Αφηρημένο

CD44 και CD147 σχετίζονται με μετάσταση και την εξέλιξη του καρκίνου. Ο σκοπός μας στη μελέτη ήταν η διερεύνηση των επιπτώσεων της ρύθμισης προς τα κάτω της CD44 ή CD147 στην μεταστατική ικανότητα του καρκίνου του προστάτη (ΚΓΠ) κύτταρα, docetaxel (DTX) ανταπόκριση τους και των πιθανών μηχανισμών που εμπλέκονται

in vitro

και

in vivo

. CD44 και CD147 ήταν γκρέμισε (KD) σε κύτταρα CaP PC-3M-Luc χρησιμοποιώντας σύντομο RNA φουρκέτας (shRNA). Έκφραση των CD44, CD147, MRP2 (πολυ-φαρμάκου αντοχή πρωτεΐνη-2) και MCT4 (μονοκαρβοξυλικό tranporter-4) αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ανοσοφθορισμό και κηλίδωση Western. Η DTX δόσης-απόκρισης και ο πολλαπλασιασμός μετρήθηκε με προσδιορισμούς ΜΤΤ και αποικιών, αντίστοιχα. Η επεμβατική δυναμικό εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία θαλάμου matrigel. πρωτεΐνες μεταγωγής σήματος σε PI3K /Akt και μονοπάτια ΜΑΡΚ /ΕΚΚ αξιολογήθηκαν από κηλίδωση Western. Ένα

in vivo

υποδόρια (s.c.) μοντέλο ξενομοσχεύματος συστάθηκε για να εκτιμήσει CaP tumorigenecity, μεταστάσεις λεμφαδένα και απόκριση DTX. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι KD του CD44 ή CD147 μειώθηκε MCT4 και έκφραση MRP2, μειωμένο πολλαπλασιασμό ΚΓΠ και επεμβατικές δυνατότητες και αυξημένη ευαισθησία DTX? και KD του CD44 ή CD147 κάτω-ρυθμίζονται p-Akt και p-Erk, τα κύρια διαμορφωτές σήματος που σχετίζονται με την κυτταρική ανάπτυξη και επιβίωση.

In vivo

, CD44 ή CD147-KD PC-3M-Luc ξενομοσχευμάτων που αναγράφεται κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου με αυξημένη ανταπόκριση DTX σε σύγκριση με τον έλεγχο των ξένων μοσχευμάτων. Τόσο CD44 και CD147 ενισχύσει τη μεταστατική ικανότητα και χημειοαντίσταση των κυττάρων καπάκι, ενδεχομένως προκαλείται από την ενεργοποίηση των μονοπατιών της PI3K και ΜΑΡΚ. Επιλεκτική στόχευση του CD44 /CD147 μόνο του ή σε συνδυασμό με DTX μπορεί να περιορίσει CaP μετάσταση και την αύξηση χημειοευαισθησία, με την υπόσχεση για μελλοντική θεραπεία CaP

Παράθεση:. Hao J, Madigan MC, Khatri Α, Υδραυλικό CA, Hung TT, Beretov J, et al. (2012)

In Vitro

και

In Vivo

Καρκίνος του προστάτη Μετάσταση και χημειοαντίσταση μπορεί να ρυθμίζεται με έκφραση είτε CD44 ή CD147. PLoS ONE 7 (8): e40716. doi: 10.1371 /journal.pone.0040716

Συντάκτης: Dean G. Τανγκ, το Πανεπιστήμιο του Τέξας M.D. Anderson Κέντρο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1 Φλεβάρη 2012? Αποδεκτές: 12, Ιούν 2012? Δημοσιεύθηκε: 3, Αυγούστου, 2012

Copyright: © Hao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Εθνική Υγεία & amp? Συμβούλιο Ιατρικής Έρευνας (ΝΗ & amp? MRC) (YL), Ίδρυμα του Αγίου Γεωργίου Ιατρικής Έρευνας (YL), Ουρολογία Ταμείο Έρευνας (PJC) και του Αγίου Γεωργίου Trust Fund Νοσοκομείο (PHG). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (ΚΓΠ) είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στους άνδρες στις ΗΠΑ [1]. Ενώ αρχικά ανταποκρίνονται σε θεραπεία αποστέρησης ανδρογόνων (ADT), οι περισσότεροι ασθενείς πάσχουν από υποτροπή του καρκίνου μετά από 12 μήνες, και το καπάκι σε αυτό το στάδιο δεν είναι πλέον ιάσιμος [2]. Η εξέλιξη της CaP σε ένα προχωρημένο στάδιο χαρακτηρίζεται από τη διάδοση κακοηθών καρκινικών κυττάρων και μικρές συστάδες κύτταρο μέσω λεμφαγγείων και αιμοφόρων αγγείων. Παρά το γεγονός ότι αρκετές γενετικές και επιγενετικές αλλαγές αναφέρονται στην εξέλιξη της ΚΑΠ, ο κυτταρικούς μηχανισμούς που εμπλέκονται στην εξέλιξη των εντοπισμένων καπάκι για να μεταστατική νόσο παραμένουν απροσδιόριστες.

Η χημειοθεραπεία χρησιμοποιείται παραδοσιακά για την ανακούφιση των συμπτωμάτων που σχετίζονται με την προχωρημένη καπάκι. Δύο πρόσφατες docetaxel (DTX) -με βάση κλινικές μελέτες έχουν για πρώτη φορά παρουσιάζεται τα πιθανά οφέλη της χημειοθεραπείας να παρατείνει το χρόνο επιβίωσης και την ποιότητα ζωής των ασθενών CaP [3], [4]. DTX είναι σήμερα η πιο αποτελεσματική χημειοθεραπευτικό φάρμακο για μεταστατικό CaP [3] – [6]. Ωστόσο, η ανθεκτική στα φάρμακα της φύσης του Cap εξακολουθεί να αμφισβητεί την αποτελεσματικότητα αυτών των θεραπειών. Σαφώς, πολυφαρμακευτική αντίσταση και μεταστατικής νόσου παραμένουν τα κύρια αίτια της αποτυχίας της θεραπείας και θνησιμότητα σε ασθενείς καπάκι. Έτσι, είναι σημαντικής αξίας για τη διερεύνηση των μηχανισμών και τις οδούς του καλύμματος μετάστασης και αντοχής φαρμάκου, να εντοπίσει χρήσιμοι θεραπευτικοί στόχοι για τη βελτίωση των σημερινών θεραπευτικών μεθόδων.

CD44 είναι μια πολυλειτουργική πρωτεΐνη που εμπλέκεται στην κυτταρική προσκόλληση, η μετανάστευση, αντοχή φαρμάκου , μετάδοση σήματος, τη μετανάστευση και την απόπτωση [7], [8]. Το γονίδιο CD44 περιέχει 20 εξόνια εναλλακτικά ματισμένες να δώσει πολλές ισομορφές ή παραλλαγές (CD44v), μερικά από τα οποία σχηματίζουν το αναλλοίωτο εξωκυτταρική περιοχή του CD44 προτύπου (CD44s). CD44 είναι ένας κύριος υποδοχέας για υαλουρονάνη (ΗΑ), ένα κύριο συστατικό της εξωκυττάριας μήτρας (ECM) και κρίσιμη για την κυτταρική σηματοδότηση και κυτταρική ECM αλληλεπιδράσεις στον καρκίνο. CD44-ΗΑ σύνδεση διεγείρει κατάντη επιδράσεις επί των πρωτεϊνών του κυτταροσκελετού εμπλέκονται στην μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων, καθώς και την τόνωση protein1 πολυφαρμακευτική αντίσταση (

MDR1

) έκφραση και αντοχής φαρμάκου [9]. CD44s είναι παρούσα στην μεμβράνη των περισσοτέρων κυττάρων σπονδυλωτών [7]. Η έκφραση ορισμένων παραλλαγών CD44 έχει αναφερθεί να σχετίζεται στενά με την εξέλιξη του όγκου, και αυτό ποικίλλει ανάλογα με τον τύπο του όγκου που μελετήθηκαν [10]. Ενδιαφέρον μελέτες έχουν ενοχοποιηθεί αλληλεπιδράσεις ΗΑ /CD44 σε επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ), «βλαστική ικανότητα» και του καρκίνου [11], [12]. Η αλληλεπίδραση μεταξύ ΗΑ και CD44 έχει δειχθεί ότι ενεργοποιούν οδούς που σχετίζονται με την ανάπτυξη όγκου και επιβίωση [13], [14]. Ωστόσο, ο ρόλος της CD44s και CD44v στην ανάπτυξη και εξέλιξη της ΚΓΠ είναι διαφορετική, με μελέτες που δείχνουν τόσο τον όγκο προώθηση (CD44v) επιδράσεις αναστολής όγκου (CD44s) και [15] – [17]. Η συμμετοχή των CD44 και τις παραλλαγές του στο Cap εξέλιξη και μεταστάσεις εγγυάται περαιτέρω διερεύνηση.

CD147 (εξωκυττάρια μήτρα μεταλλοπρωτεϊνάσης επαγωγέα πρωτεΐνη-EMMPRIN) είναι μια πολυλειτουργική γλυκοπρωτεΐνη που μπορεί να τροποποιήσει μικροπεριβάλλον του όγκου ενεργοποιώντας πρωτεϊνάσες, προκαλώντας αγγειογενετικών παραγόντων και στις δύο όγκου και στρωματικά κύτταρα, και που ρυθμίζουν την ανάπτυξη και την επιβίωση των κυττάρων ανεξάρτητη από προσκόλληση όγκου (μικρομεταστάσεων), καθώς και αντοχή πολυφαρμάκου [18]. ανάλυση μεταγραφικό και συγκριτική γενωμική υβριδοποίησης μεμονωμένων κυττάρων όγκου που απομονώνονται από το μυελό των οστών των ασθενών με CaP έδειξε ότι CD147 είναι η πιο συχνά εκφρασμένη πρωτεΐνη σε πρωτογενείς όγκους και μικρομεταστάσεων [19]. Επιπλέον, η αυξημένη έκφραση CD147 συνδέεται με αυξημένους κινδύνους συμπεριλαμβανομένων ειδικό προστατικό αντιγόνο (PSA) ανεπάρκεια, μετάσταση, και μειωμένη συνολική επιβίωση σε ανθρώπινο CaP [20]. Πρόσφατα έδειξε ότι τα υψηλά επίπεδα έκφρασης CD147 συσχετίζονται με την εξέλιξη CaP και σχετίζονται με την έκφραση των ΜΜΡ (μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας) σε όγκο όσο και τα στρωματικά κύτταρα [21]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι CD147 θα μπορούσε να είναι ένας χρήσιμος θεραπευτικός στόχος για θεραπεία καπάκι. Ωστόσο, ο ρόλος του CD147 στο Cap μετάσταση και η αντίσταση του φαρμάκου παραμένει ασαφής.

Στην παρούσα μελέτη, υποθέσαμε ότι (1) CD44 και έκφραση CD147 συσχετίζονται με το μεταστατικό ικανότητα και χημειοαντίσταση της ΚΓΠ και μπορούν να συνεργαστούν για να επηρεάσει την εξέλιξη και CaP (2) προς τα κάτω ρύθμιση του CD44 ή έκφραση CD147 θα μπορούσαν να έχουν θεραπευτικό δυναμικό για τον περιορισμό CaP μετάσταση και την ενίσχυση CaP χημειοθεραπευτικών ευαισθησία. Έχουμε αποδείξει στις ακόλουθες ενότητες που CD44 και CD147 προσδίδουν ιδιότητες σημαντικές για κάλυμμα μετάσταση και χημειοαντίσταση

in vitro

και

in vivo

, και είναι χρήσιμοι θεραπευτικοί στόχοι για τη μελλοντική θεραπεία της ΚΓΠ.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα

τα αντισώματα ελήφθησαν από διαφορετικές πηγές. Οι λεπτομερείς πληροφορίες και όροι για όλα τα αντισώματα παρατίθενται στον Πίνακα 1.

Η

Κυτταρική σειρά και κυτταρική καλλιέργεια

Το ανδρογόνο που δεν ανταποκρίνονται PC-3M-Luc-C6 (PC- 3M-Luc) Κάλυμμα κυτταρική σειρά ελήφθη από Xenogen Corp, USA. Όλα τα αντιδραστήρια καλλιέργειας ιστού παρασχέθηκαν από την Invitrogen Australia Pty Ltd (Melbourne, VIC, Australia), εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. PC-3M-Luc κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% (ο /ο) θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS), 50 U /mL πενικιλίνη, και 50 U /mL στρεπτομυκίνης. PC-3M-luc-SCR (κωδικοποιημένο έλεγχος shRNA), PC-3M-Luc-CD44-knockdown (KD), κύτταρα PC-3M-Luc-CD147-KD αναπτύχθηκαν στο ίδιο μέσο συμπληρωμένο με επιπλέον 1 μg /mL πουρομυκίνη για διαλογή. Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε ένα υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C και 5% CO

2.

Short φουρκέτα RNA (shRNA) επιμόλυνσης για CD44 /CD147

PC-3M-Luc κυττάρων με τη μεσολάβηση shRNA KD του CD44 (s και ν) /CD147 ή ένα κωδικοποιημένο αλληλουχία ελέγχου για επιδράσεις εκτός στόχου (PC-3M-luc-scr) δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας μια προηγουμένως δημοσιευμένη μέθοδο με τροποποίηση [22]. Πέντε MISSION® λεντοϊού σωματίδια μεταγωγής κωδικοποίηση Τα siRNAs εναντίον CD44 ή CD147 και MISSION® μη στοχευόμενα σωματίδια μεταγωγής ελέγχου shRNA χρησιμοποιήθηκαν (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Κάστρο Hills, Νέα Νότια Ουαλία, Αυστραλία) (Πίνακας S1). Εν συντομία, 2 χ 10

4 PC-3M-Luc κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και μεταγωγή με πέντε κλώνους λεντοικής σωματιδίων ή την ίδια ποσότητα σωματιδίων μεταγωγής μη στοχευόμενων ελέγχου shRNA ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (πολλαπλότητα μόλυνσης = 2, ιογενείς μονάδες μεταγωγής /κύτταρο). Τα μεταδιηγερμένα κλώνοι επελέγησαν σε μέσο κυτταρικής καλλιέργειας πουρομυκίνη-που περιέχει (0.5 μg /mL) (Invitrogen Australia Pty Ltd, Μελβούρνη, VIC, Australia), πολλαπλασιάζονται και τελικά μεταφέρονται στα 25 cm

φιάλες καλλιέργειας 2 κυττάρων και διατηρήθηκαν σε μέσο που περιέχει 1,0 μg /mL πουρομυκίνη για τα ακόλουθα πειράματα.

ανοσοφθορισμού συνεστιακή μικροσκοπία ανάλυση του PC-3M-Luc και PC-3M-Luc-KD κυτταρικές σειρές

χρώση ανοσοφθορισμού διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [23]. Εν συντομία, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες μονιμοποιήθηκαν, ξεπλύθηκαν και επωάστηκαν με διάφορες πρωτογενή αντισώματα για όλη τη νύχτα (Ο /Ν) στους 4 ° C: αντι-ανθρώπινο CD44 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (MAb) (1:200 αραίωση), CD147 πολυκλωνικό αντίσωμα (PAb ) (1:100 αραίωση), MRP2 MAb (1:50 αραίωση), κουνέλι αντι-ανθρώπινο MCT1 Pab (1:200 αραίωση) ή MCT4 Pab (1:400 αραίωση). Μετά το ξέπλυμα σε TBS, τα κύτταρα επωάστηκαν για 45 λεπτά σε Alexa Fluor-488 κατσίκας αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού IgG Alexa Fluor-488 κατσίκας (1:1000 αραιώσεις) σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) (0.2 mg /L) χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση των πυρήνων. Οι αρνητικοί έλεγχοι έλαβαν θεραπεία με τον ίδιο τρόπο αλλά επωάστηκαν είτε με το ποντίκι ή ισοτυπικό έλεγχο κουνέλι. Ανοσοφθορισμός οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα FV300 /FV500 της Olympus σάρωσης με λέιζερ συνεστιακό μικροσκόπιο (Olympus, Tokyo, Japan).

κηλίδωση Western ανάλυση

επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης προσδιορίσθηκαν με ανάλυση Western blotting όπως περιγράφεται [24] . Εν συντομία, προϊόντα λύσεως πλήρων κυττάρων διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα Bis-Tris NuPAGE 4-12% Νονβχ και στη συνέχεια μεταφέρονται σε μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου. Μετά τον αποκλεισμό των μη ειδικών θέσεων με 5% αποβουτυρωμένο γάλα, η μεμβράνη επωάστηκε με ειδικά αντισώματα σε κατάλληλες συγκεντρώσεις (Πίνακας 1), που ακολουθείται από επώαση με υπεροξειδάση αρμορακίας (HRP) δευτερογενή αντισώματα (αντι-ποντικού κατσίκας ή κατσίκας αντι- κατάλληλες κουνέλι, για το είδος του ξενιστή του πρωτογενούς αντισώματος) (1:5000 αραίωση). Ανοσοαντιδραστικές ζώνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL) υπόστρωμα (Pierce Chemical Co, Rockford, USA), και απεικονίζεται με τη χρήση του συστήματος ImageQuant LAS4000 (GE υγειονομική περίθαλψη, USA). Για να επιβεβαιώσετε ίση φόρτωση των προϊόντων λύσης πρωτεΐνης, μεμβράνες γδύθηκαν (Επαναφορά Western Blot απογύμνωσης Buffer, Pierce) και την εκ νέου ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το ποντίκι αντι-

β

τουμπουλίνης MAb (1:10000 αραίωση), τότε σε επεξεργασία όπως παραπάνω. Οι εικόνες επεξεργάστηκαν με το Adobe Photoshop.

Co-ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) δοκιμασία

κυτταρολύματος που περιείχαν 200 μg ολόκληρο κυτταρολύματα από το PC-3M-Ιυο κυττάρων, επωάστηκε με 2 μg του αντι- CD44 ή αντισωμάτων αντι-CD147 (ABS) ή (έλεγχος Ig) κανονικό ορό ο /η στους 4 ° C. Τα ανοσοσύμπλοκα απομονώθηκαν με καταβύθιση με χρήση πρωτεΐνης Α /G PLUS-αγαρόζης (Santa Cruz Biotechnology, Inc, USA) για 8 ώρες στους 4 ° C. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν 4 φορές σε 1000

g

και αιωρήθηκαν σε 20

μ

L ρυθμιστικού δείγματος NuPAGE LDS (Invitrogen Australia Pty Ltd, Australia), στη συνέχεια θερμαίνεται στους 100 ° C για 5 λεπτά . Εκχυλίσματα στη συνέχεια ανοσοστυπώθηκαν με CD44 και CD147 πρωτογενή αντισώματα, που ακολουθείται από επώαση με συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα και ανιχνεύεται με τη χρήση ECL υποστρώματος. Η ανάλυση εικόνας έγινε όπως περιγράφεται ανωτέρω (κηλίδωση Western).

ΜΤΤ δοκιμασία για απόκριση DTX

προσδιορισμοί ΜΤΤ διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ένα εύρος συγκεντρώσεων (0,001 έως 1000 ηΜ) DTX αραιωμένο σε 100% αιθανόλη, και ελέγχου του οχήματος. Μετά από 72 ώρες επώαση, το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει 0.5 mg /mL ΜΤΤ [3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου]. Μετά από 4 ώρες, τα υπερκείμενα απομακρύνθηκαν και το προκύπτον ΜΤΤ φορμαζάνης διαλυτοποιούνται σε DMSO και μετριέται φασματοφωτομετρικά στα 562 nm σε ΒΙΟ-ΤΕΚ αναγνώστη μικροπλάκας (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν την αναλογία OD του DTX-αγωγή και τα κύτταρα υπό αγωγή με όχημα. Η καμπύλη αναστολής ανάπτυξης δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα GraphPad Prism 4 (GraphPad, San Diego, CA, USA). Απόλυτη IC

50 τιμές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη διασταύρωση του κανονικοποιημένη απόκριση φαρμάκου 50% και τις καμπύλες αναστολής ανάπτυξης για κάθε κυτταρική σειρά, να βρείτε τις τιμές x άξονα για IC

50 συγκέντρωση DTX (nM).

Colony δοκιμασίες που σχηματίζουν

PC-3M-Luc και τα κύτταρα PC-3M-Luc-KD χρησιμοποιήθηκαν για αναλύσεις σχηματισμού αποικιών όπως περιγράφηκε προηγουμένως με μικρές τροποποιήσεις [25]. Εν συντομία, 1.500 κύτταρα /δίσκο σπάρθηκαν σε δίσκους των 10 cm για 48 ώρες στους 37 ° C, 5% CO

2 και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με μία σταθερή δόση των DTX σε 3.5 ηΜ τελική συγκέντρωση (1/2 δόση της χαμηλότερης IC

50 από τη δοκιμασία ΜΤΤ σε τέσσερις κυτταρικές σειρές ΚΓΠ) ή τον ίδιο όγκο ελέγχου του οχήματος (100% αιθανόλη). Μετά τη θεραπεία 3 ημέρες, η DTX περιέχον μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο και όλες οι καλλιέργειες επωάστηκαν για επιπλέον 7 ημέρες μέχρις ότου οι αποικίες ήταν αρκετά μεγάλη για να διακρίνεται σαφώς. Οι αποικίες, ορίζονται ως ομάδες & gt? 50 κύτταρα, βαθμολογήθηκαν με το χέρι με τη βοήθεια ενός Ολύμπου INT-2 ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Τόκιο, Ιαπωνία). Ο μέσος αριθμός των αποικιών χαράχθηκαν (Μέση τιμή ± SD, η = 3).

Matrigel δοκιμασία εισβολής

Επεμβατική ικανότητα των κυτταρικών σειρών ΚΓΠ προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας εμπορικά matrigel και να ελέγχουν μεταξύ φρεατίων θαλάμους (BD Bioscience , NSW, Αυστραλία). Εν συντομία, 2 × 10

4 PC-3M-Luc, PC-3M-Luc-scr, PC-3M-Luc-CD44-KD και PC-3M-Luc-CD147-KD CaP κύτταρα σε 500 μλ ελεύθερο ορού μέσο προστέθηκαν σε κάθε transwell εισάγετε και 750 μί πλήρες μέσο προστέθηκε στο εξωτερικό καλά για να παρέχουν χημειοελκτική και την πρόληψη της αφυδάτωσης. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2 για 24 ώρες και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ένα κιτ χρώσης Diff-Quik (Υποταγή Healthcare Corp, McGraw Park, Illinois, USA). Η περίσσεια βαφής πλένεται μακριά με νερό της βρύσης και τον αριθμό των χρωματισμένων κυττάρων που εισέβαλαν μέσω Matrigel ή τον έλεγχο ένθετα μετρήθηκε σε πέντε πεδία υψηλής ισχύος (HPF) με οπτικό μικροσκόπιο (Leica μικροσκόπιο, Nussloch, Γερμανία). Επιθετική πιθανότητα υπολογίστηκε ως εξής:% Εισβολή = [(Mean κύτταρα εισβάλλουν μέσω Matrigel εισάγετε μεμβράνη) /(μέση κύτταρα που μεταναστεύουν μέσω ενθέτου μεμβράνης ελέγχου)] χ 100%. τα ποσοστά των κυττάρων εισβολή χαράχθηκαν, με μέση και SD (n = 3).

υποδόρια (SC) ξενομοσχεύματος ζωικό μοντέλο

Άνδρας, ηλικίας 6-8 εβδομάδων Balb /c γυμνά ποντίκια (Animal Πόρων Κέντρο, Δυτική Αυστραλία) στεγάστηκαν κάτω από ειδικές συνθήκες άνευ παθογόνου σε εγκαταστάσεις εγκεκριμένες από το Πανεπιστήμιο της Νέας Νότιας Ουαλίας (UNSW) Φροντίδα ζώων και Επιτροπής Δεοντολογίας (ACEC) και οι χειρισμοί έγιναν στα γραφεία στρωτή ροή. Η ACEC εγκριθεί ειδικά αυτή τη μελέτη (ID έγκρισης είναι 10 /121Α). Τα ποντίκια διατηρήθηκαν τουλάχιστον 1 εβδομάδα πριν από την πειραματική χειραγώγηση. Όλα τα ποντίκια παρέμειναν υγιή και ενεργή κατά τη διάρκεια του πειράματος. Όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26], καλλιεργημένα PC-3M-Luc, PC-3M-Luc-scr, PC-3M-Luc-CD44-KD ή PC-3M-Luc-CD147-KD CaP κύτταρα (1,5 χ 10

6 /ένεση) σε 100 μλ DPBS εμφυτεύθηκαν υποδορίως στη δεξιά πίσω περιοχή πλευρό των ποντικών (η = 10 ποντικοί /ανά ομάδα). Η πρόοδος του όγκου τεκμηριώθηκε εβδομαδιαία από μετρήσεις χρησιμοποιώντας δαγκάνες, και οι όγκοι του όγκου υπολογίστηκαν ως εξής: μήκος Χ πλάτος Χ ύψος × 0,52 (σε χιλιοστά) [27], για μέχρι και 8 εβδομάδες. Μετά την θυσία, πρωτογενών όγκων και των τοπικών περιφερειακών λεμφαδένες αφαιρέθηκαν για ιστολογική εξέταση.

ανταπόκριση DTX σε Cap υποδορίως ζωικό μοντέλο

Μετά την ίδρυση υποδορίως μοντέλα με κυτταρικές σειρές καπάκι, όταν το μέσο μέγεθος του όγκου έφθασε 30 ± 10 cm

3 σε κάθε υποομάδα (η = 10 /υποομάδα), 5 ποντίκια (η = 5) έλαβαν αγωγή με 25 mg /kg DTX συνεχώς για 3 εβδομάδες με ip ένεση, και 5 ποντίκια (η = 5) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με έκδοχο ελέγχου (φυσιολογικός ορός). ανάπτυξη του όγκου υπολογίστηκε από μετρήσεις χρησιμοποιώντας δαγκάνες όπως δημοσιεύθηκε [27].

ιστούς Ποντίκι και ιστολογία

Όλοι οι ιστοί είτε φορμόλη σταθερό ή καταψύχθηκαν. Αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η & amp? Ε) -stained τομές εξετάστηκαν για την αξιολόγηση διάρθρωση των όγκων. ξενομοσχεύματα όγκων και των τοπικών τοπικούς λεμφαδένες συλλέχθηκαν στο τέλος των πειραμάτων και επεξεργασία για ιστολογία, ανοσοϊστοχημεία και δοκιμασία TUNEL. Πέντε-micron κατεψυγμένα τμήματα των φρέσκων δειγμάτων όγκου χρησιμοποιήθηκαν για CD31 και CD44 ανοσοχρώση.

Η ανοσοϊστοχημεία

Οι τυποποιημένες διαδικασίες ανοσοϋπεροξειδάσης χρησιμοποιήθηκαν για να απεικονίσει CD147, Ki-67, και της κασπάσης-3 (ενεργό) όπως προγενέστερα είχαν δημοσιευθεί [28]. Εν συντομία, τομές παραφίνης αποκηρώθηκαν και επανυδατώθηκαν, στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα (Ab) αντι-CD147 (1:200), Ki-67 (1:1000 αραίωση) και κασπάσης-3 (ενεργό) (1:100 αραίωση), αντιστοίχως ο /η στους 4 ° C. Τα πλακίδια στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-χοίρων κατσίκα, ποντίκι, δεύτερο αντίσωμα IgG κουνελιού βιοτινυλιωμένο (1:150 αραίωση) επί 45 λεπτά σε RT και με στρεπταβιδίνη διάλυμα /HRP (1:300 αραίωση) επί 30 λεπτά σε RT. Οι τομές αναπτύσσεται τελικά με 3,3 ‘διαμινοβενζιδίνη (DAB) διάλυμα υποστρώματος (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Κάστρο Hills, Νέα Νότια Ουαλία, Αυστραλία), στη συνέχεια με αιματοξυλίνη? θετικών κυττάρων εμφανίστηκε καφέ. πλάκες ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον ίδιο τρόπο και χρησιμοποιώντας τον ισότυπο Abs ή παραλείποντας πρωτογενές αντίσωμα ως αρνητικός έλεγχος.

CD44 και CD31 ανοσοχρώση επί τομών κατεψυγμένου πραγματοποιήθηκαν όπως προηγουμένως δημοσιευθεί (28). Οι τομές επωάστηκαν με αντίσωμα ποντικού αντι-ανθρώπινης CD44 (1:200 αραίωση) ή αρουραίου αντι-ποντικού CD31 MAb (1:100 αραίωση) ο /η στους 4 ° C. Οι τομές επωάστηκαν με αντι-ποντικού κουνελιού /αρουραίο βιοτινυλιωμένο IgG (1:200 αραίωση) για 45 λεπτά σε RT, και στη συνέχεια με στρεπταβιδίνη συζευγμένη HRP (1:200 αραίωση) /για άλλα 30 λεπτά. Τμήματα αναπτύχθηκαν με το διάλυμα DAB (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Κάστρο Hills, Νέα Νότια Ουαλία, Αυστραλία), και αντίθετα με αιματοξυλίνη. Για αρνητικούς ελέγχους, οι τομές χρωματίστηκαν με το MAb ισότυπο ή με παράλειψη πρωτογενή αντισώματα.

δοκιμασία χρώσης TUNEL αποπτωτικών κυττάρων

in vivo

Η

Η απόπτωση εκτιμήθηκε με τους ιστούς ξενομοσχεύματος όγκου χρησιμοποιώντας η μέθοδος TUNEL με το TdT-fragEL in situ κιτ ανίχνευσης αποπτωτικά (Calbiochem, San Diego, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ιδιαιτερότητα του TUNEL αντιδραστικότητας επιβεβαιώθηκε με σχετική αρνητική (TdT παραλείπεται από το μίγμα επισήμανση) και θετική (αντιμετωπίζονται HL-60 διαφάνειες που παρέχονται από την εταιρεία) ελέγχους. Διαφάνειες εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας μια Leica μικροσκόπιο φωτός (Nussloch, Γερμανία).

Αξιολόγηση της ανοσοκηλιδώσεως

ένταση χρώσης (0-3) αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας οπτικό μικροσκόπιο (Leica, Γερμανία) και μια αντικειμενική x40 . Τα κριτήρια που χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση ήταν όπως έχει ήδη αναφερθεί [29], όπου: 0 (αρνητική, & lt? 25%)? 1+ (ασθενής, 25-50%)? 2+ (μέτρια, 50-70%)? 3+ (ισχυρή, & gt? 75%) των κυττάρων του όγκου χρωματίζονται. Αξιολόγηση της χρώσης του ιστού έγινε, ανεξάρτητα, από τρεις έμπειρους παρατηρητές (JH, JB και YL). Όλα τα δείγματα βαθμολογήθηκαν τυφλά και λήφθηκε ο μέσος όρος των βαθμών.

Η στατιστική ανάλυση

Όλα τα αριθμητικά δεδομένα εκφράστηκαν ως ο μέσος όρος των τιμών που λαμβάνονται, και την τυπική απόκλιση (SD) υπολογίσθηκε. Τα δεδομένα από διαφορετικές ομάδες συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας το t τεστ Student δύο ουρά του. Όλα τα

P

τιμές ήταν 2 όψεων. Η στατιστική ανάλυση των ανοσοκηλιδώσεως ένταση σε ξενομοσχεύματα ζώο εκτελέστηκε όπως περιγράφεται σε μια πρόσφατη δημοσίευση [28]. Η μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από post hoc δοκιμασία του Dunnett, εκτελέσθηκε για τον προσδιορισμό της σημασίας των διαφορών μεταξύ των καμπυλών ανάπτυξης σε s.c. μοντέλο για μεταβολές του όγκου του όγκου.

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. Όλες οι αριθμητικές στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του GraphPad Prism 4.00 πακέτο (GraphPad, San Diego CA).

Αποτελέσματα

Η έκφραση του CD44, CD147, MCT4 και MRP2 σε CD44 ή CD147-KD και τον έλεγχο κυτταρικές σειρές

PC-3M-Luc και κυτταρικές σειρές PC-3M-Luc-scr CaP έδειξε ισχυρή θετική χρώση για CD44, CD147, MCT4 και MRP2 (Εικ. 1Α). Μετά CD44 γκρεμίζω, η μείωση της έκφρασης CD44 συσχετίστηκε επίσης με ταυτόχρονη μείωση των επιπέδων έκφρασης του CD147, MCT4 και MRP2 (Εικ. 1Α). Ομοίως, μετά να χτυπήσει κάτω CD147, τα επίπεδα έκφρασης CD147 μειώθηκαν και η συνακόλουθη μείωση στα επίπεδα της έκφρασης του CD44, MCT4 και MRP2 παρατηρήθηκε επίσης (Σχ. 1Α). Καμία ανιχνεύσιμη χρώση παρατηρήθηκε στα κύτταρα που επωάστηκαν με ελέγχους ισοτύπου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα αποτελέσματα χρώσης ανοσοφθορισμού σε διαφορετικές CaP κυτταρικές γραμμές συνοψίζονται στον Πίνακα 2. Τα αποτελέσματα ανοσοφθορισμού για την έκφραση του CD44, CD147, MCT4 και MRP2 σε κυτταρικές γραμμές CaP επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με κηλίδωση Western (Εικ. 1Β). κυτταρολύματα PC-3M-Luc επίσης ανοσοκαταβυθίστηκαν είτε με αντι-CD44 αντίσωμα, αντι-CD147 αντίσωμα ή φυσιολογικό ορό (Ig), και ανοσοστυπώθηκαν με CD44 και CD147 Abs (Εικ. 1 C). Τόσο CD44 (90 kDa) και CD147 (-50 kDa) ανιχνεύτηκαν ζώνες σε αντι-CD44 και αντι-CD147 αντίσωμα προϊόντα λύσης IP αντίστοιχα, αλλά όχι στην Ig καθιζάνει λύμα.

Αντιπροσωπευτικές εικόνες συνεστιακή του CD44, CD147 , MCT4 και MRP2 (πράσινο) ανοσοφθορισμού μετά από να χτυπήσει κάτω CD44 ή CD147 (Α). Οι πυρήνες χρωματίστηκαν με ΡΙ (κόκκινο). Μεγέθυνση: όλες οι εικόνες × 400. Αντιπροσωπευτικά στύπωμα western φαίνεται να επιβεβαιώνουν την χρώση ανοσοφθορισμού (Β). β-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. scr: ομελέτα έλεγχο shRNA. PC-3M-Luc λύματα κυττάρων ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-CD44, αντι-CD147 αντίσωμα, και φυσιολογικό ορό (Ig) ακολουθούμενη από ανοσοστύπωμα είτε με CD44 ή αντισώματα CD147 (C). IB: ανοσοαποτύπωση? IP:. Ανοσοκαταβύθιση

Η

Νοκ κάτω των CD44 ή CD147 ευαισθητοποιεί τα κύτταρα μονοστιβάδας καπάκι για να DTX θεραπεία

in vitro

Η

KD (PC-3M-Luc -KD-CD44 και PC-3M-Luc-KD-CD147) και ελέγχου (PC-3M-Luc και PC-3M-Luc-SCR) Κάλυμμα κυτταρικές σειρές με διαφορετικά επίπεδα έκφρασης CD44 και CD147 απάντησε με διαφορετικό τρόπο για να DTX θεραπεία. Το IC

50 τιμές (η δόση για την απόκτηση του 50% θανάτωση κυττάρων) συσχετίζεται έντονα με τα επίπεδα του CD44 και της έκφρασης CD147 (Εικ. 2Α). Κατά συνέπεια, τα κύτταρα ελέγχου PC-3M-Luc και PC-3M-Luc-SCR (υψηλά επίπεδα CD44 και CD147) ήταν η λιγότερο ευαίσθητη (IC

50: 118 και 104 nM, αντίστοιχα), ενώ το PC-3M-Luc -CD44-KD κύτταρα και PC-3M-Luc-CD147-KD (χαμηλά επίπεδα CD44 και CD147) ήσαν πολύ ευαίσθητα σε θεραπεία DTX (IC

50: 7 και 19 ηΜ, αντίστοιχα). Σημαντικές διαφορές (

P

& lt? 0,05) στο IC

50 παρατηρήθηκε μεταξύ του PC-3M-Luc-CD44-KD /PC-3M-Luc-CD147-KD κύτταρα και PC-3M-Luc /PC-3M-Luc-scr κύτταρα.

PC-3M-Luc, PC-3M-Luc-scr, PC-3M-Luc-CD44-KD και PC-3M-Luc-CD147-KD CaP κύτταρα κατεργασμένα με DTX (0.001-1000 ηΜ) έδειξε μεταβλητή απόκρισης. Ευαισθησία των κυττάρων CD44 /CD147-KD σε διαφορετικές συγκεντρώσεις DTX σε σύγκριση με ελέγχους προφανώς αυξάνεται κατά ΜΤΤ δοκιμασία (Α) (

P

& lt? 0,01). Τέσσερις κυτταρικές σειρές CaP σπάρθηκαν σε δίσκους των 10 cm και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με μία σταθερή δόση DTX (3,5 ηΜ) για 3 ημέρες. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο ανάπτυξης για 7 d. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως ο αριθμός των αποικιών που σχηματίστηκαν. Τυπικές εικόνες εμφανίζονται για ανάπτυξη αποικίας σε κυτταρικές σειρές CaP σε επεξεργασία με VC ή DTX (Β). Τα τυπικά αποτελέσματα της ευαισθησίας DTX σε αποικίες των κυτταρικών γραμμών πώματος που φαίνεται (C): «▴» δείχνει ότι δεν υπάρχει σημαντική διαφορά στο μέσο αριθμό των αποικιών μεταξύ των κυττάρων σε επεξεργασία DTX και VC επεξεργασμένα κύτταρα σε PC-3M-luc /PC-3Μ- Luc-scr κυτταρικές σειρές (

P

≥0.05)? «○» υποδεικνύει σημαντική διαφορά στο μέσο αριθμό των αποικιών μεταξύ των κυττάρων σε επεξεργασία DTX και VC επεξεργασμένα κύτταρα σε PC-3M-Luc-CD44-KD /PC-3M-Luc-CD147-KD κυτταρικές γραμμές (

P

& lt? 0,05)? κυτταρικές γραμμές «Δ» υποδεικνύει σημαντική διαφορά στο μέσο αριθμό των αποικιών μεταξύ των κυττάρων σε επεξεργασία DTX σε PC-3M-Luc-CD44-KD /PC-3M-Luc-CD147-KD και VC επεξεργασμένα κύτταρα σε PC-3M-Luc /PC κυτταρικές σειρές -3M-Luc-SCR (

P

& lt? 0,05). δοκιμασία Matrigel εισβολή χρησιμοποιήθηκε για να μελετηθεί η μεταβολή του δυναμικού εισβολής σε PC-3M-Ιυο, PC-3M-Luc-scr και τα κύτταρα PC-3M-Luc-CD44 /CD147-KD. Επεμβατική δυναμικό μειώθηκε σημαντικά σε 25% και 50% σε PC-3M-Luc-CD44-KD και PC-3M-Luc-CD147-KD αντίστοιχα, σε σύγκριση με 69% και 64% σε PC-3M-Luc και PC-3M -luc-scr, αντίστοιχα (

P

& lt? 0,01) (D). Εκπρόσωπος εικόνες οπτικό μικροσκόπιο για κάλυμμα κυττάρων εισβολής (Ε). Τέσσερα μόρια μεταγωγής σήματος (ρ-Akt, t-Akt, ρ-Erk και t-Erk) αξιολογήθηκαν για τη διερεύνηση της σχέσης μεταξύ CD44, CD147 και κυτταρική σηματοδότηση μονοπατιών. Τα επίπεδα του p-Akt και ρ-Erk μειώθηκαν σε κυτταρικές σειρές KD σύγκριση με το αγρίου τύπου και τους ελέγχους scr. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα φαίνονται (F). Όλα τα αποτελέσματα ήταν από τρία ανεξάρτητα πειράματα (Mean ± SD, η = 3). DTX: docetaxel? KD: γκρεμίζω? p-Akt: φωσφορυλιωμένη-Akt? p-ΕΚΚ: φωσφορυλιωμένη-Erk? scr: ομελέτα έλεγχο shRNA? t-Akt: ολική Akt? t-ΕΚΚ: ολική ΕΚΚ? VC: τον έλεγχο του οχήματος? * Υποδηλώνει 0,01 & lt?

P

& lt? 0,05? ** Υποδεικνύει 0.001 & lt?

P

& lt? 0,01? *** Δεικνύει

P

& lt? 0.001

Η

Νοκ κάτω των CD44 ή CD147 μειώνει κλωνογονικού ικανότητα και ευαισθητοποιεί αποικίες καπάκι για να DTX θεραπεία

Για να διερευνηθεί αν KD. του CD44 και CD147 επηρεάζουν την κλωνογονικότητας του είτε μόνο του είτε σε συνδυασμό με θεραπεία DTX, αξιολογήσαμε KD και κυττάρων CaP ελέγχου σε καλλιέργεια. Ο αριθμός των αποικιών μειώθηκε σημαντικά είτε με τον έλεγχο του οχήματος ή με τη θεραπεία DTX σε PC-3M-Luc-CD44 ή κύτταρα CD147-KD σύγκριση με PC-3M-Luc ή PC-3M-Luc-scr κύτταρα, ενώ δεν υπήρχε σημαντική διαφορά (

P

≥0.05) μεταξύ του αριθμού των αποικιών που παράγεται από PC-3M-Luc και τα κύτταρα PC-3M-Luc-scr. Σημαντικές διαφορές (

P

& lt? 0,05) στο μέσο αριθμό των αποικιών παρατηρήθηκε 1) μεταξύ DTX κατεργασμένα κύτταρα και VC κατεργασμένα κύτταρα σε PC-3M-Luc-CD44-KD /CD147-KD κυτταρικές σειρές? 2) μεταξύ DTX αντιμετωπίζονται PC 3M-Luc-CD44-KD-κύτταρα /CD147-KD και VC αντιμετωπίζονται PC-3M-Luc /PC-3M-Luc-scr κύτταρα. Αντιπροσωπευτικές εικόνες παρουσιάζονται στο Σχ. 2Β. Η απόκριση DTX σε κυτταρικές γραμμές CD147-KD PC-3M-Luc-CD44 ή ήταν μεγαλύτερη από την PC-3M-Luc και κυτταρικές σειρές PC-3M-luc-SCR (Σχ. 2C). Η κλωνογενοποιήσεως (μέσος DTX-θεραπεία αποικίες /μέσο όχημα μάρτυρα αποικίες%) ήταν 89%, 84%, 56% και 74% για PC-3M-Luc, PC-3M-Luc-scr, PC-3M-luc- CD44-KD, και PC-3M-Luc-CD147-KD κυτταρικές σειρές, αντίστοιχα.

Νοκ κάτω των CD44 ή CD147 μειώνει την εισβολή των κυττάρων CaP

Μετά από να χτυπήσει κάτω CD44 ή CD147, κυτταρική εισβολή μειώθηκε σημαντικά τόσο για PC-3M-Luc-CD44-KD (

P

& lt? 0.001) και τα κύτταρα PC-3M-Luc-CD147-KD (

P

& lt? 0,01) σε σύγκριση με το PC-3M-Luc και τα κύτταρα ελέγχου PC-3M-Luc-SCR (Σχ. 2D). Μια σχετικά μεγαλύτερη μείωση της ικανότητας εισβολής βρέθηκε σε κύτταρα PC-3M-Luc-CD44-KD παρά σε κύτταρα PC-3M-Luc-CD147-KD (Σχ. 2D). Το ποσοστό εισβολή για PC-3M-Luc, PC-3M-Luc-scr, PC-3M-Luc-CD44-KD και τα κύτταρα PC-3M-Luc-CD147-KD ήταν 70%, 62%, 22%, και 47 % αντίστοιχα (Σχ. 2D). Αντιπροσωπευτικές εικόνες για κάθε κυτταρική γραμμή που φαίνεται στο Σχ. 2Ε.

Τα PI3K /Akt και ΜΑΡΚ /ΕΚΚ οδών σηματοδότησης που σχετίζονται με την έκφραση του CD44 και CD147 σε κύτταρα CaP

Μετά από να χτυπήσει κάτω CD44 ή CD147, βρήκαμε ότι η έκφραση της p- Akt και p-ΕΚΚ και οι δύο προς τα κάτω σε κύτταρα PC-3M-Luc-CD44 ή CD147-KD σε σύγκριση με το PC-3M-Luc και τα κύτταρα ελέγχου PC-3M-Luc-scr, με πιο σημαντική μείωση της PC-3M-luc- κύτταρα CD44-KD? δεν υπήρχε καμία εμφανής αλλαγή στο t-Akt και την έκφραση t-ΕΚΚ σε όλα τα CaP κυτταρικές σειρές (Σχ. 2F).

Νοκ κάτω των CD44 ή CD147 επηρεάζει ογκογενετικότητας, μεταστάσεις στους λεμφαδένες και η ευαισθησία DTX σε μια υποδόρια μοντέλο ξενομοσχεύματος

Όπως φαίνεται στις γραφικές παραστάσεις της ανάπτυξης του όγκου στο Σχ. 3Α, σε σύγκριση με τον έλεγχο SCR, οι εβδομαδιαίες μετρήσεις του CD44 και CD147 KD ξενομοσχεύματα, αγωγή είτε με έκδοχο ελέγχου (VC) ή DTX (25 mg /kg), έδειξε μια σημαντικά μειωμένο ποσοστό ανάπτυξης όγκου τόσο VC (

P

& lt? 0,05) και DTX-αγωγή ομάδες (

P

& lt? 0,05) (στα αριστερά και μεσαία πλαίσια). Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές του ρυθμού αύξησης του όγκου των PC-3M-Luc άγριου τύπου και PC-3M-Luc-scr ξενομοσχευμάτων είτε VC ή DTX αντιμετωπίζονται ομάδες (

P

& gt? 0,05). Σε VC-αγωγή ξενομοσχευμάτων, μια ελαφρώς ισχυρότερη υποχώρηση της ανάπτυξης του όγκου παρατηρήθηκε σε CD44 KD ξενομοσχεύματα συγκρίθηκε με CD147 KD ξενομοσχεύματα, ενώ καμία προφανής διαφορά βρέθηκε μεταξύ της ανάπτυξης του CD44 KD και CD147 KD όγκους (

P

& gt? 0.05). Στα ξενομοσχεύματα DTX-αγωγή, οι ξενομοσχεύματα όγκου από τις τέσσερις κυτταρικές σειρές CaP είχαν μικρότερους όγκους όγκου σε σύγκριση με τις αντίστοιχες VC-αγωγή ξενομοσχευμάτων σε όλα τα χρονικά σημεία (

P

& lt? 0,05). Ελαφρώς πιο υποχώρηση του όγκου φαίνεται στα DTX-αγωγή CD44-KD ξενομοσχεύματα αλλά καμία σημαντική διαφορά βρίσκεται μεταξύ CD44-KD και καμπύλες ανάπτυξης CD147-KD (

P

& gt? 0,05). Επιπλέον, συγκρίναμε την αναλογία των όγκων του όγκου μεταξύ DTX και VC αντιμετωπίζονται ξενομοσχεύματα (DTX /VC) (Σχ. 3Α, δεξί πάνελ). Η αναλογία των CD44-KD και οι όγκοι του όγκου CD147-KD (DTX /VC) μειώθηκε ταχύτερα σε απόκριση DTX ή θεραπεία VC, γεγονός που υποδηλώνει ότι η Kd του είτε CD44 ή CD147 μπορεί να επάγει καταστολή της ανάπτυξης του όγκου, σε σύγκριση με το SCR και άγριας πληκτρολογήστε ξενομοσχεύματα.

καμπύλες ανάπτυξης όγκου για PC-3M-Luc, PC-3M-Luc-scr, PC-3M-Luc -CD44-KD και PC-3M-Luc-CD147-KD ξενομοσχεύματα εμφανίζονται είτε με VC (η πλοκή στα αριστερά) ή με θεραπείες DTX (το οικόπεδο στη μέση). Η αναλογία DTX αγωγή έναντι VC αντιμετωπίζονται οι όγκοι του όγκου (DTX /VC) παραστάθηκε γραφικά από την έναρξη της θεραπείας μέχρι το τέλος του πειράματος (φαίνεται στο διάγραμμα στα δεξιά) (Α). Στο τέλος των πειραμάτων, το βάρος του όγκου από PC-3M-CD44-KD και PC-3M-Luc-CD147-KD ποντίκια ομάδα προφανώς μειωμένη σε σύγκριση με εκείνη από το PC-3M-Luc και PC 3M–Luc-scr ποντίκια ομάδα με VC και θεραπείες DTX (

P

& lt? 0,05) (Β). Αντιπροσωπευτικές εικόνες για τα μεγέθη των όγκων και των μεταστάσεων λεμφαδένα από διαφορετικές ομάδες και θεραπείες εμφανίζονται (C). DTX: docetaxel? KD: γκρεμίζω? scr: ομελέτα έλεγχο shRNA?