Abstract

Ο υποδοχέας κινασών τυροσίνης Eph διαμεσολαβούν juxtacrine σήματα με αλληλεπίδραση «σε

trans

» με συνδετήρες συνδεδεμένη με την επιφάνεια των γειτονικών κυττάρων μέσω μιας άγκυρας GPI (εφρίνης-As) ή μια διαμεμβρανική τμήμα (εφρίνης-Β), η οποία οδηγεί στον υποδοχέα ομαδοποίηση και αυξημένη δραστικότητα κινάσης. Επιπλέον, διαλυτές μορφές των συνδεσμικών εφρίνης-Α απελευθερώνεται από την κυτταρική επιφάνεια με μεταλλοπρωτεάσες μήτρας μπορεί επίσης να ενεργοποιήσει σηματοδότηση υποδοχέα EphA. Εκτός από αυτά

trans

αλληλεπιδράσεις, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι Εφεσ υποδοχείς και εφρινών συνεκφράζονται σε νευρώνες μπορούν επίσης να συμμετάσχουν σε πλευρική «

cis

« ενώσεις που μειώνουν την ενεργοποίηση του υποδοχέα από εφρινών στο

trans

με κρίσιμες λειτουργικές συνέπειες. Παρά τη σημασία του συστήματος /ephrin Εφεσ στην ογκογένεση, Εφεσ υποδοχέα-ephrin

cis

αλληλεπιδράσεων δεν έχουν διερευνηθεί προηγουμένως στα καρκινικά κύτταρα. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι στα καρκινικά κύτταρα, συνεκφράστηκε εφρίνης-A3 μπορεί να αναστείλει την ικανότητα της EphA2 και EphA3 δεσμεύοντας εφρινών σε

trans

και ενεργοποιούνται, ενώ εφρίνης-Β2 μπορούν να αναστείλουν όχι μόνο EphB4 αλλά επίσης EphA3. Η

cis

αναστολή της EphA3 από ephrin-Β2 σημαίνει ότι σε ορισμένες περιπτώσεις εφρινών που δεν μπορούν να ενεργοποιήσουν ένα συγκεκριμένο υποδοχέα Eph στο

trans

μπορεί ωστόσο να αναστείλει την ικανότητα σηματοδότησης της μέσω

cis

σχέση. Βρήκαμε επίσης ότι μια μετάλλαξη EphA3 προσδιορίζονται στην ενισχύει τον καρκίνο του πνεύμονα

cis

αλληλεπίδραση με ephrin-Α3. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ένα νέο μηχανισμό που μπορεί να συμβάλλουν στην παθογένεση του καρκίνου με την εξασθένηση του όγκου καταστολή επιπτώσεις του υποδοχέα Eph μονοπάτια που ενεργοποιούνται από εφρινών στο

trans

σηματοδότησης.

Παράθεση: Falivelli G, Lisabeth EM, de la Torre ER, Perez-Tenorio G, Tosato G, Salvucci O, et al. (2013) Εξασθένηση του Eph κινάση υποδοχέα ενεργοποίησης σε καρκινικά κύτταρα από συνεκφράζονται Ephrin προσδέματα. PLoS ONE 8 (11): e81445. doi: 10.1371 /journal.pone.0081445

Επιμέλεια: Renping Zhou, Πανεπιστήμιο Rutgers, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7 Αυγούστου, 2013? Αποδεκτές: 21 Οκτ 2013? Δημοσιεύθηκε: 29 Νοεμβρίου, 2013

Copyright: © 2013 Falivelli et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγεί P01CA138390 και P01HD025938, χορηγούν 18XT-0099 από τον καπνό των ασθενειών που σχετίζονται Πρόγραμμα Έρευνας (ΕΒΡ), μεταδιδακτορικός υπότροφος από το ισπανικό Ίδρυμα για την Επιστήμη και την Τεχνολογία (FECYT, ΕΡΤ), Εθνικά Ινστιτούτα μεταδιδακτορική Υγείας κατάρτισης T32CA121949 επιχορήγηση και μεταδιδακτορικός υπότροφος 20ft-0076 από τον καπνό των ασθενειών που σχετίζονται Research Program (EML) και μεταδιδακτορικός υπότροφος Dnr 2009 έως 7360 από το σουηδικό Συμβούλιο Έρευνας (GP). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Μέλη του μεγάλου Eph τυροσίνης υποδοχέα της οικογένειας της κινάσης, και ιδιαίτερα EphA2 και EphB4, υπερεκφράζονται σε μια ευρεία ποικιλία τύπων όγκου [1,2]. Eph υποδοχείς σηματοδοτούν μέσω αλληλεπίδρασης «σε

trans

» με εφρινών εκφράζεται επί γειτονικών κυττάρων, η οποία προάγει την συνάθροιση υποδοχέων, αυτοφωσφορυλίωση και δραστικότητα κινάσης [3]. Οι διαλυτές μορφές των συνδετών εφρίνης-Α απελευθερώνεται από την κυτταρική επιφάνεια με μεταλλοπρωτεάσες μήτρας μπορεί επίσης να ενεργοποιήσει τους υποδοχείς EphA [4-7]. Ωστόσο, Eph υποδοχείς σε καρκινικά κύτταρα είναι συχνά ελάχιστα φωσφορυλιωμένη τυροσίνη [3]. Αυτό υποδηλώνει χαμηλή ενεργοποίηση από εφρίνης συνδέτες και είναι συνεπής με τον όγκο καταστολής ενέργειες που αναφέρθηκαν για ένα αριθμό οδών κατάντη σηματοδότησης υποδοχέα Eph [1,8,9].

Η έλλειψη ουσιαστικής ενεργοποίησης υποδοχέα Eph είναι σε ορισμένες περιπτώσεις λόγω της χαμηλής έκφρασης της εφρίνης συνδετήρων σε καρκινικά κύτταρα με υψηλή έκφραση του υποδοχέα [1,10-13]. Επιπλέον, αρκετές άλλοι μηχανισμοί μπορεί να κρατήσει Eph ενεργοποίηση του υποδοχέα χαμηλής σε καρκινικά κύτταρα τα οποία εκφράζουν επίσης συνδέτες εφρίνης. Για παράδειγμα, μεταλλάξεις του καρκίνου έχουν δειχθεί να διαταράξουν την ικανότητα ή τη δραστηριότητα της κινάσης των υποδοχέων Eph [14,15] δεσμευτικός ephrin. Επιπλέον, η έλλειψη Ε-καδερίνης εξαρτώμενη προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου μπορούν να βλάψουν την ενεργοποίηση του υποδοχέα EphA2 σε κύτταρα καρκίνου του μαστού, γεγονός που υποδηλώνει αναποτελεσματική EphA2

trans

αλληλεπίδραση με εφρινών [16]. Ένας άλλος πιθανός μηχανισμός για την εξασθένηση υποδοχέα Eph κατάντη σηματοδότησης σε καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να περιλαμβάνει ανασταλτική πλευρική

cis

αλληλεπιδράσεις μεταξύ Eph υποδοχέων και εφρινών συνεκφράζονται στα ίδια κύτταρα [2,17,18]. Ανασταλτική

cis

αλληλεπιδράσεις με έχουν εφρινών έχει αποδειχθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση του υποδοχέα μικρορύθμιση Εφεσ στο νευρικό σύστημα για να ελέγχει με ακρίβεια άξονα pathfinding και συναπτική λειτουργία [1,18-21]. Ωστόσο,

cis

αλληλεπιδράσεις δεν συμβαίνουν σε όλα τα νευρώνες που συνεκφράζουν υποδοχείς Eph και εφρινών διότι σε ορισμένες νευρώνες υποδοχείς και συνδέτες καταλαμβάνουν ξεχωριστή μικροεπικράτειες της πλασματικής μεμβράνης και ως εκ τούτου δεν μπορεί να μπερδεύονται [20,22]. Είτε

cis

αλληλεπιδράσεις μεταξύ Eph υποδοχέων και εφρινών μπορεί επίσης να εμφανιστεί σε καρκινικά κύτταρα, δεν έχει διερευνηθεί προηγουμένως.

Βιοχημικές και δομικές μελέτες έχουν δείξει ότι

cis

αλληλεπίδραση περιλαμβάνει ένα Εφεσ διεπαφή δεσμευτική διαφορετική από εκείνη του υποδοχέα-ephrin μεσολαβεί την αλληλεπίδραση υψηλής συγγένειας στο

trans

[18,23]. Η εξωκυτταρική περιοχή των δυο κατηγοριών υποδοχέων EphA και EphB περιέχει ένα Ν-τερματικό πεδίο σύνδεσης συνδετήρα, μία περιοχή πλούσια σε κυστεΐνη και δύο φιμπρονεκτίνης πεδία τύπου III [3]. Το δεύτερο πεδίο ινωδονεκτίνης ακολουθείται από ένα τμήμα διαμεμβράνης και κυτοπλασμική περιοχή που περιλαμβάνει το πεδίο κινάσης της τυροσίνης, έναν τομέα SAM και ένα μοτίβο ΡΟΖ-δεσμευτική. Οι εφρινών αποτελούνται από έναν τομέα δέσμευσης υποδοχέα Eph Ν-τερματικό συνδεδεμένο με μία βραχεία περιοχή συνδέτη σε ένα άγκυρα γλυκοσυλοφωσφατιδυλοϊνοσιτόλης (GPI) για την εφρίνης-As και ένα τμήμα διαμεμβράνης που ακολουθείται από μια σύντομη κυτταροπλασματική περιοχή για την εφρίνης-Β. Eph δεσμευτικός υποδοχέα εφρίνης

trans

περιλαμβάνει κυρίως την αλληλεπίδραση μεταξύ του βρόχου G-H του εφρίνης και μια τσέπη μέσα στην περιοχή δέσμευσης συνδέτη του υποδοχέα Eph [24]. Αυτές οι διασυνδέσεις υποστηρίζουν κυρίως τις promiscuous αλληλεπιδράσεις των υποδοχέων Eph με εφρινών που ανήκουν στην ίδια Α ή Β τάξης. Από την άλλη πλευρά,

cis

αλληλεπιδράσεις έχουν προταθεί για τη συμμετοχή των ινωδονεκτίνης τύπου III περιοχές του υποδοχέα Eph και μία περιοχή του τομέα δέσμευσης υποδοχέα της εφρίνης που είναι διαφορετική από το βρόχο GH [18,23 ].

Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι Εφεσ υποδοχείς και εφρινών συνεκφράζονται σε καρκινικά κύτταρα μπορούν να συμμετάσχουν σε

cis

αλληλεπιδράσεις που αναστέλλουν την ενεργοποίηση του υποδοχέα Eph από εφρινών στο

trans

. Είναι ενδιαφέρον, ανιχνεύσαμε αναστολή της ενεργοποίησης EphA3 μέσω

cis

αλληλεπίδραση όχι μόνο με εφρίνης-A3, αλλά και εφρίνης-Β2, το οποίο δεν είναι ένα πρόσδεμα ενεργοποίησης για EphA3 [25], υποδηλώνοντας ότι

cis

αλληλεπιδράσεις δεν εμφανίζουν τον ίδιο υποδοχέα-συνδετήρα εκλεκτικότητα ως

trans

αλληλεπιδράσεις. Βρήκαμε επίσης ότι μια μετάλλαξη του καρκίνου του πνεύμονα που προσδιορίζονται στο δεύτερο ινωδονεκτίνης τύπου III επανάληψη της EphA3 ενισχύει το

cis

σύνδεση του υποδοχέα με ephrin-Α3.

Αποτελέσματα

Ephrin-Α3 συν-έκφραση σε καρκινικά κύτταρα εξασθενεί την ενεργοποίηση του υποδοχέα EphA σε trans από διαλυτό ephrin-A3

Για να διερευνηθεί η επίδραση της ephrin συνέκφραση σε υποδοχέα Eph σηματοδότησης στον καρκίνο κύτταρα, εξετάσαμε EphA3 (υποδοχέα Eph για την οποία ανασταλτική

cis

αλληλεπιδράσεις με εφρίνης-As έχουν μελετηθεί εκτενώς στους νευρώνες [17,18,20]) και EphA2 (ο υποδοχέας EphA εκφράζεται πιο ευρέως σε καρκινικά κύτταρα [1,26-28], αλλά για τα οποία οι επιδράσεις των

cis

αλληλεπιδράσεις δεν έχουν ερευνηθεί στο παρελθόν). Εμείς μολυσμένα του καρκίνου κυτταρικών γραμμών Α549 πνεύμονα NCI-H226 και με φακοϊούς κωδικοποιούν EphA3 και ZsGreen από δισιστρονική μεταγραφή ή μόνο ZsGreen ως μάρτυρας. Μετά την επιλογή με διαλογή FACS, μπορούμε περαιτέρω μολυσμένα τα κύτταρα με φακοϊούς κωδικοποιούν εφρίνης-A3 με ετικέτα mCherry ή μόνο mCherry ως έλεγχο, που ακολουθείται από επιλογή. Οι δύο lentivirally μολυσμένα καρκινικές κυτταρικές σειρές, οι οποίες δεν εκφράζουν ανιχνεύσιμα ενδογενή EphA3 ή εφρίνης-Α3 (Σχήμα 1), μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με εφρίνης-A3 Fc (διαλυτή μορφή του συνδέτη εφρίνης-A3 συντηγμένο με το τμήμα Fc της ανθρώπινης IgG

1) για να ενεργοποιήσετε EphA3 μέσω ephrin δεσμευτικός ως προς

trans

. Ephrin-A3 Fc αυξημένη φωσφορυλίωση τυροσίνης υποδοχέα στα κύτταρα που συνεκφράζουν EphA3 με έλεγχο mCherry, όπως αναμενόταν, αλλά όχι στα κύτταρα που συνεκφράζουν EphA3 με mCherry-εφρίνης-Α3 (Σχήμα 1Α, Β). Ephrin-A3 συνέκφραση εξασθενημένος επίσης εφρίνης-A3 Fc-επαγόμενη ενεργοποίηση του ενδογενούς EphA2 σε κύτταρα Α549 (Εικόνα 1 C). Έτσι, σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα, συνεκφράστηκε εφρίνης-A3 μπορεί να αναστείλει την EphA2 και ενεργοποίηση EphA3 με εφρίνης συνδετήρες.

(Α, Β) ΝΟΙ-Η226 και Α549 πνεύμονα καρκινικά κύτταρα μολύνθηκαν με φακοϊό κωδικοποιεί EphA3 και ZsGreen μόνος ή μαζί με ένα φακοϊό κωδικοποίηση mCherry-εφρίνης-Α3? κύτταρα ελέγχου μολύνθηκαν με φακοϊούς κωδικοποίηση ZsGreen και mCherry. ανοσοϊζήματα EphA3 ανιχνεύθηκαν με ανοσοστύπωμα για φωσφοτυροσίνης (ΡΤγτ) και ξαναϊχνηθετούνται για EphA3. Τα λύματα ανιχνεύθηκαν για mCherry-εφρίνης-A3 με ένα αντίσωμα αντι-DsRed που αναγνωρίζει επίσης mCherry, για EphA3, και για β-τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης. Τα ιστογράμματα δείχνουν κανονικοποιημένες μέσο ± SE ποσοτικοποιηθεί από 3 ανοσοστυπώματα τόσο Α και Β Σε ένα από τα πειράματα Α549 χρησιμοποιούνται για την ποσοτικοποίηση, τα κύτταρα διεγέρθηκαν με εφρίνης-A5 Fc. ** Ρ & lt? 0.01 από ένα δείγμα δοκιμής t για τη σύγκριση των εφρίνης-A3 Fc-επεξεργασμένα κύτταρα που εκφράζουν τόσο EphA3 και εφρίνης-A3 με εφρίνης-A3 κύτταρα Ρο-επεξεργασία που εκφράζουν μόνο EphA3. Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα επίπεδα EphA3 ήταν υψηλότερα σε κύτταρα Α549 που εκφράζουν συν-εφρίνης-A3 /εφρίνης-Β2 (βλέπε επίσης Σχ. 2Α, 3Β, 4Α και 5C, D), γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτός ο υποδοχέας μπορεί να σταθεροποιηθεί με τις συνεκφράζονται εφρινών. (C) Τα κύτταρα Α549 μολύνθηκαν με φακοϊό κωδικοποιεί mCherry-εφρίνης-A3 ή mCherry ως μάρτυρας. Ανοσοκαταβυθισμένες ενδογενής EphA2 ανιχνεύθηκε με ανοσοστύπωμα για φωσφοτυροσίνη (ΡΤγτ) και ξαναϊχνηθετούνται για EphA2. Τα λύματα ανιχνεύθηκαν με ένα αντίσωμα αντι-DsRed και β-τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης. Το ιστόγραμμα δείχνει κανονικοποιημένες μέσο ± SE ποσοτικοποιηθεί από 3 ανοσοστυπώματα. ** Ρ & lt?. 0.01 από ένα δείγμα δοκιμής t για τη σύγκριση των εφρίνης-A3 Fc-επεξεργασμένα κύτταρα που εκφράζουν ή που δεν εκφράζουν εφρίνης-A3

Η

Συνέκφραση με εφρίνης-A3 σε καρκινικά κύτταρα μειώνει την ικανότητα του EphA3 να δεσμεύσει ephrin-Όπως και σε trans

για να εξεταστεί αν σε καρκινικά κύτταρα ephrin-Α3 συνέκφραση μειώνει την ικανότητα των EphA3 να δεσμεύουν συνδέτες εφρίνης-Α στο

trans

, μετρήσαμε τη δέσμευση του διαλυτού μορφές εφρίνης-Α5 ή εφρίνης-A3 συντήκονται με αλκαλική φωσφατάση (ΑΡ) με το NCI-H226 και τα κύτταρα Α549 που εκφράζουν EphA3 μόνο του ή μαζί με mCherry-εφρίνης-A3. Διαπιστώσαμε εφρίνης-Α AP δέσμευση σε κύτταρα που εκφράζουν μόνο EphA3 αλλά όχι σε κύτταρα που συνεκφράζουν εφρίνης-A3 με EphA3 (Σχήμα 2Α). Ανοσοαποτύπωση διαπιστώσει ότι ephrin-A3 συνέκφραση δεν μειώνει τα συνολικά επίπεδα EphA3 (Εικόνα 2Α). Βιοτινυλίωση των πρωτεϊνών επιφανείας κυττάρου που ακολουθείται από μια ELISA στην οποία EphA3 συνελήφθη με ένα αντίσωμα και το επίπεδο της βιοτινυλίωσης ανιχνεύθηκαν με στρεπταβιδίνη συζευγμένη σε ραφανιδική υπεροξειδάση (HRP) έδειξαν ότι εφρίνης-A3 συνέκφραση δεν επηρεάζει το κλάσμα του EphA3 υπάρχουν στο κύτταρο επιφάνεια (Σχήμα 2Β). Έτσι, συνεκφράστηκε εφρίνης-A3 στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα αναστέλλει τη δέσμευση να EphA3 σε

trans

χωρίς μείωση έκφραση EphA3 ή επιφάνεια εντοπισμό.

(Α) NCI-H226 και Α549 πνεύμονα καρκινικά κύτταρα μολύνθηκαν ephrin με ένα φακοϊό κωδικοποιεί EphA3 και ZsGreen μόνο του ή μαζί με ένα φακοϊό κωδικοποιεί mCherry-εφρίνης-A3? κύτταρα ελέγχου μολύνθηκαν με φακοϊούς κωδικοποίηση ZsGreen και mCherry. Τα ιστογράμματα δείχνουν την πρόσδεση του εφρίνης-A5 AP σε κύτταρα ΝΟΙ-Η226 και εφρίνης-A3 AP σε κύτταρα Α549, αποκαλύπτοντας ότι η συνέκφραση εφρίνης-A3 εμποδίζει τη δέσμευση των πρωτεϊνών εφρίνης AP προς EphA3. Οι κανονικοποιημένες μέσα από 2 πειράματα (το καθένα με δείγματα εις τριπλούν) ± SE εμφανίζεται. ** Ρ & lt? 0.01 με μονόδρομη ANOVA και δοκιμή του Dunnett post-hoc για τη σύγκριση με τα κύτταρα που εκφράζουν μόνο EphA3. Τα ανοσοαποτυπώματα δείχνουν έκφραση του EphA3, εφρίνης-A3, και β-τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης σε κυτταρολύματα, επαληθεύοντας ότι εφρίνης-A3 συνέκφραση δεν μειώνει τα επίπεδα EphA3. Στην πραγματικότητα, τα επίπεδα EphA3 εμφανίστηκε υψηλότερη σε κύτταρα Α549 που εκφράζουν συν-εφρίνης-A3. Το λευκό χώρο δείχνει την αφαίρεση ενός άσχετου λωρίδα. βιοτινυλίωση (Β) της επιφάνειας κυττάρων που ακολουθείται από μια ELISA όπου EphA3 συλλήφθηκε με ένα ακινητοποιημένο αντίσωμα και βιοτινυλιώσεως του ανιχνεύθηκαν με στρεπταβιδίνη-ΗΚΡ αποκαλύπτει ένα παρόμοιο κλάσμα EphA3 στην επιφάνεια των κυττάρων που εκφράζουν EphA3 μόνο του ή μαζί με εφρίνης-A3. Το ιστόγραμμα δείχνει μέσα από 2 πειράματα (το καθένα με δείγματα εις τριπλούν) ± SE. Η επώαση με το διπλάσιο προϊόντα λύσης έδωσε παρόμοια αποτελέσματα, υποδεικνύοντας ότι επιτεύχθηκε η μέγιστη EphA3 σύνδεση με το αντίσωμα ακινητοποιημένο σε φρεάτια. ** Ρ & lt? 0.01 με μονόδρομη ANOVA και post-hoc τεστ Tukey για τη σύγκριση με τα κύτταρα που εκφράζουν mCherry και ZsGreen? p & gt? 0,05 για τη σύγκριση των κυττάρων που εκφράζουν EphA3 με και χωρίς εφρίνης-A3. (Γ) EphA3 Fc χρησιμοποιήθηκε για κυκλώματα μειώσεως από ρυθμισμένο μέσο και προϊόντα λύσης του Α549 ή H226 κύτταρα μολυσμένα με τις υποδεικνυόμενες φακοϊών. Με ανοσοστύπωμα με αντίσωμα αντι-DsRed, εφρίνης-A3 ανιχνεύθηκε μόνο στα προϊόντα λύσης. Οι pull-downs επίσης διερευνήθηκαν για Fc να ελέγξει τα επίπεδα των EphA3 Fc. (D) πρωτεΐνες επιφάνειας βιοτινυλιώθηκαν σε κύτταρα μολυσμένα με φακοϊούς κωδικοποιεί mCherry, mCherry-εφρίνης-Α3, ή mCherry-εφρίνης-A3 μαζί με EphA3 και ZsGreen. mCherry-εφρίνης-A3 ανοσοϊζήματα (με αντι-DsRed αντίσωμα) ανιχνεύθηκαν με στρεπταβιδίνη-ΗΚΡ, αποδεικνύοντας παρόμοια επίπεδα κυτταρικής επιφάνειας του εφρίνης-A3 εκφράζονται μόνο του ή μαζί με EphA3. IgG, ανοσοκατακρήμνισμα έλεγχο με μη-ανοσοποιητικό IgGs. Τα λύματα ανιχνεύθηκαν για mCherry-εφρίνης-A3 με αντι-DsRed αντίσωμα.

Η

Μια πιθανή εξήγηση για αυτά τα αποτελέσματα θα μπορούσαν να είναι ότι το διαλυτό εφρίνης-A3 που απελευθερώνεται στο μέσο καλλιέργειας με μεταλλοπρωτεάσες μήτρας [4-6] θα ανταγωνιστεί με εφρίνης-A3 AP για δέσμευση με την EphA3 σύνδεσης συνδετήρα πεδίο ορισμού. Για την αντιμετώπιση αυτής της δυνατότητας, χρησιμοποιήσαμε την εξωκυτταρική περιοχή του EphA3 συντήκονται με Fc για να τραβήξει προς τα κάτω εφρίνης-A3 από το μέσο καλλιέργειας ή τα κύτταρα λύθηκαν σε ένα όγκο ισοδύναμο με εκείνο του μέσου καλλιέργειας. Ephrin-A3 μπορούσε να ανιχνευθεί με ανοσοαποτύπωση στα κυκλώματα μειώσεως από κυτταρολύματα, αλλά όχι από το μέσο καλλιέργειας (Σχήμα 2C), υποδεικνύοντας ότι η μεγάλη πλειονότητα των εφρίνης-A3 παρέμεινε συνδέονται με τα κύτταρα κατά τη διάρκεια της χρονικής περιόδου 24-48 ωρών των πειραμάτων μας. Επιπλέον, μια μοναδική ζώνη mCherry-εφρίνης-A3 παρατηρήθηκε στα ανοσοστυπώματα, καθιστώντας απίθανο ότι ένα σημαντικό τμήμα της εφρίνης διασπάστηκε για να δημιουργήσει ένα μικρότερο μορφή που παραμένει συνδεδεμένο με τα κύτταρα με σύνδεση προς έναν υποδοχέα EphA. Βιοτινυλίωση των πρωτεϊνών επιφανείας κυττάρου που ακολουθείται από ανίχνευση της ανοσοκαταβυθίζονται βιοτινυλιωμένου εφρίνης-A3 με στρεπταβιδίνη-ΗΚΡ επιβεβαίωσαν ότι εφρίνης-A3 παρομοίως εντοπισμένη στην επιφάνεια κυττάρων Α549 όταν εκφράζεται μόνη ή μαζί με EphA3 (Σχήμα 2D).

cis αλληλεπίδραση EphA3-εφρίνης-A3 δεν απαιτεί τον υποδοχέα σύνδεσης συνδετήρα τομέα

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι οι αλληλεπιδράσεις cis απαιτούν εντοπισμό της μεμβράνης του υποδοχέα Eph και εφρίνης [18]. Ως εκ τούτου, να εξετάσει κατά πόσον ο τομέας EphA3 σύνδεσης συνδετήρα είναι απαραίτητη για

cis

αλληλεπίδραση με ephrin-Α3 ή αν το είδος φιμπρονεκτίνης III επαναλήψεις είναι επαρκείς για να μεσολαβήσουν

cis

δεσμευτική [18,23] , εμείς παροδικά επιμολυσμένα ΗΕΚ293 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά mCherry-εφρίνης-A3 με πλασμίδια που κωδικοποιούν EphA3 ΔΝ (κολοβωμένη μορφή EphA3 που στερείται το Ν τερματικό τομέα δέσμευσης συνδέτη και πλούσια σε κυστεΐνη περιοχή) ή πλήρους μήκους EphA3. Σε πειράματα Συνανοσοκατακρήμνιση με ένα αντι-EphA3 αντίσωμα που αναγνωρίζει το Ο-τερματική περιοχή του υποδοχέα, ανιχνεύσαμε συνδέσμου εφρίνης-A3 με τόσο πλήρους μήκους και αποκομμένες EphA3 (Σχήμα 3Α). Αυτό επιβεβαιώνει ότι ο τομέας EphA3 σύνδεσης συνδετήρα, η οποία μεσολαβεί δεσμευτικός υψηλή συγγένεια

trans

, δεν είναι απαραίτητο για EphA3-εφρίνης-A3

cis

αλληλεπίδραση. κύτταρα

(Α) ΗΕΚ AD-293 μολύνθηκαν με φακοϊό κωδικοποιεί mCherry-εφρίνης-A3 ή mCherry ως μάρτυρας. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με πλασμίδια που κωδικοποιούν πλήρους μήκους EphA3 ή μια περικομμένη μορφή που δεν έχει την περιοχή σύνδεσης προσδέματος και πλούσια σε κυστεΐνη περιοχή (EphA3 ΔΝ). ανοσοϊζήματα EphA3 ανιχνεύθηκαν με αντι-εφρίνης-A3 αντιορό και ξαναϊχνηθετούνται για EphA3, αποκαλύπτοντας ότι συνδέσμου εφρίνης-A3 με EphA3 δεν απαιτεί την περιοχή EphA3 σύνδεσης συνδετήρα. Το ιστόγραμμα δείχνει κανονικοποιημένες μέσο ± SE ποσοτικοποιηθεί από τα ανοσοαποτυπώματα από 2 πειράματα. p & gt? 0.05 από ένα δείγμα t test για τη σύγκριση των ephrin-Α3 δεσμεύονται να EphA3 ΔΝ ή πλήρους μήκους EphA3. κύτταρα (Β) ΗΕΚ AD-293 έχουν μολυνθεί με ένα φακοϊό κωδικοποιεί mCherry-εφρίνης-A3, το μεταλλαγμένο mCherry-εφρίνης-A3 E129K, ή mCherry ως μάρτυρας, επιμολύνθηκαν με ένα πλασμίδιο που κωδικοποιεί EphA3 ΔΝ. ανοσοϊζήματα EphA3 διερευνήθηκαν για ephrin-Α3 και ξαναϊχνηθετούνται για EphA3, αποκαλύπτοντας ότι η μετάλλαξη E129K δεν καταργεί το

cis

αλληλεπίδραση με EphA3. Το ιστόγραμμα δείχνει κανονικοποιημένες μέσο ± SE ποσοτικοποιηθεί από 3 ανοσοστυπώματα. p & gt? 0.05 από ένα δείγμα δοκιμής t για τη σύγκριση των εφρίνης-A3 E129K έναντι άγριου τύπου εφρίνης-A3 συνδέεται προς EphA3 ΔΝ. κύτταρα (C) ΗΕΚ AD-293 μορφομετατράπηκαν με pcDNA3 ελέγχου, pcDNA3-εφρίνης-Α3, ή pcDNA3-εφρίνης-A3 E129K. Το ιστόγραμμα δείχνει μέσα από δύο πειράματα για την πρόσδεση του EphA3 AP προς Ephrin-A3, επιβεβαιώνοντας ότι μεταλλαγμένο εφρίνης-A3 E129K δεν δεσμεύεται EphA3 σε

trans

. *** Ρ & lt? 0.001 με μονόδρομη ANOVA και δοκιμή του Dunnett post-hoc για τη σύγκριση με τα κύτταρα που εκφράζουν άγριου τύπου εφρίνης-A3. Η ανοσοκηλίδα δείχνει την έκφραση εφρίνης-A3 και ephrinA3 E129K στις λωρίδες φορτώθηκαν με ίσες ποσότητες των συνολικών προϊόντων λύσης. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι εφρίνης-A3 υπερεκφράζεται σε κύτταρα ΗΕΚ δίδει δύο ζώνες, με το άνω ζώνη που αντιστοιχεί στο μέγεθος της ώριμης πρωτεΐνης πλήρους μήκους.

Η

Για να διερευνηθεί η επίδραση της μεταλλάσσοντας το GH ephrin βρόχος, εξετάσαμε την μετάλλαξη E129K σε εφρίνης-A3. Αυτή η μετάλλαξη δεν εμπόδισε το

cis

ένωση ephrin-Α3 με EphA3 ΔΝ (Εικόνα 3Β), έστω και αν καταργηθεί το

trans

αλληλεπίδραση με EphA3 ΑΡ (Σχήμα 3C). Αυτά τα αποτελέσματα συμφωνούν με εκείνα που ελήφθησαν με το αντίστοιχο μεταλλαγμένο εφρίνης-A5 E129K, η οποία μπορεί επίσης ακόμα εξασθενήσει μέσω

cis

αλληλεπίδραση φωσφορυλίωση EphA3 καθώς EphA μεσολάβηση κατάρρευση κώνου ανάπτυξης και την καθοδήγηση νευράξονα ενεργοποιείται από προσδέματα εφρίνης-Α στο

trans

[18,20]. Ως εκ τούτου, EphA3 και εφρίνης-Α3 μπορεί να συνδέσει μεταξύ τους, ακόμα και όταν λείπουν οι περιοχές που μεσολαβούν υψηλή δεσμευτικός ως προς όλα συγγένεια

trans

, υποστηρίζοντας τη γενική συμμετοχή στο

cis

αλληλεπιδράσεις του Εφεσ φιμπρονεκτίνης τύπου III τομείς και μια περιοχή εφρίνης διακριτή από το βρόχο GH.

μετάλλαξη Ο καρκίνος του πνεύμονα EphA3 G518L ενισχύει cis αλληλεπίδραση με συνεκφράζονται ephrin-A3

μελέτες Πρόσφατες αλληλουχίας έχουν εντοπίσει μεταλλάξεις EphA3 στον καρκίνο του πνεύμονα και άλλους καρκίνους, και λειτουργικό χαρακτηρισμό αποκάλυψε ότι πολλοί είναι ζημιογόνων του λειτουργίας μεταλλάξεων που αναστέλλουν την σύνδεση δραστικότητα κινάσης εντοπισμό επιφανείας κυττάρου εφρίνης, και /ή, υποδηλώνοντας ένα ρόλο καταστολέα όγκων για άγριου τύπου EphA3 [14,15,29]. Μία από τις λίγες μεταλλάξεις που δεν βρέθηκαν σε κίνδυνο κάποια από τις ιδιότητες EphA3 εξετάζονται σε προηγούμενη μελέτη, αλλά μάλλον αυξήθηκε ελαφρά επιφάνεια EphA3 κυτταρική εντόπιση, είναι η μετάλλαξη G518L στον τομέα δεύτερο ινωδονεκτίνης τύπου III [14]. Από G518 στην EphA3 αντιστοιχεί σε ένα συντηρημένο κατάλοιπο που στην κρυσταλλική δομή EphA2-εφρίνης-Α5 συμμετέχει στο

cis

interface, εξετάσαμε αν η μετάλλαξη G518L θα μπορούσε να επηρεάσει το

cis

ένωση EphA3 με συνεκφράστηκε εφρίνης-A3. Να επικεντρωθεί στο ρόλο του cis αλληλεπίδρασης, χρησιμοποιήσαμε EphA3 ΔΝ ή το μεταλλαγμένο EphA3 ΔΝ G518L. Πειράματα Συνανοσοκατακρήμνιση χρησιμοποιώντας κύτταρα ΗΕΚ293 συνεκφράζουν mCherry-εφρίνης-A3 με EphA3 ΔΝ ή του μεταλλαγμένου ΔΝ G518L αποκάλυψε περισσότερο εφρίνης-A3 που συνδέονται με το μεταλλαγμένο (Σχήμα 4Α). Μέτρηση της εφρίνης-A5 AP πρόσδεση επαλήθευσε ότι εφρίνης-A3 συν-έκφραση με την πλήρους μήκους EphA3 G518 μεταλλαγμένο ανέστειλε την ικανότητά της να δεσμεύει εφρινών σε trans (Σχήμα 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η μετάλλαξη G518L ενισχύει δεσμευτικός ως προς όλα EphA3-ephrin

cis

και υποστηρίζει τη συμμετοχή στο

cis

διασύνδεση του διατηρημένου γλυκίνης στον τομέα δεύτερο ινωδονεκτίνης τύπου III [23].

κύτταρα

(Α) ΗΕΚ AD-293 μολύνθηκαν με φακοϊό κωδικοποιεί mCherry-εφρίνης-A3 ή mCherry ως μάρτυρας. Τα κύτταρα στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με EphA3 ΔΝ ή του μεταλλαγμένου EphA3 ΔΝ G518L. ανοσοϊζήματα EphA3 ανιχνεύθηκαν με έναν αντιορό αντι-ephrinA3 και ξαναϊχνηθετούνται για EphA3. Η EphA3 G518L μετάλλαξη βρέθηκε σε καρκίνο του πνεύμονα αυξάνει τη συγγένεια της πλευρικής αλληλεπίδρασης μεταξύ EphA3 και εφρίνης-A3. Το ιστόγραμμα δείχνει κανονικοποιημένες μέσο ± SE ποσοτικοποιηθεί από τα ανοσοαποτυπώματα από 3 πειράματα. * Ρ & lt? 0.05 από ένα δείγμα δοκιμής t για τη σύγκριση της μεταλλαγμένης EphA3 ΔΝ G518 έναντι EphA3 ΔΝ. (Β) κύτταρα καρκίνου πνεύμονα Α549 μολύνθηκαν με φακοϊό κωδικοποιεί EphA3 άγριου τύπου ή του μεταλλαγμένου G518L και ZsGreen μόνο του ή μαζί με ένα φακοϊό κωδικοποιεί mCherry-εφρίνης-A3? κύτταρα ελέγχου μολύνθηκαν με φακοϊούς κωδικοποίηση ZsGreen και mCherry. Το ιστόγραμμα δείχνει δέσμευσης κυττάρων της εφρίνης-A3 ΑΡ (ένα πείραμα) και εφρίνης-A5 ΑΡ (2 πειράματα), επιβεβαιώνοντας ότι η συνέκφραση εφρίνης-A3 αποτρέπει την δέσμευση των πρωτεϊνών εφρίνης AP στο μεταλλαγμένο EphA3 G518L. Οι κανονικοποιημένες μέσα από 3 πειράματα (το καθένα με διπλά δείγματα) ± SE εμφανίζεται. *** Ρ & lt? 0.001 με μονόδρομη ANOVA και τεστ post-hoc Tukey για τη σύγκριση των κυττάρων που συνεκφράζουν EphA3 και εφρίνης-A3 με κύτταρα που εκφράζουν μόνο EphA3 και για τη σύγκριση των κυττάρων που συνεκφράζουν EphA3 G518L και εφρίνης-A3 με κύτταρα μόνο που εκφράζουν EphA3 G518L. Το ανοσοστύπωμα των κυτταρικών λυμάτων δείχνει την έκφραση του EphA3, εφρίνης-A3, και β-τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Ephrin-B2 συνέκφραση σε καρκινικά κύτταρα εξασθενίζει όχι μόνο EphB4 αλλά επίσης EphA3 ενεργοποίησης και ειδικοί της δεσμευτική ικανότητα σε trans

Κις

αλληλεπιδράσεις μεταξύ του τύπου φιμπρονεκτίνης Εφ III τομείς και εφρινών θα μπορούσε να έχει διακριτικό επιλεκτικότητα σε σύγκριση με το

trans

αλληλεπιδράσεις που αφορούν τον τομέα και η Εφεσ σύνδεσης συνδετήρα ephrin GH βρόχο [23]. Για να διερευνηθεί αυτό, χρησιμοποιήσαμε εφρίνης-Β2, η οποία δεν συνδέονται με υψηλή συνάφεια με τον τομέα EphA3 σύνδεσης συνδετήρα [25]. Εμείς μολυνθεί Α549 πνεύμονα καρκινικά κύτταρα και MCF7 κύτταρα καρκίνου του μαστού με ένα φακοϊό κωδικοποίηση ephrin-Β2 συγχωνευμένο με EGFP και πρώτα εξέτασε τις επιπτώσεις στην ενδογενή EphB4, η οποία συνδέεται με τον συνδετήρα ephrin-Β2 στο

trans

. Όπως EphA2, EphB4 εκφράζεται ευρέως σε καρκινικά κύτταρα [1,30] και την ικανότητά της να ρυθμίζεται από εφρινών σε

cis

δεν εξετάστηκε προηγουμένως. Βρήκαμε ότι η έκφραση εφρίνης-B2 αναστέλλει τη δέσμευση του εφρίνης-B2 ΑΡ στην επιφάνεια του κυττάρου (Σχήμα 5Α) και η φωσφορυλίωση τυροσίνης EphB4 επάγεται σε

trans από

εφρίνης-B2 Fc (Σχήμα 5Β). Έτσι,

cis

αλληλεπίδραση με συνεκφράζονται ephrin-Β2 αναστέλλει τη σύνδεση στο

trans

και την ενεργοποίηση των καρκινικών κυττάρων συνδέτη EphB4. Για να εξεταστεί αν EphA3 μπορεί επίσης να ρυθμίζεται από

cis

αλληλεπίδραση με εφρίνης-B2, μολύναμε Α549 καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων που εκφράζουν EphA3 με φακοϊούς κωδικοποιούν EGFP-εφρίνης-B2 ή μόνο EGFP σαν ένας έλεγχος. Είναι ενδιαφέρον ότι, εφρίνης-B2 συνέκφραση εξασθενημένο ενεργοποίηση EphA3 με εφρίνης-A3 Fc (Σχήμα 5C) και ανέστειλαν την ικανότητα του να δεσμεύει EphA3 εφρίνης-A5 AP χωρίς μείωση των συνολικών επιπέδων EphA3 (Εικόνα 5D). έκφραση EphA3 μόνο ελαφρώς αυξημένη η δέσμευση της εξωκυτταρικής περιοχής του εφρίνης-B2 AP στα κύτταρα (Σχήμα 5D), επιβεβαιώνοντας ότι εφρίνης-Β2 δεν δεσμεύει αποτελεσματικά να EphA3 σε

trans

[25]. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι αν και ephrin-Β2 δεν είναι ένα πρόσδεμα ενεργοποίησης για EphA3, μπορεί να επηρεάσει EphA3 λειτουργία μέσω

cis

αλληλεπίδραση. Αυτό σημαίνει ότι οι δεσμευτικές ιδιαιτερότητες που διέπουν

cis

και

trans

Εφεσ αλληλεπιδράσεις υποδοχέα-ephrin δεν είναι το ίδιο.

(Α) Το ιστόγραμμα δείχνει την πρόσδεση της εφρίνης-B2 AP σε κύτταρα Α549 μολύνθηκαν με φακοϊούς κωδικοποιούν EGFP-εφρίνης-B2 ή EGFP, αποκαλύπτοντας ότι εφρίνης-B2 συνέκφραση αναστέλλει εφρίνης-B2 AP σύνδεση προς EphB4. Οι κανονικοποιημένες μέσα από 3 πειράματα (το καθένα με δείγματα εις τριπλούν) ± SE εμφανίζεται. *** Ρ & lt? 0.001 από ζευγαρωμένο t τεστ για τη σύγκριση των κυττάρων που εκφράζουν εφρίνης-Β2 με κύτταρα που δεν εκφράζουν εφρίνης-B2. Το ανοσοστύπωμα των κυτταρικών λυμάτων δείχνει την έκφραση του EphB4, εφρίνης-B2 και β-τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) Α549 πνεύμονα καρκινικά κύτταρα και MCF7 κύτταρα καρκίνου μαστού μολύνθηκαν με φακοϊούς κωδικοποιούν EGFP-εφρίνης-B2 ή EGFP. ανοσοϊζήματα EphB4 ανιχνεύθηκαν με ανοσοστύπωμα για φωσφοτυροσίνης (ΡΤγτ) και ξαναϊχνηθετούνται για EphB4. Κυτταρολύματα ανιχνεύτηκαν για εφρίνης-B2 με ένα αντίσωμα αντι-ΕΟΡΡ και για β-τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης. Τα ιστογράμματα δείχνουν κανονικοποιημένες μέσο ± SE ποσοτικοποιηθεί από 2 ανοσοστυπώματα για κάθε κυτταρική γραμμή. * Ρ & lt? 0.05 από ένα δείγμα δοκιμής t για τη σύγκριση των εφρίνης-B2 κύτταρα Fc επεξεργασμένα εκφράζουν εφρίνης-Β2 με κύτταρα που δεν εκφράζουν εφρίνης-B2. (C) Τα κύτταρα Α549 μολύνθηκαν με φακοϊό κωδικοποιεί EphA3 και ZsGreen μαζί με ένα φακοϊό κωδικοποιεί ΕΟΡΡ- εφρίνης-B2 ή μόνο EGFP. Κύτταρα ελέγχου μολύνθηκαν με φακοϊούς κωδικοποιεί ZsGreen και EGFP. ανοσοϊζήματα EphA3 ανιχνεύθηκαν με ανοσοστύπωμα για φωσφοτυροσίνης (ΡΤγτ) και ξαναϊχνηθετούνται για EphA3. Τα λύματα ανιχνεύθηκαν για εφρίνης-B2 με ένα αντίσωμα αντι-ΕΟΡΡ, καθώς και για EphA3 και για β-τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης. Το ιστόγραμμα δείχνει κανονικοποιημένες μέσο ± SE ποσοτικοποιηθεί από 2 ανοσοστυπώματα. * Ρ & lt? 0.05 από ένα δείγμα δοκιμής t για τη σύγκριση των εφρίνης-A3 Fc-επεξεργασμένα κύτταρα που εκφράζουν εφρίνης-Β2 με κύτταρα που δεν εκφράζουν εφρίνης-B2. (D) Ephrin-A5 AP πρόσδεση σε κυτταρική επιφάνεια EphA3 αναστέλλεται με εφρίνης-B2 συνέκφραση. Το ιστόγραμμα δείχνει μέσο ± SE από 3 πειράματα (το καθένα με δείγματα εις τριπλούν) για την πρόσδεση του εφρίνης-A5 AP ή εφρίνης-B2 AP στα κύτταρα Α549 χρησιμοποιήθηκαν για το πείραμα σε C. Για την πρόσδεση εφρίνης-Α5, ** ρ & lt? 0,01 με μονόδρομη ANOVA και post-hoc τεστ Dunnett για τη σύγκριση με τα κύτταρα που εκφράζουν EphA3 και EGFP? για εφρίνης-B2 AP δέσμευσης, ** ρ & lt? 0.01 με ζευγαρωμένο t τεστ για τη σύγκριση των κυττάρων που εκφράζουν ή που δεν εκφράζουν EphA3. Το ανοσοστύπωμα των κυτταρικών λυμάτων δείχνει έκφραση του εφρίνης-B2, EphA3 και β-τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης, εξακρίβωση ότι η εφρίνης-B2 συνέκφραση δεν μειώνει τα επίπεδα EphA3. Αξίζει να σημειωθεί ότι η διπλή αντιστοιχεί σε υπερεκφράζεται εφρίνης-Β2 δεν οφείλεται σε διαφορετικούς βαθμούς Ν-συνδεδεμένη γλυκοζυλίωση επειδή απομάκρυνση των Ν-συνδεδεμένων ολιγοσακχαριτών με την ΡΝΟάση-F ενδογλυκοσιδάση παρομοίως αύξησε την κινητικότητα SDS-PAGE των δύο συγκροτημάτων (δεν φαίνεται). Είτε η ανώτερη ζώνη μπορεί να αντιπροσωπεύει μια φόρμα με Ο-συνδεδεμένων ολιγοσακχαριτών [51] ή άλλων μετα-μεταφραστική τροποποίηση μένει να καθοριστεί.

Η

Η ενδογενής εφρίνης-As εξασθενούν ενεργοποίηση συνεκφράζονται EphA2 στα καρκινικά κύτταρα

Για να διερευνηθεί αν εφρινών ενδογενώς εκφράζονται σε καρκινικά κύτταρα μπορούν επίσης να συμμετάσχουν σε

cis

αλληλεπιδράσεις που αναστέλλουν την ενεργοποίηση των συνεκφράζονται ενδογενών υποδοχέων Eph, επιλέξαμε τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού SKBR3 και MCF7. Αυτές οι γραμμές εκφράζουν υψηλά επίπεδα συνδετήρων εφρίνης-Α μαζί με EphA2 [11] (broadinstitute.org/ccle), αν και ο υποδοχέας εκφράζεται σε σχετικά χαμηλά επίπεδα, σύμφωνα με την συμπληρωματική έκφραση των υποδοχέων Eph και εφρινών παρατηρείται σε πολλές καρκινικές κυτταρικές γραμμές [1]. Δεδομένου ότι τόσο SKBR3 και MCF7 κύτταρα εκφράζουν πολλαπλούς συνδετήρες εφρίνης-Α, οι οποίες είναι ΟΡΙ-αγκυροβολημένα, χρησιμοποιήσαμε το ένζυμο φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης-ειδική φωσφολιπάση C (PI-PLC) για την απομάκρυνση όλων των εφρίνης-As από την κυτταρική επιφάνεια. Σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, η αφαίρεση της ενδογενούς εφρίνης-As από την κυτταρική επιφάνεια ως αποτέλεσμα την αυξημένη ενεργοποίηση EphA2 με εφρίνης-A1 Fc σε

trans

σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 6 Α, Β). Αντίθετα, η θεραπεία ΡΙ-PLC ελέγχου κυττάρων Ρο-αγωγή μείωσε την χαμηλή ενεργοποίηση βασική EphA2, υποδηλώνοντας ότι η ενδογενής εφρίνης-Όπως μπορεί να προκαλέσει κάποια ενεργοποίηση EphA2. Από εφρίνης-Α1 έχει αναφερθεί να διασπαστεί από την επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων με μεταλλοπρωτεάσες μήτρας, υποβάλλαμε σε αγωγή επίσης κύτταρα SKBR3 με την ευρέως φάσματος αναστολέα μεταλλοπρωτεάσης μήτρας GM-6001 [4,6,31]. Η θεραπεία με τον αναστολέα επί 24 ώρες αυξήθηκε περαιτέρω κυτταρικής επιφάνειας που σχετίζονται εφρίνης-Α1. Ωστόσο, αυτό δεν επηρέασε ουσιαστικά την EphA2 φωσφορυλίωση τυροσίνης που προκαλείται από ephrin-Α1 Fc δεσμευτικός ως προς

trans

, πιθανόν να οφείλεται στο ήδη υψηλό

cis

αναστολή από τα υψηλά επίπεδα της εφρίνης-Α1 παρόντες ακόμη και σε η απουσία του GM-6001. Έτσι, στα καρκινικά κύτταρα

cis

αλληλεπίδραση με ενδογενείς συνδέτες εφρίνης-Α μπορεί να μετριάσει την ενεργοποίηση EphA2 από ephrin-Όπως παρουσιάζεται στο

trans

, υποστηρίζοντας τη σημασία του

cis

αλληλεπιδράσεις καρκίνος παθογένεση.

(Α) SKBR3 και (Β) κύτταρα καρκίνου του μαστού MCF7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΡΙ-ΡΕΟ επί 4 ώρες και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με εφρίνης Α1-Ρο. ανοσοϊζήματα EphA2 ανιχνεύθηκαν με ανοσοστύπωμα για φωσφοτυροσίνης (ΡΤγτ) και ξαναϊχνηθετούνται για EphA2. Τα υλικά λύσεως ανιχνεύθηκαν με αντι-εφρίνης-Α1 αντισώματος επαληθεύει την απομάκρυνση των ephrin-Όπως με PI-PLC? β-τουμπουλίνης επαληθεύει ίση φόρτωση των λωρίδων. Το σύστημα Οδύσσεια LI-COR χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση και οι έγχρωμες εικόνες μετατρέπονται σε αποχρώσεις του γκρι με το Photoshop. Τα ιστογράμματα δείχνουν τα κανονικοποιημένα δεδομένα από 3 διαφορετικά πειράματα * ρ & lt? 0,05 και *** ρ & lt? 0.001 από ένα δείγμα δοκιμής t για τη σύγκριση των εφρίνης Α1-Ρο-διεγερμένα κύτταρα που κατεργάζονται ή όχι με PI-PLC. κύτταρα (C) SKBR3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΡΙ-ΡΕΟ όπως στο Α ή με το ευρέως φάσματος αναστολέα μεταλλοπρωτεάσης μήτρας GM-6001 για 24 ώρες. Ανοσοϊζήματα και λύματα ανιχνεύθηκαν όπως υποδεικνύεται.

Η

Συζήτηση

Διαφορετικές οικογένειες των υποδοχέων και η επιφάνεια που σχετίζεται με συνδέτες κελί που μαζί μεσολαβούν σήματα juxtacrine αλληλεπιδρώντας στο

trans

σε όλη την κυττάρου-κυττάρου διασταυρώσεις μπορούν επίσης, όταν συν-εκφράζονται στο ίδιο κυτταρική επιφάνεια, αλληλεπιδρά πλευρικά σε

cis

[32]. Αυτές

cis

αλληλεπιδράσεις, οι οποίες έχουν ως επί το πλείστον μελετηθεί στο νευρικό σύστημα και το ανοσοποιητικό σύστημα, συνήθως εξασθενούν τα σήματα που προκλήθηκε από τις

trans

αλληλεπιδράσεις μέσω μηχανισμών που σε πολλές περιπτώσεις δεν είναι καλά κατανοητές [ ,,,0],32-34]. Πρόσφατες μελέτες έχουν αποκαλύψει βασικούς λειτουργικούς ρόλους για ανασταλτική

cis

αλληλεπιδράσεις μεταξύ Eph υποδοχέων και συνδετήρων ephrin συνεκφράζονται σε νευρώνες [17-21].