Αφηρημένο

Ιστορικό

Πρόσφατες εκθέσεις δείχνουν ότι

in vitro

ναρκωτικών οθόνες σε συνδυασμό με τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης (GEP) κυτταρικών σειρών καρκίνου μπορεί να δημιουργήσει ενημερωτικό υπογραφές πρόβλεψη της κλινικής έκβασης της χημειοθεραπείας. Στο πολλαπλό μυέλωμα (ΜΜ) μια σειρά από νέα φάρμακα έχουν εισαχθεί και τώρα αμφισβητούν τη συμβατική θεραπεία συμπεριλαμβανομένων των υψηλών μελφαλάνη δόση. Κατά συνέπεια, η παραγωγή της πρόβλεψης υπογραφές για απόκριση σε μελφαλάνη μπορεί να έχει κλινική σημασία. Η υπόθεση είναι ότι μελφαλάνη οθόνες και Geps του καρκίνου Β-κυττάρων κυτταρικές σειρές σε συνδυασμό με πολυμεταβλητή στατιστική μπορεί να παρέχει προγνωστική κλινικές πληροφορίες.

Υλικά και Μέθοδοι

μικροσυστοιχιών βασισμένη Geps και μελφαλάνη οθόνη αναστολή της ανάπτυξης των 59 καρκινικές κυτταρικές σειρές είχαν κατεβάσει από τη βάση δεδομένων του National Cancer Institute. Ισοδύναμα δεδομένα παρήχθησαν για 18 καρκινικού κυττάρου Β-κυτταρικές γραμμές. Γραμμική διακριτική ανάλυση (LDA), αραιά μερική ελαχίστων τετραγώνων (SPLS) και κατά ζεύγη συγκρίσεις των δεδομένων κυτταρική γραμμή χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή υπογραφές αντίσταση από τους δύο πίνακες κυτταρική σειρά. Ένας δείκτης αντίστασης μελφαλάνη ορίστηκε και υπολογίζεται για κάθε ασθενή MM σε διαθέσιμες στο κοινό κλινικά δεδομένα που και αξιολογούνται εκ των υστέρων από αναλογικών κινδύνων κατά Cox και την ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier.

Κύρια Ευρήματα

Τόσο η κυτταρική σειρά πάνελ απέδωσε καλά σε σχέση με την εσωτερική επικύρωση της προσέγγισης SPLS αλλά μόνο στον πίνακα Β-κυττάρων ήταν σε θέση να προβλέψει ένα σημαντικά υψηλότερο κίνδυνο υποτροπής και θανάτου με την αύξηση του δείκτη αντίστασης στα σύνολα κλινικά δεδομένα. Οι πιο ευαίσθητων και ανθεκτικών κυτταρικών σειρών, MOLP-2 και RPMI-8226 LR5, αντίστοιχα, είχαν υψηλή μόχλευση, γεγονός που υποδηλώνει διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων τους να κατέχουν σημαντική προγνωστική αξία.

Συμπέρασμα

Η παρούσα μελέτη παρουσιάζει ένα δείκτη αντίστασης μελφαλάνης που παράγεται από την ανάλυση ενός πλαισίου Β-κυττάρων των καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Ωστόσο, ο δείκτης αντοχής πρέπει να επικυρωθεί λειτουργικά και συσχετίζονται με τις γνωστές βιοδείκτες ΜΜ σε ανεξάρτητα σύνολα δεδομένων με σκοπό την καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών που διέπουν την ετοιμότητα να μελφαλάνη αντίσταση

Παράθεση:. Boegsted Μ, Holst JM, Fogd K , Falgreen S, S Sørensen, Schmitz A, et al. (2011) Δημιουργία μιας πρόβλεψης μελφαλάνη Αντίστασης Δείκτη κατά Ανίχνευσης Ναρκωτικών του Καρκίνου Β-κυττάρων Γραμμές κυττάρων. PLoS ONE 6 (4): e19322. doi: 10.1371 /journal.pone.0019322

Επιμέλεια: Venugopalan Cheriyath, Cleveland Clinic, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Ιούλη, 2010? Δεκτές: 1 Απρίλη 2011? Δημοσιεύθηκε: 29 Απριλίου 2011

Copyright: © 2011 Boegsted et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα υποστηρίζεται από MSCNET, ένα μεταφραστικό πρόγραμμα μελετώντας καρκινικά βλαστικά κύτταρα στο πολλαπλό μυέλωμα που υποστηρίζονται από το 6ο ΠΠ της ΕΕ, και CHEPRE, ένα πρόγραμμα που σπουδάζουν χημειοευαισθησία στο κακόηθες λέμφωμα από γονιδιωματική υπογραφών που υποστηρίζονται από τον οργανισμό της Δανίας για την Επιστήμη, την Τεχνολογία και την καινοτομία, καθώς και Det Obelske Familiefond και η Karen Elise Jensen Fonden. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο παράγοντας αλκυλίωσης, μελφαλάνη, είναι η ραχοκοκαλιά της τρέχουσας θεραπείας σε ΜΜ. Από τη δεκαετία του 1990, η μελφαλάνη έχει χρησιμοποιηθεί στη θεραπεία υψηλής δόσης (HDT) που ακολουθείται από αυτόλογη μεταμόσχευση βλαστικών κυττάρων (ASCT) [1] και έχει ως εκ τούτου βελτίωσαν το ποσοστό απόκρισης, καθώς επίσης και παρατεταμένη συμβάν ελεύθερη επιβίωση (EFS) και τη συνολική επιβίωση ( OS) [2]. Ακόμα κι αν τα τελευταία χρόνια έχουν δει σημαντικές βελτιώσεις, η συνολική επιβίωση παραμένει θλιβερή και η ασθένεια θεωρείται ανίατη – κυρίως λόγω της αρχικής ανθεκτική νόσο ή επαγόμενη αντίσταση με αποτέλεσμα την υποτροπή της νόσου. Πυρίμαχα ασθένεια και πρώιμη υποτροπή θεωρείται ότι έχει συσχετιστεί με την ανάπτυξη της μελφαλάνης αντίστασης το οποίο είναι ένα σύνθετο φαινόμενο δεν είναι πλήρως κατανοητό [3]. Μια πιθανή στρατηγική για τη βελτίωση των γνώσεων σχετικά με την αντίσταση των ναρκωτικών είναι η συνδυασμένη χρήση των νέων τεχνολογιών, συμπεριλαμβανομένων GEP και την οθόνη του φαρμάκου σε προκλινικό κακοήθη μοντέλο καρκίνο Β-κυττάρων κυτταρική γραμμή [4].

Η βασική ιδέα των πρόσφατων μελετών σχετικά με αντοχή φαρμάκου ήταν να κατηγοριοποιήσει κυτταρικές σειρές σε ευαίσθητες, ανθεκτικό και των ενδιάμεσων ομάδων βασίζεται σε πειράματα απόκρισης δόσης του φαρμάκου και στη συνέχεια να παράγει ένα γενετικό ταξινομητής ή υπογραφή με βάση την ανάλυση μικροσυστοιχίας. Οι διαθέσιμες στο κοινό δεδομένων από τον πίνακα NCI60 κυτταρική σειρά που παράγεται από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (NCI) έχουν χρησιμοποιηθεί εκτεταμένα σε τέτοιες μελέτες για διάφορους τύπους καρκίνου και αγωγές θεραπείας. Ωστόσο, η προσέγγιση παραμένει αμφιλεγόμενη [5], [6]. Αρκετοί συγγραφείς έχουν υποστηρίξει ότι η απόδοση θα μπορούσε να βελτιωθεί με ένα συγκεκριμένο πίνακα κυτταρική σειρά. Μια τέτοια προσέγγιση χρησιμοποιήθηκε από τον Lee et al. [7] και Liedtke et al. [8] για την ουροδόχο κύστη και ο καρκίνος του μαστού όγκους, αντίστοιχα. Η επιτυχής προσέγγιση των Lee et al. [7] ήταν με βάση την επιλογή του γονιδίου εκφράσεις για τα όργανα συγκεκριμένες κυτταρικές σειρές που συσχετίζονται με γονιδιακή έκφραση στο υλικό του ασθενούς πριν από την ανάπτυξη ταξινομητή τους από ένα οπίσθιο αλγόριθμο εσφαλμένη κατάταξη-κυρώσεις. Ωστόσο, Liedtke et al. [8] δεν ήταν σε θέση να προβλέψει το αποτέλεσμα της απάντησης σε χημειοθεραπεία με μια προσέγγιση που βασίζεται σε διαγώνια ανάλυση γραμμικής διακρίνουσας (DLDA) για την ταξινόμηση.

Η έννοια της παρούσας μελέτης είναι ότι μελφαλάνη αντίσταση στο MM μπορεί να μελετηθεί σε ένα προκλινικό μοντέλο κακοήθων καρκινικών κυτταρικών γραμμών Β-κυττάρων με το συνδυασμό φαρμάκων και οθόνες Geps και δημιουργούν ένα γονίδιο υπογραφή για αντίσταση, η οποία κλινικά μπορεί να επικυρωθεί από την πρόβλεψη της έκβασης για όγκους αναλύθηκαν πριν μελφαλάνης υψηλής δόσης και ASCT. Μια τέτοια στρατηγική περιλαμβάνει την εντατική παραγωγή δεδομένων στο εργαστήριο και κατάφεραν με τη χρήση της διαχείρισης των δεδομένων και την προηγμένη στατιστική ανάλυση [5], [6]. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε εφαρμόσει αναπαραγωγιμότητα από scripting το σύνολο της ροής ανάλυση των δεδομένων στον τομέα της Ε και Bioconductor.

Συνοπτικά, οι ειδικοί στόχοι αυτής της μελέτης ήταν να αναπτύξει μια μελφαλάνη δείκτη γονίδιο αντίστασης με τη χρήση 1) η διαθέσιμων στο κοινό πίνακα κυτταρική γραμμή NCI60 ή 2) ένα πάνελ των κυτταρικών γραμμών καρκίνου του Β-κυττάρων και 3) η υποστήριξη της έννοιας αν και διαθέσιμα «on-line» μικροσυστοιχίες και κλινικά δεδομένα που από ασθενείς MM αγωγή με διπλή μελφαλάνης υψηλή δόση [9].

Υλικά και Μέθοδοι

Η κυτταρική σειρά NCI60 Panel

Η μέθοδος οθόνη κυτταρική σειρά NCI60 έχει αναπτυχθεί από την NCI και χρησιμεύει για τον έλεγχο ενός μεγάλου αριθμού ουσιών για την κυτταροτοξική δράση. Ο πίνακας αποτελείται από 59 κυτταρικές γραμμές που προέρχονται από διαφορετικούς τύπους του καρκίνου [10], [11]. Τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης και τα δεδομένα ευαισθησίας χημειοθεραπεία είναι διαθέσιμα στο κοινό. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στην ηλεκτρονική ενότητα Πληροφορίες παρακάτω. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήσαμε το GI

50 αξία, όπως ορίζεται από NCI [12].

Καρκίνος Β-κυττάρων Γραμμές κυττάρων και καλλιέργειας

Ο πίνακας Β-κυττάρου αποτελείται από 13 κυττάρων ΜΜ γραμμές, 1 πλασματοκύτωμα (PC) κυτταρική γραμμή και 4 διάχυτο μεγάλου κυτταρικές σειρές Β-λεμφώματος κυττάρων (DLBCL). Οι κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν υπό πρότυπες συνθήκες στους 37 ° C? σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα /5% CO

2 με το κατάλληλο μέσο, ​​πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη προσθήκη ορού εμβρύου μόσχου (FBS) και 1%. Βλέπε Πίνακα S1. Οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν για ένα μέγιστο 20 περάσματα για την ελαχιστοποίηση τυχόν μακροπρόθεσμες επιπτώσεις καλλιέργεια. Πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη 1%, ΚΡΜΙ1640, IMDM και FBS αγοράσθηκαν από την Invitrogen. Οι κυτταρικές σειρές KMM-1 και KMS-11 ελήφθησαν από JCRB (ιαπωνική συλλογή της έρευνας Bioresources), και KMS-12-ΡΕ, KMS-12-BM, LP-1, MM1S, MOLP-2, MOLP-8, NCI -H929, OPM-2, RPMI-8226, U-266, ΑΓ-1, DB, HT και SU-DHL-4 από DSMZ (Deutsche συλλογή μικροοργανισμών και καλλιεργειών κυττάρων). Η κυτταρική σειρά MM1S δόθηκε από τον Steven T. Rosen [13], RPMI-8226 LR5 από τον William S. Dalton [14] και OCI-Ly7 από τον Hans Messner [15].

Πειράματα μελφαλάνη δόσης απόκρισης

Ο αριθμός των κυττάρων στην καλλιέργεια προσδιορίσθηκε με μετρήσεις απορρόφησης (Αντιδραστήριο CellTiter 96 Υδατικό One Solution, Promega) όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή. Η γραμμική σχέση μεταξύ του αριθμού των κυττάρων και η απορρόφηση ελήφθη με εμβολιασμό κυττάρων σε πλάκες 96 φρεατίων με το κατάλληλο μέσο σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται μεταξύ 15 έως 60.000 κύτταρα /φρεάτιο. Οι κυτταρικές σειρές 18 επωάστηκαν για 24 ώρες πριν από την προσθήκη 18 αυξανόμενες συγκεντρώσεις μελφαλάνη εις τριπλούν. Όλα τα φρεάτια σπάρθηκαν με κύτταρα, αλλά διασυνοριακές επιπτώσεις καταστρατηγήθηκαν περιλαμβάνοντας μόνο τα μη σύνορα πηγάδια για ανάλυση. Η μελφαλάνη επιλύθηκε εντός αιθανόλης με αποτέλεσμα μία τελική συγκέντρωση αιθανόλης 0,06% στο μέσο. Ο σχετικός αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε 48 ώρες μετά την προσθήκη της μελφαλάνης χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο CellTiter και το Optima-Fluostar (BMG LABTECH) στα 492 nm. Για να επιτευχθεί υψηλή επαναληψιμότητα, το όλο πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον δύο φορές την αξιοποίηση νέων αποθεμάτων πάγωμα των επιμέρους κυτταρικών σειρών.

Ανάλυση μικροσυστοιχιών RNA

Όλα τα Geps διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα Affymetrix μικροσυστοιχιών και τυποποιημένες διαδικασίες . Ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας Αντιδραστήριο Invitrogen ΤΚΙζοΙ συνδυασμό με Qiagen RNeasy Mini κιτ. Η ποιότητα ελέγχθηκε από Agilent 2100 Bioanalyzer. Τα δείγματα παρασκευάστηκαν για υβριδοποίηση σε Affymetrix GeneChip HG-U133 Plus 2.0 συστοιχίες μετά τις οδηγίες του κατασκευαστή και .CEL αρχεία δημιουργήθηκαν από Affymetrix GeneChip Command Console λογισμικού (AGCC) και κατατίθεται στη Έκφραση NCBI Gene Omnibus (GEO) αποθετήριο. Τα στοιχεία που πληρούν τις απαιτήσεις του να είναι MIAME συμμορφούμενα. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στην ηλεκτρονική Τμήμα Πληροφόρησης.

Αρκάνσας και Hummel στρατιές MM και DLBCL Ασθενείς

δεδομένα γονιδιακής έκφρασης, EFS, και OS στοιχεία για 565 ασθενείς που διαγιγνώσκονται με προοδευτική ή συμπτωματική ΜΜ είναι διαθέσιμες στο κοινό. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στην ηλεκτρονική Τμήμα Πληροφόρησης. Το σύνολο δεδομένων είναι γνωστή ως «δεδομένα Arkansas» [16]. Οι ασθενείς εντάχθηκαν από το μυέλωμα Ινστιτούτο Έρευνας και Θεραπείας του Πανεπιστημίου του Αρκάνσας, Σχολή Ιατρικών Επιστημών, και ήταν μέρος μιας ευρύτερης μελέτης με σκοπό να διερευνήσει κατά πόσον θαλιδομίδη σε συνδυασμό με HDT μπορεί να παρατείνει την επιβίωση των ασθενών με ΠΜ [9 ]. Οι 565 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε αγωγή σύμφωνα με τη συνολική θεραπεία δύο (TT2) ή ολική θεραπεία με τρία (ΤΤ3) πρωτόκολλο που περιλαμβάνει διπλή μελφαλάνης υψηλή δόση και ASCT.

Το σύνολο των δεδομένων γνωστή ως «δεδομένα Hummel» [17] ήταν που χρησιμοποιείται στην παρούσα μελέτη για να ελεγχθεί η εξειδίκευση του ταυτοποιημένου δείκτη αντίστασης. Οι 87 ασθενείς διαγνώστηκαν με DLBCL και έλαβε (κυκλοφωσφαμίδη, δοξορουβικίνη, βινκριστίνη και πρεδνιζόνη) θεραπεία εισαγωγής του τύπου CHOP. δεδομένα γονιδιακής έκφρασης και OS είναι διαθέσιμα στο κοινό, καθώς και (για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στην ηλεκτρονική Τμήμα Πληροφόρησης).

Στατιστική Ανάλυση

Η πλήρης τεκμηρίωση της στατιστικής ανάλυσης παρέχεται από ένα Sweave έγγραφο, δείτε κείμενο S1. Sweave είναι ένα χαρακτηριστικό στη στατιστική γλώσσα προγραμματισμού R που επιτρέπει την ενσωμάτωση του κώδικα R σε LaTex και ως εκ τούτου παρέχει επαναλήψιμα ανάλυση των δεδομένων και της έρευνας [18]. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν με R [19] έκδοση 2.12.1 και μια σειρά από Bioconductor [20] πακέτα. Λεπτομερείς πληροφορίες συνεδρία περιέχεται στο S1 Κείμενο.

Ανάλυση μελφαλάνη δόσης απόκρισης.

Οι τιμές απορρόφησης που προέρχονται από τα πειράματα απόκρισης δόσης διορθώθηκαν φόντο και κατά μέσο όρο πάνω από επαναλήψεις. Τυχόν ακραίες τιμές μεταξύ των εις τριπλούν κυτταρικές συγκεντρώσεις απομακρύνθηκαν με δοκιμή Grubbs «[21] (περίπου 0,5%, βλέπε κείμενο S1). Σχετική καμπύλες αναστολής ανάπτυξης υπολογίστηκαν για κάθε συγκέντρωση σε σχέση με τον μη επεξεργασμένο μάρτυρα, και κατόπιν διαμορφώθηκε μια καμπύλη αυτοτελή γραμμική ανάπτυξη. Μέσα από την οπτική επιθεώρηση, πέντε ακραίες τιμές αφαιρέθηκαν (Σχήμα S1). Η GI

50 τιμές των κυτταρικών γραμμών στον πίνακα Β-κυττάρου ορίστηκαν ως το πρώτο σημείο στο οποίο η καμπύλη ανάπτυξης πέσει κάτω από το επίπεδο του 50%. Δεδομένων κατά μέσο όρο κατά τη διάρκεια των μετρήσεων αναπαραχθεί κυτταρική γραμμή για να πραγματοποιούν αυτή την ανάλυση. Η αβεβαιότητα της GI

50 τιμές εκτιμήθηκε με υπο-δειγματοληψία των αναπαραχθούν πηγάδια με αντικατάσταση και εκ νέου υπολογισμό όλων των GI

50 τιμές 200 φορές. Η 10-πλάσια λογάριθμος της GI

50 τιμές μετασχηματίστηκε στο αρχείο καταγραφής

10 μΜ κλίμακας και για τα δύο πάνελ κυτταρική γραμμή και χρησιμοποιείται ως δείκτης αντίστασης μελφαλάνη – στα εξής συμβολίζεται με το δείκτη NCI60 και δείκτη Β-κυττάρου, αντίστοιχα . Ως μέσο για τη διάκριση μεταξύ των ευαίσθητων, τα ενδιάμεσα και ανθεκτικά άτομα (κυτταρικές γραμμές ή άτομα) σε ένα πληθυσμό, επιλέξαμε το κριτήριο της Havaleshko et al. [22], όπου ένα άτομο είναι ανθεκτικό εάν ο δείκτης ανθεκτικότητας του υπερβαίνει το 75 εκατοστημόριο του πληθυσμού. Ομοίως, ορίσαμε ένα θέμα είναι ευαίσθητο, εάν ο δείκτης αντίστασης της ήταν μικρότερο από το 25 εκατοστημόριο του πληθυσμού. Τα υπόλοιπα θέματα που χαρακτηρίστηκαν ως έχουσες ενδιάμεσο αντίσταση.

μικροσυστοιχιών προ-επεξεργασίας.

Τα Β-κυττάρου .CEL-αρχεία και τα κατεβάσει NCI60 .CEL αρχεία διορθώθηκαν υπόβαθρο και κανονικοποιούνται από το απλά. RMA λειτουργία από τη Affy πακέτο. Όλα τα RMA-ομαλοποιηθεί συστοιχίες περάσει το στατιστικό έλεγχο ποιότητας που προβλέπονται από τις arrayQualityMetrics λειτουργία στις arrayQualityMetrics R-πακέτο [23]. Όπως ο πίνακας NCI60 αναλύθηκε στη συστοιχία HG-U133a και Β-κυττάρου στη συστοιχία HG-U133 Plus 2.0, δόθηκε έμφαση στην ανιχνευτές παρόν μόνο στη συστοιχία HG-U133A. Τα δεδομένα Αρκάνσας επίσης διόρθωση υποβάθρου και ομαλοποιήθηκε με just.rma.

Διαφορικές Εκφράσεις.

Μετά την μη ειδική φιλτράρισμα των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης, οι κυτταρικές σειρές κατατάσσεται ως ανθεκτικό, ενδιάμεσο ή ευαίσθητο σύμφωνα με ΓΕ τους

50 τιμές. Μεταγραφές που εκφράζονται σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων από τις πιο ευαίσθητες και πιο ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μετριάστηκε F-tests, όπως εφαρμόζεται στο πακέτο limma Bioconductor [24]. Γονιδίων με ένα P-τιμή κάτω από 0,05 θεωρήθηκαν να έχουν προγνωστική αξία. Οι τιμές P ήταν σκόπιμα επιλεγεί αντί των ποσοστών εσφαλμένων ανακάλυψης όπως ο σκοπός ήταν να κατασκευάσει ένα ταξινομητή αντίσταση και όχι για την ανίχνευση διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων. Τα διαφορικά εκφρασμένα γονίδια είχαν κλιμακωθεί να έχουν μηδενική μέση τιμή και τυπική απόκλιση ένα. Ένας ταξινομητής χτίστηκε από τους κλίμακα γονίδια και γραμμική διακριτική ανάλυση (LDA) όπως εφαρμόζεται στην sda R-πακέτο [25]. Για να αποφευχθούν οι δυσκολίες αναστρέφοντας μεγάλους πίνακες συνδιακύμανσης, κατ ‘ανώτατο όριο των 400 γονιδίων σε sda επιλέχθηκε.

πολυμεταβλητή παλινδρόμηση.

Τα γονίδια φιλτράρονται σύμφωνα με βέβαιοι έλεγχο ανεξαρτησίας (SIS), δηλαδή όλα τα γονίδια ήταν κατατάσσονται ανάλογα με το συντελεστή συσχέτισης Pearson μεταξύ της έκφρασης γονιδίου και δείκτη αντίστασης. Όλα τα γονίδια, για τα οποία η P-τιμή του τεστ για μηδενική συσχέτιση ήταν πάνω από 0,05, θεωρήθηκαν για τη μείωση των διαστάσεων από SPLS [26]. Για να αποκτήσετε αραιότητας, SPLS τιμωρεί τα μετασχηματισμένα διανύσματα εισόδου αναγκάζοντας μικρούς συντελεστές να είναι μηδέν. Η καθαρή διατύπωση SPLS περιέχει τέσσερις παραμέτρους ρύθμισης, ωστόσο, σύμφωνα με Chun et al. [26], μια απλή διατύπωση παλινδρόμηση SPLS, η οποία εξαρτάται μόνο από μία παράμετρο

η

, είναι ο έλεγχος της αραιότητας της λύσης και ο αριθμός των κρυφών συνιστωσών

K

. Για συγκεκριμένες επιλογές της παραμέτρου νομιμοποίησης

η

και τα κρυφά συστατικά

K

η απόδοση αξιολογήθηκε από την άδεια-one-out cross-επικυρώσεων. Η βέλτιστη διαμόρφωση των παραμέτρων επιλέχθηκε να είναι το σύνολο ελαχιστοποίηση του μέσου σφάλματος τετράγωνο πρόβλεψης (MSPE). Μόλις οι βέλτιστες παράμετροι έχουν επιλεγεί εσωτερικά από τις κυτταρικές γραμμές, ο δείκτης αντίσταση μπορεί να προβλεφθεί για τα υποκείμενα μέσα από ένα γραμμικό συνδυασμό των κλιμακωμένων γονιδίου εκφράσεις με τους συντελεστές εκτιμάται από SPLS [27]. Η ανάλυση SPLS και οι προβλέψεις γίνονται με τις SPLS R-πακέτο που παρέχεται από Chun et al. [26].

Ανεξάρτητη φιλτράρισμα.

Είναι γνωστό ότι οι ανεξάρτητοι φιλτράρισμα αυξάνει την ισχύ ανίχνευσης για πειράματα υψηλής απόδοσης [28]. Για να διερευνηθεί κατά πόσο ανεξάρτητη φιλτραρίσματος θα αυξήσει την ακρίβεια και σφάλμα πρόβλεψης, μια μη ειδική φιλτράρισμα, αφήνοντας έξω τα γονίδια με χαμηλή διακύμανση κατά τη διάρκεια των γονιδιακή έκφραση NCI60 και Β-κυττάρου, διεξήχθησαν με τη nsFilter λειτουργία από το πακέτο genefilter Bioconductor. Οι τιμές cut-off κυμάνθηκε μεταξύ 0% και 100%, και εμείς επιλέξαμε την τιμή αποκοπής που εκτελείται καλύτερα σε σχέση με το cross-επικυρωμένη ακρίβεια για το LDA και MSPE για SPLS. Προκειμένου να διερευνηθεί εάν κάποια προβλεπτική ικανότητα παρέμεινε μετά το φιλτράρισμα, cross-επικύρωση εκτελέστηκε για τις επιλεγμένες παραμέτρους.

Ανάλυση Επιβίωσης.

Kaplan-Meier ανάλυση επιβίωσης, δοκιμή logrank και αναλογικών κινδύνων κατά Cox μοντέλα υπολογίστηκαν με λειτουργίες από το survfit R-πακέτο. Μια μη γραμμική σχέση μεταξύ της προβλεπόμενης ανταπόκριση στη θεραπεία και τον δείκτη αντίστασης παρατηρήθηκε και η σχέση εκτιμήθηκε με περιορισμένη κυβικά σφήνες (RCS) με τη βοήθεια του σχεδιασμού R-πακέτο [29]. Το επίπεδο σημαντικότητας έχει οριστεί σε 0,05 και οι αναλογίες κινδύνου (HR) δίνονται με διαστήματα εμπιστοσύνης 95%.

Οι online πληροφορίες

Λεπτομέρειες σχετικά με την απαιτούμενη και κατατίθεται on-line πληροφορίες που περιγράφονται παρακάτω.

Η Β-κυττάρου Gene Expression Data.

τα αρχεία .CEL για τις μικροσυστοιχίες 18 κυτταρική σειρά έχουν κατατεθεί σε https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/υπό ένταξη GEO αριθμός GSE22759. Τα στοιχεία που πληρούν τις προϋποθέσεις για να είναι συμβατό με MIAME

Το NCI60 Gene Expression Data

.CEL-αρχεία για τα NCI60 μικροσυστοιχίες κυτταρική σειρά είχαν κατεβάσει από το http:.. //www.ncbi.nlm .nih.gov /geo /κάτω GEO αριθμό προσχώρησης GSE5720 επιλέγοντας το υποσύνολο των δεδομένων που προέρχονται από την ποικιλία HG-U133A. χρησιμοποιείται στην παρούσα μελέτη επαναληπτικές A21 – Η κυτταρική γραμμή IGROV1 παρέχεται στο dublicates. Τα στοιχεία που πληρούν τις προϋποθέσεις για να είναι συμβατό MIAME. Παρατηρήστε ότι έχουμε επανα τα αρχεία .CEL όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι τμήμα.

Το NCI60 DTP δεδομένων.

Τα δεδομένα ελήφθησαν διαλογής κυτταρική σειρά DTP ανθρώπινου όγκου (Αύγουστος 2008 απελευθέρωση) κατεβάζοντας τις cancer60gi50.lis αρχείο από την ιστοσελίδα: https://dtp.nci.nih.gov/docs/cancer/cancer_data.html. Ορισμένα τμήματα του σεναρίου για την εξαγωγή NCI60 απάντηση του φαρμάκου έχουν αναπτυχθεί από τον Kevin Coombes και Keith Baggerly και μπορείτε να το κατεβάσετε από την ιστοσελίδα https://bioinformatics.mdanderson.org/Supplements/ReproRsch-Chemo/.

Το Αρκάνσας γονιδιακή έκφραση και κλινικών δεδομένων.

.CEL αρχεία για τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης και κλινικές πληροφορίες είναι διαθέσιμες στο https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/υπό GEO αριθμό ένταξης GSE24080. Τα στοιχεία που πληρούν τις προϋποθέσεις για να είναι συμβατό MIAME. Τα αρχεία .CEL επανα όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι τμήμα

Η Εκδήλωση Hummel Gene και Κλινικών Δεδομένων

Τα αρχεία .CEL και κλινικές πληροφορίες είναι διαθέσιμες στη διεύθυνση http:.. //www. ncbi.nlm.nih.gov/geo/υπό GEO αριθμό ένταξης GSE4475. Τα στοιχεία που πληρούν τις προϋποθέσεις για να είναι συμβατό MIAME. Τα αρχεία .CEL επανα όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι τμήμα.

Αποτελέσματα

Η ομάδα Δείκτης Αντίστασης NCI60

Σε σύντομη περίληψη, είχαν κατεβάσει δεδομένα απόκρισης δόσης μελφαλάνης . Ένα διάγραμμα των δεδομένων φαίνεται στο σχήμα S2. Οι κυτταρικές σειρές 59 έδειξε GI

50 τιμές που κυμαίνονται -5,77 έως -3,99 στο ημερολόγιο

10 μΜ /ml κλίμακας -. Η πιο ευαίσθητη κυτταρική γραμμή είναι SR και η πιο ανθεκτική κυτταρική σειρά είναι Α498

Ανάπτυξη η Β-κυττάρων Αντίστασης Δείκτης

p> δόσης πειράματα

50 τιμές που κυμαίνονται από -6,02 -4,13 να αφορούν το ημερολόγιο

10 μΜ /ml κλίμακα – η πλέον ευαίσθητη κυτταρική γραμμή είναι MOLP-2 και η πιο ανθεκτική κυτταρική γραμμή είναι RPMI-8226 LR5 . Η Εικόνα 1Β δείχνει γραφικές παραστάσεις κουτί της μέσης GI

50 τιμή από καμπύλες νέα δειγματοληψία δόσης-απόκρισης για όλες τις 18 καρκινικού κυττάρου Β-κυτταρικές γραμμές. Καθώς δεν ανιχνεύθηκε σαφής διάκριση μεταξύ ενός ανθεκτικού και ευαίσθητη ομάδα των κυτταρικών γραμμών, το 25% /50% /25% διάσπαση που περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι τμήμα επιλέχθηκε, δηλαδή τα πέντε κυτταρικές σειρές με το χαμηλότερο GI

50 τιμές ήταν συμβολίζεται ευαίσθητη και οι πέντε κυτταρικές σειρές με την υψηλότερη GI

50 τιμές υποδηλώνονται ανθεκτικά.

Α) κατά μέσο όρο καμπύλες δόσης-απόκρισης για κάθε κυτταρική γραμμή. Β) Κουτί οικόπεδο 200 νέα δειγματοληψία GI

50 τιμές για κάθε κυτταρική σειρά. Οι κυτταρικές σειρές κατατάσσονται ανάλογα με την αναμενόμενη ΓΕ τους

50 τιμή.

Η

ταξινομητή Με βάση LDA

Για τον πίνακα NCI60, ένας ταξινομητής LDA με βάση χτίστηκε όπως περιγράφεται στο υλικά και Μέθοδοι τμήμα, για λεπτομέρειες βλέπε S1 κειμένου. Ο ταξινομητής LDA με βάση έδειξε κακή εσωτερικής επικύρωσης (Σχήμα S3). Η βέλτιστη ακρίβεια (που προσδιορίζεται με την άδεια-one-out διασταυρούμενης επικύρωσης) 0,6 λήφθηκε για το πάνελ Β-κυττάρου σε ένα ρυθμό διήθησης των 0.95, στην οποία περίπτωση ο μετριάστηκε F-test έδωσε 159 γονίδια (Πίνακας S2). LDA χρησιμοποιήθηκε για να συνδυάσει τις 159 γονίδια για την ανάπτυξη ενός ταξινομητή. Ο ταξινομητής έδειξε 60% συνολική ακρίβεια άδεια-one-out-cross-επικύρωσης για τις κυτταρικές σειρές από το οποίο αναπτύχθηκε.

Cross-επικύρωσης του υποδείγματος SPLS

Μετά τα απροσδιόριστα βήματα φιλτραρίσματος ήταν επιτυγχάνεται, SPLS χρησιμοποιήθηκε για την επίτευξη συγκεκριμένων φιλτραρίσματος. Προκειμένου να αποφευχθεί η υπερβολική τοποθέτηση και τον θόρυβο που συμβάλλουν γονίδια, ο αριθμός των κρυφών στοιχείων και probesets επιλέχθηκαν από την άδεια-one-out cross-επικύρωσης. Ο βέλτιστος αριθμός των probesets και εξαρτημάτων βρέθηκαν στις τιμές όπου επιτεύχθηκε η ελάχιστη MSPE. Για τον πίνακα NCI60, μια λογική εσωτερικής επικύρωσης παρατηρήθηκε (Σχήμα S4). Για τον πίνακα Β-κυττάρου, δύο κρυμμένα στοιχεία και 19 probesets παρείχε την καλύτερη MSPE (Σχήμα S5). Η μόχλευση μιας ενιαίας κυτταρικής γραμμής με το μοντέλο πρόβλεψης ερευνήθηκε με γραφική παράσταση την τιμή της αντίστασης προβλεπόμενη προέρχονται από την άδεια-one-out-διασταυρούμενης επικύρωσης σε σχέση με την μετρούμενη δείκτη αντίστασης (Σχήμα S6). Οι πιο ευαίσθητων και ανθεκτικών κυτταρικών σειρών MOLP-2 και RPMI-8226 LR5, αντίστοιχα, αποδείχθηκε ότι ήταν υψηλά σημεία μόχλευσης.

Σταθερότητα Αξιολόγηση

Για να δείτε πώς SPLS παλινδρόμησης καταφέρνει με θόρυβο, η πίνακας Β-κυττάρου χρησιμοποιήθηκε για την επιλογή 20 probesets τυχαία ανάμεσα στις 100 probesets με τον υψηλότερο οριακό συνδέσμου (απόλυτη τιμή του συντελεστή συσχέτισης Pearson) με τον δείκτη αντίστασης. Προκειμένου να διατηρηθεί η δομή εξάρτηση μεταξύ των probesets άθικτο, αυτά όλα τυχαία διαταράσσεται, εκτός από τις 20 probesets. Οι συντελεστές των probesets απεικονίζεται ως συνάρτηση της παραμέτρου νομιμοποίησης

η

στο Σχήμα S7. Για αυτό το παράδειγμα, ο βέλτιστος αριθμός των αραιών συστατικά μερική ελαχίστων τετραγώνων ήταν

K =

3 και η βέλτιστη παράμετρος νομιμοποίησης ήταν

η =

0.83. Έντεκα probesets επιλέχθηκαν, γεγονός που αποδεικνύει μια μέση ευαισθησία 55%, ειδικότητα 99% και ένα ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη του 63%. Το πείραμα επαναλήφθηκε 100 φορές και έδωσε στη μέση ευαισθησία 54%, ειδικότητα 99% και ένα ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη του 67%.

Σύγκριση των πιο ευαίσθητων και ανθεκτικών κυτταρικών γραμμών

Λόγω της υψηλής επιρροής του πιο ευαίσθητο κυτταρική γραμμή, MOLP-2, και το πιο ανθεκτική κυτταρική γραμμή, RPMI-8226 LR5, μια άμεση σύγκριση αυτών των δύο κυτταρικών σειρών έγινε. Αυτό έγινε με τη διαλογή των γονιδίων σύμφωνα με την απόλυτη διαφορά τους στην έκφραση γονιδίων και επιλέγοντας (αρκετά αυθαίρετα) τα 100 γονίδια με τα υψηλότερα απόλυτη απόκλιση εκφράσεις. Ένας δείκτης πρόβλεψης αντίσταση κατασκευάστηκε από τη διαφορά στη γονιδιακή έκφραση, όπως το βάρος. Τα γονίδια και τα βάρη τους εμφανίζονται στα στοιχεία στήριξης (Πίνακας S3).

Εξωτερικές Επικύρωση σε κλινικά δείγματα

EFS και OS επιλέχθηκαν ως τελικά σημεία με την υπόθεση ότι melphalan αντίσταση συσχετίζεται με αυτά τα τελικά σημεία. Για τους πίνακες NCI60 και Β-κυττάρου, οι LDA και SPLS μοντέλων καθώς και το μοντέλο που αποτελείται από τις δύο κυτταρικές σειρές επιρροή στον πίνακα Β-κυττάρου χρησιμοποιήθηκαν για να εκτιμηθεί η δείκτης αντίστασης μελφαλάνης για κάθε ένα από τους ασθενείς Arkansas.

Για οι προβλέψεις βασίζονται LDA βασίζεται στον πίνακα NCI60 δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά σε σχέση με το λειτουργικό σύστημα και EFS για τις προβλεπόμενες ευαίσθητα, ενδιάμεσα και ανθεκτικά ομάδες ασθενών (Σχήμα S8 και S9). Για τις προβλέψεις NCI60 και SPLS βάση δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά για τις προβλεπόμενες ευαίσθητα, ενδιάμεσων και ανθεκτικό ομάδες, καθώς και το προβλεπόμενο αρχείο καταγραφής σχετικό κίνδυνο του OS και EFS για τα δεδομένα του ασθενούς Αρκάνσας. Δείτε το Σχήμα 2Α και C και το Σχήμα 3Α και C, αντίστοιχα.

Καμπύλες επιβίωσης

Α) Kaplan Meier βασίζονται σε NCI60. Β) Καμπύλες κατά Kaplan Meier επιβίωσης βασίζονται σε Β-κυττάρου.