Αφηρημένο

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα είναι η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σε όλο τον κόσμο, χωρίς ικανοποιητική θεραπεία μέχρι σήμερα. Σε αυτή τη μελέτη, εξετάσαμε αν η συνδυασμένη αναστολή της κυκλοοξυγενάσης-2 (COX-2) και της κατηγορίας Ι αποακετυλάσης ιστόνης (HDAC) μπορεί καταλήγει σε ένα καλύτερο έλεγχο του πόρου αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος. Ο αντίκτυπος της ταυτόχρονης HDAC και COX-2 αναστολή στην ανάπτυξη των κυττάρων, αξιολογήθηκε η απόπτωση και κυτταρικό κύκλο πρώτο

in vitro

επί ανθρώπινο πάγκρεας BxPC-3, PANC-1 ή CFPAC-1 κύτταρα κατεργασμένα με χημικούς αναστολείς ( SAHA, MS-275 και celecoxib) ή HDAC1 /2 /7.3 siRNA. Για να ελεγχθεί η δυνητική αντικαρκινική δραστηριότητα αυτού του συνδυασμού

in vivo

, έχουμε αναπτύξει και χαρακτηριστεί, ένα μοντέλο όγκου χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης νεοσσού εκλεπτυσμένη ότι ιστολογικά και proteomically μιμείται την ανθρώπινη παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα. Ο συνδυασμός των HDAC1 /3 και η αναστολή της COX-2 εξασθενημένη σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των BxPC-3 κύτταρα

in vitro

και στασιμότητα εντελώς την ανάπτυξη του όγκου BxPC-3 κύτταρα επί της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης

in vivo

. Ο συνδυασμός ήταν πιο αποτελεσματικό από οποιοδήποτε φάρμακο χρησιμοποιείται μόνο του. Σταθερά, δείξαμε ότι οι δύο HDAC1 και αναστολή HDAC3 προκάλεσε την έκφραση της COX-2 μέσω του μονοπατιού ΝΡ-κΒ. Τα δεδομένα μας καταδεικνύουν, για πρώτη φορά σε ένα παγκρεατικό πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) μοντέλο, ένα σημαντικό δράση των HDAC και αναστολείς COX-2 στην κυτταρική ανάπτυξη του καρκίνου, η οποία ορίζει τη βάση για την ανάπτυξη των εν δυνάμει αποτελεσματικά νέα συνδυαστική θεραπείες για πόρου αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος ασθενείς

Παράθεση:. Peulen O, Γκονζάλες Α, Peixoto P, Turtoi Α, Mottet D, Delvenne P, et al. (2013) Η αντι-όγκου Επίδραση της HDAC αναστολή σε ένα ανθρώπινο πάγκρεας Καρκίνος Μοντέλο βελτιώνεται σημαντικά με την ταυτόχρονη αναστολή της κυκλοοξυγενάσης 2. PLoS ONE 8 (9): e75102. doi: 10.1371 /journal.pone.0075102

Επιμέλεια: Γκύντερ Schneider, Τεχνικό Πανεπιστήμιο του Μονάχου, Γερμανία

Ελήφθη: 7 Μαΐου 2013? Αποδεκτές: 12 Αυγ 2013? Δημοσιεύθηκε: 11 του Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Peulen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ταμείο το Βέλγιο για την Επιστημονική Έρευνα (https://www.frs-fnrs.be) και Télévie? το Κέντρο Καταπολέμησης Cancéreux près de l’Université de Liège (https://www.cac.ulg.ac.be). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. A. Gonzalez είναι υπότροφος Télévie. Α Turtoi και Δ Mottet είναι αντίστοιχα Μεταδιδακτορικός Ερευνητής και Επιστημονικός Συνεργάτης στο Εθνικό Ταμείο του Βελγίου για την Επιστημονική Έρευνα

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνιστικά συμφέροντα υπάρχουν

Εισαγωγή

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) λίστες από τα πιο θανατηφόρα μορφή καρκίνου [1]. Νωρίς-στάδιο της νόσου είναι κλινικά σιωπηλή και η διάγνωση της νόσου γίνεται ως επί το πλείστον σε προχωρημένο στάδιο. Αυτή η καθυστερημένη διάγνωση συμβάλλει σε ένα από τα χαμηλότερα ποσοστά επιβίωσης 5 ετών (μόλις 3%) [2]. Σήμερα PDAC αντιμετωπίζονται με χειρουργική επέμβαση και /ή συμπληρωματική θεραπεία με γεμσιταβίνη, αυξάνοντας μόνο ελαφρώς την μέση επιβίωση των ασθενών. Υπάρχει, επομένως, επιτακτική ανάγκη για την ανάπτυξη νέων αποτελεσματικών θεραπειών για ασθενείς PDAC.

Υπάρχουν άφθονα στοιχεία που δείχνουν ότι η απορρύθμιση των ιστονών ακετυλίωση συμβάλλει στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του παγκρέατος [3]. αποακετυλασών ιστόνης (HDAC) αντιπροσωπεύουν μια οικογένεια ενζύμων που ρυθμίζουν ύψιστης κυτταρικών δραστηριοτήτων συμπεριλαμβανομένων επιγενετική αποσιώπηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων και ρύθμιση των λειτουργιών πρωτεΐνης. Εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι η αναστολή HDAC εξασκεί αμφότερα τα αντι-καρκίνου και αντι-αγγειογένεσης δραστηριότητες [4] – [6]. έκφραση HDAC μεταβάλλεται σε PDAC, συμπεριλαμβανομένων HDAC1, HDAC2, HDAC3 και HDAC7 [7] – [10]. Προκλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι η αναστολή HDAC κατέχουν σημαντικό δυναμικό για την ανάπτυξη νέων αντικαρκινικών θεραπειών [11]. Συνεπώς, διάφοροι αναστολείς HDAC έχουν πρόσφατα εγκριθεί από την Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων για την αγωγή της δερματικό Τ-κυτταρικό λέμφωμα, ενώ νέα μόρια βρίσκονται σήμερα σε κλινικές μελέτες φάσης ΙΙΙ. Ωστόσο, όταν χρησιμοποιούνται σε μονοθεραπεία, οι αναστολείς HDAC έδειξαν περιορισμένη αποτελεσματικότητα σε διάφορες στερεές κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου PDAC [3], [12], [13]. Πράγματι, LAQ824 ή MS-275 έχει αξιολογηθεί σε κλινικές δοκιμές φάσης Ι σε στερεά καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων PDAC, χωρίς καμία αντικειμενική κλινική ανταπόκριση [14], [15]. Εναλλακτικά, οι αναστολείς HDAC έχουν χρησιμοποιηθεί σε στρατηγικές συνδυασμένη θεραπεία [16], [17], με ορισμένοι συνδυασμοί παράγει υποσχόμενες συνέπειες για την ανθρώπινη PDAC

in vitro

[18] – [21] ή σε πειραματικούς όγκους [22] . Δυστυχώς, τα αποτελέσματα αυτά δεν μεταφράζονται σε κλινικές δοκιμές [23], [24].

Η έλλειψη αποτελεσματικότητας των αναστολέων HDAC σε καρκίνο του παγκρέατος θα μπορούσε να συνδέεται με τις πλειοτροπικές δραστηριότητες των HDACs στην βιολογία κυττάρων [25], [26] οδηγεί σε ανεπιθύμητα αποτελέσματα προ-καρκίνου. Για παράδειγμα, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι οι αναστολείς HDAC παν-επάγουν κυκλοοξυγενάσης-2 (COX-2) έκφραση σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα, που οδηγεί σε διέγερση του πολλαπλασιασμού των ενδοθηλιακών κυττάρων [27]. Δεδομένου ότι η COX-2 έχει επίσης συνδέεται με τον πολλαπλασιασμό των παγκρεατικών κυττάρων καρκίνου [28] ή την ανάπτυξη του όγκου [29] – [31], υποθέσαμε ότι η COX-2 υπερέκφραση μπορεί επίσης να επάγεται σε PDAC όταν έλαβαν θεραπεία με αναστολείς HDAC, οδηγώντας σε μειωμένη απόδοση και ως εκ τούτου θεραπευτικής αποτυχίας.

για να δοκιμαστεί η βιολογική σημασία του συνδυασμού κατηγορίας Ι HDAC και αναστολείς COX-2

in vivo

, έχουμε επινοήσει μια χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης (CAM) μοντέλο εκλεπτυσμένη PDAC γκόμενα με βάση μας προηγούμενες εργασίες [32]. Το μοντέλο CAM έχει χρησιμοποιηθεί επιτυχώς με αρκετές κυτταρικές σειρές για την παραγωγή όγκων [33], [34]. Ομοίως με το μοντέλο ποντικού, οι περισσότερες βαθμίδες εξέλιξης του όγκου είναι ανακεφαλαιώνονται σε ένα πολύ σύντομο χρονικό διάστημα [35]. Προηγουμένως, BxPC-3 παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα που έχουν ήδη αποδειχθεί για να παράγουν αγγειοποιημένου 100 μm καιρό κόμβους του όγκου σε CAM [32]. Ωστόσο, το μικρό μέγεθος των όζων αντιπροσώπευε ένα σημαντικό περιορισμό για τις διαρθρωτικές παρατήρησης, ακριβή αξιολόγηση του όγκου και τη μελέτη της αποτελεσματικότητας του φαρμάκου. Εδώ, έχουμε δημιουργήσει και εφαρμόσει ένα εκλεπτυσμένο BxPC-3 PDAC μοντέλο που χαρακτηρίζει μια δραματική αύξηση (64 φορές) στο μέγεθος του όγκου και την εμφάνιση έκφρασης δομική αρχιτεκτονική και την πρωτεΐνη που μιμούνται την ανθρώπινη PDAC. Αυτό το μοντέλο αξιοποιήθηκε επιτυχώς να αποδείξουν ότι ο συνδυασμός της κατηγορίας Ι HDAC και αναστολείς COX-2 οδηγεί σε πλήρη αναστολή της ανάπτυξης του όγκου.

Υλικά και Μέθοδοι

Cells και χημικά

BxPC-3 (ATCC CRL-1687), PANC-1 (ATCC CRL-1469) και CFPAC-1 (ATCC CRL-1918) είναι ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές που προέρχονται αντίστοιχα από PDAC [36], το πάγκρεας καρκίνωμα αγωγός επιθηλιοειδή [37 ] και PDAC μετάσταση στο ήπαρ [38]. BxPC-3 ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο από τον καθηγητή Bikfalvi (Inserm u1029, Μπορντό, Γαλλία), Panc-1 ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο από τον καθηγητή Muller και Burtea (Εργαστήριο NMR, Πανεπιστήμιο της Μονς, Βέλγιο). CFPAC-1 αγοράστηκαν από την ATCC. Η celecoxib ελήφθη από το Πανεπιστήμιο Φαρμακευτικής (Kemprotec Ltd, Μίντλεσμπρο, UK). MS-275 και SAHA αγοράστηκαν από την Enzo Life Sciences (Antwerpen, Belgium). Τα άλλα χημικά αγοράστηκαν από την Sigma (Bornem, Belgium).

Κυτταροκαλλιέργεια

BxPC-3 ανθρώπινου παγκρεατικού καρκίνου του κυτταρική γραμμή διατηρήθηκε σε μέσο RPMI1640 συμπληρωμένο με γλυκόζη (2.5 g /L), νάτριο πυροσταφυλικό (1 mM) και FBS (10%). PANC-1 διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με FBS (10%). CFPAC-1 διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο του Dulbecco του Iscove με FBS (10%). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με το MS-275, celecoxib ή συνδυασμό και των δύο, καθώς και με το σουβεροϋλανιλιδο υδροξαμικό οξύ (SAHA) διαλυτοποιείται εντός μέσου με 0,1% DMSO.

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA μορφομετατροπή

HDAC-ειδική μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) συντέθηκαν με Eurogentec (Seraing, Βέλγιο). NF-kB p65 SMARTpool siRNA αγοράστηκαν από την Thermo Fisher-Dharmacon (Whaltham, ΜΑ). Lipofectamine μεσολάβηση επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν σε μία συγκέντρωση siRNA 40 ηΜ ακόλουθες συστάσεις του κατασκευαστή (Life Technologies, Carlsbad, ΝΜ). GL3 ήταν μια άσχετη λουσιφεράσης στόχευση siRNA. αλληλουχίες siRNA δημοσιεύτηκαν προηγουμένως [5].

Η κυτταρική ανάπτυξη

Ίσες πυκνότητες κύτταρα σπάρθηκαν σε πλήρες μέσο και συλλέχθηκαν στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία. Οι αριθμοί κυττάρων καθορίζεται έμμεσα με τη χρήση ενσωμάτωση Hoechst. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως περιεχόμενο DNA.

Western-blotting

BxPC-3 κύτταρα ή κατεψυγμένα όγκοι διασπάστηκαν σε ρυθμιστικό λύσης (1% SDS, 40 mM Tris-HCl ρΗ 7.5) στο παρουσία αναστολέων πρωτεάσης και φωσφατάσης. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE (6-12,5%) και στη συνέχεια electrotransfered σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Μετά πρωτογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: αντι-COX-2 (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI), αντι-HDAC1 (Cell σηματοδότηση, Danvers, ΜΑ), αντι-HDAC2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), αντι-HDAC3 (Cell σηματοδότηση Danvers, ΜΑ), αντι-ακετυλιωμένης ιστόνης-3 (Millipore, Billerica, ΜΑ), αντι-HDAC7 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), αντι-φωσφο-IkBα (Cell σηματοδότηση Danvers, ΜΑ ), αντι-p65 (κυτταρική σηματοδότηση, Danvers, ΜΑ), αντι-ρ21 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), αντι-p27 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), αντι-pRB (BD Biosciences, Franklin Lakes , NJ), αντι-E2F1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), αντι-ΜΕΚ2 (κυτταρική σηματοδότηση, Danvers, ΜΑ), αντι-Orc2 (κυτταρική σηματοδότηση, Danvers, ΜΑ), αντι-κασπάση-3 (σηματοδότηση κυττάρων , Danvers, ΜΑ) και αντι-HSC70 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Ανοσοανίχνευση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κατάλληλο δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας.

ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR

Σύνολο RNA εκχύλιση και ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [39] . έκφραση Ανθρώπινη COX-2 ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας μία εμπορική δοκιμασία TaqMan RT-qPCR (Hs00153133-Μ1? Applied Biosystems, Carlsbad, ΝΜ). έκφραση ανθρώπινης IL-8 ανιχνεύτηκε χρησιμοποιώντας ειδικό προς τα εμπρός (5′-GAAGGAACCATCTCACTGTGTGTAA-3 ‘) και ανάστροφα (5′-ATCAGGAAGGCTGCCAAGAG-3’) συντίθεται με εκκινητές Eurogentec (Seraing, Βέλγιο).

αννεξίνης V /προπίδιο ιωδιούχο χρώση

κύτταρα αποπτωτικά προσδιορίστηκαν με αννεξίνη V-FITC και μη ζωτικής ιωδιούχο βαφή προπιδίου (ΡΙ) χρώση με κιτ ανίχνευσης απόπτωσης FITC-Annexin V I (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) σύμφωνα με το τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε σε ένα FACSCalibur ™ II και τα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό CellQuest ™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ).

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Το σχετικό ποσοστό των κυττάρων σε κάθε στάδιο του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33] με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής με πρόγραμμα FACSCalibur ™ II και ModFit LT ™.

η ανάπτυξη του όγκου σε CAM

γονιμοποιημένα αυγά κότας άνοιξαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Στις μετα-γονιμοποίηση ημέρα 11, επιφάνεια CAM απαλά γδαρμένο με μια βελόνα και 3,5 × 10

6 BxPC-3, PANC-1 ή κυττάρων CFPAC-1 σε αιώρημα με 50% Matrigel σε τελικό όγκο 100 μL μεταμοσχεύθηκαν επί της CAM που περικλείεται από ένα πλαστικό δακτύλιο 6-mm. Η ημέρα εμφύτευσης θεωρήθηκε ως ημέρα 0 της ανάπτυξης του όγκου. Drugs (celecoxib 8 μΜ ή /και MS-275 0.2 μΜ σε 30 μΙ τελικός όγκος) εφαρμόσθηκαν καθημερινά απευθείας επί του όγκου αρχίζοντας την ημέρα 2. Την ημέρα 7, οι όγκοι αποκόπηκαν από το CAM και ελήφθησαν ψηφιακές φωτογραφίες με τη χρήση ενός στερεοσκοπικού μικροσκοπίου . Ο όγκος του όγκου υπολογίσθηκε με τη χρήση ενός ελλειψοειδούς τύπου: Όγκος = (4 × πxZ

1 × Z

2 × Z

3) /3 όπου το Ζ

1-3 είναι η κύρια ακτίνα του όγκου.

Ηθική δήλωση

Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Μέριμνας ζώων του Πανεπιστημίου της Λιέγης (έγκριση # 1278).

διαδικασία Ιστολογίας

BxPC -3 όγκοι πλύθηκαν σε PBS και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 30 λεπτά στους 4 ° C. Οι όγκοι ενσωματωμένα σε παραφίνη και 5 μm τομές βάφτηκαν με αιματοξυλίνη-ηωσίνη ή τριχρωματική μέθοδος του Masson.

Immunoperoxydase και Schiff (PAS) χρώση αμυλάση περιοδικών οξύ διεξήχθησαν στις 5 μm τομές, αντιστοίχως, με το σημείο αναφοράς XT IHC /ISH αυτοματοποιημένη χρώσης και η NexES Special Stains (Ventana Medical Systems Inc, Tucson, AZ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: αντι-κυτοκερατίνης 7 (CK7 – Dako, Glostrup, Δανία), αντι-κυτοκερατίνης 19 (CK19 – Roche Diagnostics, Vilvoorde, Βέλγιο), αντι-κυτοκερατίνης 20 (ΟΚ20 – Dako, Glostrup, Δανία), αντι- CD56 (Novocastra, Leica Microsystem Inc, Buffalo Grove, IL), αντι-καρκινοεμβρυονικού αντιγόνου (CEA – Roche Diagnostics, Vilvoorde, Βέλγιο), αντι-Κί67 (Dako, Glostrup, Denmark), αντι-λανθάνουσα πρωτεΐνη δέσμευσης ανάπτυξης μετασχηματισμού παράγοντα-βήτα 2 (LTBP2 – Santa Cruz Biotchnology, Santa Cruz, CA), αντι-αυξητικού παράγοντα μεταμόρφωσης βήτα-επαγώμενη (TGFBI – Σηματοδότηση Cell, Danvers, ΜΑ), αντι-myoferlin (Sigma, Bornem, Βέλγιο) και αντι-δεσμίνης (Dako, Glostrup, Denmark) χρησιμοποιήθηκαν για την πρωτογενή αντίδραση.

Κί67 ποσοτικοποίηση πραγματοποιήθηκε σε τυχαία λαμβάνονται εικόνες (3 εικόνες από κάθε όγκο, 3 όγκων σε κάθε πειραματική ομάδα). Μετά την διάσπαση του καναλιού, μπλε εικόνες του καναλιού ήταν δυαδικοποιημένων σύμφωνα με τη φωτεινότητα. Το μέγεθος της περιοχής που καταλαμβάνεται από όλα τα κύτταρα ή με Ki67-θετικών κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ 1.46r.

Για να απεικονίσει το αγγειακό σύστημα του όγκου, πάχους επανυδατώθηκαν τμήματα ιστού (35 μm) επωάστηκαν για 30 λεπτά σε σκοτάδι με 0,05% Triton Χ-100 σε PBS που περιέχει 5 μg /mL

Sambucus nigra αγλουτινίνης

(ΣΕΛ, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Οι τομές πλύθηκαν με 0,05% Triton Χ-100 σε PBS και κατέστησαν ορατά με ομοεστιακό μικροσκόπιο (Leica SP2). Τρισδιάστατες εικόνες ανακατασκευάστηκαν με το λογισμικό Imaris (Bitplane Scientific Λογισμικό, Ζυρίχη, Ελβετία).

Η στατιστική ανάλυση

Όλα τα αποτελέσματα αναφέρθηκαν ως μέσο με τυπική απόκλιση. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση μονόδρομης ή αμφίδρομης ANOVA ανάλογα με τον αριθμό των ομαδοποίησης παράγοντες. μέσα ομάδας συγκρίθηκαν με post-test ενός Bonferroni του. P & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν ως 3 ανεξάρτητες βιολογικές επαναλήψεις.

Αποτελέσματα

Κατηγορίας Ι HDAC αναστολή μειωμένη παγκρέατος ανάπτυξης καρκινικού κυττάρου in vitro

έχουν

BxPC-3 κύτταρα έχουν περιγραφεί για να εκφράσουν μεταβληθεί τα επίπεδα της κατηγορίας Ι HDAC1, HDAC3 και τάξη HDAC7 II [40], [41]. Για να αξιολογηθεί ο ρόλος αυτών των HDAC σε BxPC-3 κύτταρα, εξετάσαμε πρώτη φορά-εξαρτώμενη και εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση αύξηση τους σε παρουσία SAHA, ένα κλάσης Ι /ΙΙ αναστολέα (Σχήμα 1Α). Τα αποτελέσματα μας επιβεβαίωσαν ότι BxPC-3 κύτταρα ευαίσθητα σε SAHA, με μείωση κατά 50% αύξηση (Ρ & lt? 0,001) παρατηρήθηκε σε 5 μΜ. Στη συνέχεια, επιλεκτικά σιγήσει HDAC1, -3 ή -7 με τη χρήση siRNA να εξετάσει την ατομική συμμετοχή αυτών των HDAC στην SAHA που προκαλείται από τη μείωση της ανάπτυξης. HDAC7 σίγηση δεν επηρέασε την ανάπτυξη των κυττάρων (Σχήμα 1Β). Ωστόσο, HDAC1 και HDAC3 σίγασης που μείωσε σημαντικά την κυτταρική ανάπτυξη BxPC-3 με αντίστοιχα 50% (Ρ & lt? 0.001) και 20% (Ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 1 C). Για να αξιολογηθεί αυτή η μείωση στην κυτταρική ανάπτυξη με κλινικά συμβατή φάρμακο, αξιολογήσαμε την εξαρτώμενη από το χρόνο και εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση αύξηση της BxPC-3 κύτταρα σε παρουσία του MS-275 (HDAC1 και αναστολέας HDAC3). MS-275 (1 μΜ) μείωσε την κυτταρική ανάπτυξη BxPC-3 κατά 50% (P & lt? .001), Ενώ 5 μΜ κατάργησε εντελώς την ανάπτυξη (P & lt? .001). (Εικόνα 1Δ)

(Α) Ώρα εξαρτώμενη και δοσο-εξαρτώμενη επιδράσεις του SAHA επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. (Β) Χρόνος-εξαρτώμενη επίδραση της κατηγορίας ΙΙα HDAC7 φίμωση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. έκφραση HDAC7 ανιχνεύθηκε με 48 ώρες δυτικού στυπώματος μετά siRNA διαμόλυνση. HSC70 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (C) Χρόνος-εξαρτώμενη επίδραση της κατηγορίας Ι HDAC1 ή -3 φίμωση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων .. έκφρασης HDAC1 και HDAC3 ανιχνεύθηκε από 48 ώρες δυτικής κηλίδας μετά siRNA επιμόλυνση. HSC70 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (D) Χρόνος-εξαρτώμενη και δοσο-εξαρτώμενο επιδράσεις του MS-275 επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού *** Ρ & lt? 0.001 έναντι DMSO ή GL3 συνθήκες. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD, n≥3 σε κάθε κατάσταση.

Η

αναστολή HDAC κατηγορίας Ι έκφραση που προκαλείται από COX-2 in vitro

Η περιορισμένη αποτελεσματικότητα των αναστολέων HDAC σε κλινικές δοκιμές συμπεριλαμβανομένων PDAC ασθενών θα μπορούσε να εξηγηθεί, τουλάχιστον εν μέρει, από το δυναμικό πάνω ρύθμιση της έκφρασης του COX-2 σε παγκρεατικά κακοήθη κύτταρα. Για να αξιολογηθεί αυτή η υπόθεση, αναλύσαμε πρώτα την έκφραση της COX-2 σε BxPC-3 κύτταρα σιγήσει για HDAC1, HDAC2, HDAC3 ή κατεργασμένα με το MS-275. HDAC1 ή HDAC3 καταστολή που επάγεται αντίστοιχα ένα 6,3-φορές και 4,8-φορές αύξηση της έκφρασης COX-2 σε επίπεδο πρωτεΐνης (Σχήμα 2Α), ενώ HDAC2 σίγηση μειωμένη έκφραση COX-2 (Σχήμα 2Β). HDAC1 σίγηση προκάλεσε μια υπερέκφραση HDAC2.

(Α) ανίχνευσης Western blot-του COX-2 και HDAC σε 20 μg BxPC-3 πρωτεΐνες 48h μετά HDAC1 ή HDAC3 siRNA διαμόλυνση. (Β) ανίχνευση Western-κηλίδος του COX-2 και HDAC σε 20 μg BxPC-3 πρωτεΐνες 48 ώρες μετά την επιμόλυνση HDAC2 siRNA. (C) Δόση εξαρτώμενη επιδράσεις των 48h MS-275 αγωγή επί της έκφρασης COX-2. Ακετυλιωμένης ιστόνης Η3 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος της αποτελεσματικότητας της θεραπείας. HSC70 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (D) Χρόνος εξαρτώμενη σχετική έκφραση της COX-2 mRNA σε BxPC-3 κύτταρα που κατεργάζονται με 1 μΜ MS-275. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τ.α., η = 3.

Η

Κατεργασία BxPC-3 κύτταρα με το MS-275 έδειξε παρόμοια αποτελέσματα επί συσσώρευση της COX-2 σε μια συγκέντρωση-εξαρτηθεί τρόπο (Σχήμα 2C). Για να καθοριστεί εάν η επαγωγή της COX-2 λαμβάνει χώρα σε μετεγγραφικό επίπεδο, αναλύσαμε COX-2 mRNA επίπεδο με RT-qPCR ακόλουθα 6, 12, και 24 ώρες αγωγής MS-275. Βρήκαμε ότι η έκφραση του γονιδίου COX-2 ρυθμίζεται προς τα πάνω μετά την θεραπεία MS-275 σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο (Εικόνα 2D).

Για τη μελέτη των μηχανισμών με τους οποίους τάξη αναστολή Ι HDAC επάγει COX-2, διερευνήσαμε τη γνωστή σχέση μεταξύ της NF-kB και HDAC1 /3 [42], [43] και δοκιμάστηκαν την πιθανότητα ότι το MS-275 επαγόμενη έκφραση της COX-2 θα μπορούσε να είναι NF-kB εξαρτώμενη. Κατά συνέπεια, συν-επεξεργασμένα κύτταρα με το MS-275 και BAY-11-7082, έναν αναστολέα IkBα κινάσης (ΙΚΚ). ΒΑΥ-11-7082 μειώνονται κατά 30% έως 90% της έκφρασης της COX-2 μετά από αντίστοιχα 6h να 48h θεραπείας MS-275 (Σχήμα 3Α), γεγονός που υποδηλώνει την MS-275-επαγόμενη έκφραση της COX-2 είναι, τουλάχιστον εν μέρει , NF-kB εξαρτώμενη. Αυτή η υπόθεση υποστηρίχθηκε από ρ65-σίγηση και ρ65 μετατόπιση προς τον πυρήνα. έκφραση COX-2 διεγέρθηκε με επεξεργασία 24h με το MS-275 και εμποδίστηκε από ρ65 siRNA (Σχήμα 3Β). Επιπλέον, 24h θεραπεία MS-275 προκάλεσε μια αύξηση κατά 50% του επιπέδου της πρωτεΐνης ρ65 στο κυτταρόπλασμα και στον χρωματίνη κλάσμα BxPC-3 κύτταρα (Σχήμα 3C). Η ίδια μεταχείριση MS-275 που προκαλείται από το γονίδιο έκφρασης της IL-8 (Σχήμα 3D), με άμεσο στόχο της NF-kB.

(Α) Επίδραση ενός αναστολέα ΙΚΚ (10 μΜ BAY-11-7082) επί 1 μΜ MS-275 επαγόμενη έκφραση COX-2. Φωσφο-IkBα χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος ΒΑΥ-11-7082 αποτελεσματικότητας της θεραπείας. HSC70 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Πυκνομετρία εκφράστηκε ως αναλογία COX-2 /HSC70 ή IkBα /HSC70. (Β) ανίχνευση Western-κηλίδος του COX-2 σε 20 μg BxPC-3 πρωτεΐνες μετά από 1 μΜ MS-275 αγωγή και ρ65 μορφομετατροπή siRNA. HSC70 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Γ) την ανίχνευση Western κηλίδωσης του ρ65 σε 15 μg BxPC-3 κυτταρόπλασμα, πυρηνόπλασμα ή χρωματίνη πρωτεΐνες που συνδέονται μετά από 1 μΜ MS-275 αγωγή. ΜΕΚ2 και Orc2 χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος φόρτωσης αντίστοιχα σε κλάσματα κυτταροπλάσματος και χρωματίνης. Πυκνομετρία εκφράστηκε ως p65 /p65 ΜΕΚ2 ή /αναλογία Orc2. (D) Χρόνος εξαρτώμενη σχετική έκφραση της IL-8 mRNA σε BxPC-3 κύτταρα που κατεργάζονται με 1 μΜ MS-275, 10 μΜ Celecoxib ή ένα συνδυασμό των φαρμάκων. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± s.d. *** P & lt? .001, * P & lt? 0,05 έναντι DMSO. n≥3 σε κάθε κατάσταση.

Η

συνδυασμένη αναστολή της κατηγορίας Ι HDAC και COX-2 αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων in vitro

Για να επικυρώσετε την υπόθεσή μας ότι η κατηγορία Ι επαγωγής αναστολή που προκαλείται HDAC της COX-2 μπορεί να συμβάλλει στην χαμηλή αποτελεσματικότητα των HDAC που βασίζονται θεραπείας σε ασθενείς PDAC, έχουμε συνδυάσει το τελευταίο με celecoxib, ένας εκλεκτικός αναστολέας της COX-2 σε IC50 (αντίστοιχα 1 μΜ του MS-275 και 10 μΜ της celecoxib). Το MS-275 που προκαλείται από COX-2 υπερέκφραση οδήγησε σε αύξηση κατά 50% της συγκέντρωσης της PGE2 στο μέσο καλλιέργειας (Σχήμα 4Α). BxPC-3 θεραπεία κυττάρων με μόνο ή σε συνδυασμό με το MS-275 celecoxib μείωσε σημαντικά την

συγκέντρωση PGE 2 στο κυτταρικό μέσο. Στη συνέχεια αναλύθηκε η επίδραση αυτών των θεραπειών για την ανάπτυξη των κυττάρων. Ο συνδυασμός των δύο φαρμάκων μειώνεται σημαντικά (& gt? 85%, Ρ & lt? 0.001) η αύξηση BxPC-3 κυττάρων σε σύγκριση με τη χρήση είτε φάρμακο μόνο (Σχήμα 4Β). Είμαστε δίπλα έθεσε το ερώτημα αν αυτή η μείωση οφείλεται στην επαγωγή της απόπτωσης και εκτέλεσε μια βαφή ιωδιούχου αννεξίνη V /προπίδιο στις 24, 48 και 72 ώρες (Εικόνα 4C) μετά τη θεραπεία. Κανένα από τα μεμονωμένα φάρμακα ούτε ο συνδυασμός τους ήταν σε θέση να διεγείρει απόπτωση. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με κηλίδωση Western, δείχνει ανέπαφα κασπάσης-3 σε όλα τα δείγματα (Σχήμα 4C). Για να διερευνηθεί περαιτέρω οι μηχανισμοί της παρατηρούμενης διακοπής κυτταρικής ανάπτυξης, έχουμε την επόμενη εξετάσαμε την επίδραση της MS-275 συνδυασμός /celecoxib επί του κυτταρικού κύκλου (Εικόνα 4D). MS-275 μόνη της, αλλά όχι σελεκοξίμπη, αύξησε το ποσοστό των κυττάρων σε G1 κατά 50% σε 48 ώρες. Ωστόσο, το MS-275 /συνδυασμός celecoxib μειώθηκε σημαντικά (Ρ & lt? 0.001) η αναλογία των κυττάρων στη φάση S 24 (-74%), 48 (-92%) και 72 ώρες (-82%) και αυξήθηκε σημαντικά (Ρ & lt? 0,001) το ποσοστό σε G1 φάση στους 24 (+ 48%), 48 (+ 119%) και 72 ώρες (+ 80%). Να επικυρώσει αυτά τα αποτελέσματα αναλύσαμε με κηλίδα western της έκφρασης των δεικτών κυτταρικού κύκλου και βρήκε μια σαφή συσσώρευση του p21

WAF1 και p27

Kip1, δύο αναστολείς του κυτταρικού κύκλου, σε 24 ώρες και 48 ώρες μετά τη συγχορήγηση του MS- 275 και σελεκοξίμπη (Σχήμα 4Ε). Συνέπεια, η υπερφωσφορυλιωμένη μορφή pRb ήταν λιγότερο άφθονα, όταν BxPC-3 κύτταρα συν-θεραπεία με το MS-275 /celecoxib. Η υποφωσφορυλιωμένη μορφή pRb εμφανίστηκε με την συν-αναστολή της HDAC κατηγορίας Ι και COX-2. Ολόκληρη η πρωτεΐνη pRb εξαφανίστηκε στις 48 ώρες μετά την ταυτόχρονης θεραπείας. Αυτή η εξαφάνιση είχε ήδη παρατηρηθεί από άλλους μετά από ένα ρ21

WAF1 ή p27

συσσώρευση Kip1 [44]. Ο μεταγραφικός παράγοντας E2F1, ένας ενορχηστρωτής S-φάση, έγινε μη ανιχνεύσιμα 48 ώρες μετά τη συγχορήγηση του MS-275 και celecoxib. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η κυτταρική αναστολή της ανάπτυξης σχετίζεται με ένα μπλοκάρισμα φάση G0 /G1.

δοκιμασίας (Α) ELISA της PGE

2 σε καλλιέργεια κυττάρων 24 ώρες μέσα και 48 ώρες μετά από 1 μΜ MS-275 και 10 μΜ θεραπείας celecoxib. (Β) Ο χρόνος που εξαρτώνται επιδράσεις του MS-275 και celecoxib στην ανάπτυξη των κυττάρων. (C) Χρόνος που εξαρτώνται επιπτώσεις από 1 μΜ MS-275 και 10 μΜ celecoxib σε αναλογία αποπτωτικών κυττάρων από αννεξίνη V /PI κυτταρομετρία ροής και κασπάσης-3 διάσπασης. (Δ) Ο χρόνος που εξαρτώνται επιπτώσεις από 1 μΜ MS-275 και 10 μΜ celecoxib σε κυτταρικό κύκλο με ενσωμάτωση PI. (Ε) ανίχνευση Western-κηλίδος του ρ21, ρ27, pRb ppRb και E2F1 σε 20 μg BxPC-3 πρωτεΐνες 6 έως 48 ώρες μετά από 1 μΜ MS-275 και 10 μΜ θεραπεία celecoxib. HSC70 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± s.d., *** Ρ & lt? 0.001, ** Ρ & lt? 0,01, * Ρ & lt? 0,05 έναντι DMSO ή ενδείκνυται συνθήκες. n≥3 σε κάθε κατάσταση.

Η

BxPC-3 είναι ένας PDAC κυτταρική γραμμή που χαρακτηρίζεται από KRAS άγριου τύπου, ενώ οι μεταλλάξεις του γονιδίου που κωδικοποιεί για την πρωτεΐνη αυτή είναι η πιο κοινή γενετική μεταβολή που παρατηρείται στην ανθρώπινη PDAC. Ωστόσο, BxPC-3 κύτταρα υπερεκφράζουν COX-2, μια κατάσταση σημειώνεται σε 50% των ανθρώπινων PDAC. Έχουμε αποφασίσει να επεκτείνει τις παρατηρήσεις μας σχετικά με το συμφέρον της συνδυασμένης θεραπείας στον καρκίνο του παγκρέατος με την εξέταση της αποτελεσματικότητας των εν λόγω συνδυασμένης θεραπείας σε δύο ανθρώπινου παγκρέατος κυτταρικές σειρές με αναφερθεί μεταλλάξεις KRAS. Η πρώτη κυτταρική σειρά ήταν PANC-1 ([12 ASP] -KRAS) στον οποίο το COX-2 εντοπιζόταν στο πρωτεϊνικό επίπεδο [45]. Η δεύτερη κυτταρική σειρά ήταν CFPAC-1 ([12 VAL] -KRAS), αλλά στην οποία COX-2 ανιχνεύθηκε σε πρωτεϊνικό επίπεδο [45].

PANC-1 κυτταρική σειρά καλλιεργήθηκε με το MS-275, σελεκοξίμπη ή και τα δύο φάρμακα σε συνδυασμό. Celecoxib 10 μΜ δεν μετέβαλε την ανάπτυξη των κυττάρων, όταν το MS-275 1 μΜ μειωθεί σημαντικά (p & lt?, 001) την ανάπτυξη των κυττάρων κατά 32%. Ο συνδυασμός των δύο φαρμάκων μείωσε την ανάπτυξη των κυττάρων PANC-1 (49%, Ρ & lt? 0.001). Ωστόσο, ο συνδυασμός επαγόμενη αναστολή ανάπτυξης δεν ήταν σημαντικά διαφορετική από την MS-275 που προκαλείται από ένα (Σχήμα 5Α). Σε αυτή την κυτταρική γραμμή, MS-275 δεν επήγαγε την έκφραση της COX-2 (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) Χρόνος που εξαρτώνται από επιδράσεις του MS-275 και celecoxib επί της ανάπτυξης κυττάρου PANC-1. (Β) Ο χρόνος που εξαρτώνται επιδράσεις του MS-275 και celecoxib για την ανάπτυξη των κυττάρων CFPAC-1. (Γ) την ανίχνευση Western-κηλίδος του Cox-2, ρ21, ρ27 σε 30 μg πρωτεϊνών CFPAC-1 48 ώρες μετά την 1 μΜ MS-275 και 10 μΜ θεραπεία celecoxib. HSC70 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± s.d., *** Ρ & lt? 0.001 έναντι DMSO ή ενδείκνυται συνθήκες. n≥3 σε κάθε κατάσταση.

Η

CFPAC-1 κυτταρική σειρά καλλιεργήθηκε υπό τις ίδιες συνθήκες. Celecoxib 10 μΜ μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων κατά 54% (p & lt?, 001) και MS-275 1 μΜ μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων κατά 59% (p & gt?, 001). Εδώ, ο συνδυασμός των δύο φαρμάκων μειώνεται σημαντικά (79%, Ρ & lt? 0.001) κυτταρική ανάπτυξη CFPAC-1 σε σύγκριση με κάθε φάρμακο μόνο του (Σχήμα 5Β). Στη συνέχεια αναλύθηκαν με στύπωμα Western της έκφρασης του COX-2 και οι δείκτες κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα CFPAC-1 48 ώρες μετά τη χορήγηση φαρμάκων. Δείξαμε ένα MS-275 που προκαλείται από συσσώρευση του COX-2, όπως σε BxPC-3 κύτταρα (Σχήμα 5C). Βρήκαμε επίσης μια συσσώρευση του p21

WAF1 και p27

Kip1 μετά τη συγχορήγηση του MS-275 και σελεκοξίμπη (Σχήμα 5C), γεγονός που υποδηλώνει μια διακοπή του κυτταρικού κύκλου.

BxPC-3 CAM όγκου μιμείται την ανθρώπινη PDAC

Η αξιολόγηση των νέων φαρμάκων ή συνδυασμών φαρμάκων για τον καρκίνο του παγκρέατος, θα διευκολυνθεί από τη διαθεσιμότητα εύκολο, ηθικά και οικονομικά βιώσιμη ζωικά μοντέλα. Έτσι, έχουμε αναλάβει να βελτιώσετε μια (CAM) μοντέλο ανθρώπινου παγκρέατος χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης με βάση την αρχική μας εργασία [32]. Ενσωμάτωση BxPC-3 κύτταρα σε matrigel πριν από την CAM εμφύτευση δημιουργείται μια σημαντική βελτίωση στον όγκο του όγκου. Πράγματι, μετά την εμφύτευση, ο όγκος του όγκου αυξήθηκε γραμμικά (r

2 = 0,87) μέχρι την ημέρα 7 (Σχήμα 6Α). Κατά τη στιγμή της συλλογής του όγκου (ημέρα 7), ένα μέσο όρο όγκου του όγκου του 59,95 ± 15,34 πιπί παρατηρήθηκε

3 (n = 10). όγκοι BxPC-3 CAM μεγάλωσε μέσα στη CAM συνδετικό ιστό ως ένα μοναδικό σφαιρικών οζίδιο. Η ίδια διαδικασία ακολουθήθηκε για κυτταρικές γραμμές CFPAC-1 BxPC-3, PANC-1 και. PANC-1 δεν αυξήθηκε σε CAM όταν CFPAC-1 αυξήθηκαν ως πολύ μικρά οζίδια (μήκους 1 mm).

(Α) Κύτταρα εμφυτεύθηκαν σε CAM σε εμβρυϊκή ημέρα 11 και συλλέγεται 2, 4, 5, 6 ή 7 ημέρες μετά την εμφύτευση. Μακροσκοπική εικόνες ελήφθησαν με την ίδια μεγέθυνση από πάνω, κάτω και πλάγια όψη. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τ.α., η & gt? 5 σε κάθε χρονικό σημείο. (Β) Η ιστολογική (Αιματοξυλίνη-Ηωσίνη ή χρώση τριχρωματική του Masson) ανάλυση των όγκων που συλλέγονται 2, 4, 5, 6 ή 7 ημέρες μετά την εμφύτευση. (Γ) Η ανοσοϊστολογία όγκων 7 ημέρες μετά την BxPC-3 εμφύτευση σε CAM και την ανθρώπινη PDAC όγκων. CK7 = Cytokeratin-7, CK19 = κυτοκερατίνη-19, CEA = καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο, PAS = αμυλάσης περιοδικών χρώση Schiff οξύ.

Η

BxPC-3 ιστολογία CAM όγκου (Σχήμα 6Β) αποκάλυψε μεγάλες νησίδες της συνεκτικής κύτταρα, μερικά από τα οποία έδειξαν μια εκκολαπτόμενη κεντρικό αυλό και απομονώθηκαν από το άλλο με μια εξωκυτταρική μήτρα που περιέχει κολλαγόνο με αρκετά αραιά μοιάζουν με ινοβλάστες κύτταρα που αποδεικνύει την παρουσία ενός διάμεσου στρώματος.

Για να αξιολογηθούν περαιτέρω ανθρώπινο πάγκρεας μας καρκίνος μοντέλο CAM, συγκρίναμε την έκφραση της κυτοκερατίνη-7, -19, -20, CD56, CEA και Ki67 χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία για την ανθρώπινη PDAC. Μπορούμε επίσης να ελέγχονται για βλεννίνη και πρωτεογλυκανών παραγωγής χρησιμοποιώντας τη χρώση PAS. Κύτταρα όγκου τόσο από BxPC-3 CAM όγκου και τα δείγματα PDAC ήταν έντονα θετικά για κυτοκερατίνη-7 και -19, CEA και Ki67 (Σχήμα 6C) αλλά αρνητικό για κυτοκερατίνη-20 και CD56 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Και οι δύο όγκοι ήταν θετικά για χρώση PAS. Συνολικά, τα στοιχεία έδειξαν αξιοσημείωτες ομοιότητες ιστολογίας και της έκφρασης βιοδεικτών μεταξύ του BxPC-3 μοντέλο CAM και PDAC από ανθρώπους ασθενείς.

Επιπλέον, πρόσφατες εργασίες μας την δυνατότητα στόχευσης βιοδεικτών σε ανθρώπινα PDAC [46] εντοπίστηκαν αρκετοί υποψήφιοι βιοδείκτη μεταξύ των οποίων myoferlin, αυξητικός παράγοντας μεταμόρφωσης βήτα-επαγόμενη και λανθάνουσας-μετασχηματισμού πρωτεΐνη αυξητικός παράγοντας βήτα-δεσμευτική 2. Ανοσοϊστοχημεία και δυτικού στυπώματος επιβεβαίωσε την παρουσία αυτών των νέων PDAC βιοδείκτες στα BxPC-3 όγκους CAM (Σχήμα 7Α-Β). Τέλος, χρησιμοποιώντας στύπωμα Western επιβεβαιώσαμε ότι HDAC1, HDAC2, HDAC3 και COX-2 εκφράζονται στο BxPC-3 CAM όγκου (Σχήμα 7Α).

(Α) ανίχνευσης Western blot-HDAC1 του, HDAC2, HDAC3 , HDAC7, COX-2, TGFBI, MYOF, LTBP2 σε 20 μg PDAC-CAM ή πρωτεΐνες BxPC-3. HSC70 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) την επισήμανση Immunoperoxydase της MYOF, TGFBI, LTBP2, COX-2.

Η

επόμενο έδειξαν ότι οι όγκοι ήταν λειτουργικά vascularized. BxPC-3 αιμοφόρα αγγεία CAM βάφτηκαν με συζευγμένο με FITC SNA και 3D ανακατασκευάστηκε μετά ομοεστιακό απόκτησης. BxPC-3 όγκους CAM εμφανίζεται αιμοφόρα αγγεία γύρω από παγκρεατικά νησίδια (Σχήμα 8Α). Ο φθορισμός του στρώματος του όγκου μετά φθορίζουσα χρωστική ένεση στην CAM αγγείων επιβεβαιώνει ότι τα πλοία είναι λειτουργική (Σχήμα 8Β) και η ανίχνευση της δεσμίνης θετική περικύτταρα υποδηλώνει σταθεροποίηση σκάφος (Εικόνα 8C).

(Α) Imaris 3D ανακατασκευή από μια στοίβα εικόνα 35 μm μετά από χρώση με ΣΕΛ (πράσινο). Οι πυρήνες χρωματίστηκαν με μετρητή ϋΑΡΙ (μπλε). (Β) Ομοεστιακή εικόνα μετά FITC (πράσινο) ένεση στα αιμοφόρα αγγεία CAM. Οι πυρήνες βάφτηκαν με μετρητή TOPRO (μπλε) (Γ) Η δεσμίνη ανοσοανίχνευση (κόκκινο) σε PDAC-CAM χρωματίστηκαν με SNA (πράσινο). Οι πυρήνες χρωματίστηκαν με μετρητή ϋΑΡΙ (μπλε).

Η

Στη συνέχεια, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία BxPC-3 όγκους ξεκινώντας την ημέρα 2, είτε με 8 μΜ celecoxib ή 0,2 μΜ MS-275 ή με έναν συνδυασμό δύο φαρμάκων κατά τους αντίστοιχες συγκεντρώσεις. συγκέντρωση MS-275 επιλέχθηκε για να ταιριάζει με την πλασματική συγκέντρωση μετράται σε Ανθρώπινα σε 5 mg /m

2 εβδομαδιαία δοσολογικό σχήμα [15]. Ενώ celecoxib μόνη της δεν επηρέασε την ανάπτυξη του όγκου, MS-275 μόνος επαγόμενη μειωμένη της ανάπτυξης του όγκου κατά 50% (Ρ & lt? 0.001) και προκάλεσε την έκφραση της COX-2. Συνδυασμός celecoxib και MS-275 καταργήθηκε πλήρως (Ρ & lt? 0.001) την ανάπτυξη του όγκου, οδηγώντας σε καμία αλλαγή στον όγκο του όγκου σε σύγκριση με την έναρξη της θεραπείας (Σχήμα 9Α-Β). Οι όγκοι που έλαβαν θεραπεία με το MS-275 υπερεκφράζεται COX-2 (Σχήμα 9C). Οι όγκοι που έλαβαν θεραπεία με συνδυασμό της celecoxib και MS-275 αποκάλυψε κενά στο εσωτερικό του όγκου. (Σχήμα 9D). Στη συνέχεια έθεσε το ερώτημα αν αυτή η μείωση του μεγέθους του όγκου οφείλεται στην επαγωγή της απόπτωσης ή για τη σύλληψη του πολλαπλασιασμού. Οι όγκοι που έλαβαν θεραπεία με το MS-275, celecoxib ή δύο φάρμακα υποβλήθηκαν σε διασπασμένο ανίχνευσης κασπάσης-3 και σημάνθηκαν για Κί67. Το πλήρους μήκους κασπάση-3 ανιχνεύθηκε σε όλα τα δείγματα, αλλά όχι διασπασμένη κασπάση 3 παρατηρήθηκε (Σχήμα 9Ε).