ιστούς που λαμβάνονται από 434 ασθενείς συλλέχθηκαν από χειρουργικά πρωτογενή γαστρικών όγκων και ήταν διαθέσιμα για την τελική ανάλυση. Όλα τα κατεψυγμένα ιστοί συλλέχθηκαν (εντός & lt? 30 λεπτά) στο χειρουργικό πεδίο και αμέσως καταψύχθηκαν και αποθηκεύθηκαν σε υγρό άζωτο μέχρι μεταγενέστερη χρήση. δείγματα όγκου επιβεβαιώθηκαν για την παρουσία & gt? 70% περιοχή του όγκου από τον παθολογοανατόμο. Για την ανάλυση, τα μικρά κομμάτια των κατεψυγμένων ιστών (10 μm τμήμα Χ3) παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας προψυχθέντα ξυριστική λεπίδα και λύθηκαν σε 100 μL ρυθμιστικού διαλύματος λύσης. Τα προϊόντα λύσης αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι την επακόλουθη ανάλυση

Η ιστοπαθολογική εξέταση Επανεξέταση και HER2 καθορισμού του καθεστώτος του

Όλα τα διαθέσιμα H & amp?. Ε-χρώση πλάκες κεντρικά επανεξετάζονται από δύο παθολόγους (ID, KKM ) σε πειραματικό πυρήνα παθολογία της Samsung Cancer Research Institute. Όλα τα δείγματα όγκων ήταν από χειρουργικά πρωτογενείς γαστρικών όγκων. κατάσταση του HER2 καθορίστηκε από την IHC και FISH. ανάλυση IHC διεξήχθη χρησιμοποιώντας το HercepTest ™ (Dako, Glostrup, Δανία). τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης HER2 βαθμολογήθηκαν ως 0 έως 3+, σύμφωνα με τις συστάσεις συναίνεση πάνελ στην HER2 σκοράροντας για GC [13], [14]. Για τα ψάρια, σετ καθετήρα PathVysion HER2 DNA (Abbott, Des Plaines, IL) χρησιμοποιήθηκε. Ariol σύστημα ανάλυσης εικόνας χρησιμοποιήθηκε για να μετρήσει τα σήματα υβριδοποίησης (Genetix, San Jose, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Όλα τα δείγματα με αναλογίες HER2 /CEP17 μεταξύ 1,8 και 2,2 βαθμολογήθηκαν με το χέρι μετρώντας πάνω από 60 μη-επικαλυπτόμενα κύτταρα. Αναλογίες & gt? 2.2, 1.8 – 2.2, ή & lt? 1.8 ταξινομήθηκαν ως θετικά, διφορούμενα ή αρνητικό για ενίσχυση, αντίστοιχα. Χρωμοσωμικές 17 πολυσωμία ορίστηκε ως σήμα CEP17 που είχαν πάνω από έξι αντίτυπα κατά μέσο όρο ανά κύτταρο. Από τα 447 δείγματα, 434 δείγματα συμπεριλήφθηκαν στην τελική ανάλυση.

Συνεργατική Enzyme Ενισχυμένη Reactive-ανοσολογική δοκιμή (CEER)

διαφάνειες CEER τυπώθηκαν, επωάστηκαν με λύματα GC και υποβάλλονται σε επεξεργασία όπως περιγράφεται παραπάνω [ ,,,0],6]. Διαφάνειες σαρώθηκαν σε τέσσερις ρυθμίσεις φωτοπολλαπλασιαστή (PMT) κέρδος για την αύξηση της πραγματικής δυναμικής περιοχής. Τα δεδομένα προσαρμόστηκαν σε μια εξίσωση πέντε παραμέτρων προκύπτει ως συνάρτηση της συγκέντρωσης αντισώματος σύλληψης και PMT και παρουσιάζονται στην υπολογιζόμενη μονάδες (ΝΜ).

εκτύπωση Πολυπλεκτικά-μικροσυστοιχιών.

αντισώματα Capture τυπώθηκαν σε γυάλινες πλάκες νιτροκυτταρίνης με επίστρωση (ONCYTE®, Γκρέις Bio-Labs) χρησιμοποιώντας εκτυπωτές μη-επαφής (Nanoplotter, gESIM). Η διάμετρος σημείο ήταν περίπου 175 μm. Τα πλακίδια διατηρήθηκαν σε αφυδατωμένο θάλαμο στους 4 ° C. Περίπου 500 pL σύλληψης Abs τυπώθηκαν εις τριπλούν σε σειριακή αραίωση συγκεντρώσεις 1 mg /ml, 0,5 mg /mL, και 0.25 mg /mL. Καθαρισμένο ποντίκι-IgGs χρησίμευσαν ως αρνητικοί έλεγχοι. Οι ανοσο-συστοιχία διαμορφώσεις ολίσθησης που φαίνεται στο Σχήμα S1.

σύζευξη αντισώματος και καθαρισμό.

Στόχευση-ειδικά αντισώματα (μονοκλωνικά ποντικού κατά συγκεκριμένων επιτόπων επί ανθρώπινων πρωτεϊνών μεταγωγής σήματος) και τις αντίστοιχες ένζυμα ανιχνευτή, οξειδάση γλυκόζης (GO) ή με υπεροξειδάση (HRP), ενεργοποιήθηκαν με διλειτουργικά διασταυρούμενης σύνδεσης, ηλεκτριμιδυλ-4- (Ν-μηλεϊμιδομεθυλο) κυκλοεξανο-1-καρβοξυλικό (SMCC), και συζευγμένο αποδίδοντας προϊόντα σύζευξης αντισώματος-ενζύμου. Προϊόντα σύζευξης καθαρίστηκαν με HPLC. Αντίσωμα δραστηριότητες στα καθαρισμένα προϊόντα σύζευξης προσδιορίστηκαν με ELISA ανταγωνισμού και οι ενζυμικές δραστηριότητες μετά σύζευξη ανιχνεύθηκαν με λειτουργικές δοκιμασίες ειδικές για κάθε ένζυμο ανιχνευτή.

δοκιμασίες CEER.

διαφάνειες Immuno-μικροσυστοιχιών ξεπλύθηκαν 2Χ με TBST (50 mM Tris /150 mM NaCl /0,1% Tween-20, ρΗ 7,2-7,4), αποκλείστηκαν με 80 μL Whatman Ρυθμιστικό Δέσμευσης για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, στη συνέχεια πλύθηκε 2Χ με TBST. Διαδοχικά αραιωμένα λύμα μάρτυρες ή σε δείγματα σε 80 μΙ ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης (2% BSA /0,1% TritonX-100 /TBS, ρΗ 7,2-7,4) προστέθηκαν σε καθορισμένα υπο-συστοιχίες σε διαφάνειες και επωάστηκαν για 1 ώρα σε RT. Τα πλακίδια πλύθηκαν 4Χ (3 λεπτά. Το καθένα), και Abs ανιχνευτής προστέθηκαν σε 80 μΙ ρυθμιστικού αντίδρασης και επωάστηκε για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά διαφάνειες πλύση με TBST προς απομάκρυνση του μη δεσμευμένου Abs ανιχνευτή, 80 μι διαλύματος βιοτίνης-τυραμιδίου (5 μg /ml σε 50 mM γλυκόζης /PBS) που παρασκευάζεται από 400 μg /mL σε διάλυμα αιθανόλης (Perkin-Elmer Life Science) προστέθηκε και επωάστηκε για 15 λεπτά σε σκοτάδι. διαδικασία ενίσχυσης σήματος GO /HRP μεσολάβηση τυραμιδίου τερματίστηκε με πλύση με TBST 4Χ, 3 λεπτά η κάθε μία. Τοπική εναπόθεση βιοτίνης-τυραμιδίου ανιχνεύθηκε με επώαση με στρεπταβιδίνη (SA) -Alexa647 (Invitrogen) σε 0,5 μg /mL σε 2% BSA /0,1% Triton /TBS για 40 λεπτά. Μετά την ολοκλήρωση της επώασης, διαφάνειες πλύθηκαν 4Χ με TBST, ξηραίνονται και φυλάσσονται στο σκοτάδι μέχρι να απεικονίστηκαν μέσω ενός σαρωτή μικροσυστοιχιών.

Για CEER ανάλυση των δεδομένων, διαφάνειες σαρώθηκαν σε τέσσερις ρυθμίσεις κέρδους PMT για να ενισχυθεί η αποτελεσματική δυναμική σειρά. εντάσεις σήματος Ιστορικό διορθωμένη τέθηκαν στον μέσο όρο για κηλίδες τυπωμένα εις τριπλούν. Διάφορα κριτήρια χρησιμοποιήθηκαν για να φιλτράρετε τα δεδομένα για περαιτέρω αναλύσεις, συμπεριλαμβανομένων των ορίων επί τόπου αποτυπώματα, συντελεστή μεταβλητότητας για spot επαναλήψεις, και η συνολική φόντο μαξιλάρι. Για κάθε προσδιορισμό, μια πρότυπη καμπύλη παρήχθη από σειριακά αραιωμένο κυτταρολύματα ελέγχου που παρασκευάζονται από κυτταρικές γραμμές με καλά χαρακτηρισμένες πρωτεΐνες μεταγωγής σήματος. Τα δεδομένα προσαρμόστηκαν σε μια εξίσωση πέντε παραμέτρων προκύπτει ως συνάρτηση της συγκέντρωσης αντίσωμα σύλληψης και ΡΜΤ. Η πρότυπη καμπύλη για κάθε δείκτη ήταν ταιριάζει ως συνάρτηση της έντασης του σήματος καταγραφής, μετρούμενη ως μονάδα σχετικό φθορισμό (RFU) έναντι της συγκέντρωσης log των κυτταρολυμάτων και αναφέρονται με το πρότυπο κυτταρικές γραμμές. Για παράδειγμα, πρότυπη καμπύλη σειριακά αραιωμένου κυτταρολύματα παρασκευάζονται από ΒΤ474 χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση της έκφρασης HER2 και ο βαθμός της φωσφορυλίωσης σε κάθε δείγμα (Εικόνα S2). Ως εκ τούτου, ένα δείγμα με 1 CU έκφρασης HER2 έχει την αξία που αντιστοιχεί RFU να RFU τιμή του 1 τυπική κυττάρων ΒΤ474 αναφοράς. Καθώς τα κύτταρα αναφοράς έχουν 1~2 × 10

6 HER1 ή HER2 υποδοχέων ανά κύτταρο με περίπου 10% φωσφορυλιωμένη υποδοχείς, 1 CU αποτελεί την έκφραση της 1~2 × 10

6 RTKs ή 1~2 × 10

5 φωσφορυλιωμένη RTKs [6]. Το όριο ανίχνευσης αξίας (LOD) με CU προσδιορίστηκε ότι είναι μικρότερο από 1 CU τόσο για την έκφραση και την ενεργοποίηση των HER2. Ατομική προβλέψεις από κάθε αραίωση και αύξηση κατά μέσο όρο σε μια ενιαία, τελική πρόβλεψη.

Κατατετμημένη HER2 Εμπλουτισμός

Ολόσωμη ρ 185-HER2 υποδοχέων είχαν εξαντληθεί από λύματα ιστού όγκου χρησιμοποιώντας μαγνητική χάντρα σε συνδυασμό αντισωμάτων ειδικά για εξωκυτταρική περιοχή (ECD) του HER2, όπως φαίνεται στο Σχήμα S3. Τα προκύπτοντα ρ185-HER2 εξαντλημένο προϊόντα λύσης, το οποίο περιείχε εμπλουτισμένη κολοβωμένες πρωτεΐνες υποδοχέα HER2 (t-HER2) λείπει η ECD, χρησιμοποιήθηκαν για μετέπειτα ποσοτικοποίηση της έκφρασης Τ-HER2 και φωσφορυλίωση χρησιμοποιώντας τις αντίστοιχες δοκιμασίες CEER. Μια κόψει αξίας 500 CU χρησιμοποιήθηκε για να σκοράρει για p95HER2 θετικότητα ανά 20 μg ιστού που αναλύθηκαν. Η συνολική τιμή της αποτίμησης p95HER2 ήταν σε σχέση με τα σήματα που παράγονται από τις πρότυπες καμπύλες που παράγονται χρησιμοποιώντας ένα προϊόν λύσης κυττάρων ελέγχου από τον καρκίνο των κυττάρων του μαστού γραμμή ΒΤ474.

κυτταρικής καλλιέργειας και αντιδραστηρίων

κυτταρικές γραμμές ελέγχου δοκιμασία CEER , MDA-MB-468, T47D, HCC827 και ΒΤ474 κύτταρα με ποικίλους βαθμούς έκφρασης erbB-RTK ελήφθησαν από την ATCC και αναπτύχθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2 – για MDA-MB-468 (κατά Dulbecco ελάχιστο βασικό μέσο (DMEM) + 10% FBS), ΒΤ474 (ϋΜΕΜ + 10% FBS), και HCC827 και T47D (RPMI 1640 + 10% FBS, 0,2 U /ml βόεια ινσουλίνη). Τα κύτταρα μετρήθηκαν και πλύθηκαν με 1 χ PBS πριν αυξητικού παράγοντα διέγερσης. MDA-MB-468 κύτταρα διεγέρθηκαν με 100 ηΜ του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) ή αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού α (ΤΟΡα), κύτταρα T47D διεγέρθηκαν με 20 ηΜ heregulin β (HRGβ) ή 100 ng /ml ινσουλίνη αυξητικός παράγοντας-1 (IGF1) σε μέσο ανάπτυξης άνευ ορού για 5 ή 15 λεπτά. Διεγερμένα κύτταρα πλύθηκαν με 1 χ PBS και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε λύση (ρυθμιστικό λύσης: 50 mM Tris, ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 1% Trition Χ-100 και 2 mM Na

3νο

4) και διατηρείται σε πάγο για 30 λεπτά πριν από τη λήψη του υπερκειμένου για μεταγενέστερη ανάλυση ή φυλάσσονται στους -80 ° C.

αποφασιστικότητα δείκτη CEER και ομαδοποίηση χάρτη θερμότητας

Θετικότητα για ένα συγκεκριμένο βιοδείκτη ορίστηκε ως μεγαλύτερο από το τρίτο τεταρτημόριο για ένα άτομο βιοδείκτη στον πληθυσμό της μελέτης αυτής ασθενούς. Οι ασθενείς ταξινομήθηκαν με βάση την τιμή CU από τη δοκιμασία CEER για ένα δεδομένο βιοδείκτη. Εκείνοι οι ασθενείς είναι μεγαλύτερη από την τρίτη cutoff τεταρτημόριο θεωρήθηκαν διατρέχουν υψηλότερο κίνδυνο να έχουν αυξημένα επίπεδα βιοδεικτών και επομένως δυνητικά ενεργοποιημένη οδούς σήματος. ανάλυση μετέπειτα επιβίωση έγινε για να εκτιμηθεί η κατηγορηματικό ποιότητα αυτών των cutoffs.

Το προφίλ βιοδεικτών των δειγμάτων όγκου εκπροσωπήθηκε από έναν χάρτη θερμότητας. Κάθε κυττάρων χρωματίζονται με βάση την κατάταξη δεκατημόριο της ενεργοποίησης του εν λόγω δείκτη. Κάθε δείκτης κατετάγη από δεκατημόρια, εκπροσωπούμενη από μια ξεχωριστή απόχρωση, με την κλίμακα που δείχνει το χρώμα. Τόσο η σειρά (ασθενή) και η στήλη (δείκτης) ομαδοποίηση φάνηκε. Η πλήρης αλγόριθμος σύνδεσης χρησιμοποιήθηκε για να ληφθεί μια ιεραρχική σύμπλεγμα (ή δενδρόγραμμα) με διαδοχική ομαδοποίηση των πιο συσχετίζεται παρατηρήσεις χρησιμοποιώντας τη λειτουργία hclust σε R, που ονομάζεται από τη λειτουργία heatmap.2 διατίθεται με τη βιβλιοθήκη gplots της στατιστικής περιβάλλοντος R: μία γλώσσα και περιβάλλον για στατιστικούς υπολογισμούς (https://www.r-project.org/). Υποομάδες των δεικτών ορίστηκαν με τη συσπείρωση που επέτρεψε συγκρίσεις προφίλ δείκτη για τους ασθενείς.

CTC και ATC απομόνωση

Για την αξιολόγηση της CTC, 7,5 ml δείγματα αίματος ελήφθησαν σε 10 ml εκκενώθηκαν αιθυλενοδιαμίνη τετραοξικό οξύ (EDTA) σωλήνες. Το Σύστημα CellSearch (Veridex) χρησιμοποιήθηκε για ανοσο-μαγνητικά απομόνωση CTC σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφηκε προηγουμένως [6] χρησιμοποιώντας ferrofluids συζευγμένο με Ab έναντι επιθηλιακών μόριο κυτταρικής προσκόλλησης. Για την αξιολόγηση ATC, κυτταρικά περιεχόμενα εμπλουτίστηκαν από 50 έως 100 κ.εκ. υγρό ασκίτη με φυγοκέντρηση και απομόνωση των κυττάρων του όγκου ανοσο-μαγνητικά διεξήχθη με παρόμοιο τρόπο. Πολλαπλές σειρές ενεργοποιημένα Τ-λεμφοκύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με κοκτέιλ των αυξητικών παραγόντων (EGF, HRG, HGF και IGF1) με ή χωρίς λαπατινίμπη και PHA-665752 συνδυασμός αναστολέα.

Αποτελέσματα και συζητήσεις

Τα χαρακτηριστικά των ασθενών

τα χαρακτηριστικά των 434 ασθενών GC παρέχονται στον πίνακα 1. Όλοι οι ασθενείς έλαβαν gastrectomies με D2 λεμφαδένων με 242 (55,8%) ασθενείς που έλαβαν υποσύνολο gastrectomies. Σύμφωνα με AJCC σύστημα σταδιοποίησης 2002, 86 ασθενείς είχαν παθολογική φάση Ι, 116 είχαν σταδίου ΙΙ, 126 είχαν σταδίου ΙΙΙ και 106 είχαν σταδίου IV (35 ασθενείς με μεταστατικό Μ1) GC. Κατά το χρόνο της ανάλυσης, 226 ασθενείς ήταν νεκροί και 237 ασθενείς είχαν τεκμηριωμένη επανάληψη. 70 ασθενείς είχαν καρκίνωμα σφραγιστικό δαχτυλίδι. Το 5-ετή συνολική και τα ποσοστά επιβίωσης ελεύθερης νόσου ήταν 52,4% και 50,0%, αντίστοιχα. Όλες οι πρωτεύοντες ιστούς GC είχαν αγοραστεί κατά το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης και αμέσως καταψύχθηκαν για μελλοντική μοριακή ανάλυση.

Η

δοκιμασίες που βασίζονται CEER αποκαλύπτουν ετερογένεια στην έκφραση HER2 και HER2 παρουσία κολοβωμένων παραλλαγή, p95HER2, σε HER2 ( +) γαστρικών καρκίνων

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν την ανάπτυξη των δοκιμασιών CEER ανοσο-μικροσυστοιχιών βασισμένη [6], [15]. Χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία HER2 CEER για τη διερεύνηση της κατάστασης HER2 των HER2 (+) και HER2 – δείγματα στην ομάδα των ασθενών GC μας που διαχωρίζονται με βάση το πρότυπο IHC HercepTest /ανάλυση FISH (). Το πλεονέκτημα των αναλύσεων που βασίζονται CEER είναι υψηλότερη ευαισθησία και εξειδίκευση τους σε σύγκριση με προσδιορισμούς IHC-based [6]. Με βάση τους ορισμούς για τους ΕΚ τρέχουσα HER2 (+) [13], [14], δηλαδή, τα δείγματα με σκορ HER2-IHC 3+ ή 2+ και ένα θετικό

HER2

καθεστώς ενίσχυσης του γονιδίου, 50 434 (11,5%) δείγματα στην ομάδα των ασθενών GC μας ήταν HER2 (+) με IHC HercepTest /ανάλυση FISH (Πίνακας S1). Αντιθέτως, σύμφωνα με τις οδηγίες IHC ειδικά για καρκίνους του μαστού, μόνο το 78% (39/50) από αυτούς τους ασθενείς ήταν HER2 (+) (Πίνακας S1) υποδεικνύοντας τις διαφορές σε κριτήρια βαθμολόγησης για HER2 θετικότητα μεταξύ γαστρικού και του μαστού. Η πλειοψηφία των GCs HER2 (+) (36 από 50 δείγματα (72%)) ήταν της εντερικής υποτύπου παρά τις διάχυτες ή μικτού τύπου GCs σε συμφωνία με δημοσιευμένες αναφορές [13], [16], [17].

δοκιμασία HER2 CEER που βασίζεται κατέδειξε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα έκφρασης HER2 σε IHC /FISH HER2 (+) όγκους σε σύγκριση με εκείνες του HER2 (-) όγκους (με μια μέση τιμή 77.9 CU έναντι 4,3 CU, p-value 8.18E-10), όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α. Τα δεδομένα HER2 CEER με βάση παρουσιάζεται στο CU, ένα πρότυπο λειτουργική μονάδα που βασίζεται σε κυτταρική σειρά ελέγχει με γνωστή έκφραση HER2 [6], η οποία επιτρέπει τη σύγκριση της έκφρασης HER2 απέναντι δείγματα. Μόνο 32/50 ή 64% του IHC /FISH HER2 (+) GCs αποδεικνύεται έκφραση HER2 από CEER και υπήρχε ένα σημαντικό επίπεδο της ετερογένειας στην έκφραση HER2 σε αυτά τα δείγματα, όπως αποκαλύφθηκε από τις ποσοτικές ενδείξεις CEER. Ετερογένεια στην έκφραση HER2 μπορεί να εξηγήσει το λόγο για μόνο ένα μέτριο βαθμό αντιστοιχίας (87,5%) μεταξύ του IHC και αναγνώσεις FISH για HER2 στη δοκιμή ToGA [12]. Αυτή η διαφορά θα επηρεάσει άμεσα την έκβαση των θεραπευτικών HER2-στοχευμένη, όπως trastuzumab σε GCs. Επιπλέον, λόγω της υψηλής ευαισθησίας του προσδιορισμού CEER, παρατηρήθηκε ότι περίπου 20% του IHC /FISH HER2 (-) GCs ακόμα εξέφρασε την απόλυτη HER2 αν και σε σαφώς χαμηλότερα επίπεδα από ό, τι το HER2 (+) πληθυσμό ασθενών

.

(Α) κατανομή CU για HER2 έκφρασης των δειγμάτων GC σε 0,25 μg λύμα. Η

x-άξονα

αντιπροσωπεύει την κατάσταση IHC /FISH, και το

y-άξονα

αντιπροσωπεύει τις τιμές CU από δοκιμασία CEER όπως προσδιορίζεται από μία πρότυπη καμπύλη ΒΤ474. Διαχωρισμός παρουσιάζεται μεταξύ των δύο ομάδων, με μέση τιμή 0 για την IHC /FISH αρνητικό πληθυσμό (384 από 434) σε σύγκριση με ένα μέσο όρο 11 για την IHC /FISH θετικό πληθυσμό (50 από 434). Ένα κορεσμένο δείγμα, πάνω από το όριο ποσοτικοποίησης και υποδεικνύεται ως «Αριθμός κορεσμένες» στον αντίστοιχο πίνακα, δεν φαίνεται. Κουτιά αντιπροσωπεύουν το διατεταρτημοριακό διάστημα, με την 75η εκατοστιαία στην κορυφή και το 25ο εκατοστημόριο στο κάτω μέρος. Η γραμμή στη μέση του κουτιού αντιπροσωπεύει τη μέση. Μουστάκια επεκταθεί με την υψηλότερη και τη χαμηλότερη τιμή μέσα σε 1,5 φορές το διατεταρτημοριακό εύρος.

P

αξία & lt? .001 Καθορίστηκε με Wilcoxon signed-rank test. (Β) διανομή CU για p95HER2 σε ένα υποσύνολο των δειγμάτων του όγκου (58 434) στους 20 μg λύματος. Η

x-άξονα

αντιπροσωπεύει την κατάσταση IHC, και το

y-άξονα

αντιπροσωπεύει τις τιμές CU από δοκιμασία CEER για P95. Πλήρους μήκους HER2 απομακρύνθηκε με ανοσο-εξάντληση πριν από τη δοκιμασία. Τα σημεία δεδομένων χρωματισμένα με βάση την κατάσταση του HER2 με ανοσοϊστοχημεία και FISH. Όπως φαίνεται, ένα σημείο δεδομένων με IHC 2 προσδιορίστηκε ότι είναι θετικά μέσω ανάλυσης FISH. Από τα 34 δείγματα που καθορίστηκε να είναι θετικό για την p95 από CEER, 24 (71%) από αυτούς ήταν HER2 (+) με IHC /FISH. έκφραση p95HER2 δεν μπορεί να προσδιοριστεί σε ένα δείγμα το οποίο αναφέρεται ως «Αριθμός ΝΑ ‘στον αντίστοιχο πίνακα.

Η

Χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα δοκιμασία p95HER2 CEER-based, ακρωτηριασμένες μορφές του HER2 ήταν ειδικά εντοπιστεί, εκτός από σε όλο το μήκος HER2, στην GCs για πρώτη φορά. έκφραση p95HER2 αναλύθηκε σε 31/50 HER2 (+) δείγματα και 27/384 HER2 (-) δείγματα) που έδειξαν σημαντική έκφραση πλήρους μήκους HER2 με CEER (Σχήμα 1Β). Η συχνότητα των p95HER2 σε HER2 (+) GCs ήταν ~77% (σε 24/31 δείγματα) (Πίνακας S1). Παρόμοια με την έκφραση πλήρους μήκους HER2, η πλειονότητα της έκφρασης p95HER2 (79% του p95HER2 εκφράζονται σε HER2 (+)) ανιχνεύθηκε σε εντερικό GCs τύπου. έκφραση p95HER2 παρατηρήθηκε επίσης σε ένα μικρό ποσοστό των HER2 (-) GCs (37% ή 10/27 δείγματα) που έδειξαν έκφραση πλήρους μήκους HER2. Ωστόσο, η μέση έκφραση p95HER2 στο HER2 δείγματα GC (+) ήταν σημαντικά υψηλότερο από εκείνο που παρατηρήθηκε σε HER2 (-) GCs (5083,6 CU με HER2 (+) vs 437,0 CU στο HER2 (-), p-value = 1.27e-05 ). p95HER2 μπορεί να συμβάλει στην τραστουζουμάμπη μη-αποκρισιμότητα σε όγκους GC όπως συμβαίνει σε 70-80% των HER2 καρκίνων του μαστού υπερεκφράζουν [18]. Trastuzumab συν τυπική χημειοθεραπεία καθίσταται μια συνολική απάντηση της μόνο το 47% σε HER2 (+) GCs στη δίκη ToGA [12] δείχνει ύπαρξη πιθανών μηχανισμών αντίστασης trastuzumab και την ανικανότητά μας να επιλέξει με ακρίβεια ανταποκρίθηκαν trastuzumab. Για να κλινικά επικύρωση έκφραση p95HER2 με την αντίσταση στην trastuzumab, η οποία υπήρξε αμφιλεγόμενη, ιδίως λόγω των πρόσφατων αντικρουόμενα ευρήματα από τις μελέτες για τον καρκίνο του μαστού GeparQuattro [19], αυστηρή φινέτσα δοκιμασία p95HER2 από την άποψη της κλινικά σχετική διαγνωστική δοκιμασία cut-off προσδιορισμούς και τη δυνατότητα εφαρμογής σε κλινικό περιβάλλον απαιτείται. Μια επικύρωση της έκφρασης p95HER2 έχει προγραμματιστεί σε μια εισαγωγική λαπατινίμπη φάσης ΙΙ συν χημειοθεραπεία κλινική δοκιμή σε ασθενείς με GC και αρκετές μελέτες προτείνουν τη χρήση της λαπατινίμπης σε p95HER2 (+) καρκίνους [20], [21].

Στο σύνολό τους , τα στοιχεία μας καθορίζουν με σαφήνεια την κατάσταση HER2 σε ΔΘ και να αποδείξει τη χρησιμότητα της διάγνωσης HER2 CEER που βασίζονται σε δείγματα ασθενών GC για τον προσδιορισμό της ακριβούς τους πλήρους μήκους και αποκομμένες έκφραση HER2. Η ανάπτυξη αυτών των διαγνωστικών θα επηρεάσει έντονα την ακριβή επιλογή των HER2 (+) GCs που ανταποκρίθηκαν στην τραστουζουμάμπη και άλλους παράγοντες που στοχεύουν HER2. Έχουμε αναφέρει προηγουμένως τη χρήση των διαγνωστικών HER2 CEER που βασίζεται σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού [6], [15] τα οποία καταδεικνύουν μία υψηλότερη ευαισθησία και εξειδίκευση σε σύγκριση με διαγνωστικά IHC-based.

γαστρικών καρκίνων αποδεικνύουν την ταυτόχρονη ενεργοποίηση του μονοπάτια

Χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία CEER απευθείας σε δείγματα GC για να εκτιμηθεί η παρουσία του συνόλου και φωσφορυλιωμένη (ενεργοποιημένη) μορφές αρκετών μορίων σηματοδότησης που είναι γνωστό φαρμακευτικών στόχων σηματοδότησης: αυτές περιλάμβαναν πολλές RTKs (HER1, HER2, HER3, cMet, IGF1R) και PI3K. Αντιπροσωπευτικά εικόνες των πολυπλεγμένων CEER οδού-συστοιχίες από οκτώ διαφορετικά δείγματα που φαίνεται στο Σχήμα 2Α. Αυτές οι εικόνες δείχνουν σαφώς την ετερογένεια σε ενεργοποιημένα υπογραφές μονοπάτι που επικρατεί στην GCs. Για παράδειγμα, τόσο HER1 /HER2 είναι coactivated σε δείγματα 1 και 6, ενώ μόνο HER2 ενεργοποιείται σε δείγμα 2 αν και HER1, HER2 και cMet εκφράζονται σε υψηλά επίπεδα. Δείγμα 5 δείχνει την ενεργοποίηση όλων των 5 αναλύονται RTKs συμπεριλαμβανομένου του κατάντη PI3K και μονοπάτια Shc. Η ακόλουθη ενότητα περιγράφει την ετερογένεια σηματοδοτικό μονοπάτι που παρατηρήθηκαν σε GC ομάδα των ασθενών μας, όπως καθορίζεται από τις δοκιμασίες CEER.

(Α) Εκπρόσωπος εικόνες ανοσο-array για μονοπατιού προφίλ της ενδεικνυόμενης πρωτεϊνών μεταγωγής σήματος. ένταση του σήματος Array κυμαίνεται από μαύρο /σκούρο μπλε (χαμηλή) σε κόκκινο /λευκό (υψηλή /κορεσμού). (Β) Heat χάρτη και ιεραρχική ομαδοποίηση των 434 δειγμάτων που βασίζονται σε αξίες CU από δοκιμασία CEER για φωσφορυλιωμένη δείκτες μετρώνται στα 10 μ συγκέντρωση g λύμα. Κάθε στήλη αντιπροσωπεύει έναν δείκτη και κάθε σειρά αντιπροσωπεύει ένα δείγμα ασθενούς. Τα σχετικά επίπεδα φωσφορυλίωσης απεικονίζεται με μια χρωματική κλίμακα όπου το κόκκινο αντιπροσωπεύει το υψηλότερο επίπεδο ενεργοποίησης και πράσινο αντιπροσωπεύει το χαμηλότερο επίπεδο. Οι τιμές CU για κάθε δείκτη (στήλη) ήταν ανάλογα με τη δεκατημόρια. Jitter, μεταξύ 0 και 0.1, προστέθηκε σε κάθε τιμή CU βιοδείκτη για τη δημιουργία ίσου μεγέθους κάδους. Σειρά και στήλη δενδρόγραμμα δείχνουν το αποτέλεσμα του υπολογισμού ιεραρχικής ομαδοποίησης.

Η

Οι όγκοι από 202 ασθενείς (46,5%) δεν είχαν ανιχνεύσιμη ενεργοποίηση των RTKs δοκιμάστηκε στη μελέτη μας. μοτίβα ενεργοποίησης Pathway για το υπόλοιπο των όγκων, όπως απεικονίζεται σε ένα ανάλυση μονοπάτι ομαδοποίησης (Σχήμα 2Β), ποικίλλουν ευρέως σε ορισμένες GCs αποδεικνύουν την ταυτόχρονη ενεργοποίηση πολλαπλών RTKs όπως HER2 /HER3, HER1 /2/3, HER1 /3 /cMet ή HER3 /cMet ενώ άλλοι φωσφορυλιώθηκαν μόνο σε μία μόνο πρωτεΐνη. Η περιεκτικότητα του όγκου όλων των δειγμάτων που αναλύθηκαν ήταν & gt? 70% με βάση την ιστολογική εξέταση τους. Ωστόσο, η έκφραση παν-κυτοκερατίνη (παν-CK) ήταν σαφώς μεταβλητή που υποδηλώνει ανομοιογένεια στην επιθηλιακό περιεχόμενο των GCs. Με βάση αυτό το προφίλ, θα κατηγοριοποιούνται το δείγμα ομάδα 434 GC σύμφωνα με υπογραφές ενεργοποίηση τους RTK και την κατάσταση του HER2

άξονα της στο γαστρικών καρκίνων. (Πίνακας 2 & amp? Πίνακας S1).

Η

τουλάχιστον ένα μέλος του υποδοχέα του άξονα της ήταν δραστηριοποιείται στο 41% ​​των ασθενών GC. φωσφορυλίωση HER2 ανιχνεύθηκε όχι μόνο στο 50% των ασθενών GC HER2 (+), αλλά και σε ~ 22% του HER2 (-) καρκίνων σε συμφωνία με την παρατηρούμενη συνολική έκφραση HER2 που περιγράφεται παραπάνω. 16/25 HER2 (+) δείγματα που έδειξαν ενεργοποιείται HER2 εξέφρασε επίσης p95HER2. Παρομοίως, HER3 επίσης φωσφορυλιώθηκαν σε ένα υψηλότερο ποσοστό του HER2 (+) GCs (36%) σε σύγκριση με HER2 (-) καρκίνους (~ 24%). Ωστόσο, φωσφορυλιωμένη HER1 δεν έχουν μια τέτοια προτίμηση και ισοδύναμα ενεργοποιείται σε δύο τύπους GC (26% σε HER2 (+) και 25% σε HER2 (-)). Επιπλέον, τα περισσότερα των ενεργοποιημένων μέλος όγκους GC HER (~ 64%) έδειξε ένα ταυτόχρονη ενεργοποίηση άλλων RTKs, δηλαδή, cMet ή IGF1R. Ιστολογικά, η πλειοψηφία του HER2 (+), εντερική τύπος ΔΘ εξέφρασε μια ενεργοποιημένη HER2 (σε 22/36 ή ~61%) ακολουθούμενη από HER3 (σε 13/36 ή -36%) με συνολικό 36% των εντερικών GCs τύπου που εκφράζουν ένα ενεργοποιημένο μονοπάτι HER2. Συνολικά, η ενεργοποίηση του HER2 ήταν περισσότερο συγκεντρωμένη σε εντερικό τύπο (55/154 ή 35,7%) σε σύγκριση με τους καρκίνους διάχυτου τύπου (43/225 ή 19,1%). Αντίθετα, ενεργοποιείται HER1 ήταν εξίσου παρατηρήθηκε τόσο στην εντερική τύπου (38/154 ή 24,7%) και διάχυτη τύπου (58/225 ή 25,8%) GCs. Ενεργοποιείται HER3 ήταν επίσης ισοδύναμα σήμερα (29,9% και 21,8%) μεταξύ των δύο υποτύπων κατάταξη της Lauren.

Καθώς η λειτουργία σηματοδότησης του άξονα κινάσης HER εξαρτάται από ενεργοποιείται διμερισμό υποδοχέα, εξετάσαμε τα διάφορα ζεύγη μέλους HER coactivations. Συνενεργοποίησης του HER2 με HER3 προτιμήθηκε σε HER2 (+) καρκίνους (13/50 ή 26%) με 7/13 HER2: HER3 ενεργοποιηθεί GCs χωρίς συνενεργοποίησης HER1. Περίπου το 54% του HER2: HER3 coactivated HER2 (+) GCs συνεκφράζονται p95HER2. Από την άλλη πλευρά, HER2 (-) GCs δεν επιδεικνύουν μία προτίμηση για κάθε συγκεκριμένο ζεύγος κινάσης HER διμερές με τις τρεις πιθανές ενεργοποιηθεί ζεύγη διμερές (HER1: HER2, HER1: HER3 και HER2: HER3) εκφράζεται σε -15% καθένα από HER2 (-) δείγματα. Τριπλή ενεργοποίηση /2/3 υποδοχείς HER1 παρατηρήθηκε στο 11,1% των GCs με οριακά υψηλότερα διανομής στην HER2 (-) καρκίνοι

cMet ενεργοποιηθεί γαστρικών καρκίνων (Πίνακας 3 & amp? Πίνακας S1).

.

Παρόμοια με HER1, φωσφορυλίωση cMet ήταν ισοδυνάμως κατανεμημένη μεταξύ HER2 (+) (22%) και HER2 (-) (~ 25%) GCs. Επιπλέον, ενεργοποιείται διανομή cMet βασίζεται στην histotype Lauren ήταν παρόμοια μεταξύ των εντερικών (48/154 ή 31,2%) και διάχυτη τύπου (55/225 ή 24,4%) GCs.

Η πλειονότητα των δειγμάτων που ενεργοποιείται GC cMet (~ 71% ή 77/108) έδειξε μια ταυτόχρονη ενεργοποίηση των μελών HER υποδοχέων κινάσης. Όλα τα δείγματα με μια φωσφορυλιωμένη cMet αποδειχθεί ένας

ενίσχυση cMet

(τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).