Αφηρημένο

Καθώς ο καρκίνος του προστάτη εξελίσσεται σε ευνουχισμό ανθεκτική νόσο, υπάρχει μια αύξηση της δραστηριότητας μεταγωγής σήματος. Οι περισσότεροι ευνουχισμός ανθεκτικά όγκους του προστάτη συνεχίζουν να εκφράζουν τον υποδοχέα ανδρογόνων (AR), καθώς και γονίδια που αποκρίνονται στο ανδρογόνο, παρά την σχεδόν απουσία των κυκλοφορούντων ανδρογόνων σε αυτούς τους ασθενείς. Η AR ρυθμίζεται όχι μόνο από συγγενή στεροειδή ορμόνη της, αλλά και από τις αλληλεπιδράσεις με έναν αστερισμό από κοινού ρύθμισης και σηματοδότηση μορίων. Έτσι, η αυξημένη δραστηριότητα της σηματοδότησης που λαμβάνει χώρα κατά τη διάρκεια της εξέλιξης σε αντίσταση ευνουχισμός μπορεί να επηρεάσει την προστάτη ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, είτε μέσω του AR ή ανεξάρτητο από το AR. Προκειμένου να προσδιοριστούν τα μονοπάτια σηματοδότησης που ρυθμίζουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη, θα προβληθεί ένα πάνελ Τα siRNAs που στοχεύουν 673 ανθρώπινα κινάσες έναντι καρκινικών κυττάρων LNCaP του προστάτη που αναπτύσσονται παρουσία και απουσία ορμόνης. Η οθόνη που προσδιορίζονται πολλαπλούς κλώνους shRNA έναντι γνωστών και νέων στόχων γονίδιο που ρυθμίζουν την αύξηση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Με βάση το μέγεθος της επίδρασης στην ανάπτυξη, έχουμε επιλέξει έξι κινάσες για περαιτέρω μελέτη: MAP3K11, DGKD, ICK, CIT, GALK2 και PSKH1. Knockdown αυτών των κινασών μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων και στις δύο ανδρογόνο-εξαρτώμενη και ευνουχισμός ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Ωστόσο, αυτές οι κινάσες είχε διαφορετικά αποτελέσματα επί της βασικής ή ανδρογόνο επαγόμενη μεταγραφική δραστηριότητα των γονιδίων στόχων AR. MAP3K11 νοκ ντάουν μεταβληθεί πιο σταθερά τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων AR, γεγονός που υποδηλώνει ότι MAP3K11 επηρεάζονται ανασταλτική της επίδραση της ανάπτυξης με τη διαμόρφωση του προγράμματος AR μεταγραφικό. Συνεπής με MAP3K11 δρουν στο AR, νοκ ντάουν της MAP3K11 ανέστειλε AR Ser 650 φωσφορυλίωση, υποστηρίζοντας περαιτέρω την πίεση ρύθμισης της κινάσης της φωσφορυλίωσης AR. Η μελέτη αυτή καταδεικνύει την εφαρμοσιμότητα του λεντοϊού που βασίζονται shRNA για τη διεξαγωγή φαινοτυπική οθόνες και προσδιορίζει MAP3K11, DGKD, ICK, CIT, GALK2, και PSKH1 ως ρυθμιστές της ανάπτυξης του προστάτη καρκινικών κυττάρων. Η διεξοδική αξιολόγηση αυτών των κινασών στόχων θα ανοίξει το δρόμο για την ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών θεραπειών για τον ευνουχισμό ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη

Παράθεση:. Whitworth Η Bhadel S, M Ivey, Conaway M, Spencer Α, Hernan R, et al. (2012) Προσδιορισμός των κινασών Ρύθμιση καρκίνου του προστάτη ανάπτυξη των κυττάρων χρησιμοποιώντας μια οθόνη RNAi Φαινοτυπικής. PLoS ONE 7 (6): e38950. doi: 10.1371 /journal.pone.0038950

Επιμέλεια: Jindan Yu, του Πανεπιστημίου Northwestern, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11 Ιαν 2012? Αποδεκτές: 15η Μάη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 27 του Ιούν 2012

Copyright: © 2012 Whitworth et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας Grant R01 CA124706 στην ΓΔ και του Paul Mellon Ινστιτούτο Καρκίνου Ουρολογικής στο Πανεπιστήμιο της Βιρτζίνια. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεις: Andrea Spencer, Ronald Hernan και Heather Holemon απασχολούνταν σε Sigma-Aldrich Βιοτεχνολογία κατά τη διάρκεια της οθόνης RNAi. Sigma-Aldrich πωλεί την βιβλιοθήκη αποστολή που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο υποδοχέας ανδρογόνων (AR) είναι ένας κρίσιμος ρυθμιστής της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη και είναι ολοένα και πιο σαφές ότι η AR ρυθμίζεται όχι μόνο από συγγενή στεροειδή ορμόνη της, αλλά και από τις αλληλεπιδράσεις με έναν αστερισμό κοινού ρύθμισης και σηματοδότηση μορίων [1] – [3]. Για τους ασθενείς που παρουσιάζουν με διάχυτη καρκίνο του προστάτη, ο όγκος εξαρτάται τυπικά από ανδρογόνων για την ανάπτυξη και ως εκ τούτου, αρχικά αποκρίνεται σε χειρουργικές και /ή φαρμακολογικές εξάντληση των κυκλοφορούντων ανδρογόνων [4]. Ωστόσο, η θεραπευτική επιτυχία είναι προσωρινή. Ο καρκίνος σχεδόν πάντοτε επανέρχεται και εξελίσσεται σε μεταστατική και θανατηφόρα ασθένεια. Η εκτεταμένη διαγώνια συζήτηση μεταξύ των οδών σηματοδότησης, όπως ανδρογόνων και πεπτίδιο οδών σηματοδότησης, πολλαπλές γενετικές μεταλλάξεις, και τη γενετική πλαστικότητα του καρκίνου, όλα συμβάλλουν στην έμφυτη και επίκτητη αντοχή σε ανδρογόνων [5].

Προηγούμενες μελέτες έχουν αποδείξει ότι οδούς μεταγωγής σήματος παράγοντα ανάπτυξης πολυπεπτιδίου μπορεί να διεγείρει την ενεργοποίηση AR, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αύξηση του αυξητικού παράγοντα και την έκφραση του υποδοχέα θα μπορούσε να αιτιώδης σε εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη σε αντίσταση ευνουχισμό. διέγερση αυξητικού παράγοντα έχει αναφερθεί να καταστήσει AR-αποκρίσιμων προαγωγών υπερευαίσθητοι σε ανδρογόνων [6] – [14], και την αναγκαστική υπερέκφραση του HER2 /neu σε εξαρτώμενη από ανδρογόνο καρκινικών κυττάρων του προστάτη έχει αποδειχθεί ότι οδηγεί ευνουχισμό ανθεκτικά Ανάπτυξης [15] , [16]. Επιπλέον, η αναστολή της EGFR σηματοδότησης /HER2 μπορούν να αναστείλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη

in vitro

και

in vivo

[17], [18], καθώς και AR μεταγραφική δραστικότητα, σταθερότητα πρωτεΐνης, DNA δεσμευτική , και Ser 81 φωσφορυλίωσης [19]. Η ικανότητα των καταρρακτών σηματοδότησης για να επηρεάσει τη λειτουργία AR μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη, όπου η αύξηση της δραστηριότητας μεταγωγής σήματος έχει συνδεθεί με την απόκτηση του ευνουχισμού ανθεκτική νόσο. Αυτό υποδηλώνει ότι οι θεραπευτικές στρατηγικές που στοχεύουν κινασών μπορεί να ξεπεράσει τα αντισταθμιστικών μηχανισμών σηματοδότησης που περιορίζουν την αποτελεσματικότητα των ανδρογόνων.

Για να προσδιοριστούν τα μονοπάτια σηματοδότησης που ρυθμίζουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη, θα προβληθεί ένα πάνελ Τα siRNAs που στοχεύουν το ανθρώπινο kinome έναντι LNCaP κυττάρων καρκίνου του προστάτη που αναπτύσσονται παρουσία και απουσία ανδρογόνου. Ψάξαμε για κινάσες που είχε γενικά αποτελέσματα της ανάπτυξης και κινασών που αντισταθμίζεται ανδρογόνων. Η οθόνη εντοπίστηκαν πολλαπλές κλώνοι shRNA έναντι των στόχων γονιδίων που ρυθμίζουν τόσο ανδρογόνων ευαισθησία και την ανάπτυξη των κυττάρων. Αναφέρουμε εδώ τα αποτελέσματα της οθόνης μας και τη λεπτομερή αξιολόγηση ενός υποσυνόλου των κινασών που προσδιορίζονται ως ρυθμιστές της ανάπτυξης του καρκίνου του προστάτη κυττάρων.

Αποτελέσματα

Πριν από την εξέταση ενός πάνελ Τα siRNAs που στοχεύουν το ανθρώπινο kinome έναντι καρκινικών κυττάρων LNCaP του προστάτη, πραγματοποιήσαμε προσεκτική βελτιστοποίηση των παραμέτρων, συμπεριλαμβανομένων των συνθηκών ανάπτυξης των κυττάρων, πολλαπλότητα της μόλυνσης, την επιλογή πουρομυκίνης, θεραπεία ανδρογόνων, και οι μετρήσεις βιωσιμότητας των κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ταυτοποιήσαμε shRNA κλώνοι που μειώθηκε και αυξημένη κυτταρική ανάπτυξη LNCaP τόσο στην παρουσία και απουσία ανδρογόνου (Σχήμα 1). Η οθόνη που χρησιμοποιείται τη βιβλιοθήκη MISSION® με πέντε παρα τρία Τα siRNAs για καθένα από 673 στόχους κινάσης? τρεις ανεξάρτητες βιολογικές επαναλήψεις διεξήχθησαν σε ξεχωριστές ημέρες. Μετά knockdown, μεταβολές στο μεταβολισμό των κυττάρων LNCaP προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας alamarBlue ως υποκατάστατο για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Πολλαπλές κλώνοι shRNA έναντι των στόχων γονίδιο που επηρεάζει την ανάπτυξη των κυττάρων εντοπίστηκαν.

LNCaP κύτταρα μετήχθησαν εις τριπλούν με πέντε παρα τρία Τα siRNAs που στοχεύουν ενάντια 673 ανθρώπινη κινασών. Η κυτταρική ανάπτυξη μετρήθηκε με alamarBlue την ημέρα 7. απεικονίζονται είναι η κυτταρική ανάπτυξη σε σχέση με pLKO κενό φορέα ελέγχου σε απόκριση κάθε shRNA με την παρουσία και απουσία του ορμόνης (0,05 ηΜ R1881). Οι κόκκινες και πράσινες γραμμές οριοθετούν κόψει πόντους βασισμένο σε ελέγχους, συμπεριλαμβανομένων pLKO, NTC, τα μέσα ενημέρωσης και μόνο, και AR shRNA. Η κόκκινη γραμμή δείχνει την αναστολή της ανάπτυξης και την ανάπτυξη της πράσινης γραμμής.

Η

Δεν υπήρχε καμία διαφορά στην ανάπτυξη κατά τη σύγκριση pLKO άδειο φορέα σε έλεγχο μη στόχους (NTC) (n = 82, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) . κύτταρα ανδρογόνο θεραπεία αυξήθηκε 3,2 φορές μεγαλύτερη από ό, τι τα κύτταρα υπό αγωγή με όχημα (n = 82). AR knockdown χρησιμοποιώντας shRNA χρησιμοποιήθηκε ως ένας θετικός έλεγχος στην οθόνη, αναστολή ανάπτυξης κατά περισσότερο από 60% σε κύτταρα που αναπτύσσονται με την παρουσία ανδρογόνων (n = 41, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), αλλά έχουν ελάχιστη επίδραση επί κυττάρων LNCaP που αναπτύχθηκαν απουσία του ανδρογόνων (n = 41, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Με την παρουσία ανδρογόνων, θα σημειωθούν Τα siRNAs που ανέστειλε την ανάπτυξη κατά τουλάχιστον 75%, που αντιστοιχεί σε λιγότερο από την κορυφή του 1% του Τα siRNAs αναστολής της ανάπτυξης, όπως Τα siRNAs που στοχεύουν κινάσες που ρυθμίζουν θετικά την ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP. Εν απουσία ανδρογόνων, θα σημειωθούν Τα siRNAs που ανέστειλε την ανάπτυξη κατά 50% ή περισσότερο, το οποίο αντιπροσωπεύει λιγότερο από την κορυφή 2% του Τα siRNAs αναστολής της ανάπτυξης, όπως Τα siRNAs που στοχεύουν κινάσες που ρυθμίζουν θετικά την ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP. Χρησιμοποιώντας αυτά τα κριτήρια, shRNA knockdown του 46 κινασών ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον ότι, πολύ λίγοι Τα siRNAs έδειξε μια επίδραση η οποία ήταν εξαρτάται από την παρουσία ή την απουσία ανδρογόνων. Οι περισσότεροι Τα siRNAs ανέστειλε την ανάπτυξη υπό αμφότερες τις συνθήκες, αν και το μέγεθος της αναστολής ποικίλει, υποδεικνύοντας ότι αυτή η οθόνη δεν αποκάλυψε κινάσες που ρυθμίζουν ειδικά την ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP προκαλούνται από τα ανδρογόνα. Κινάσης ριβοσωμικής πρωτεΐνης S6 (RPS6KA3), η οποία έχει εμπλακεί στην ρύθμιση της δραστικότητας AR και την ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων του προστάτη [20] – [24], ταυτοποιήθηκε σε αυτήν την οθόνη, υποστηρίζοντας μια προσέγγιση διαλογής RNAi για τον εντοπισμό των κινασών που ρυθμίζουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Παρατηρήσαμε επίσης 34 κινασών που αντιπροσωπεύουν το κορυφαίο 1%, του οποίου νοκ ντάουν αυξημένη ανάπτυξη LNCaP κυττάρων (Σχήμα 1)

Έχουμε επιλέξει έξι ανασταλτική κινάσες για περαιτέρω μελέτη με βάση το μέγεθος της επίδρασης από shRNA νοκ ντάουν:. Μιτογόνο ενεργοποιημένη πρωτεΐνη κινάση κινάση κινάση 11 (MAP3K11), διακυλογλυκερόλη κινάσης δέλτα (DGKD), εντερική κινάσης κυττάρων (ΙΟΚ), κίτρο rho αλληλεπιδρούν κινάσης (CIT), galactokinase2 (GALK2), και πρωτεΐνη σερίνη Η1 κινάσης (PSKH1). Μία πρόβλεψη προϋποθέτει ότι εάν οι κινάσες που μειώνουν την ανάπτυξη όταν χτυπηθεί κάτω είναι συνάφεια εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη, τότε η δραστηριότητα αυτών των κινασών θα πρέπει να αυξήσουν τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου. Ως ενδιάμεσο βήμα για την εξέταση της κατάστασης ενεργοποίησης των κινασών, εξετάσαμε τα επίπεδα μήνυμα κινάσης στο Oncomine βάση δεδομένων. Βρήκαμε ότι σε τουλάχιστον δύο ανεξάρτητες μελέτες τα επίπεδα mRNA για τις έξι κινάσες αυξηθεί είτε όταν πρωτοπαθή καρκίνο του προστάτη σε σύγκριση με φυσιολογικό προστάτη ή όταν μεταστατικό καρκίνο του προστάτη είναι σε σύγκριση με πρωτογενή νόσο ή φυσιολογικό προστάτη (Σχήμα S1).

Εμείς επικύρωσε την επίδραση της ανάπτυξης και της knockdown των έξι επιλεγμένες κινασών μας χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία CyQuant, που μετρά το περιεχόμενο DNA ως υποκατάστατο για τον αριθμό των κυττάρων, και χρησιμοποίησε αυτή την τεχνική για να επεκτείνουν επίσης την ανάλυση μας με την κυτταρική γραμμή ευνουχισμό ανθεκτική, C4-2B. Τα κύτταρα μετάγονται με λεντοϊού σωματίδια που εκφράζουν δύο Τα siRNAs συγκεκριμένων για κάθε κινάση που μας ενδιαφέρει ή pLKO ελέγχου κενού φορέα υπό την παρουσία (0,05 ηΜ R1881) ή απουσία ανδρογόνων. Όπως παρατηρήθηκε στην Εικόνα 2, η αύξηση μειώθηκε στις δύο κυτταρικές σειρές σε ανταπόκριση προς κάθε shRNA. Σε γενικές γραμμές, κινάση knockdown ανέστειλε την ανάπτυξη παρουσία και απουσία ανδρογόνου. Επιπλέον, κινάση knockdown επηρεάζονται ανάπτυξη ισοδύναμα τόσο στο ανδρογόνο-εξαρτώμενη LNCaP και ευνουχισμός ανθεκτική C4-2B κυτταρική γραμμή.

Η σχετική επίδραση των δύο ανεξάρτητων Τα siRNAs ανά κινάση στην κυτταρική ανάπτυξη σε LNCaP (Α) και C4- 2Β κύτταρα (Β). Δοκιμασία CyQuant περιεχόμενο μετρήθηκε DNA ως υποκατάστατο για τον αριθμό των κυττάρων 7 ημέρες μετά shRNA μεταγωγή. Το πείραμα έγινε με την παρουσία και απουσία ορμόνης (0,05 ηΜ R1881), η = 3 έως 7, ανάλογα με την κινάση. Η ανάπτυξη των κυττάρων σε σύγκριση με μη επεξεργασμένο μάρτυρα pLKO και οι τιμές υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο σε όλη την βιολογική επαναλήψεις. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής. * Υποδηλώνει στατιστική σημαντικότητα.

Η

qPCR χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί κινάσης knockdown από shRNA σε LNCaP και κυττάρων C4-2B (Σχήμα 3). Ορμόνη προστέθηκε σε διάφορες συγκεντρώσεις (όχημα, 0,05, 0,5 και 1 ηΜ R1881) και το RNA απομονώθηκε σε 2 και 24 ώρες μετά την ορμονική θεραπεία. Αυτές οι ορμονικές θεραπείες ήταν οι ίδιες με εκείνες που χρησιμοποιήθηκαν για την εκτίμηση της επίδρασης της κινάσης knockdown επί AR μεταγραφική δραστηριότητα, η οποία περιγράφεται παρακάτω και παρουσιάζεται στον Πίνακα 1. Κάθε κινάσης χτυπήθηκε κάτω στις δύο κυτταρικές σειρές με δύο διαφορετικές Τα siRNAs και σε σύγκριση με το κενό pLKO τον έλεγχο των φορέων. Δεν παρατηρήσαμε μια επίδραση της δόσης ορμόνης σχετικά με την αποτελεσματικότητα του knockdown κινάσης (Σχήμα S2)? Έτσι, τα δεδομένα που δείχνονται στο Σχήμα 3 είναι οι τιμές qPCR μέσο όρο σε όλη την βιολογική επαναλήψεις και τις συγκεντρώσεις ορμόνης για κάθε shRNA ή τον έλεγχο pLKO στις 24 ώρες μετά τη διέγερση της ορμόνης. Οι ιοί shRNA εκμαιεύσει μεγαλύτερη από 50% knockdown του mRNA της κινάσης στόχου σε σύγκριση με pLKO, με τα περισσότερα knockdowns μεγαλύτερη από 70% και στα δύο χρονικά σημεία και στις δύο κυτταρικές σειρές. Ουσιαστικά ταυτόσημες παρατηρήσεις έγιναν για κινάση knockdown ακόλουθες 2 ώρες διέγερσης ορμόνη (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

επίπεδα μεταγραφής κινάσης σε LNCaP (Α) και C4-2B κύτταρα (Β) μετά από knockdown με δύο ανεξάρτητες Τα siRNAs ανά κινάσης . επίπεδα μεταγραφής μετρήθηκαν με qPCR την ημέρα 4 μετά τη μεταγωγή και 2 ώρες μετά τη θεραπεία ορμονικής R1881 (όχημα, 0,05, 0,5 και 1 ηΜ). επίπεδα Απομαγνητοφώνηση συγκρίθηκαν με μη επεξεργασμένο έλεγχο pLKO και ομαλοποιήθηκε ως προς το γονίδιο καθαριότητας, PSMB6. Οι τιμές κατά μέσο όρο σε συγκεντρώσεις ορμονών και βιολογικές επαναλήψεις. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής. * Υποδηλώνει στατιστική σημαντικότητα.

Η

Υπήρξε κάποια απόκλιση νοκ ντάουν του mRNA της κινάσης από shRNA, το οποίο μπορεί να ευθύνεται για τη διαφορική νοκ ντάουν της ανάπτυξης. Για παράδειγμα, σε κύτταρα LNCaP, CIT shRNA-2 προκάλεσε μία μεγαλύτερη αναστολή της ανάπτυξης από CIT shRNA-1, η οποία είναι παράλληλη με την επίδραση επί knockdown mRNA της κινάσης, όπου CIT shRNA-2 μείωσε τα επίπεδα του mRNA CIT περισσότερο από CIT shRNA-1. Ωστόσο, οι ομοιότητες μεταξύ της αναστολής της ανάπτυξης και του mRNA knockdown δεν είναι εμφανείς για όλα κινάσες στοχευμένες.

Για να προσδιοριστεί εάν η αναστολή της ανάπτυξης που επάγεται από knockdown κινάση ήταν ειδική για καρκινικά κύτταρα προστάτη, μετρήσαμε την αύξηση του LHS και τα κύτταρα ΜΟΡ10Α σε απόκριση shRNA στόχευση των επτά κινάσες (Εικόνα 4). κύτταρα LHS είναι μη-ογκογονικά αθανατοποιημένα επιθηλιακά κύτταρα ανθρώπινου προστάτη που παράγεται από έκτοπη έκφραση της SV40 μεγάλο, μικρό Τ αντιγόνο, και ανθρώπινης τελομεράσης [25]. ΜΟΡ10Α είναι ένα μη-ογκογόνα, αυθόρμητα αθανατοποιημένη μαστού επιθηλιακή κυτταρική γραμμή [26]. LNCaP κύτταρα χρησίμευσε ως έλεγχος, με παράλληλα πειράματα καταδεικνύουν την αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων LNCaP και έκφραση της κινάσης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε γενικές γραμμές, shRNA στρέφεται κατά της κινάσες είχε ελάχιστη επίδραση στην ανάπτυξη LHS και ΜΟΡ10Α κύτταρο, υποδεικνύοντας την επιλεκτικότητα προς τον καρκίνο του προστάτη κύτταρα (Σχήμα 4). Η knockdown του μηνύματος κινάσης σε κύτταρα LHS και ΜΟΡ10Α ήταν μεταβλητή (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε κύτταρα LHS, MAP3K11 ήταν αποτελεσματικά χτυπηθεί κάτω (75 έως 90% αναστολή) και PSKH1 (50% αναστολή)? Ωστόσο, το νοκ ντάουν ήταν αναποτελεσματική για τις άλλες κινάσες. Σε κύτταρα ΜΟΡ10Α, CIT ανεστάλη (80%) και PSKH1, DGKD, και GALK2 καθένα αναστέλλεται κατά περίπου 50%. Η ανικανότητα παρεμπόδισης της κινάσης έκφραση σε παρόμοιο βαθμό όπως στο LNCaP, C4-2B, (Σχήμα 3) και τα κύτταρα CWR22Rv1 (τα δεδομένα δεν φαίνονται), περιπλέκει την ερμηνεία της σημασίας αυτών των κινασών στην κανονική ανάπτυξη των κυττάρων και την επιβίωση. Ωστόσο, όλοι οι έξι κινάσες χτυπήθηκαν κάτω σε τουλάχιστον μία από τις φυσιολογικές κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα είναι συνεπή με ύπαρξη εκλεκτικότητα για τη στόχευση αυτών των κινασών σε κύτταρα καρκίνου πάνω από τα φυσιολογικά κύτταρα.

Η σχετική επίδραση των δύο ανεξάρτητων Τα siRNAs ανά κινάση στην κυτταρική ανάπτυξη σε LHS (Α) και ΜΟΡ10Α κύτταρα (Β) . Δοκιμασία CyQuant περιεχόμενο μετρήθηκε DNA ως υποκατάστατο για τον αριθμό των κυττάρων 7 ημέρες μετά shRNA μεταγωγή. n = 2 για κύτταρα LHS και η = 3 για τα κύτταρα ΜΟΡ10Α. Η ανάπτυξη των κυττάρων συγκρίθηκε με τον έλεγχο pLKO και οι τιμές υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο σε όλη την βιολογική επαναλήψεις. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής.

Η

Από το AR είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων του προστάτη, θέλαμε να καθορίσει εάν οποιαδήποτε από τις έξι επιλεγμένες κινάσες μπορεί να επηρεάσει την ανάπτυξη μέσω ρυθμίζουν την μεταγραφικό AR . Για να εξεταστεί η επίδραση της κινάσης knockdown στη μεταγραφή γονιδίου-στόχου AR, qPCR χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθούν τα επίπεδα μεταγραφής των δύο γονιδίων στόχων AR, TMPRSS2 και SGK, σε κύτταρα LNCaP και C4-2B με δύο ανεξάρτητες Τα siRNAs χρησιμοποιηθούν για να αναστέλλουν την έκφραση της κινάσης (Πίνακας 1) . Εξετάσαμε μεταγραφή αυτών των γονιδίων σε 2 και 24 ώρες για να αξιολογηθεί η επίδραση της knockdown κινάσης επί των άμεσα-πρώτα επίπεδα απόκρισης και σταθερής κατάστασης του AR μεταγραφικής δραστικότητας. Η στατιστική ανάλυση δείχνει ότι δεν υπήρξε καμία επίδραση της δόσης ορμόνης στην ικανότητα των κινάσης knockdown να επηρεάσουν AR μεταγραφή? κινάσης νοκ ντάουν μεταβληθεί μεταγραφή ισοδύναμα, ή δεν είχε κανένα αποτέλεσμα, σε κάθε ανδρογόνων δόση. Συντήρηση της επαγωγής των ανδρογόνων σε pLKO παρατηρήθηκε σε όλα αναλύθηκαν πειράματα. Αναφέρονται στον Πίνακα 1 είναι οι στατιστικά σημαντικές αλλαγές στο AR μεταγραφή του TMPRSS2 και SGK σε απόκριση σε κινάσης knockdown από δύο ανεξάρτητους Τα siRNAs σε 2 και 24 ώρες μετά τρεις διαφορετικές αγωγές δόσεως ανδρογόνων. Τόσο Τα siRNAs έπρεπε να αλλάξει μεταγραφής γονιδίων σημαντικά προς την ίδια κατεύθυνση για την αναφορά στον πίνακα.

Δεν υπήρχε συνεπής μείωση στην μεταγραφική δραστικότητα AR σε απόκριση knockdown των έξι κινασών στις δύο κυτταρικές σειρές, γονίδια στόχους AR εξετάστηκαν , και τα δύο χρονικά σημεία που εξετάστηκαν (Πίνακας 1). Εξόντωση MAP3K11 μειωμένη μεταγραφή του TMPRSS2 σε LNCaP κύτταρα σε 24 ώρες και σε C4-2B κύτταρα σε 2 ώρες μετά την προσθήκη του ανδρογόνων. Ωστόσο, MAP3K11 knockdown αυξημένη μεταγραφή του SGK σε C4-2B κύτταρα 2 ώρες μετά την προσθήκη ή την ορμόνη. Εξόντωση DGKD μειωμένη μεταγραφή του TMPRSS2 σε κύτταρα και C4-2B του SGK σε κύτταρα LNCaP στις 24 ώρες. Δεν υπήρξε καμία αλλαγή στην TMPRSS2 ή μεταγραφή SGK σε κάθε κυτταρική σειρά, ως αποτέλεσμα της εξουδετέρωσης του ICK ή PSKH1. CIT νοκ ντάουν έχει διαφορετικές συνέπειες για τη μεταγραφή AR. Είναι ενδιαφέρον ότι η πιο συνεπής επίδραση στη μεταγραφή AR ήταν από GALK2 knockdown, η οποία προκάλεσε μια αύξηση στην SGK σε 24 ώρες μετά την προσθήκη ορμόνης σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές και σε 2 ώρες σε κύτταρα C4-2B. Ωστόσο, εξετάζοντας μόνο TMPRSS2 και SGK ως εκπρόσωπος AR γονίδια-στόχους μπορεί να δημιουργήσει μεροληψία επιλογής? Ως εκ τούτου, έχουμε επεκτείνει την ανάλυσή μας των γονιδίων AR-ρυθμίζονται.

Αναλύσαμε 14 επιπλέον γονίδια, συμπεριλαμβανομένου του AR-ενεργοποιημένα γονίδια PSA, FKBP51, ORM1, STAG, Nkx3.1, FASN, AQP3, KLK2 και UGT2B ? Το AR-καταπιεσμένη γονίδια DKK και FST? και οι ευνουχισμό ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη AR-ρυθμιζόμενων γονιδίων CDC20, CDK1 και UBE2C. Μεταγραφή σε LNCaP κύτταρα μετά MAP3K11 knockdown εξετάστηκε στις 24 ώρες μετά τη θεραπεία ανδρογόνων. Όπως ήταν αναμενόμενο, ανδρογόνων που προκαλείται ή κατασταλεί η μεταγραφή όλων των γονιδίων στόχων AR σε κύτταρα ελέγχου pLKO. Η επίδραση της MAP3K11 νοκ ντάουν για μεταγραφή AR εξαρτάται στόχο. Ανδρογόνων που διεγείρεται μεταγραφή του TMPRSS2, SGK, και ORM1 μειώθηκε σε απάντηση MAP3K11 νοκ ντάουν (Εικόνα 5Α). Το αντίστροφο ήταν αλήθεια για τα ανδρογόνα καταστέλλεται γονίδια DKK και FST. MAP3K11 knockdown διεγείρεται έκφραση γονιδίου και μείωσε την ποσότητα του ανδρογόνου που προκαλείται καταστολή (Σχήμα 5Β). PSA, FKBP51, STAG, Nkx3.1, FASN, AQP3, KLK2 και UGT2B δεν αλλάζουν ανάλογα με MAP3K11 νοκ ντάουν. Στο βαθμό που αυτό υποσύνολο των γονιδίων στόχων AR αντιπροσωπεύει το μεταγραφικό AR, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων σε απόκριση προς MAP3K11 κινάση knockdown μπορεί να οφείλεται στη ρύθμιση του AR μεταγραφική δραστικότητα σε ένα υποσύνολο του AR-ρυθμιζόμενων γονιδίων. Η AR ρυθμίζει επιλεκτικά κυτταρικό κύκλο ρυθμίζεται γονίδια όπως CDC20, CDK1, και UBE2C για την προώθηση της ανάπτυξης των κυττάρων [27]. Βρήκαμε ότι MAP3K11 knockdown οδήγησε σε ελαφρά αλλά στατιστικά σημαντική μείωση της μεταγραφής αυτών των AR-ρυθμιζόμενα γονίδια Μ-φάση (Σχήμα 5C).

επίπεδα (Α) Αντίγραφο των γονιδίων στόχων AR προκαλούνται από τα ανδρογόνα που άλλαξε σε απάντηση MAP3K11 νοκ ντάουν στα κύτταρα LNCaP μεταγωγή με δύο ανεξάρτητες Τα siRNAs και ελέγχου pLKO. RNA απομονώθηκε 24 ώρες μετά την προσθήκη των R1881 στο 1 ηΜ. επίπεδα μεταγραφής μετρήθηκαν με qPCR, σε σύγκριση με pLKO και ομαλοποιήθηκε ως προς το γονίδιο οικοκυρική, GUS. (Β) Τα επίπεδα μεταγραφής των γονιδίων στόχων AR ανδρογόνου καταστέλλεται και τα επίπεδα (C) μεταγραφή του AR-ρυθμιζόμενων γονιδίων Μ-φάσεως που περιγράφεται στο [27]. (Β) και (C) υπέστησαν επεξεργασία όπως περιγράφεται για το (Α). Οι τιμές υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο σε όλη την βιολογική επαναλήψεις, η = 3. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής. * Υποδηλώνει στατιστική σημαντικότητα.

Η

Προηγουμένως, δείξαμε ότι οι κινάσες άγχος θα μπορούσε να ρυθμίσει AR Ser 650 φωσφορυλίωση [28]. Έτσι, για την περαιτέρω διερεύνηση του μηχανισμού ρύθμισης MAP3K11 ανάπτυξης καρκίνου του προστάτη κυττάρων και AR μεταγραφή, ελέγξαμε αν MAP3K11 νοκ ντάουν ρυθμίζονται AR Ser 650 φωσφορυλίωση από το MAP3K11 είναι ένα ανάντη ρυθμιστή της δραστηριότητας της JNK. ΡΜΑ επαγόμενη AR Ser 650 φωσφορυλίωση σε κύτταρα LNCaP και C4-2B περισσότερο από 3 φορές (Σχήμα 6). Σε αυτά τα πειράματα, οι δύο Τα siRNAs μειωμένη έκφραση πρωτεΐνης MAP3K11, με MAP3K11 shRNA-1 μειώνεται έκφραση σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι MAP3K11 shRNA-2. Παρόμοιες μεταβολές στην φωσφορυλίωση c-Jun παρατηρήθηκαν, υποδεικνύοντας ότι ο MAP3K11 Τα siRNAs ανέστειλε προκαλείται από ΡΜΑ σηματοδότηση κινάσης στρες. Υπό αυτές τις συνθήκες, AR Ser 650 φωσφορυλίωση μειώθηκε στις δύο κύτταρα LNCaP και C4-2B. Παρατηρήθηκε μία παράλληλη μείωση της συνολικής AR. Η ποσοτικοποίηση της σχετικής ποσότητας του Ser 650 φωσφορυλίωσης προς το σύνολο των AR έδειξαν μείωση στη φωσφο-Ser 650 (Σχήμα 6 ιστόγραμμα), προτείνοντας μια στοιχειομετρική αλλαγή στο AR Ser 650 φωσφορυλίωση σε απόκριση MAPK3K11 knockdown. MAP3K11 shRNA-1 είχε το μεγαλύτερο αντίκτυπο στην AR Ser 650 φωσφορυλίωση, παράλληλα με την επίδραση στην έκφραση της πρωτεΐνης MAP3K11 και φωσφορυλίωση c-Ιούνιος Αυτές οι παρατηρήσεις είναι συνεπείς με τα προηγούμενα αποτελέσματά μας, που δείχνουν ότι η σηματοδότηση της κινάσης στρες ρυθμίζει AR Ser 650 φωσφορυλίωση [28] και την περαιτέρω δείχνουν ότι MAP3K11 νοκ ντάουν μπορούν να προκαλέσουν την αναστολή της ανάπτυξης μέσω της διακοπής της AR.

LNCaP και C4-2B κύτταρα μετατράπηκαν με δύο ανεξάρτητες τα siRNAs που στοχεύουν MAP3K11 ή τον έλεγχο pLKO. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με έκδοχο ή ΡΜΑ. Σύνολο AR ανοσοκατακρημνίστηκε και καθάρισε για φωσφο-S650 και το συνολικό AR επίπεδα. κυτταρόλυμα στυπώθηκε για ολική MAP3K11, ολική JNK, φωσφο-ΙΝΚ, και τουμπουλίνης. Απεικονίζονται είναι το σήμα φωσφο-S650 κανονικοποιείται στη συνολική AR, η = 3. Ποσοτικοποίηση διεξήχθη σε σύστημα απεικόνισης Οδύσσεια licor. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής.

Η

Συζήτηση

Η μελέτη μας καταδεικνύει την εφαρμοσιμότητα λεντοικής με βάση το shRNA για τη διεξαγωγή φαινοτυπική οθόνες για να προσδιορίσει τους στόχους που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη. Οι οδοί σηματοδότησης που ρυθμίζουν την ανάπτυξη των κυττάρων του προστάτη και του καρκίνου δραστικότητα AR διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στη μετάβαση από εξαρτώμενων από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη σε ευνουχισμό ανθεκτικά ασθένεια [29]. Για τον εντοπισμό των κινασών εντός αυτών των δικτύων, εξετάσαμε το πώς RNAi knockdown κινασών επηρεάζει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων LNCaP του προστάτη. Έχουμε προβλέψει την εξεύρεση τόσο νέα και γνωστά ρυθμιστές της ανάπτυξης. Οι οθόνη προσδιορίζονται κινάσες δειχθεί προηγουμένως να ρυθμίσει την ανάπτυξη των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη και τη δραστηριότητα AR, συμπεριλαμβανομένης της κινάσης ριβοσωμικής S6 (RPS6KA3 ή RSK) [30]. RSK είναι κατάντη της ΜΑΡΚ και ενισχύει τη μεταγραφή του PSA. Χημική αναστολή της RSK μειωμένη έκφραση PSA και την ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων του προστάτη [30]. RSK φαίνεται να μεσολαβεί AR μεταγραφική ενεργοποίηση μέσω της δικής της λειτουργίας της κινάσης της, καθώς και αλληλεπιδράσεις με p300, ένα AR συν-ρυθμιστής με δραστικότητα ΗΑΤ. Ο εντοπισμός RSK στην οθόνη μας υποστηρίζει υποπλασμένα γενετική οθόνες για τον εντοπισμό των κινασών που ρυθμίζουν την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη κυττάρων.

Πολλαπλοί στόχοι εντοπίστηκαν στην οθόνη RNAi μας, γεγονός που υποδηλώνει ότι η πολλαπλή κινάσης σηματοδότησης μονοπατιών ρυθμίζουν την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη κυττάρων. Έχουμε επιλέξει έξι κινάσες για περαιτέρω μελέτη, συμπεριλαμβανομένων MAP3K11, DGKD, ICK, CIT, GALK2 και PSKH1. Knockdown όλων των έξι κινασών βρέθηκε να μειώνει την ανάπτυξη των κυττάρων και στις δύο ανδρογόνο-εξαρτώμενη και ευνουχισμός ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Για να προσδιορίσετε αν το αποτέλεσμα ανάπτυξης με τη μεσολάβηση του AR, εξετάσαμε αρχικά μεταγραφή δύο καλά χαρακτηρίζεται AR ανταποκρίνεται γονίδια, TMPRSS2 και SGK. Εμείς δεν τήρησε μια συνεπή επίδραση σε όλα τα χρονικά σημεία και κυτταρικές σειρές που έχουν δοκιμαστεί σε AR μεταγραφή του TMPRSS2 και SGK, όταν οι έξι κινάσες είχαν χτυπηθεί κάτω. Ωστόσο, όταν επεκτείναμε την ανάλυσή μας σε 16 σύνολο AR-ρυθμιζόμενων γονιδίων σε απόκριση προς MAP3K11 knockdown, βρήκαμε ότι ένα υποσύνολο των γονιδίων στόχων AR μεταβλήθηκε. Αυτό υποδηλώνει ότι MAP3K11 νοκ ντάουν μπορούν να διαμορφώσουν AR μεταγραφική δραστηριότητα και μπορεί να μεσολαβήσει επιπτώσεις της ανάπτυξης μέσω της AR. Επιπλέον, τα δεδομένα αυτά προσθέτουν στην απόδειξη ότι η AR μπορεί να ρυθμιστεί σε έναν προαγωγό επιλεκτικό τρόπο, επιτρέποντάς της να χρησιμεύσει ως ένα ολοκληρωτή πολλαπλών εξωκυτταρικών σημάτων. Το εργαστήριο μας και άλλοι έχουν αναφέρει αυτό σε προηγούμενες μελέτες [31], [32]. Περαιτέρω πειράματα που περιλαμβάνουν επιπλέον γονιδίων στόχων AR θα είναι απαραίτητη για να αξιολογήσει πλήρως τις επιπτώσεις των νοκ ντάουν από αυτές τις έξι κινασών για τη μεταγραφή AR.

MAP3K11, που ονομάζεται επίσης Μικτή Lineage κινάσης (ΜίΚ3), είναι μέλος της σερίνης /θρεονίνης οικογένεια κινάσης που ενεργοποιεί επιλεκτικά MAPK8 /κινάσης JNK και λειτουργεί ως θετικός ρυθμιστής της JNK σηματοδότησης [33]. Επιπλέον, αυτή η κινάση μπορεί άμεσα φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν ΙκάππαΒ κινάση και εμπλέκεται στην μεταγραφική δραστικότητα του ΝΡ-κΒ που προκαλείται από Rho οικογένεια ΟΤΡάσες. MAP3K11 απαιτείται για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του ορού που διεγείρεται και για μιτογόνο και κυτοκίνης ενεργοποίηση των ρ38, ERK, και JNK1. MAP3K11 παίζει επίσης ένα ρόλο στην φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση του BRAF μιτογόνο διεγείρονται, χωρίς φωσφορυλίωση άμεσα BRAF. Έτσι, MAP3K11 λειτουργεί ως κόμβος στα μονοπάτια μιτογόνο και το άγχος σηματοδότησης. Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού της ΜΑΡ κινάσης συσχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη σε μια ποικιλία των ρυθμίσεων και προσδιορίστηκε ότι η σηματοδότηση κινάσης στρες ρυθμίζει AR Ser 650 φωσφορυλίωσης [28], [34]. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε επιβεβαιώσει ότι η σηματοδότηση της κινάσης στρες ρυθμίζει AR Ser 650 φωσφορυλίωση? νοκ ντάουν της MAP3K11 μειώθηκε στοιχειομετρικά PMA-επαγόμενη AR Ser 650 φωσφορυλίωση. Διαφοροποίηση των Ser 650 φωσφορυλίωσης μπορούν να ρυθμίζουν AR μεταγραφική δραστηριότητα των γονιδίων στόχων AR που μεταβάλλεται κατά την MAP3K11 knockdown, συμπεριλαμβανομένων TMPRSS2, SGK, ORM1, DKK και FST. Βρήκαμε επίσης ότι οι ευνουχισμός ανθεκτικά καρκίνο του προστάτη AR ρυθμιζόμενων γονιδίων φάσης Μ CDC20, CDK1, και UBE2C [27], μειώθηκαν σε απόκριση MAP3K11 knockdown, αν και η μείωση στην μεταγραφή αυτών των γονιδίων μπορεί να αντανακλά την αναστολή της ανάπτυξης που οφείλεται MAP3K11 νοκ ντάουν και δεν αντιπροσωπεύουν μεταβληθεί δραστηριότητα AR μεταγραφικής. οθόνη μας εντόπισε επίσης άλλες κινάσες στρες, συμπεριλαμβανομένων MAP3K7, MAP4K3, και ΜΑΡΚΑΡΚ5 (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), το οποίο υπογραμμίζει την κρίσιμη φύση της σηματοδότησης κινάσης στρες στη ρύθμιση της ανάπτυξης του καρκίνου του προστάτη κυττάρου.

DGKD είναι ένα ένζυμο που φωσφορυλιώνει διακυλογλυκερόλη (DAG) για να παραχθεί το φωσφατιδικό οξύ (ΡΑ). DGK καταλύει την φωσφορυλίωση της DAG με τη μετατροπή του σε ΡΑ, ανταλλάσσοντας αυτόν τον τρόπο μια δεύτερου αγγελιαφόρου για ένα άλλο και ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC) [35]. Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι DGKD εμπλέκεται στη ρύθμιση των επιπέδων DAG και ΡΑ σε απόκριση προς διάφορους παράγοντες ανάπτυξης και ορμόνες [35]. DGKD αναφέρθηκε να αλληλεπιδρά με RACK1, μια πρωτεΐνη που είχαμε προηγουμένως αποδειχθεί ως AR αλληλεπιδρά πρωτεΐνη που ρυθμίζει τη φωσφορυλίωση AR και μεταγραφική δραστηριότητα [36], [37]. Έτσι, DGKD μπορεί να συμβάλλει στη ρύθμιση AR μέσω RACK1. Ωστόσο, νοκ ντάουν της DGKD δεν είχε σημαντική επίδραση στην AR μεταγραφική δραστηριότητα. Προηγούμενη έρευνα έχει δείξει ότι σε απουσία DGKD, σηματοδότηση EGFR μειώνεται διότι τόσο η έκφραση και η δραστικότητα της κινάσης αναστέλλονται [38]. Αυτή η επίδραση επί του EGFR είναι ένα αποτέλεσμα της μείωσης σε ένα deubiquitinase, USP-8, και ως εκ τούτου αυξημένη ουβικιτινίωση και αποικοδόμηση του EGFR [38]. σηματοδότηση αυξητικού παράγοντα είναι ένας γνωστός ρυθμιστής της ανάπτυξης καρκινικών κυττάρων του προστάτη [29]. Συνεπώς, είναι πιθανό ότι η επίδραση της ανάπτυξης που αντιστοιχεί με DGKD knockdown είναι το αποτέλεσμα της αλλαγμένης σηματοδότηση του υποδοχέα της κινάσης της τυροσίνης.

ICK είναι μία κινάση σερίνης /θρεονίνης που περιέχει μία διπλή θέση φωσφορυλίωσης βρέθηκαν σε μιτογόνο πρωτείνη ενεργοποίησης κινασών των οποίων η δραστηριότητα ρυθμίζεται από τον κυτταρικό κύκλο που σχετίζονται με κινάση (CCRK) και ανθρώπινη πρωτεΐνη φωσφατάσης 5 (ΡΡ5) [39]. ICK σχετίζεται με ανδρική γεννητικών κυττάρων που σχετίζεται με πρωτεΐνη κινάση (ΜΑΚ). ΜΑΚ είναι ένα AR συν-ρυθμιστής που δεσμεύει άμεσα τον AR σε πειράματα συν-ανοσοκαταβύθιση και ενισχύει AR-εξαρτώμενη μεταγραφή κατά τρόπο κινάση εξαρτώμενη [40]. Αναστολή της MAK είτε με RNAi ή μια μορφή της κινάσης-νεκρό μειωμένη ανάπτυξη LNCaP κυττάρων. Το αποτέλεσμα των MAK νοκ ντάουν στην ανάπτυξη παραλληλίζει τις παρατηρήσεις μας με ICK παρόλο που δεν έχουν παρατηρηθεί επίδραση του ICK στη μεταγραφή AR προτείνοντας έναν εναλλακτικό μηχανισμό ρύθμισης της ανάπτυξης. ICK μπορεί να φωσφορυλιώσει Scythe, ένα αντιαποπτωτικών πρωτεΐνη και έτσι μπορεί να ρυθμίσει την επιβίωση των κυττάρων [39], [41].

CIT είναι μία πρωτεϊνική κινάση διπλή ειδικότητα η οποία είναι ένας πιθανός RHO και RAC τελεστή, το οποίο μπορεί να παίζει ρόλο στην κυτοκίνηση [42]. CIT νοκ ντάουν μπορεί να διαταράξει την κυτοκίνηση και ως εκ τούτου την ανάπτυξη των κυττάρων. GALK2 είναι Ν-ακετυλογαλακτοζαμίνη (ΟαΙΝΑο) κινάση, η οποία έχει επίσης γαλακτοκινάσης δραστικότητα σε υψηλές συγκεντρώσεις γαλακτόζης [43]. Ρύθμιση του μεταβολισμού των υδατανθράκων είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη των κυττάρων και ΟαΙΝΑο είναι κρίσιμη για Ο-συνδεδεμένη γλυκοζυλίωση και την αντίστοιχη ρύθμιση της κυτταρικής σηματοδότησης [44]? GALK2 νοκ ντάουν μπορεί να διαταράξει αυτές τις θεμελιώδεις κυτταρικές διεργασίες. PSKH1 είναι ένα μελετημένο κινάση που μπορεί να αποτελέσει παράγοντα ματίσματος διαμέρισμα που σχετίζεται με κινάση σερίνης με ένα ρόλο στην intranuclear μη-snRNP διακίνηση παράγοντα ματίσματος και προ-mRNA επεξεργασία [45]. Η απουσία μιας σημαντικής επίδρασης στις μη ογκογόνα κύτταρα LHS προστάτη και των κυττάρων του μαστού ΜΟΡ10Α μπορεί να οφείλονται σε διαφορές στην σχετική αποτελεσματικότητα του knockdown ή /και απαίτηση για αυτές τις κινάσες σε αυτές τις βασικές κυτταρικές λειτουργίες. Είναι εύλογο ότι η απαίτηση για την CIT, GALK2 και PSKH1 ποικίλλει ανάλογα με το ογκογόνο κράτος από τα επίπεδα του mRNA αυτών των κινασών αυξηθεί, καθώς ο καρκίνος του προστάτη εξελίσσεται (Σχήμα S1). Απαιτείται περαιτέρω μελέτη για να προσδιοριστεί ο μηχανισμός ρύθμισης της ανάπτυξης για αυτές τις κινάσες στον καρκίνο του προστάτη.

Σε αυτή τη μελέτη σε διαλογή ένα πάνελ Τα siRNAs που στοχεύουν τον ανθρώπινο kinome κατά του καρκίνου του προστάτη LNCaP κύτταρα που αναπτύσσονται παρουσία και απουσία ανδρογόνων για τον προσδιορισμό των οδών σηματοδότησης που ρυθμίζουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Εντοπίσαμε πολλαπλές κλώνοι shRNA έναντι των κινασών που ρυθμίζουν τόσο ανδρογόνο-εξαρτώμενη και τον ευνουχισμό ανθεκτικά ανάπτυξης καρκίνου του προστάτη κυττάρων. Η μελέτη αυτή αποδεικνύει περαιτέρω τη δυνατότητα εφαρμογής λεντοικής βάση shRNA για τη διεξαγωγή φαινοτυπική οθόνες για να προσδιορίσει τους στόχους που εμπλέκονται σε μια ποικιλία βιολογικών διεργασιών, και καθιερώνει MAP3K11, DGKD, ICK, CIT, GALK2 και PSKH1 ως ρυθμιστές του προστάτη ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων.