Αφηρημένο

CD133 (προμινίνη-1), ένα 5-διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη, έχει πρόσφατα εξεταστεί σε να είναι ένας σημαντικός δείκτης που αντιπροσωπεύει τον πληθυσμό υποσύνολο του καρκίνου βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν. Εδώ αναφέρουμε την απομόνωση του CD133-θετικών κυττάρων (LC-CD133

+) και CD133-αρνητικά κύτταρα (LC-CD133

-) από δείγματα ιστών από δέκα ασθενείς με μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (LC) και πέντε LC κυτταρικές γραμμές. LC-CD133

+ εμφανίζεται υψηλότερη Oct-4 εκφράσεις με τη δυνατότητα να αυτο-ανανέωση και μπορεί να αντιπροσωπεύει μια δεξαμενή με πολλαπλασιαστικές δυνατότητες για τη δημιουργία κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. Επιπλέον, LC-CD133

+, σε αντίθεση με LC-CD133

-, ιδιαίτερα συν-εξέφρασαν την ABCG2 δείκτη πολλαπλών ανθεκτικών στα φάρμακα και έδειξε σημαντική αντοχή σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες (π.χ., σισπλατίνη, ετοποσίδη, δοξορουβικίνη και πακλιταξέλη) και ακτινοθεραπεία. Η θεραπεία της Oct-4 siRNA με φορέα λεντοϊού μπορεί να μπλοκάρει συγκεκριμένα την ικανότητα της LC-CD133

+ για να σχηματίσουν σφαίρες και μπορεί να διευκολύνει περαιτέρω LC-CD133

+ για να διαφοροποιηθούν σε LC-CD133

-. Επιπλέον, knock-down της Oct-4 έκφραση σε LC-CD133

+ μπορεί να αναστέλλει σημαντικά τις δυνατότητες της εισβολής του όγκου και του σχηματισμού αποικιών, και να αυξήσει την αποπτωτική δραστηριότητα της κασπάσης 3 και πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP). Τέλος,

in vitro

και

in vivo

μελέτες επιβεβαιώνουν επίσης ότι η επίδραση της θεραπείας των χημειοραδιοθεραπεία για LC-CD133

+ μπορεί να βελτιωθεί με τη θεραπεία Oct-4 siRNA. Συμπερασματικά, αποδείξαμε ότι Oct-4 έκφραση παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη διατήρηση της αυτο-ανανέωση, καρκινικά βλαστικά-όπως, και chemoradioresistant ιδιότητες του LC-CD133

+. Η μελλοντική έρευνα είναι δικαιολογημένη όσον αφορά την up-ρυθμιζόμενη έκφραση Oct-4 στο LC-CD133

+ και κακοήθη καρκίνο του πνεύμονα

Παράθεση:. Chen YC, Hsu ΕΣ, Chen YW, Tsai Θ, πώς CK, Wang CY, et al. (2008) Οκτώβριος-4 Έκφραση Συντηρείται Cancer Stem-Like Properties σε καρκίνο του πνεύμονα-Προέρχεται CD133-θετικά κύτταρα. PLoS ONE 3 (7): e2637. doi: 10.1371 /journal.pone.0002637

Συντάκτης: Μινγκ Μπορείτε, Πανεπιστήμιο της Ουάσιγκτον, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Μαρτίου 2008? Αποδεκτές: 8 Ιουνίου 2008? Δημοσιεύθηκε: 9, Ιουλίου, 2008

Copyright: © 2008 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από ερευνητικές επιχορηγήσεις από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο (NSC-96 με 3111-B-075-001-my3, 95-2314-B-075-055-MY2, 96-2628-Β-010-006-my3, 96 -2314-B-075-024), Ταϊπέι Γενικού Νοσοκομείου Βετεράνων (V96C1-151, V96E1-004, V96ER2-016, V96E2-010), τα κοινά σχέδια των UTVGH (VGHUST96-P1-07), γεν-Tjing-Ling Ιατρικό Ίδρυμα, Taipei City Hospital (96001-62-014, 96001-62-018, 96002-62-092), και το Εθνικό Πανεπιστήμιο Yang Ming-(Υπουργείο Παιδείας, στόχος για το σχέδιο Top Πανεπιστήμιο), Ταϊβάν.

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι μία από τις κύριες αιτίες του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους στις βιομηχανικές χώρες [1], [ ,,,0],2]. Η ακτινοθεραπεία και η χημειοθεραπεία παίζουν σημαντικό και κρίσιμο ρόλο στην κλινική θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα κατά την επίτευξη παρατεταμένη επιβίωση των ασθενών [3], [4]. Ωστόσο, ένα υψηλό ποσοστό αποτυχίας και χαμηλή μέση ποσοστό επιβίωσης παρατηρούνται σε ασθενείς που υποβάλλονται σε χημειοραδιοθεραπεία με υποτροπιάζοντα, δυσεπίλυτα καρκίνο του πνεύμονα [5]. Για να βελτιωθεί το ποσοστό επιβίωσης των ασθενών, έρευνα για τη διαλεύκανση του μηχανισμού είναι απαραίτητη ογκογένεση του καρκίνου του πνεύμονα [5]. Πρόσφατα δεδομένα έδειξαν ότι οι όγκοι περιέχουν ένα μικρό υποπληθυσμό κυττάρων, δηλαδή, τα καρκινικά κύτταρα στέλεχος που μοιάζει (ΚΕΠ) ή καρκίνο κύτταρα έναρξης (CICs), οι οποίες εμφανίζουν μια αυτο-ανανέωση ικανότητας και είναι υπεύθυνοι για τη συντήρηση και τη μετάσταση των όγκων [6] . Τα βλαστικά κύτταρα έχουν απομονωθεί από την ικανότητά τους να εκρέει χρωστική Hoechst 33342 και αναφέρεται ως «πλευρά πληθυσμού (SP)» [7]. Χο και οι συνεργάτες απομονώθηκε και χαρακτηρίσθηκε κύτταρα SP από έξι ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών γραμμών του πνεύμονα και έδειξαν ότι μια αυξημένη έκφραση του ABCG2 καθώς και άλλα ΑΤΡ-σύνδεσης μεταφορείς κασέτας σχετίστηκαν θετικά με την ανθεκτικότητα σε πολλαπλά χημειοθεραπευτικά φάρμακα [8]. Επιπλέον, Gutova και οι συνεργάτες έχουν καθαρισμένο uPAR θετικά ΚΕΠ από τρεις γραμμές κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. Αυτές οι uPAR-θετικά κύτταρα συν-εκφράζεται με CD44 και MDR1, και είχε την ικανότητα να προάγουν την προηγμένη κακοήθεια και χημειοαντίσταση [9].

CD133 (προμινίνη-1), ένα 5-διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη, αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά το CD34

+ προγονικών πληθυσμών από ενήλικο αίμα, μυελό των οστών, και τα κύτταρα εμβρυϊκού ήπατος [10]. Πρόσφατα, CD133 έχει θεωρηθεί ένας σημαντικός δείκτης που αντιπροσωπεύει τον πληθυσμό υποσύνολο των ΚΕΠ σε λευχαιμία, όγκους του εγκεφάλου, ρετινοβλάστωμα, νεφρικών όγκων, παγκρεατικά νεοπλάσματα, καρκίνωμα του κόλου, καρκίνωμα του προστάτη, και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [11] – [19]. Με βάση τα ανοσοϊστοχημικά ευρήματα, Hilbe και συνεργάτες πρότειναν ότι CD133-θετικό (CD133

+) προγονικά κύτταρα παίζουν ένα ρόλο στην ανάπτυξη του αγγειακού συστήματος του όγκου σε ασθενείς με καρκίνο μη-μικρών κυττάρων του πνεύμονα (NSCLC) [20]. Πιο πρόσφατα, μια καλά σχεδιασμένη μελέτη από Eramo και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι ο καρκίνος του πνεύμονα περιέχει έναν πληθυσμό CD133

+ ΚΕΠ σε θέση να αυτο-ανανέωση και να δημιουργήσει έναν απεριόριστο απογόνους των μη ογκογόνων κυττάρων. Αυτές

+ κύτταρα CD133 είναι επίσης ανθεκτικά στην συμβατική χημειοθεραπεία [21]. Ωστόσο, οι μηχανισμοί γονιδιακής ρύθμισης για τη διατήρηση της αυτο-ανανέωσης και τις ιδιότητες ανθεκτικών στα φάρμακα στην υποθετική καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με των όγκων του πνεύμονα είναι ακόμα ασαφής.

Οκτώβριος-4, ένα μέλος της οικογένειας των POU-τομέα παράγοντες μεταγραφής, εκφράζεται σε πολυδύναμων εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων (ES) και γεννητικά κύτταρα [22] – [23]. Οκτ-4 mRNA βρίσκεται κανονικά στα παντοδύναμα και πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα εμβρύων pregastrulation [24]. Να χτυπήσει έξω το

Oct-4

γονιδίων σε ποντίκια προκαλεί πρόωρη θνησιμότητα λόγω της έλλειψης σχηματισμού ICM, δείχνοντας ότι Oct-4 έχει μια κρίσιμη λειτουργία για την αυτο-ανανέωση των κυττάρων ES [25]. Οκτ-4 ενεργοποιεί τη μεταγραφή μέσω οκταμερές μοτίβα, και οι θέσεις πρόσδεσης Oct-4 έχουν βρεθεί σε διάφορα γονίδια, συμπεριλαμβανομένων των

FGF 4

(παράγοντα ανάπτυξης ινοβλαστών 4) και

PDGF

α

r

(που προέρχεται από αιμοπετάλια αυξητικού παράγοντα α υποδοχέα) [26], [27]. Αυτό υποδηλώνει ότι Oct-4 λειτουργεί ως κύριος διακόπτης κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης από τη ρύθμιση των πολυδύναμων δυνατότητες των βλαστικών κυττάρων, και Oct-4 παίζει κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη των θηλαστικών [24], [25].

Σε αυτό το μελέτη, τα CD133-θετικά κύτταρα (LC-CD133

+) και CD133-αρνητικά κύτταρα (LC-CD133

-) απομονώθηκαν από δείγματα ιστού καρκίνου του πνεύμονα (LC) ασθενείς και κυτταρικές σειρές LC. Αυτά LC-CD133

+ κύτταρα κατείχε τόσο τα χαρακτηριστικά των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν και κακοήθεις όγκους. Τα στοιχεία μας κατέδειξε επίσης ότι Oct-4 έκφραση σε LC-CD133

+ εμπλέκεται στην κακοήθεια του όγκου των καρκίνων του πνεύμονα και παρουσιάζει πυρίμαχες ιδιότητες για χημειοραδιοθεραπεία σε καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση της Oct-4 παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη διατήρηση καρκινικά βλαστικά-όπως και chemoradioresistant ακίνητα σε καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται + κύτταρα CD133

.

Υλικά και Μέθοδοι

απομόνωση του CD133

+ κυττάρων υποομάδα

η έρευνα ακολούθησε τις αρχές της Διακήρυξης του Ελσίνκι και όλα τα δείγματα ελήφθησαν μετά από ασθενείς παρείχαν ενημερωμένη συγκατάθεση. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας Θεσμικών /Διοικητικό κριτική Θεσμική της Ταϊπέι Γενικού Νοσοκομείου Βετεράνων. Τα διαχωρισμένα κύτταρα από τα δείγματα του μη μικροκυτταρικού ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα (Πίνακας 1) και των καρκινικών (LC) κυτταρικές σειρές πνεύμονα σημάνθηκαν με χάντρες μικρομαγνητικών /l 1 mL CD133 ανά 1 εκατομμύριο κύτταρα χρησιμοποιώντας το κιτ απομόνωσης των κυττάρων CD133 (Miltenyi Biotech , Auburn, CA). CD133

+ κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ένα μέσο αποτελούμενο από ελεύθερο ορού DMEM /F12 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD), συμπλήρωμα Ν2 (R &? D Systems Inc., Minneapolis), 10 ng /ml ανθρώπινης ανασυνδυασμένης bFGF ( Ε & amp? D Systems) και 10 ng /ml EGF (R & amp?. D Systems) [28]

Η

κυττάρων Βιωσιμότητας Καθορίζεται από χρωματομετρική δοκιμασία

Η απομονωμένη CD133

+ και CD133

– κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ένα σύμπλεγμα κυτταρικής καλλιέργειας 96-φρεατίων (Corning Costar, Acton, ΜΑ) σε πυκνότητα 3 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο με 100 μΙ μέσου καλλιέργειας. Σε συγκεκριμένα χρονικά σημεία κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, το μέσο απορρίφθηκε και αντικαταστάθηκε με ίσο όγκο (100 μΙ) φρέσκου μέσου που περιέχει 0,2 mg /ml του 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -5- (3-καρβοξυμεθοξυφαινυλ ) -2- (4-σουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο (MTS, Promega, Madison, WI) και 0,038 mg /ml του φαιναζίνη (PMS? Promega) και επωάστηκαν για επιπλέον 1,5 ώρες σε 37 ° C 5% CO

2. Η βιωσιμότητα των κυττάρων ανάλογη προς την οπτική πυκνότητα (OD) μετρήθηκε με χρωματομετρική δοκιμασία από την άποψη της δραστηριότητας μιτοχόνδρια για να μετατρέψει τετραζολίου σε ένα έγχρωμο προϊόν φορμαζάνης διαλυτό στο μέσο. Οι τιμές OD μετρήθηκαν σε μήκος κύματος 490 nm με ένα μετρητή 1420 multilabel VICTOR από Wallac (PerkinElmer Wallac, Turku, Φινλανδία).

σε πραγματικό χρόνο Αντίστροφη Μεταγραφή-Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR)

σε πραγματικό χρόνο RT-PCR ανάλυση, το ολικό RNA των κυττάρων εκχυλίζεται με τη χρήση του RNA

εύκολο κιτ (Qiagen, Valencia, CA). Εν συντομία, το ολικό RNA (1 μ§) του κάθε δείγματος αντίστροφα μεταγράφηκε σε 20 μι χρησιμοποιώντας 0.5 μα ολίγο dT και 200 ​​U Superscript II RT (Invitrogen, Carlsbad, CA). Η ενίσχυση διεξήχθη σε έναν συνολικό όγκο 20 μΙ που περιείχε 0.5 μΜ του κάθε εκκινητή, 4 mM MgCl

2, 2 μΐ LightCycler FastStart DNA κύριο SYBR Green Ι (Roche Diagnostics, Pleasanton, CA) και 2 μΙ 1: 10 αραιωμένο cDNA. Η ποσοτικοποίηση των άγνωστων δειγμάτων πραγματοποιήθηκε με LightCycler Λογισμικό Σχετική ποσοτικοποίηση, έκδοση 3.3 (Roche Diagnostics). Σε κάθε πείραμα, το γονίδιο GAPDH οικοκυρικής ενισχύθηκε ως πρότυπο αναφοράς. εναύσματα GAPDH σχεδιάστηκαν: GAPDH (στ): GCCAAAAGGGTCATCATC (nt 448-465, GenBank με καμία NM_002046.), GAPDH (r): ATGACCTTGCCCACA GCCTT (nt 745-765), Οκτ-4α (στ): CGCAAGCCCTCATTTCAC (nt 5- 22, η ένταξη της GenBank δεν NM_002701), Οκτ-4α (r):. CATCACCTCCACCACCTG (nt 98-115, GenBank με καμία NM_002701).. Οι αντιδράσεις PCR παρασκευάστηκαν εις διπλούν και θερμαίνεται στους 95 ° C για 10 λεπτά ακολουθούμενη από 40 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 10 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 55 ° C για 5 δευτερόλεπτα, και επέκταση στους 72 ° C για 20 δευτερόλεπτα. Όλες οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν. Πρότυπες καμπύλες (τιμές κατωφλίου κύκλου έναντι της συγκέντρωσης εκμαγείου) παρασκευάστηκαν για κάθε γονίδιο στόχο και για την ενδογενή αναφοράς (GAPDH) σε κάθε δείγμα.

ανοσοφθορισμού χρώση για δείκτες βλαστικών κυττάρων

Μια αβιδίνης-βιοτίνης σύμπλοκο μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για την χρώση ανοσοφθορισμού στον διαφοροποιημένο σφαιροειδές και νευρωνικών-όπως κύτταρο. Εν συντομία, τα κύτταρα επιστρώθηκαν πάνω σε γυάλινες καλυπτρίδες με πολυ-L-ορνιθίνη-επικαλυμμένα και σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεϋδη για 15 έως 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές (10 λεπτά η κάθε μία) με 1 χ PBS. Τα κύτταρα κατέστησαν διαπερατά με 0.1% Triton Χ-100 /PBS για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και στη συνέχεια δύο φορές (10 λεπτά η κάθε μία) με 1 χ PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια δεσμεύτηκαν με διάλυμα αποκλεισμού για 30 λεπτά και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα (Οκτώβριος-4, Chemicon, Temecula, CA) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια πλύναμε τα κύτταρα τρεις φορές (10 λεπτά η κάθε μία) με 1 χ PBS. Ανοσοαντιδραστικά σήματα ανιχνεύθηκαν με ένα μίγμα βιοτινυλιωμένου κουνελιού κατά IgG ποντικού και Fluorsave (Calbiochem, San Diego, CA). Τα κύτταρα περαιτέρω ανιχνεύθηκαν με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) ταμπέλα σήμα δευτερεύοντα αντισώματα. εικόνες φθορισμού έγιναν ορατά με ένα μικροσκόπιο φθορισμού. Για να αναλυθεί ποσοτικά η ένταση φθορισμού, καταγράψαμε εικόνες με ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού εξοπλισμένο με μια κάμερα CCD. Το ποσοστό του φθορισμού σήματος ανά φωτογραφημένο τομέα αναλύθηκε με το λογισμικό επεξεργασίας εικόνας (Image Pro-Plus, MediaCybernetics, Inc., Silver Spring, MD).

FACS Ανάλυση

Για την ταυτοποίηση δείκτη κυτταρικής επιφάνειας , ένα αιώρημα μονών κυττάρων από sixth- να όγδοη διέλευση κυττάρων από επεξεργασία με θρυψίνη σφαίρες βάφτηκε με αντι-CD133, CD117 (c-Kit), ή ABCG2 και δευτερογενή φλουορεσκεΐνη (FITC) -ή φυκοερυθρίνη (ΡΕ) -συζευγμένων αντισώματα (Dako, Carpinteria). Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 2% παραφορμαλδεΰδη και αναλύθηκαν με μια συσκευή BD FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ).

Ακτινοθεραπεία για την Κυτταρική Βιωσιμότητα Ανάλυση

Η ακτινοβολία γάμμα ( ιονίζουσα ακτινοβολία? IR) παραδόθηκε από Theratronic μονάδα κοβαλτίου T-1000 (Theratronic International, Inc., Ottawa, Canada) σε δόση των 1.1Gy /min (SSD = 57,5 ​​εκατοστά). Για την αξιολόγηση του ρυθμού πολλαπλασιασμού των κυττάρων που σπείρονται κύτταρα σε πλάκες 24 φρεατίων σε πυκνότητα 2 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο. Τα κύτταρα σπάρθηκαν 24 ώρες μετά την IR και στη συνέχεια αναλύθηκαν με methyle θειαζολ δοκιμασία τετραζολίου (ΜΤΤ δοκιμασία, Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΝ). Η ποσότητα του ΜΤΤ φορμαζόνης προϊόντος προσδιορίστηκε με τη χρήση ενός αναγνώστη μικροπλακός και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 560 nm (SpectraMax 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Χημειοθεραπευτικοί παράγοντες

σισπλατίνη, ετοποσίδη (VP16), και πακλιταξέλη ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich και διαλύθηκαν σε DMSO (Sigma-Aldrich) σε 100 mM διαλύματος αποθέματος.

In Vitro

εισβολής κυττάρων Ανάλυση και αποικίας μαλακού άγαρ Δοκιμασία

χρησιμοποιήθηκε Η 24-φρεατίων σύστημα Transwell με ένα 8-μm μεμβράνη φίλτρο μεγέθους πόρου από πολυανθρακικό (Corning Costar, Coming, ΝΥ). Η μεμβράνη του φίλτρου επικαλύφθηκε με Matrigel (BD Biosciences, San Diego) αραιώνεται με μέσο χωρίς ορό και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 37 ° C. Τα εναιωρήματα κυττάρων σπάρθηκαν στο άνω διαμέρισμα του θαλάμου Transwell στην πυκνότητα κυττάρων 1 χ 10

5 σε 100 μΐ ορού μέσο ελεύθερο. Μετά από 24 ώρες, το μέσο απομακρύνθηκε και η μεμβράνη φίλτρο στερεώθηκε με 4% φορμαλίνη για 1 ώρα. Η αντίθετη επιφάνεια της μεμβράνης του φίλτρου που αντιμετωπίζει η κάτω θάλαμο βάφτηκε με Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich) για 3 λεπτά και τα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν στη συνέχεια κατέστησαν ορατές κάτω από ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο. Το πρωτόκολλο της δοκιμασίας μαλακό άγαρ αποικίας περιγράφεται ως εξής. Κάθε φρεάτιο (35 mm) από δίσκο καλλιέργειας έξι φρεατίων επικαλύφθηκε με 2 ml πυθμένα μίγμα άγαρ (ϋΜΕΜ, 10% (ν /ν) FCS, 0,6% (w /v) άγαρ). Μετά το κάτω στρώμα στερεοποιήθηκε, μίγμα άγαρ-μέσης κορυφή 2 ml (ϋΜΕΜ, 10% (ν /ν) FCS, 0.3% (β /ο) άγαρ) που περιέχει 2 × 10

4 κύτταρα προστέθηκε, και οι δίσκοι επωάζονται στους 37 ° C για 4 εβδομάδες. Οι πλάκες βάφτηκαν με 0,5 ml 0,005% κρυσταλλικού ιώδους για 1 ώρα και στη συνέχεια ένα ανατομικό μικροσκόπιο χρησιμοποιήθηκε για να μετρήσει τον αριθμό των αποικιών [29].

λεντοϊών μεσολάβηση RNAi

Ο φορέας pLVRNAi και του φορέα pCDH-MCS1-EF1-copGFP αγοράστηκαν από Biosettia Inc. (Biosettia, San Diego, CA). Η μέθοδος της κλωνοποίησης του διπλόκλωνου αλληλουχία shRNA περιγράφεται στο πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το ολιγονουκλεοτίδιο 5′-siRNA CCGGCCCTCACTTCACTGCACTGTACTCGAGTACAGTGC AGTGAAGTGAGGGTTTTT-3 ‘στόχευσης ανθρώπινο Oct-4 (NM_002701, nt 1035-1055) συντέθηκε και κλωνοποιήθηκε σε pLVRNAi για τη δημιουργία ενός βραδέος φορέα έκφρασης. Το cDNA Oct-4 ενισχύθηκε και καθαρίστηκε με RT-PCR και κλωνοποιήθηκε εντός ενός φορέα pCDH-MCS1-EF1-copGFP. Λεντοϊών παραγωγή έγινε με διαμόλυνση κυττάρων 293Τ χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (LF2000, Invitrogen). Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση και, στη συνέχεια, διηθούνται? οι ιικοί τίτλοι στην συνέχεια προσδιορίστηκε με FACS στις 48 ώρες μετά την μεταγωγή. κύτταρα Υποσυρρέουσες μολύνθηκαν με φακοϊό σε πολλαπλότητα μόλυνσης 5 παρουσία 8 μg /ml polybrene (Sigma-Aldrich).

In Vivo

Ανάλυση ανάπτυξη και μετάσταση όγκου

Όλες οι διαδικασίες που αφορούν τα ζώα ήταν σύμφωνα με τις οδηγίες του ιδρύματος καλή διαβίωση των ζώων της Ταϊπέι Γενικού Νοσοκομείου Βετεράνων. 1000, 3000, και 10

4 κύτταρα εγχύθηκαν στην ουραία φλέβα ποντικών SCID ή /και γυμνά ποντίκια (στέλεχος BALB /c) η κάθε ηλικίας 8 εβδομάδων. In vivo απεικόνιση GFP οπτικοποιήθηκε και μετρήθηκε με μια συσκευή φωτισμού (LT-9500 Illumatool TLS εφοδιασμένο με διέγερση φωτίζουσα πηγή [470 nm] και πλάκα φίλτρου [515 nm]). Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με παχύμετρο και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε σύμφωνα με τον τύπο (μήκος Χ πλάτος

2) /2. Η ολοκληρωμένη οπτική πυκνότητα του πράσινου έντασης φθορισμού συνελήφθη και στη συνέχεια αναλύθηκαν με εικόνα λογισμικού Pro-plus [29].

Στατιστική Ανάλυση

Στατιστική Πακέτο λογισμικού Κοινωνικών Επιστημών (έκδοση 13.0) (SPSS, Inc., Chicago, IL) χρησιμοποιήθηκε για στατιστική ανάλυση. Η ανεξάρτητη Μαθητή

t

ANOVA χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση των συνεχών μεταβλητών μεταξύ των ομάδων, ενώ το 2 τεστ χ

εφαρμόστηκε για τη σύγκριση των διχοτομικών μεταβλητών-τεστ ή. Η εκτίμηση κατά Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση επιβίωσης, και η δοκιμασία log-rank χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση των σωρευτικών διάρκεια επιβίωσης σε διαφορετικές ομάδες ασθενών. Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε στο 0,05 για όλες τις δοκιμές.

Αποτελέσματα

Απομόνωση και Χαρακτηρισμός καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται CD133-θετικά κύτταρα

Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο μαγνητικών σφαιριδίων, απομονώσαμε CD133

+ κύτταρα (Σχ. 1Α) από δείγματα ιστού από δέκα μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) ασθενών (Πίνακας 1) και πέντε καρκίνο του πνεύμονα (LC) κυτταρικές σειρές (Πίνακας S1). Το υψηλό ποσοστό (97%) του CD133

+ (LC-CD133

+) υποσύνολο απομονώθηκε στους ιστούς LC και κυτταρική γραμμή γονική LC (Εικ. 1Α). Έχει αναφερθεί ότι τα καρκινικά κύτταρα βλαστικά παρόμοια μπορούν να καλλιεργηθούν σε εναιώρημα για την παραγωγή επιπλεόντων σωμάτων κάπως σφαιροειδή (SB) υπό μέσου χωρίς ορό με bFGF & amp? ΕΤΠ [30]. Βρήκαμε ότι το LC-CD133

+ απομονώθηκε από αυτά τα δέκα ασθενείς (Πίνακας 1) και πέντε LC κυτταρικές σειρές (Πίνακας S1) μπορούν να σχηματίσουν SB σε DF-12 χωρίς ορό μέσο με bFGF και EGF (Σχήμα 1Β? Αριθμ. 1 [PLC] και Νο.2 [LLC]). (Εικ. 1ϋ) Επιπλέον, η ικανότητα να σχηματίζουν SB (Εικ. 1 C) και ο ρυθμός πολλαπλασιασμού σε LC-CD133

+ ήταν σημαντικά υψηλότερες από ότι σε LC-CD133

– (ρ & lt? 0,05). Επιπλέον, για να καθορίσει το

in vivo

ογκογόνο δράση του LC-CD133

+ και LC-CD133

-, εμείς ένεση αντίστοιχα ποσά του 1000, 3000, και 10

4 κύτταρα σε οι φλέβες της ουράς των ποντικών SCID. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το 10

4 LC-CD133

– δεν προκάλεσε σχηματισμό όγκου αλλά 3000 LC-CD133

+ από τους ιστούς καρκίνου του πνεύμονα από τους δέκα ασθενείς και πέντε LC κυτταρικές σειρές σε ξένο μόσχευμα ποντίκια μπορούν όλα να δημιουργήσει ορατό όγκων 4 εβδομάδες μετά την ένεση (Πίνακας 1 και Πίνακας S1).

(α) χρησιμοποιώντας μία μέθοδο με μαγνητικά σφαιρίδια, ταξινομήσαμε CD133

+ κυττάρων από δείγματα ιστών ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα (LC), και χαρακτηρίζεται από αυτούς από FACS δοκιμασία. (Β) LC-CD133

+ ταξινομημένο από δύο ασθενείς με Νο.1 (PLC-CD133

+) και Νο 2 (LLC-CD133

+) καλλιεργήθηκαν σε bFGF και EGF με DMEM ελεύθερο ορού ελεύθερο μέσο. (Γ) Αξιολόγηση των ικανοτήτων σχηματισμό σφαιροειδή όπως σώματα (SB) από LC-CD133

+ και LC-CD133

– κάτω μέσο ελεύθερο ορού με bFGF & amp? EGF. (Δ) Οι καμπύλες ανάπτυξης των LC-CD133

+ και LC-CD133

– μετρήθηκαν με αιμοκυτταρόμετρο. Bar: 100 μm. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ είναι η μέση τιμή ± SD τριών πειραμάτων.

Η

αυξημένη έκφραση ABCG2 και Επεμβατική Δυνατότητα LC-CD133

+

In Vitro

Η

Για να χαρακτηρίζουν απομονωθεί μας LC-CD133

+, ανάλυση FACS χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει το προφίλ έκφρασης των επιφανειακών κυττάρων δεικτών. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, η πλειοψηφία των απομονωμένων LC-CD133

+ βάφτηκαν με υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του CD133, CD117 (c-Kit), και ABCG2 σύγκριση με LC-CD133

-. Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι απομονωμένα LC-CD133

+ ήταν σχεδόν ABCG2-θετικά κύτταρα (Σχ. 2Β). Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η ενίσχυση της ογκογονικότητας LC-CD133

+, εξετάσαμε

in vitro

Matrigel-σε συνδυασμό Transwell εισβολή και μαλακό δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας agar. Σε σύγκριση με LC-CD133

-, LC-CD133

+ που προέρχονται από ασθενείς με ΜΜΚΠ Νο.1 (PLC) και Νο 2 (LLC) έδειξαν υψηλότερη δραστηριότητα εισβολή μέσω της δοκιμασίας εισβολή Matrigel φρεατίων (

p

& lt? 0.001? Σχ. 2C). Ομοίως, η εστίες ικανότητα σχηματισμού της LC-CD133

+ από PLC (Νο.1) και LLC (Αρ.2) ενισχύθηκε σε σύγκριση με το LC-CD133

– αυτών των δύο ασθενείς (

p

& lt? 0.001? Σχ. 2D)

(Α) και (Β) Τα επίπεδα έκφρασης του CD133, CD117 (c-Kit), και ABCG2 αναλύθηκαν με τη δοκιμασία FACS σε LC-CD133

+ και LC-CD133

-. Οι δυνατότητες του (Γ) την μετανάστευση /την εισβολή και (Δ) τις εστίες όγκου (μαλακό αποικία άγαρ) σχηματισμό σε LC-CD133

+ ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με LC-CD133

– (*

p

& lt? 0.001). Τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ είναι η μέση τιμή ± SD τριών πειραμάτων.

Η

Αυξημένη

In Vivo

όγκων-αποκατάσταση και την πολλαπλασιαστική ικανότητα σε LC-CD133

+

Αξιολογήσαμε περαιτέρω την

in vivo

όγκου-αποκατάσταση και πολλαπλασιαστική ικανότητα της LC-CD133

+ και LC-CD133

– από ξένο μόσχευμα ανάλυση ογκογενετικότητας (Εικ. 3Α). Τέσσερις εβδομάδες μετά από 10

4 κύτταρα εγχύθηκαν μέσα στις φλέβες της ουράς των ποντικών SCID, μια σημαντική αύξηση στις πολλαπλές οζίδια του σχηματισμού όγκων στην επιφάνεια των πνευμόνων σημειώθηκε στο LC-CD133

+ -. Ενίεται ομάδα (Σχ 3Α4 & amp? 3A7) αλλά όχι στην LC-CD133

– ομάδα (Εικ 3Α1).. παρατηρήθηκαν διάχυτη διείσδυση της LC-CD133

+ από το πνευμονικό παρέγχυμα στην φατνιακή κοιλότητα (Εικ. 3Α5, 3Α6 και 3Α8). Η ιστολογική εξέταση έδειξε ότι η προεξέχουσα σχηματισμός θρόμβου νεοαγγείωση και ανιχνεύθηκαν στο πνευμονικό παρέγχυμα του LC-CD133

+ – εγχύθηκε ποντίκια SCID (Εικ 3Α9.). Αντιθέτως, καμία σημαντική εστιών όγκων ή το σχηματισμό νεοαγγειακών βρέθηκε στους πνεύμονες των LC-CD133

– εγχύθηκε SCID ποντίκια (Σχήματα 3Α2 & amp? 3Α3.). Ερευνήσαμε περαιτέρω το

in vivo

ρυθμό ανάπτυξης του όγκου σε 10

+ κυττάρων

4 LC-CD133, 10

6 LC-CD133

– κυττάρων, και 5 × 10

6 κύτταρα μητρική όγκου από τον ίδιο ασθενή. Το εύρημα κατέδειξε ότι ο ρυθμός ανάπτυξης όγκου των 10

4 LC-CD133

+ ομάδα (από ασθενείς # 1, 2, 4, και 7? Πίνακας 1) ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη του 10

6 LC-CD133

– ομάδα και 5 × 10

6 ομάδα γονικών καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 3Β.). Επιπλέον, 10

4 LC-CD133

+ απομονώθηκαν από δευτερογενείς όγκους μπορεί να δημιουργήσει περαιτέρω νέα (δεύτερη) όγκοι από μεταμοσχευμένα ποντίκια SCID. Αποτελέσματα της κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι ένα υψηλό ποσοστό (60%) του CD133-θετικών κυττάρων ανιχνεύθηκε στο δεύτερο όγκο (Σχ. 3C). Επιπλέον, χίλια LC-CD133

+ απομονώθηκε από το δεύτερο όγκο μπορούν επίσης να δημιουργήσουν ένα νέο (τρίτο) του όγκου σε ποντικούς SCID μεταμοσχεύθηκαν (Σχ. 3C). Για να συνοψίσω, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι LC-CD133

+ παρούσας αυτο-ανανέωσης και εμπλουτισμού πληθυσμών δυνατότητες τόσο

in vitro

και

in vivo

.

(Α) Οι i

n vivo

καρκινογένεση από LC-CD133

+ και LC-CD133

– στη φλέβα της ουράς-ένεση ποντίκια αναλύθηκε με μακροσκοπική και ιστολογική εξέταση. Α1-3: LC-CD133

-? βέλη: φυσιολογική κυψελιδική δομή του πνεύμονα. A4-6: LC-CD133

+? βέλη: το σχηματισμό όγκων. A7-9: LC-CD133

+? βέλη: neovascularity και θρόμβωση. Bar: 200 μm. (Β) Το

in vivo

όγκου-αποκατάσταση και πολλαπλασιαστική ικανότητα των 10

4 LC-CD133

+ 10

5 LC-CD133

– και 5 × 10

5 συνολικά κύτταρα όγκου από τον ασθενή Νο 1, 2, 4, και 7 εξετάστηκαν με ξένο μόσχευμα ανάλυση ογκογονικότητας. (Γ) Η ικανότητα αποκατάστασης του πληθυσμού του όγκου των LC-CD133

+ μελετήθηκε σε μεταμοσχευμένα ποντίκια SCID. Τα επίπεδα έκφρασης CD133 προσδιορίστηκαν με ανάλυση FACS από την πρωτογενή LC-CD133

+, δεύτερο όγκο, και το τρίτο του όγκου. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ είναι η μέση τιμή ± SD τριών πειραμάτων

Η

Ενισχυμένη Η χημειοθεραπεία και η ακτινοβολία αντοχή σε LC-CD133

+

Αξιολογήσαμε την πολλαπλά φάρμακα (χημειοθεραπεία). – ανθεκτικά ικανότητες του LC-CD133

+ και LC-CD133

-. Δοκιμάσαμε περαιτέρω τεσσάρων κοινών χημειοθεραπευτικών παραγόντων συμπεριλαμβανομένης της σισπλατίνης, VP16 (ετοποσίδη), δοξορουβικίνη, πακλιταξέλη. Σε σύγκριση με LC-CD133

-, LC-CD133

+ είναι ιδιαίτερα ανθεκτικό στις τέσσερις δοκιμαστεί χημειοθεραπευτικούς παράγοντες (

σ

& lt? 0,01? Σχήμα 4Α.). Για να προσδιοριστεί περαιτέρω η επίδραση της ακτινοβολίας στο ρυθμό ανάπτυξης του όγκου, χρησιμοποιήσαμε ένα ιονίζουσα ακτινοβολία (IR) δόση 0-10 Gy για τη θεραπεία τόσο LC-CD133

+ και LC-CD133

-. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Β, μετά την επεξεργασία IR, το ποσοστό επιβίωσης και τον αριθμό των LC-CD133

+ ήταν σημαντικά υψηλότερες από εκείνες των LC-CD133

– (

σ

& lt? 0,01). Βρήκαμε επίσης ότι το LC-CD133

+ κύτταρα έχουν υψηλότερο βαθμό ραδιοαντοχή (

σ

& lt? 0,01? Εικ. 4Β). Επιπλέον, μελετήθηκε η συνδυασμένη επίδραση της θεραπείας των ακτινοχημειοθεραπεία σε LC-CD133

+. Τα πειράματα διεξήχθησαν με σισπλατίνη (10 μΜ) μόνο, VP-16 (10 μΜ) μόνο του, ή σε συνδυασμό σισπλατίνης και VP-16 στο IR (2 Gy) κατεργασμένους LC-CD133

+. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C, τα δεδομένα αποκάλυψαν ότι το ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων σε IR-αγωγή LC-CD133

+ δεν μειώθηκε σημαντικά από την αγωγή με IR σε συνδυασμό με σισπλατίνη, με ή χωρίς VP-16 (

ρ

& gt? 0,05). Αντίθετα, η επιβίωση των κυττάρων μειώθηκε σημαντικά μετά τη χημειοθεραπεία με σισπλατίνη σε συνδυασμό με VP-16 σε IR-αγωγή LC-CD133

– (

ρ

& lt? 0,01? Σχήμα 4C.). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το LC-CD133

+ μπορεί να διαδραματίσει ζωτικό ρόλο στην ικανότητα του όγκου να αντισταθεί ακτινοβολία και χημειοθεραπείες.

(Α) Τόσο 10.000 LC-CD133

+ και LC-CD133

– απλώθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις σισπλατίνης, VP-16, δοξορουβικίνη, και πακλιταξέλη για 24 ώρες σε 10% FBS /DMEM /F-12 μέσο. Το ποσοστό επιβίωσης προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. (Β) Για τον προσδιορισμό της επίδρασης της ακτινοβολίας στο ρυθμό ανάπτυξης του όγκου, η ιονίζουσα ακτινοβολία (IR) δόση 0-10 Gy είχε χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία LC-CD133

+ και LC-CD133

-. *

σ

& lt? 0.01: LC-CD133

+ σε σύγκριση με LC-CD133

-. (Γ) Η συνδυασμένη επίδραση της θεραπείας των ακτινοχημειοθεραπεία σε LC-CD133

+ και LC-CD133

– περαιτέρω αξιολόγηση. Το τέσσερα πρωτόκολλα-ακτινοβολίας (2 Gy) μόνο, ακτινοβολία με σισπλατίνη (10 μΜ), ακτινοβολία με VP-16 (10 μΜ), και η ακτινοβολία με πακλιταξέλη (10 ηΜ) -υποβλήθκαν χρησιμοποιούνται. *

σ

& lt? 0,01. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ είναι η μέση τιμή ± SD τριών πειραμάτων.

Η

Ο ρόλος της Oct-4 έκφραση σε LC-CD133

+

αποτελέσματα μικροσυστοιχιών πρότεινε ότι το επίπεδο έκφρασης του Οκτώβρη -4 αυτο-ανανέωση και γονίδιο βλαστική ικανότητα σε LC-CD133

+ ήταν σημαντικά up-ρυθμίζεται από εκείνο στο LC-CD133

-. Για την επικύρωση αυτή τη διαπίστωση, εξετάσαμε την έκφραση του Oct-4 και τα δύο μεταγραφικά και μεταφραστικά. Τα ποσά των Oct-4 μεταγραφή και η πρωτεΐνη των απομονωμένων LC-CD133

+ (Ασθενείς Νο.1 [PLC] και Νο.2 [LLC]) ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με εκείνες των LC-CD133

– από πραγματικούς -Time RT-PCR και κηλίδωση Western ανάλυση (Σχ. 5Α και 5Β). Για να διερευνηθεί κατά πόσο Oct-4 έκφραση παίζει ένα ρόλο στη διατήρηση της αυτο-ανανέωσης ή καρκίνο ιδιότητες των βλαστικών όπως στο LC-CD133

+, χρησιμοποιήσαμε τη μέθοδο του siRNA με φορέα λεντοϊού για νοκ ντάουν της Oct-4 έκφραση σε LC-CD133

+. Βρήκαμε ότι είναι σημαντικό ότι η θεραπεία της Oct-4 siRNA σε LC-CD133

+ μπορεί να επηρεάσει σημαντικά τις δυνατότητες της σφαιροειδή όπως σώματα (SB) σχηματισμό (

σ

& lt? 0.001? Σχ. 5C ). Μετά από 7 ημέρες από την αγωγή Oct-4 siRNA, το SB του LC-CD133

+ δεν θα μπορούσε να διατηρήσει κυμαινόμενο σφαίρες αλλά διαφοροποιούνται σε προσκολλημένα κύτταρα επιθηλιακά-σαν (Εικ. 5C). Αντίθετα, η θεραπεία του ελέγχου αγωνίζομαι siRNA δεν επηρέασε την ικανότητα σχηματισμού SB σε LC-CD133

+ (Σχ. 5C). Η SB της LC-CD133

+ εκφράζεται ενδογενώς ισχυρά θετικά μηνύματα για Oct-4 και CD133 (Εικ. 5D). Επιπλέον, τα αποτελέσματα κατέδειξαν ανοσοφθορισμού ότι τόσο η CD133 και Oct-4 εκφράσεις στο LC-CD133

+ ήταν σημαντικά μπλοκαριστεί μετά από 7 ημέρες από Oct-4 θεραπεία siRNA (Σχ. 5D). δοκιμασία FASC επιβεβαίωσε ότι το ποσό του CD133 μειώθηκε δραματικά σε Oct-4 siRNA που έλαβαν LC-CD133

+ και τα ποσοστά των LC-CD133

– ήταν σημαντικά αυξημένη σε LC-CD133

+ μετά από 7 ημέρες της Oct-4 θεραπεία siRNA (

σ

& lt? 0.001? Σχ. 5Ε). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η Oct-4 μπορούν να διατηρούν τις ιδιότητες των πρωτόγονων αρχέγονων κυττάρων και αναστέλλουν την τάση για διαφοροποίηση σε LC-CD133

+.

(α) Τα ποσά των Oct-4 μεταγραφές των απομονωμένων LC- CD133

+ ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με εκείνες των LC-CD133

– με πραγματικού χρόνου RT-PCR αναλύσεις. (Β) Δυτική δεδομένα Blott έδειξαν ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης Oct-4 σε LC-CD133

+ απομονώθηκε από PLC και LLC ήταν επίσης σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε σύγκριση με εκείνες του LC-CD133

-. (Γ) Η πρωτεΐνη έκφραση Oct-4 στο LC-CD133

+ είχαν ουσιαστικά αποκλειστεί από Οκτώβριο-4 siRNA. Θεραπεία της Oct-4 siRNA σε LC-CD133

+ μπορεί να παρεμποδίσει τις δυνατότητες σχηματισμού SB και την περαιτέρω διευκόλυνση της SB για να διαφοροποιηθούν σε συνημμένο επιθηλιακά κύτταρα όμοια. Bar: 100 μm. (Δ) χρησιμοποιώντας χρώση ανοσοφθορισμού, δείξαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης αμφοτέρων Oct-4 και CD133 σε LC-CD133

+ ήταν σημαντικά μειωμένη μετά Oct-4 θεραπεία siRNA. Bar: 30 μm. (Ε) Το ποσοστό των LC-CD133

– ήταν σημαντικά αυξημένη σε Oct-4 siRNA που έλαβαν LC-CD133

+ με ανάλυση FACS. *

σ

& lt? 0.001. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ είναι η μέση τιμή ± SD τριών πειραμάτων.

Η

Ενισχυμένη Chemoradiotherapeutic Ευαισθησία και αποπτωτική ενεργότητα εντός LC-CD133

+ αντιμετωπίζεται με Oct-4 siRNA

Για την περαιτέρω μελέτη ο ρόλος του Oct-4 σε κακοήθεια όγκων του LC-CD133

+

in vitro

, χρησιμοποιήθηκαν ο μετανάστευση /επεμβατική και δοκιμασία μαλακού άγαρ αποικίας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ικανότητες του

in vitro

μεταναστευτικών εισβολή και αποικία σχηματισμό σε LC-CD133

+ αντιμετωπίζεται με Oct-4 siRNA σημαντικά μειώθηκαν σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα LC-CD133

+ ή LC-CD133

+ αντιμετωπίζονται με αγωνίζομαι-siRNA (έλεγχος?

σ

& lt? 0.001? Εικ. 6Α). Επιπλέον, η επίδραση της θεραπείας του χημειοραδιοθεραπεία για το LC-CD133

+ ομάδα μπορεί να βελτιωθεί σημαντικά με τη θεραπεία Oct-4 siRNA σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα LC-CD133

+ ή LC-CD133

+ αντιμετωπίζονται από αγωνίζομαι-siRNA (Σχήμα 6Β?.

σ

& lt? 0.001). Επιπλέον, βρήκαμε ότι τα αποπτωτικά δραστηριότητες αννεξίνης V (Σχήμα 6C). Και κασπάσης 3 (Εικόνα 6D?. Άνω τμήμα) έχουν γρήγορα και αποτελεσματικά προκαλείται σε LC-CD133

+ αντιμετωπίζονται από Oct-4 siRNA μετά από 72 ώρες . Σύμφωνα με το αποτέλεσμα της κυτταρικής επιβίωσης και της θεραπείας αποτελέσματα σε Oct-4 siRNA επεξεργασμένα LC-CD133

+ (Σχ. 6Β), τα δεδομένα κηλίδας western κατέδειξε επίσης ότι οι ποσότητες των ενεργοποιημένων (διασπάται) μορφή του PARP ήταν σταθερά αυξημένα σε LC-CD133

+ αντιμετωπίζεται με Oct-4 siRNA με IR μόνο του ή σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία (Σχήμα 6D?. κάτω μέρος). Έτσι, νοκ ντάουν της Oct-4 έκφραση σε LC-CD133

+ μπορεί να ενισχύσει αποτελεσματικά chemoradiosensitivities και αποπτωτικών δραστηριότητες σε απάντηση IR και τη χημειοθεραπεία, γεγονός που υποδηλώνει ότι Oct-4 θα μπορούσε να είναι ένας βασικός παράγοντας επιτρέπει LC-CD133

+ για να αντισταθεί