Αφηρημένο

Οι μιτωτική κινεσίνη 5 πρωτεϊνών κινητήρα διασταυρώσεων και σύρετε εκτός αντιπαράλληλες μικροσωληνίσκων της ατράκτου, εκτελώντας έτσι βασικών λειτουργιών σε μιτωτική δυναμική της ατράκτου. Ειδική αναστολή της λειτουργίας τους από μοναστρόλη-όπως μικρά μόρια έχει εξεταστεί σε κλινικές δοκιμές ως αντικαρκινική θεραπεία, με μερική μόνο επιτυχία. Έτσι, οι στρατηγικές που βελτιώνουν την αποτελεσματικότητα της μοναστρόλη-όπως αντικαρκινικά φάρμακα που απαιτούνται. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε τη σχέση μεταξύ της ευαισθησίας στην μοναστρόλη και την εμφάνιση της μιτωτικής διολίσθηση σε διάφορες ανθρώπινες κυτταρικές σειρές. Βρήκαμε ότι η κατάταξη της ευαισθησίας σε μοναστρόλη, από την πιο ευαίσθητη σε λιγότερο ευαίσθητη, είναι: AGS & gt? HepG2 & gt? Lovo & gt? Du145≥HT29. Δείχνουμε συσχέτιση μεταξύ της ευαισθησίας ενός συγκεκριμένου κυττάρου-line για να μοναστρόλη και την τάση της ίδιας κυτταρικής γραμμής να υποστούν μιτωτική ολίσθηση. Βρήκαμε επίσης ότι τα ανθεκτικά μοναστρόλη κύτταρα ΗΤ29, παρατεταμένη θεραπείες μοναστρόλη να αυξήσει τα επίπεδα του mRNA και της πρωτεΐνης της χρωμοσωμικής πρωτεΐνης επιβάτη survivin. Σε αντίθεση, τα επίπεδα survivin δεν αυξήθηκε κατά την κατεργασία αυτή στα AGS κύτταρα μοναστρόλη ευαίσθητα. Δείχνουμε επίσης ότι η υπερ-έκφραση του survivin στα AGS κύτταρα μοναστρόλη ευαίσθητα μειώνει μιτωτική ολίσθηση και αυξάνει την αντίσταση στις μοναστρόλη. Τέλος, δείχνουμε ότι κατά τη σύντομη έκθεση σε μοναστρόλη, Si RNA σίγηση του survivin έκφρασης μειώνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων και στις δύο AGS και τα κύτταρα ΗΤ29. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η αποτελεσματικότητα της θεραπείας κατά του καρκίνου με ειδικούς αναστολείς κινεσίνης-5 μπορεί να βελτιωθεί με τη διαμόρφωση των επιπέδων έκφρασης της survivin

Παράθεση:. Asraf Η Avunie-Masala R, Hershfinkel M, L Gheber ( 2015) Μιτωτικά ολίσθηση και έκφραση Σουρβιβίνης συνδέονται με διαφορετική ευαισθησία των Ανθρωπίνων Cancer Cell-Γραμμές για την κινησίνη 5 Αναστολέας μοναστρόλη. PLoS ONE 10 (6): e0129255. doi: 10.1371 /journal.pone.0129255

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Κιλιάνγκ Cai, Πανεπιστήμιο Fudan, Κίνα

Ελήφθη: May 16, 2014? Αποδεκτές: 6η Μαΐου 2015? Δημοσιεύθηκε: 2, Ιουν, 2015

Copyright: © 2015 Asraf et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το Ταμείο εκκίνησης, Σχολή Επιστημών Υγείας, Ben-Gurion Πανεπιστήμιο της Νεγκέβ, απονέμεται σε MH και LG? από τον ισραηλινό Ίδρυμα Επιστημών επιχορήγηση 165/2013 κυρίου του στην LG (https://www.isf.org.il/english/) και το Ίδρυμα ισραηλινή επιστήμη δεν χορηγούν. 891/2014 χορηγείται σε MH (https://www.isf.org.il/english/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι μιτωτική πρωτεΐνες κινησίνη 5 κινητήρα (bimC /Kif11 /Eg5 /Ν-2) εκτελούν συντηρημένες λειτουργίες στο μιτωτικής ατράκτου δυναμική. Ανακαλύφθηκε στις αρχές του 1990, αυτά ήταν τα πρώτα κινεσίνες για τα οποία έχουν μιτωτική ρόλους καταδειχθεί σε έναν αριθμό οργανισμών [1-5]. Κινεσίνη 5 κινητήρες λειτουργούν ως ομοτετραμερή με δύο ζεύγη καταλυτικών πεδίων μοτέρ που βρίσκεται σε αντίθετες πλευρές του έναν αλτήρα-σαν συγκρότημα τετραμερή [6, 7]. Με αυτή τη διπολική δομή, κινεσίνη-5 κινητήρες μπορεί να διασυνδεθεί και να γλιστρήσει πέρα ​​αντιπαράλληλες μικροσωληνίσκων της ατράκτου [8-11], εκτελώντας έτσι τις λειτουργίες τους στη συναρμολόγηση ατράκτου [1-5] και επιμήκυνση ανάφαση άξονα [12-19].

Το ανθρώπινο κινεσίνη-5 HsEg5 υπερεκφράζεται σε μία ποικιλία στερεών όγκων, υποδηλώνοντας το ρόλο της στην ογκογένεση [20, 21]. Λόγω των ουσιωδών μιτωτικής λειτουργίες κινεσίνης-5 κινητήρες στη δυναμική της ατράκτου, και επειδή μίτωση είναι ένα αποδεκτό φάση του κυτταρικού κύκλου για παρέμβαση κατά του καρκίνου [22, 23], ήταν γενικά πιστεύεται ότι ειδική αναστολή της κινεσίνης-5 κινητήρες θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως πιθανή θεραπεία κατά του καρκίνου. Μοναστρόλη ήταν η πρώτη αναφερόμενη ειδικός αναστολέας της ανθρώπινης κινεσίνης-5, τα οποία προσδιορίζονται σε μια οθόνη για μικρά μόρια που προκάλεσε μιτωτική σύλληψη χωρίς να επηρεάζει τη δυναμική των μικροσωληνίσκων και άλλων κυτταρικών λειτουργιών [24]. Από την ανακάλυψη της μοναστρόλη, αρκετές δεκάδες μόρια αναφέρθηκαν ως αλλοστερικοί αναστολείς HsEg5, με μεταβλητό ισχείς [23, 25]. Η πλειονότητα αυτών των μορίων είναι ειδικά για τον ανθρώπινο HsEg5 επειδή συνδέονται σε μία αλλοστερική θέση, βρόχος 5 στο καταλυτικό τομέα των κινητήρων κινεσίνης που σχετίζονται με (που επισκοπείται στο [23, 26, 27]), η οποία μεταβάλλεται σε μήκος και αλληλουχία μεταξύ των κινεσίνης ομολόγων [28, 29]. Ανθρώπινα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με μοναστρόλη και μοναστρόλη-όπως τα μόρια σύλληψης σε μίτωση με κατεστραμμένα μονοπολικές ατράκτους [24, 30] και υφίστανται μιτωτικό κυτταρικό θάνατο [31]. Σε ορισμένες περιπτώσεις μοναστρόλη αντιμετωπίζονται κύτταρα βρίσκονται σε μια G1-σαν φάση λόγω μιτωτική ολίσθηση [32]. Το τελευταίο φαινόμενο επιτρέπει στα κύτταρα να προχωρήσει στο επόμενο G1 φάση χωρίς διαχωριστικές DNA τους με την παρουσία του άξονα βλάβη (που επισκοπείται στο [33, 34]). Μετά μιτωτικά ολίσθηση, τα κύτταρα μπορεί να πεθάνουν απόπτωσης που προκαλείται από ένα συγκεκριμένο σημείο ελέγχου που παρακολουθεί το περιεχόμενο DNA των κυττάρων που μίτωση εξόδου, γνωστή ως «tetraploidy σημείο ελέγχου» [33, 35].

έχουν εισέλθει Διάφοροι αναστολείς ειδικών HsEg5 κλινικές δοκιμές ως αντικαρκινικών παραγόντων [36-38]. Παρά την αναπαραγώγιμη κυτταροτοξική δράση σε καλλιέργειες ιστών, αυτές οι κλινικές δοκιμές αποκάλυψαν περιορισμένη επιτυχία (που επισκοπείται στο [27, 39]). Μία από τις προτεινόμενες λόγους αυτής της αναποτελεσματικότητας είναι ελλιπής γνώση των μιτωτικών οδών σύλληψης και, ως εκ τούτου, η αδυναμία να προσδιορίσει μοριακά συστατικά που μπορούν να στοχεύσουν επιπροσθέτως κινεσίνη 5 αναστολείς για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητάς τους στην αντικαρκινική θεραπεία [27, 39] .

για να αντιμετωπιστεί αυτό το ζήτημα, στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε την ευαισθησία να μοναστρόλη και την εμφάνιση της μιτωτικής διολίσθηση σε διάφορες ανθρώπινες κυτταρικές σειρές. Βρήκαμε ότι υπάρχει μια συσχέτιση μεταξύ της ευαισθησίας ενός συγκεκριμένου κυττάρου-line για να μοναστρόλη και την τάση της ίδιας κυτταρικής γραμμής να υποστούν μιτωτική ολίσθηση. Εξετάσαμε περαιτέρω την έκφραση survivin, ενός αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη επιβάτης χρωμοσωμικό που έχει αποδειχθεί ότι έχει πολλαπλούς ρόλους μιτωτικής (που επισκοπείται στο [40-43]). Βρήκαμε ότι η θεραπεία με μοναστρόλη επάγει αύξηση στην έκφραση του survivin σε μοναστρόλη-ανθεκτικά κύτταρα, αλλά όχι σε κύτταρα τα οποία είναι μοναστρόλη ευαίσθητα. Σταθερά, δείχνουμε ότι η υπερ-έκφραση της survivin στα μοναστρόλη-ευαίσθητων κυττάρων μειώνεται μιτωτική ολίσθηση και αυξημένη μοναστρόλη-αντίσταση. Τέλος, δείχνουμε ότι η μερική αποσιώπηση της έκφρασης σουρβιβίνης από Si RNA μειώνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από σύντομη έκθεση σε μοναστρόλη. Έτσι, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η συνδυασμένη αναστολή της HsEg5 και τη διαμόρφωση της έκφρασης της survivin μπορεί να βελτιώσει την ικανότητα της αντικαρκινικής θεραπείας με αναστολείς κινεσίνης-5.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας, τη βιωσιμότητα, την επιμόλυνση, και θεραπεία μοναστρόλη

AGS και τα κύτταρα LoVo αναπτύχθηκαν σε DMEM /F-12 (ΗΑΜ) 1: 1, τα κύτταρα ΗΤ29 σε DMEM, τα κύτταρα Du145 σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 1% πυροσταφυλικό νάτριο, και τα κύτταρα HepG2 σε ΜΕΜ μέσο -EAGLE του Earle. Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 2mM L-γλουταμίνη, και 1% διάλυμα αντιβιοτικό-αντιμυκητιασικό περιέχον 10 μονάδες /μΙ πενικιλλίνη, 10 μg /μl στρεπτομυκίνη, και 1250 μονάδες /ml νυστατίνη. αντιδραστήρια Media αγοράστηκαν από Beit Haemek, το Ισραήλ. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εξετάσθηκε με τη χρήση νατρίου 2,3-δις- (2-μεθοξυ-4-νιτρο-5-σουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο-5-καρβοξανιλίδιο άλας (ΧΤΤ, Sigma, Ισραήλ), μετά από μια τυποποιημένη διαδικασία [44] ή με μπλε Τρυπάνης δοκιμασία [30]. Για τα πειράματα της βιωσιμότητας, μέχρι 3-ημερών χρησιμοποιώντας την δοκιμασία ΧΤΤ, ~ 4×10

3 κύτταρα επιστρώθηκαν ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων. Αριθμός κυττάρων παρουσία του μοναστρόλη κανονικοποιήθηκε προς τον αριθμό των κυττάρων παρουσία του μόνο DMSO. Για τα πειράματα που χρησιμοποιούν 12 και 24h μοναστρόλη θεραπεία, ~ 1.5×10

5 κύτταρα ανά πηγάδι τοποθετήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων. Η θεραπεία με μοναστρόλη διεξήχθη 24 ώρες μετά την επίστρωση, κατά τον οποίο χρόνο επιτεύχθηκε 70-80% συρροή. Πλασμίδια που εκφράζουν GFP-tagged survivin και του φορέα GFP ήταν μόνο ένα δώρο από τον Dr. Dario Γ Altieri [45]. διαμόλυνση κυττάρων εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο διαμόλυνσης JetPEI (Polyplus επιμόλυνση, Tal Ron, Ισραήλ). Σταθερή διαμόλυνση επιτεύχθηκε με ανάπτυξη κυττάρων σε μέσο που περιέχει G418 3 mg /ml (Sigma, Ισραήλ) για αρκετές εβδομάδες μέχρι το 80% των κυττάρων που περιέχονται σήματος φθορισμού GFP. Οι μοναστρόλη (Tocris, UK) ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για κάθε πείραμα. Για σύγκριση μεταξύ μοναστρόλη ευαίσθητα AGS και μοναστρόλη-ανθεκτικά κύτταρα ΗΤ29, διαφορετικές συγκεντρώσεις μοναστρόλη χρησιμοποιήθηκαν για την επίτευξη συγκρίσιμων φαινοτύπους: 100 μΜ και 150 μΜ του μοναστρόλη για AGS και ΗΤ29 κύτταρα, αντίστοιχα. Με βάση το Σχήμα 1, χαμηλή συγκέντρωση μοναστρόλη θα είχε ως αποτέλεσμα έλλειψη επίδρασης επί των κυττάρων ΗΤ29, ενώ η υψηλή συγκέντρωση του μοναστρόλη θα είχε ως αποτέλεσμα τον θάνατο των AGS κύτταρα, είτε περίπτωση μη επιτρέποντας την ανάλυση του φαινοτύπου. Πειράματα ελέγχου πραγματοποιήθηκαν με την παρουσία DMSO.

Κύτταρα από AGS, HepG2, Lovo39, Du145, και ΗΤ29 κυτταρικές γραμμές, που αναφέρεται στην κάτω αριστερή γωνία του κάθε πάνελ, επωάστηκαν για έως και τρεις ημέρες με διάφορες συγκεντρώσεις μοναστρόλη, αναγράφεται στην δεξιά (0, 20, 50, 100, και 150 μΜ). Ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων (% του ελέγχου) προσδιορίστηκε με δοκιμασία ΧΤΤ για μιτοχονδριακή δραστικότητα. Τα σημεία και τα μπαρ αντιπροσωπεύουν κατά μέσο όρο και το SEM 3-4 ανεξάρτητα πειράματα. * Ρ & lt? 0.05: ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων Du145 ακόλουθες 2-ημερών αγωγή με 20 ή 50 μΜ μοναστρόλη, σε σύγκριση με τα βιώσιμα κύτταρα ΗΤ29 πανομοιότυπα αγωγή (κόκκινο και μπλε κύκλοι). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι διάφορες κυτταρικές σειρές είναι διαφορετικά ευαίσθητα σε μοναστρόλη, με την ευαισθησία κατάταξη: AGS & gt? HepG2 & gt? Lovo & gt? Du145≥HT29

Η

Η ανοσοχρώση

Για να απεικονίσει το κυτταροσκελετού μικροσωληνίσκων. και DNA, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε καλυπτρίδες, μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 30 λεπτά, και διαπερατά για 2 λεπτά με 0,3% Triton-x-100 σε 4% παραφορμαλδεΰδη. Τα δείγματα πλύθηκαν με PBS που περιέχει 0.1% BSA (Sigma, Ισραήλ). Οι καλυπτρίδες επωάστηκαν με αρουραίου αντι-τουμπουλίνης YOL1 /34 και στη συνέχεια με Alexa 488 συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα αντι-αρουραίου. DNA χρωματίστηκε με DAPI (0,07 μg /ml). Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν με ένα μικροσκόπιο Olympus BX51.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Πλωτή και προσκολλημένα κύτταρα στερεώθηκαν με 70% αιθανόλη και αποθηκεύονται σε -20 ° C για τουλάχιστον 7 ημέρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και επαναιωρηματοποιήθηκαν σε 0.1% Triton-X-100 και 30 μg /ml RNase Α τύπου Ι-Α (Sigma, Ισραήλ) σε θερμοκρασία δωματίου για 40 λεπτά. Πυρηνικό DNA χρωματίστηκε με 15 μg ιωδιούχο προπίδιο σε PBS διάλυμα και το DNA περιεχόμενο μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής (BD Biosciences, UK). αναλογίες κυττάρων σε υπο-G0 /G1, G0 /G1, S, G2 και /φάσεις Μ αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το κατάλληλο λογισμικό. Για κάθε δείγμα, 10,000 κύτταρα βαθμολογήθηκαν.

mRNA ανάλυση

επίπεδα κυκλίνης Β, survivin, και ακτίνης ως γονίδιο αναφοράς προσδιορίστηκαν με πραγματικού χρόνου PCR (RT-PCR) του συνολικού RNA εξάγεται από κύτταρα κατεργασμένα με μοναστρόλη. Σύνολο εκχύλιση RNA έγινε με το κιτ RNeasy μίνι (Qiagen, Germany), με ϋΝΑση θεραπεία (Qiagen, Γερμανία) για να εξασφαλιστεί η αφαίρεση του γενωμικού DNA. Το πρότυπο cDNA παρασκευάστηκε με δείγματα RNA 1 μg, χρησιμοποιώντας το Verso cDNA Synthesis Kit, όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή (Thermo Scientific). Για την ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο, τα πρότυπα αραιώνονται 1:16 και υποβλήθηκαν σε Taqman πραγματικού χρόνου διαδικασία PCR χρησιμοποιώντας το κιτ Absolute Blue QPCR (Thermo Scientific). Οι εκκινητές και ανιχνευτές (Solaris) για την ενίσχυση PCR και το μέγεθος του προϊόντος είχαν ως εξής: survivin (95 bp) προς τα εμπρός εκκινητή 5′-TTTCTCAAGGACCACCGCAT-3 ‘, αντίστροφος εκκινητής 5′-ATGAAGCCAGCCTCGGCCAT-3′, 5’-ανιχνευτής CACCCCGGAGCGGATGG-3 ‘? Κυκλίνη Β (86 bp) προς τα εμπρός εκκινητή 5’-ATCTGAGACAACTTGAGGAAG-3 ‘, αντίστροφος εκκινητής 5′-GATGGCTCTCATGTTTCCAG-3′, 5’-ανιχνευτής GGTCGGGAAGTCACTGG-3 ‘? Ακτίνης (134 bp) προς τα εμπρός εκκινητή 5’-TGGAGAAAATCTGGCACCAC-3 ‘, αντίστροφος εκκινητής 5′-GGTCTCAAACATGATCTGG-3′, 5’-ανιχνευτής ACCGCGAGAAGATGACC-3 ‘. Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν στον ανιχνευτή αλληλουχία ΑΒΙ-PRISM7500 (Applied Biosystems, Darmstadt, Γερμανία). Χρησιμοποιήθηκαν πρότυπες συνθήκες ποδηλασίας για αυτό το μέσο. θερμοκρασία αναδιάταξης ήταν 60 ° C για όλα τα γονίδια. Για κάθε δείγμα, τα επίπεδα της κυκλίνης Β και survivin κανονικοποιήθηκαν στο γονίδιο αναφοράς (ακτίνη) επίπεδα. Real-time PCR αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν μέσο όρο τρία διαφορετικά πειράματα

επίπεδο Protein ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση μεθόδου κηλίδος Western (WB) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30], με τη χρήση αντι ανθρώπινο αντίσωμα survivin (R &? D Systems)., κυκλίνη Β1 (Santa Cruz Biotechnology Inc.), ή β-ακτίνης (Cell Signaling Technology, Inc. ΜΑ, USA). Η πυκνομετρική ανάλυση του επιπέδου έκφρασης πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας EZQuant-Gel επεξεργασία εικόνας και λογισμικό ανάλυσης (EZQuant, Rehovot, Israel). Τα επίπεδα πρωτεΐνης κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα ακτίνης

Si RNA φίμωση

Τα κύτταρα απλώνονται σε ~ 1.5×10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 24 φρεατίων.? μοναστρόλη εφαρμόστηκε 24 ώρες μετά την επίστρωση. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siSurvivin ή ένα κωδικοποιημένο (SC) κατασκεύασμα siRNA (40ηΜ, Sigma-Aldrich), siRNA διαμόλυνση διεξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η αλληλουχία στόχος της survivin για siRNA ήταν: 5 ‘GGACCACCGCAUCUCUACA 3’ ή ομελέτα 5 ‘GCCCAGAUCCCUGUACGU 3’. 12h και μετά 24 ώρες την επιμόλυνση τα κύτταρα μετρήθηκαν με χρήση Trypan μπλε.

Η στατιστική ανάλυση

Στήλες και τα μπαρ σε όλα τα στοιχεία αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM. Η σημασία των διαφορών μεταξύ των μέσων τιμών προσδιορίστηκε με τη χρήση του Student

t-test

. * P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01

Αποτελέσματα

Για να εξετάσει τους παράγοντες που επηρεάζουν την ευαισθησία των διαφορετικών κυττάρων στο μοναστρόλη, πρέπει πρώτα να χαρακτηρίζεται αυτή την ευαισθησία σε πέντε διαφορετικές κυτταρικές σειρές:. AGS από αδενοκαρκίνωμα του στομάχου [46 ], HepG2 από ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [47], LoVo από αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου [48], Du154 από καρκίνωμα του προστάτη [49], και ΗΤ29 από αδενοκαρκίνωμα του κόλου [50]. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε παρατεταμένη θεραπεία με μοναστρόλη έως τρεις ημέρες. Σε κάθε χρονικό διάστημα, ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων εξετάσθηκε με ανίχνευση μιτοχονδριακή δραστηριότητα χρησιμοποιώντας 2,3-δις- (2-μεθοξυ-4-νιτρο-5-σουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο-5-καρβοξανιλίδιο άλας (ΧΤΤ) [44 ]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι, όπως αναμενόταν, ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων μειώθηκε μετά από παρατεταμένη θεραπεία με μοναστρόλη σε όλες τις κυτταρικές σειρές. Ωστόσο, το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων στις διαφορετικές κυτταρικές γραμμές μετά από θεραπεία με μοναστρόλη ποικίλη. Για παράδειγμα, η θεραπεία με 100 μΜ του μοναστρόλη για δύο ημέρες είχε ως αποτέλεσμα ~ μείωση 80% στον αριθμό των κυττάρων AGS και HepG2, ~ 60% μείωση στον αριθμό των κυττάρων Lovo και μόνο ~ 30% μείωση στην Du145 και κύτταρα ΗΤ29 (σχήμα 1, πράσινοι κύκλοι). Βρήκαμε επίσης μια μικρή αλλά αναπαραγώγιμη διαφορά μεταξύ της βιωσιμότητας των Du145 και κυττάρων ΗΤ29 σε επεξεργασία με μοναστρόλη. Για παράδειγμα: το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων Du145 επεξεργασία με 20 ή 50 μΜ μοναστρόλη για 2 ημέρες είναι σημαντικά μικρότερη από εκείνη των πανομοιότυπα αγωγή ΗΤ29 κύτταρα. Με βάση τα στοιχεία βιωσιμότητας (Σχήμα 1), ιδρύσαμε το βαθμό ευαισθησίας σε μοναστρόλη, από την πιο ευαίσθητη σε λιγότερο ευαίσθητα, όπως:. AGS & gt? HepG2 & gt? Lovo & gt? Du145≥HT29

Μιτωτικά ολίσθηση είναι ένα φαινόμενο με η οποία με την παρουσία της μιτωτικής βλάβη, τα κύτταρα προχωρήσει στην G1 φάση του επόμενου κύκλου χωρίς διαχωριστικές τους DNA [31, 33, 34, 51]. Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν η αντίσταση μιας συγκεκριμένης κυτταρικής γραμμής να μοναστρόλη σχετίζεται με την τάση της να υποστούν μιτωτική ολίσθηση με την παρουσία του φαρμάκου. Για να χαρακτηρίσουμε μιτωτική ολίσθηση, εμείς κατεργασμένα κύτταρα με μοναστρόλη για 48 ώρες σε συγκεντρώσεις που κατέληξαν σε τουλάχιστον κυτταρική επιβίωση, και εξέτασαν την μορφολογία των μικροσωληνίσκων κυτταροσκελετού με ανοσοχρώση (Σχήμα 2Α και 2Β) και διανομή του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής (Σχήμα 2C). Τα κύτταρα καθηλώθηκαν στην μίτωση με μοναστρόλη έχουν προηγουμένως δειχθεί ότι εμφανίζουν monoastral ατράκτους [24, 30]. Βρήκαμε ότι μετά τη θεραπεία μοναστρόλη 48h δύο κύρια μορφολογίες των κυττάρων ήταν εμφανείς: G1-ομοειδών ή monoastral μιτωτικών κυττάρων (Σχήμα 2Α). Ο αριθμός των φυσιολογικών κυττάρων μιτωτικών ή κυττάρων με αγνώστων μορφολογίες ήταν αμελητέα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι μετά από αγωγή 48 ωρών με μοναστρόλη, οι διάφορες κυτταρικές σειρές παρουσίασαν διαφορετικά ποσοστά των κυττάρων με monoasters. Για παράδειγμα, η πλειονότητα των κυττάρων που επιβιώνουν AGS εμφανίστηκε ως G1-όπως μεγάλα κύτταρα με μονά πυρήνες (σχήμα 2Α). Το ποσοστό των monoasters σε αυτά τα κύτταρα ήταν πολύ μικρό, ~ 7% (Σχήμα 2Β). Βρήκαμε ότι και οι δύο AGS και HepG2 κυτταρικές σειρές, οι οποίες είναι ευαίσθητες σε μοναστρόλη, παρουσίασαν ένα μικρό ποσοστό των monoasters (& lt? 10%) και ένα μεγάλο ποσοστό των G1-όπως κύτταρα, μετά από θεραπεία 48h μοναστρόλη (Σχήμα 2Β). Από την άλλη πλευρά, LoVo, Du145, και ΗΤ29 κυτταρικές σειρές, οι οποίες είναι πιο ανθεκτικές σε μοναστρόλη, εμφανίζουν σημαντικά μεγαλύτερα ποσοστά, 20-30%, του monoastral ατράκτους (Σχήμα 2Β), υποδεικνύοντας ότι οι μεγάλοι αριθμοί αυτών των κυττάρων που συνελήφθησαν το μίτωσις. Ανάλυση της κατανομής φάσης του κυτταρικού κύκλου αποκάλυψαν ότι μετά από αγωγή 48 ωρών με μοναστρόλη, παρά τη διαφορά στο ποσοστό των μιτωτικών κυττάρων με monoasters, όλοι εξετάστηκαν κυτταρικές γραμμές περιείχε ένα μεγάλο ποσοστό των κυττάρων με διπλό περιεχόμενο DNA (Σχήμα 2C, διπλό βέλος ). Αυτό δείχνει ότι αν και ορισμένα από τα κύτταρα εμφανίστηκε με την τυπική G1-όπως μικροσωληνίσκων κυτταροσκελετού, τα κύτταρα είχαν διπλασιαστεί περιεχόμενο DNA, δηλαδή, είχαν υποβληθεί σε μιτωτική ολίσθηση χωρίς διαίρεση DNA. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι υπάρχει σχέση μεταξύ της ευαισθησίας στην μοναστρόλη και η τάση να υποστούν μιτωτική ολίσθηση:. μοναστρόλη-ανθεκτικά κύτταρα κατέχουν μιτωτική σύλληψη για μεγαλύτερα χρονικά διαστήματα, ενώ μοναστρόλη ευαίσθητα κύτταρα υφίστανται μιτωτική ολίσθηση

(Α ) AGS και κύτταρα ΗΤ29 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 48 ώρες με 100 μΜ και 150 μΜ του μοναστρόλη, αντίστοιχα. Τουμπουλίνης κυτταροσκελετός οπτικοποιήθηκε μετά από στερέωση με ανοσοχρώση, DNA χρωματίστηκε με DAPI. Μετά 48 ώρες της θεραπείας μοναστρόλη, η πλειονότητα των κυττάρων AGS εμφανίστηκε ως μεγάλα, G1 κύτταρα που μοιάζουν με ένα πυρήνα (κίτρινα βέλη), ενώ ένα υψηλό ποσοστό κυττάρων ΗΤ29 συνελήφθησαν στην μίτωση ως monoasters (πράσινα βέλη). (Β) Επίδραση της παρατεταμένης θεραπείας με μοναστρόλη σε ποσοστό monoasters στις διάφορες κυτταρικές σειρές, που υποδεικνύεται στο κάτω μέρος. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μοναστρόλη, επεξεργασία για ανοσοκηλίδωση, και το ποσοστό των monoasters προσδιορίστηκε με βαθμολόγηση 200-300 κύτταρα για κάθε κυτταρική σειρά. Στήλες και ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέσους όρους και SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα, * P & lt? 0,05, σε σύγκριση με τα κύτταρα AGS. (Γ) Κατανομή των φάσεων του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής σε απουσία (έλεγχος) ή παρουσία μοναστρόλη. Οι κυτταρικές σειρές που αναγράφεται στην κορυφή. Μονά και διπλά βέλη παριστάνουν κορυφές με 2η και 4η περιεχόμενο του DNA, αντίστοιχα.

Η

κάτω ρύθμιση της αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη survivin είχε προηγουμένως αποδειχθεί ότι αυξάνουν μιτωτική ολίσθηση με την παρουσία του άξονα βλάβης [52] . έτσι Υποθέσαμε ότι κατά τη διάρκεια της έκθεσης σε μοναστρόλη, η έκφραση του survivin θα διαφέρουν μεταξύ μοναστρόλη ευαίσθητα και ανθεκτικών κυττάρων. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, συγκρίναμε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης survivin σε κύτταρα ΗΤ29 μοναστρόλη ανθεκτικά και AGS κύτταρα μοναστρόλη ευαίσθητα (Σχήμα 3). Για να καταστεί δυνατή η μέτρηση των αλλαγών στο επίπεδο της πρωτεΐνης πριν την απόπτωση [30], θα αντιμετωπίζονται κύτταρα με μοναστρόλη για μικρότερους χρόνους, 12h και 24h. Για να εκτιμηθεί η μιτωτική κατάσταση των εξεταζόμενων κυττάρων, ακολουθήσαμε επίπεδα της μιτωτικής πρωτεΐνης κυκλίνης Β mRNA (Σχήμα 3Α) και της πρωτεΐνης (Σχήμα 3Β και 3C) Βρήκαμε ότι μετά από αγωγή 24 ώρες με κύτταρα ΗΤ29 μοναστρόλη εμφανίζουν αυξημένα επίπεδα κυκλίνης Β σε σύγκριση για 12h της θεραπείας, υποδεικνύοντας ότι έχει διακοπεί η μίτωση (Σχήμα 3). Από την άλλη πλευρά, στην AGS κύτταρα, τα επίπεδα κυκλίνης Β είχαν ήδη αυξηθεί σε 12 ώρες της θεραπείας με τα επίπεδα μοναστρόλη και κυκλίνη Β εμφάνισε μια τάση να μειώνεται στις 24 ώρες, 0,05 & lt? P & lt? 0,1 (Σχήμα 3). Αυτό υποδηλώνει ότι η θεραπεία με μοναστρόλη για 24 ώρες προκαλεί ήδη μερική μιτωτική διολίσθηση στο AGS κύτταρα ενώ τα κύτταρα ΗΤ29 διατηρούν μιτωτική σύλληψη. Εξέταση του mRNA survivin (Σχήμα 3Α) και της πρωτεΐνης (Σχήμα 3Β και 3C) επίπεδα αποκάλυψε ότι σε ΗΤ29 επίπεδα κύτταρα »της survivin αυξάνεται σε αγωγή 24 ώρες με μοναστρόλη, γεγονός που υποδηλώνει ότι η survivin εμπλέκεται στη διατήρηση της μίτωσης. Από την άλλη πλευρά, στα κύτταρα AGS επίπεδα του mRNA της survivin παρέμεινε αμετάβλητη στις 24 ώρες σε σύγκριση με τη θεραπεία με μοναστρόλη 12h. Επιπλέον, στα AGS κύτταρα, τα μέσα επίπεδα πρωτεΐνης survivin ήταν χαμηλότερες σε 24 ώρες συγκριτικά με 12 ώρες της θεραπείας μοναστρόλη, αν και η διαφορά αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Σχήμα 3Β και 3C, δεξί πάνελ). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα αυξημένα επίπεδα survivin σε ένα συγκεκριμένο κύτταρο-γραμμή συσχετίζεται με την αντίσταση αυτής της κυτταρικής γραμμής να μοναστρόλη θεραπεία.

ΗΤ29 και AGS κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μοναστρόλη για 12h και 24h και υποβάλλονται σε επεξεργασία για mRNA ανάλυση με RT PCR (Α) και ανάλυση επίπεδο πρωτεΐνης με WB (Β και C). 150 μΜ και 100 μΜ μοναστρόλη χρησιμοποιήθηκαν για κύτταρα ΗΤ29 και AGS, αντίστοιχα. Σε Α και C, στήλες και ράβδοι αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο και SEM τιμές για 3-4 ανεξάρτητα πειράματα. Σε κάθε πείραμα, τα επίπεδα της κυκλίνης Β (αριστερά) και survivin (δεξιά), που υποδεικνύεται στην κορυφή, με την παρουσία του μοναστρόλη κανονικοποιήθηκαν με τις τιμές ελέγχου που ελήφθησαν με μόνο DMSO. * P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? a-0,05 & lt? P & lt? 0,1 σε σύγκριση με 12 ώρες της θεραπείας μοναστρόλη. (Β) Αντιπροσωπευτική WB ανάλυση της κυκλίνης Β και η έκφραση πρωτεΐνης survivin σε AGS (αριστερά) και ΗΤ29 (δεξιά) κύτταρα κατεργασμένα με μοναστρόλη για 12 ώρες και 24 ώρες, που υποδεικνύεται στο κάτω μέρος. Ίση φόρτωση πρωτεΐνης ήταν ακολουθούν από την έκφραση της ακτίνης (κάτω πάνελ). (+) Μοναστρόλη? (-) DMSO

Η

Για να εξεταστεί αν τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης της survivin διατηρούν άμεσα παρατεταμένη μιτωτική σύλληψη, επιμολύναμε τις μοναστρόλη ευαίσθητα AGS κυττάρων με ένα πλασμίδιο που κωδικοποιεί για την πρωτεΐνη survivin φυσικού τύπου συγχωνευμένου στη GFP (. pSurvivin, [45]), και δημιούργησε ένα πολυ-κλωνικών σταθερώς επιμολυσμένη κυτταρική σειρά AGS (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι). διάνυσμα GFP που εκφράζουν χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. κύτταρα που εκφράζουν AGS το πλασμίδιο pSurvivin εμφάνισε 5,2 ± 0,9 (SEM, η = 4) φορές αύξηση στην έκφραση survivin (Σχήμα 4Α, κάτω). Μετά την παραγωγή του σταθερώς επιμολυσμένων κυτταρικές σειρές, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μΜ μοναστρόλη και υποβάλλονται σε επεξεργασία για ανοσοκηλίδωση τουμπουλίνης, βιωσιμότητα, και ανάλυση κατανομής του κυτταρικού κύκλου (σχήμα 4Α-4D). Βρήκαμε ότι μετά από αγωγή 24 ώρες με μοναστρόλη, το ποσοστό των μιτωτικών κυττάρων συνελήφθησαν με monoasters αυξήθηκε σημαντικά σε κύτταρα από survivin που εκφράζουν σε σύγκριση με AGS κύτταρα που εκφράζουν τον φορέα μόνο (Σχήμα 4Α και 4Β). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η υπερέκφραση της survivin αυξάνει την ικανότητα των κυττάρων AGS να διατηρήσει μιτωτική σύλληψη παρουσία ατράκτου βλάβη που προκαλείται από μοναστρόλη. Ανάλυση της κατανομής φάσης κυτταρικού κύκλου υποδεικνύει ότι μετά από αγωγή 12 ώρες με μοναστρόλη, το ποσοστό των AGS κυττάρων από survivin που εκφράζουν με διπλό (4Ν) περιεκτικότητα DNA είναι σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με κύτταρα που εκφράζουν μόνο τον φορέα (Σχήμα 4C, 12Η), υποδεικνύοντας ότι η survivin προκαλεί παρατεταμένη μιτωτική σύλληψη. Σημαντικά, μετά από αγωγή 24 ώρες με μοναστρόλη βρήκαμε καμία διαφορά στο ποσοστό του πληθυσμού των κυττάρων με 4Ν περιεχόμενο DNA μεταξύ των κυττάρων που εκφράζουν survivin και εκείνων που εκφράζουν τον φορέα μόνο (Σχήμα 4C, 24h). Ωστόσο, μετά από αγωγή 24 ώρες με μοναστρόλη, υπήρξε μια σημαντική αύξηση στον αριθμό των κυττάρων με monoasters σε κύτταρα από survivin που εκφράζουν, υποδεικνύοντας τα κύτταρα είναι σε μιτωτική σύλληψη, σε σύγκριση με κύτταρα που εκφράζουν μόνο τον φορέα, το οποίο υποβλήθηκε σε μιτωτικά ολίσθηση και προορίζονταν για κύτταρο θάνατος (Σχήμα 4Α και 4Β). Έτσι, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι σε απουσία survivin υπερέκφρασης, AGS κύτταρα υφίστανται μιτωτικά ολίσθηση και θάνατο των κυττάρων μετά από θεραπεία με μοναστρόλη, ενώ η υπερέκφραση του survivin επάγει μιτωτικής σύλληψης, πιθανόν διάσωση των κυττάρων. Επιπλέον, συνεπής με την προτεινόμενη αντι-αποπτωτική λειτουργία του survivin [45, 53], βρήκαμε ότι η υπερέκφραση του survivin σε AGS κύτταρα αύξησε την βιωσιμότητα αυτών των κυττάρων μετά από 24 ώρες και η επεξεργασία 48h με μοναστρόλη (Σχήμα 4C).

(Α-Δ) AGS κύτταρα σταθερώς επιμολυσμένα με ένα πλασμίδιο που εκφράζει GFP (vector) ή ένα πλασμίδιο που κωδικοποιεί για υπερέκφραση της survivin-GFP (pSurvivin). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μΜ μοναστρόλη και υποβάλλονται σε επεξεργασία για ανοσοκηλίδωση μικροσωληνίσκων (Α και Β), ανάλυση κατανομής του κυτταρικού κύκλου (C), και το τεστ βιωσιμότητας (D). (Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες των μικροσωληνίσκων κυτταροσκελετού σε AGS κύτταρα που φέρουν ένα άδειο φορέα ή pSurvivin, που υποδεικνύεται στο κάτω μέρος. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μΜ μοναστρόλη για 24 ώρες. Τα G1-όπως κύτταρα (κίτρινα βέλη) και μιτωτική κύτταρα (πράσινο βέλος) που παρατηρήθηκαν. Δεδομένου ότι τα μιτωτικά κύτταρα είναι στρογγυλά, εστιακού επιπέδου τους είναι διαφορετική από εκείνη των επίπεδων G1-σαν κύτταρα. Οι εικόνες στο (Α) επικεντρώθηκε στα κύτταρα G1 και ως εκ τούτου τα monoasters σε μίτωση δεν παρατηρούνται σε αυτές τις εικόνες. Κατά συνέπεια, μιτωτικά κύτταρα εμφανίζονται ως φωτεινές σφαίρες (πράσινα βέλη). Κάτω: survivin WB ανάλυση των πολλαπλασιαζόμενων AGS κυττάρων παρουσία (+) ή απουσία (-) του πλασμιδίου pSurvivin υπερέκφραση. (Β) Ποσοτικοποίηση% των μιτωτικών κυττάρων με βάση τις εικόνες, όπως φαίνεται στο (Α). μόνο γκρι-φορέα? μπλε-pSurvivin. Στήλες και ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέσους όρους και SEM των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων στα οποία μετρήθηκαν συνολικά 200-300 κυττάρων. ** Ρ & lt? 0,01, σε σύγκριση με μόνο φορέα. (C) Σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα AGS υποβλήθηκαν σε θεραπεία με μοναστρόλη για 12h και 24h (υποδεικνύεται στην κορυφή) και επεξεργάστηκαν για ανάλυση κατανομής φάση του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής. Μονά και διπλά βέλη παριστάνουν κορυφές με 2η και 4η περιεχόμενο του DNA, αντίστοιχα. Οι αριθμοί στις παρενθέσεις αντιπροσωπεύουν το ποσοστό των κυττάρων με διπλό (4Ν) περιεκτικότητα DNA. (D) Βιωσιμότητα των σταθερά επιμολυσμένων κυττάρων με την παρουσία 100 μΜ μοναστρόλη για 24 ώρες και 48 ώρες. μόνο γκρι-φορέα? Μπλε-pSurvivin. Ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία ΧΤΤ για μιτοχονδριακή δραστικότητα. Ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων υπολογίστηκε σε σχέση με τον έλεγχο των πειραμάτων με μόνο DMSO. Στήλες και ράβδοι αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο και το SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα. * Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με μόνο φορέα. (Ε) AGS και τα κύτταρα ΗΤ29 παροδικά επιμολυσμένα με survivin (σκούρο πράσινο) ή ως κωδικοποιημένο (SC, ανοιχτό πράσινο) ακολουθία Si RNA. 12h εξής AGS επιμόλυνση και τα κύτταρα ΗΤ29 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 και 150 μΜ μοναστρόλη, αντίστοιχα, για 12 ώρες και 24 ώρες (υποδεικνύεται στο κάτω μέρος). Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με Trypan blue. Ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων υπολογίστηκε σε σχέση με τον έλεγχο των πειραμάτων με μόνο DMSO. Στήλες και ράβδοι αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο και το SEM 2-4 ανεξάρτητα πειράματα προσχηματισμένες εις τριπλούν. * P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? a-0,05 & lt? P & lt?. 0.1, σε σύγκριση με ομελέτα ακολουθία Si RNA

Η

Για να εξεταστεί περαιτέρω η σχέση μεταξύ της βιωσιμότητας των κυττάρων υπό θεραπεία μοναστρόλη και την έκφραση της survivin, είμαστε εν μέρει σιγήσει έκφραση survivin από Si RNA ( Σχήμα 4Ε). Κωδικοποιημένα ακολουθία RNA χρησίμευσε ως μάρτυρας. Η εξέταση των επιπέδων mRNA των survivin με RT PCR επιβεβαίωσε ότι ενώ παροδική διαμόλυνση κωδικοποιημένα RNA αλληλουχίας δεν προκάλεσε μεταβολή στα επίπεδα mRNA του survivin, η επιμόλυνση με survivin Si RNA προκάλεσε ~ 70% και 50-60% μείωση στα επίπεδα του mRNA της survivin σε AGS και ΗΤ29 κύτταρα, αντίστοιχα (δεν δείχνεται). Βρήκαμε ότι μετά 12h έκθεσης σε μοναστρόλη, μερική αποσιώπηση της έκφρασης της survivin προκάλεσε μία μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων AGS και ΗΤ29 κατά 50-60%, σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με το κωδικοποιημένο RNA αλληλουχία (Σχήμα 4Ε). Ενώ τα AGS κύτταρα μοναστρόλη ευαίσθητα έδειξε μόνο μια τάση (0,05 & lt? P & lt? 0,1), οι μοναστρόλη-ανθεκτικά κύτταρα ΗΤ29 έδειξαν σαφώς σημαντική μείωση στην βιωσιμότητα μετά από μερική σίγηση επιζών (Ρ & lt? 0,05), υποδεικνύοντας ότι η survivin απαιτείται για βιωσιμότητα και αντοχή σε μοναστρόλη. Μετά 24h της θεραπείας με μοναστρόλη, η βιωσιμότητα των κυττάρων AGS μοναστρόλη ευαίσθητα μειώθηκε περαιτέρω σε κύτταρα επιμολυσμένα με survivin Si ή κωδικοποιημένο RNA (Εικ 4Ε). Στα μοναστρόλη-ανθεκτικά κύτταρα ΗΤ29, μερική αποσιώπηση της έκφρασης της survivin προκάλεσε μια αυξημένη βιωσιμότητα σε σύγκριση με την αλληλουχία κωδικοποιημένα RNA, δείχνοντας ότι υπάρχουν μηχανισμοί προσαρμογής σε αυτά τα κύτταρα να μειωθεί μερικώς επίπεδα survivin. Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η αύξηση των επιπέδων της survivin κατά την διάρκεια μίτωσης συνδέονται με τη βιωσιμότητα των κυττάρων, η οποία είναι τουλάχιστον εν μέρει σχετίζεται με την ικανότητά του να επάγει παρατεταμένη μιτωτική σύλληψη υπό θεραπεία με μοναστρόλη.

Συζήτηση

Μελέτες κατά την τελευταία δεκαετία έχουν δείξει ότι όταν τα κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με αντι-μιτωτικές φάρμακα όπως ειδικοί αναστολείς κινεσίνης-5, δύο κύρια σενάρια μπορούν να εμφανιστούν: κύτταρα μπορούν είτε να διατηρούν μιτωτική σύλληψη και πεθαίνουν από μιτωτική απόπτωση [30, 31], ή να προχωρήσει στην επόμενη φάση G1 από μιτωτική ολίσθηση και υφίστανται απόπτωση [33, 34]. Στην τελευταία περίπτωση, τα κύτταρα πεθαίνουν γρήγορα απόπτωσης που προκαλείται από το «tetraploidy σημείο ελέγχου» [33, 35]. Με αυτό το σενάριο, τα κύτταρα που υποβάλλονται σε μιτωτική ολίσθηση πιο εύκολα υπό την παρουσία μοναστρόλη θα υπόκεινται σε απόπτωση που επάγεται από το tetraploidy οδοφράγματος και έτσι να είναι πιο ευαίσθητα σε μοναστρόλη. Ωστόσο, η tetraploidy σημείο ελέγχου βρέθηκε να είναι εξαρτώμενη από την καταστολέα όγκου ρ53 πρωτεΐνη [51, 54]. Έτσι, τα κύτταρα αναμένεται να είναι πιο ευαίσθητα στην μοναστρόλη εφόσον υποβάλλονται σε μιτωτική ολίσθηση και να εκφράσει ένα άγριου-τύπου ρ53. Πράγματι, οι κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη εκφράζουν και τις δύο εκδόσεις της πρωτεΐνης p53: ρ53 είναι άγριου τύπου σε AGS [55], HepG2 [56], και LoVo [57] κυτταρικές σειρές, ενώ είναι μεταλλαγμένο σε ΗΤ29 [58] και Du145 [49] κύτταρα. Η ανακάλυψή μας ότι η κατάταξη της ευαισθησίας σε μοναστρόλη είναι AGS & gt? HepG2 & gt? Lovo & gt? Du145≥HT29 υποστηρίζει την ιδέα ότι τα κύτταρα θα είναι πιο ευαίσθητα στις κινεσίνη-5 αναστολείς, αν έχουν την τάση να υποστούν μιτωτική ολίσθηση και να φέρουν αλληλόμορφο ρ53 άγριου τύπου. Η τάση να υποστούν μιτωτική ολίσθηση per se δεν εξαρτάται άμεσα από την κατάσταση της ρ53 αφού τα κύτταρα LoVo τα οποία φέρουν WT p53 [57] υφίστανται μιτωτική ολίσθηση στον ίδιο βαθμό όπως το ΗΤ29 και κύτταρα Du125, τα οποία φέρουν ένα μεταλλαγμένο p53 [49, 58 ] (Σχ 2Β και 2C). Παρ ‘όλα αυτά, αυξημένο κυτταρικό θάνατο εμφανίζεται στα κύτταρα LoVo όταν WT p53 επιτρέπει την ενεργοποίηση του «tetraploidy σημείο ελέγχου».

Όταν μιτωτική ολίσθηση συμβαίνει σε p53 μεταλλαγμένα κύτταρα, κύτταρα προχωρήσει με πολλαπλασιασμό χωρίς σωστή διαίρεση του DNA.

In vivo

, αυτό μπορεί να οδηγήσει σε συσσώρευση μεταλλάξεων που μειώνουν κυτταροτοξική δραστικότητα /αντικαρκινική κινεσίνης-5 αναστολείς [22, 27, 39]. Έτσι, μία από τις στρατηγικές για την αύξηση της αποτελεσματικότητας των αντι-μιτωτικών φαρμάκων κατά του καρκίνου μπορεί να είναι για να προκαλέσει παρατεταμένη μιτωτική σύλληψη σε καρκίνους που εκφράζουν μεταλλαγμένες εκδόσεις του ρ53.