Abstract

συνδεσίνες (Cx), τα οποία αποτελούν καναλιών χασμοσυνδέσμου μεσοκυττάρια σε σπονδυλωτά, έχουν δειχθεί ότι καταστέλλουν μετασχηματισμένο κύτταρο ανάπτυξης και ογκογένεση , αλλά ο μηχανισμός (ες) εξακολουθούν να παραμένουν σε μεγάλο βαθμό θεωρητική. Εδώ, ορίζουμε τη μοριακή βάση με την οποία Cx26, αλλά λιγότερο συχνά Cx43 ή Cx32, επιλεκτικά παρέχουν καταστολή της ανάπτυξης σε καρκινικά κύτταρα. Λειτουργική μεσοκυττάρια σύζευξη φαίνεται να απαιτείται, παράγοντας μερική μπλοκ του κυτταρικού κύκλου λόγω της παρατεταμένης ενεργοποίηση αρκετών μιτογόνου κινάσες. PKA είναι τόσο αναγκαία και επαρκής για την Cx26 που προκαλείται αναστολή της ανάπτυξης σε χαμηλό ορό και την απουσία της αγκύρωσης. Η ενεργοποίηση του ΡΚΑ δεν συσχετίστηκε με αυξημένα επίπεδα cAMP, αλλά φαίνεται να προκύπτει από μία ανακατανομή του cAMP σε όλο τον πληθυσμό των κυττάρων, εξαλείφοντας τις ταλαντώσεις του κυτταρικού κύκλου σε cAMP απαιτούνται για την αποτελεσματική εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Cx43 και Cx32 αποτυγχάνουν να διαμεσολαβούν αυτή ανακατανομή ως, σε αντίθεση με Cx26, αυτά τα κανάλια είναι κλειστά κατά τη διάρκεια της φάσης G2 /M του κυτταρικού κύκλου όταν cAMP επίπεδα αιχμής. Συγκρίσεις των καρκινικών κυτταρικών σειρών δείχνουν ότι αυτό είναι ένα γενικό πρότυπο, με καταστολή της ανάπτυξης με συνδετίνες συμβαίνουν κάθε φορά cAMP ταλαντώνεται με τον κυτταρικό κύκλο, και η διασταύρωση χάσμα παραμένει ανοικτή καθ ‘όλη του κυτταρικού κύκλου. Έτσι, σύζευξη μεσοκυττάριου, ελλείψει οποιωνδήποτε εξωτερικών σημάτων, παρέχει ένα γενικό μέσο για τον περιορισμό της μιτωτικής ποσοστό των κυτταρικών πληθυσμών

Παράθεση:. Chandrasekhar Α, Kalmykov ΕΑ, Polusani SR, Mathis Α.Ε., Zucker SN, Nicholson BJ (2013) ενδοκυτταρικής Ανακατανομή του cAMP κρύβεται Επιλεκτική καταστολή του καρκίνου κυτταρική ανάπτυξη κατά Connexin26. PLoS ONE 8 (12): e82335. doi: 10.1371 /journal.pone.0082335

Επιμέλεια: David M. Ojcius, Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια Merced, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30 Αύγ, 2013? Αποδεκτές: 30η Οκτωβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 3 Δεκ 2013

Copyright: © 2013 Chandrasekhar et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από το ακόλουθο κείμενο: ΝΙΗ – R01 CA048049, Ρ30 CA54174, P01 AG19316, και Ρ30 AG013319. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Gap κόμβους είναι συστοιχίες μεσοκυττάρια κανάλια που είναι οι μόνες μεσολαβητές της άμεσης μεσοκυττάρια ανταλλαγή μικρών μεταβολιτών και των μορίων σηματοδότησης σε πολυκύτταρους συστήματα [1,2]. Στα σπονδυλωτά, οι εν λόγω δίαυλοι αποτελείται από ενσωματωμένες μεμβρανικές πρωτεΐνες ονομάζεται συνδετίνες (Cx), με τέσσερις διαμεμβρανικές περιοχές και κυτταροπλασματική Ν και C -termini. Έξι συνδετίνες έρχονται μαζί για να σχηματίσουν ένα hemichannel ή connexon, και δύο τέτοιες hemichannels από αντίθετες κύτταρα δέσει για να δημιουργήσετε το μεσοκυττάριο κανάλι διασταύρωση χάσμα [3]. Το ολοκλήρωμα, αλλά εξειδικευμένη ρόλος του μεσοκυττάριου σε ποικίλες ιστούς διευκολύνεται από την παρουσία τουλάχιστον 21 διαφορετικές ισομορφές συνδετίνη σε ανθρώπους, με διακριτές πρωτεΐνες που έχουν ταξινομηθεί σύμφωνα με το μοριακό τους βάρος [4], και ένα ονοματολογία γονίδιο που περιγράφεται στο [5 ]. Οι πρωτεΐνες Cx43, Cx32 και Cx26 μελετηθεί εδώ που κωδικοποιείται από το

GJA1

,

GJB1

και

GJB2

γονίδια, αντίστοιχα.

Σχεδόν δεδομένου ότι ανακάλυψη, χασμοσυνδέσμους τους έχουν ενοχοποιηθεί ως καταστολείς όγκων σε αρκετούς ιστούς [6]. Αυτό έχει επιβεβαιωθεί σε γενετική οθόνες πολλών τύπων όγκων συμπεριλαμβανομένου του καρκινώματος του μαστού [7], ο καρκίνος του προστάτη [8], και το μελάνωμα [9]. Ένα πλήθος τύπων όγκων και μετασχηματισμένες κυτταρικές σειρές επιδεικνύουν μειωμένη έκφραση πρωτεΐνης συνδετίνης και /ή λειτουργικότητας μεσοκυττάριου (ανασκόπηση στο 10). Επιπλέον, υπάρχουν αρκετές καταγεγραμμένες περιπτώσεις όπου η εξωγενής έκφραση του συνδετίνες σε μετασχηματισμένη κυτταρική γραμμή μπορεί να καταστείλει δραματικά μετασχηματιστεί ιδιότητές του και την ικανότητά του να σχηματίζουν όγκους σε γυμνούς ποντικούς [Cx43 σε κύτταρα C6 γλοιώματος [11]? Cx43 σε 10Τ1 /2 εμβρυονικά μεσεγχυματικά κύτταρα [12]? Cx43 και Cx32 σε LNCaP κυττάρων καρκίνου του προστάτη [13]? Cx26 σε HeLa κύτταρα καρκίνου του τραχήλου [14]? Cx26 και Cx43 σε MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού [15,16] και? Cx32 σε κύτταρα ηπατώματος SKHep1 [17]. Το τελευταίο είναι επίσης συνεπής με την αύξηση της ηπατικής ογκογένεση παρατηρήθηκε σε Cx32 – /- ποντίκια [8,18]

καταστολή της ανάπτυξης των μετασχηματισμένων κυττάρων με έκφραση Cx έχει συνδεθεί με ρύθμιση των προ- και αντι-αποπτωτικό. πρωτεΐνες (π.χ. Bcl-2) [19,20] ή αλλαγές στις πρωτεΐνες του κυτταρικού κύκλου όπως Νοέμβριο (CCN3) [21], Skp2 [22] και p21 [23,24]. Ωστόσο, για τη θέσπιση άμεση σύνδεση μεταξύ οποιοδήποτε από αυτά τα γεγονότα και την ανταλλαγή των μορίων μεταξύ των κυττάρων σηματοδότησης μέσω κόμβων χάσμα έχει αποδειχθεί απατηλό. Η πρόοδος στον τομέα αυτό έχει περιοριστεί από περιορισμένες πληροφορίες σχετικά τόσο με τις ιδιότητες διαπερατότητας των συνδεσινών, και την χωροχρονική κατανομή των συγκεντρώσεων βάρους μεταβολίτη χαμηλού μοριακού σε πολυκύτταρους πληθυσμούς. Σε ορισμένες περιπτώσεις, οι συνδετίνες έχουν προταθεί για να καταστείλει την ανάπτυξη, ακόμη και εν απουσία της δράσεως του διαύλου κόμβου αποδείξιμη χάσμα [15,21,24,25,]. Αυτό μπορεί να συμβεί μέσω αλληλεπιδράσεων με άλλες πρωτεΐνες που είναι γνωστό ότι δεσμεύονται σε συνδετίνες (ανασκόπηση από [26]), μέσω της λειτουργίας τους ως ημικανάλια, τα οποία μπορούν να συμβάλουν στην αύξηση της κυτταρικό θάνατο [27], ή ακόμα και μέσω MIS-εντοπισμό των τμημάτων της πρωτεΐνης ( 25). Ωστόσο, η οριστική δεσμοί μεταξύ οποιαδήποτε από αυτές τις διαδικασίες και αντι-ογκογόνο παράγοντες μένει να αποδειχθεί.

Αν και ο ρόλος της σύζευξης των κυττάρων, σε σύγκριση με άλλες λειτουργίες συνδετίνη, εξακολουθεί να είναι ένα θέμα για συζήτηση στην καταστολή των όγκων, η σύνδεση μεταξύ χάσμα σύζευξη σύνδεσης και μιτογένεση έχει καθιερωθεί σε πολλές μη-παθογόνες συνθήκες. Διάφοροι παράγοντες ανάπτυξης, όπως EGF [28] και PDGF [12] έχει αποδειχθεί ότι επάγει παροδική αποσύνδεση των κυττάρων ως μέρος της άμεσης πρώιμης απόκρισης που προηγείται της έναρξης μίτωσης. Οι ογκογονίδια όπως

v-src

έχει αποδειχθεί ότι έχουν παρόμοια, αλλά πιο μακροχρόνιες επιπτώσεις στις ζεύξης [29].

In vivo

, ως μέρος της αναγεννητικής απόκρισης μετά από μερική ηπατεκτομή, μια οξεία απώλεια των κόμβων χάσμα μεταξύ των ηπατοκυττάρων φαίνεται να προηγείται αμέσως το πρώτο κύμα της μίτωσης [30]. Ωστόσο, όπως έχει συμβεί σε όγκους, η μοριακή βάση της μιτογόνου αναστολής σχετίζεται με σύζευξη κύτταρο μένει να επιλυθούν. Σε αυτή τη μελέτη, επιδιώξαμε να καθορίσουν το μοριακό μηχανισμό καταστολής της ανάπτυξης με συνδετίνες σε κύτταρα HeLa, ένα πολύ καλά χαρακτηριζόμενη μετασχηματισμένο καρκίνο του τραχήλου κυτταρική γραμμή, και να δοκιμάσει το γενίκευση των μηχανισμών αυτών με άλλους τύπους κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι Cx26 επιτρέπει ειδικά το πέρασμα του cAMP μεταξύ των κυττάρων, ισοπέδωση τις κορυφές των cAMP που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου και, μέσω της ενεργοποίησης PKA, προκαλώντας καθυστερήσεις του κυτταρικού κύκλου. Το αποτέλεσμα είναι ειδικό συνδετίνη, όπως και άλλες συνδετίνες, όπως Cx43 και 32, κοντά κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου ακριβώς τη στιγμή που τα επίπεδα της cAMP συσσωρεύονται. Εξέταση διαφόρων κυτταρικών γραμμών όγκου υποδεικνύει μια γενικότητα για το σκοπό αυτό εφ ‘όσον οι cAMP ταλαντώσεις δει και τα κανάλια παραμένουν ανοικτά σε όλη του κυτταρικού κύκλου.

Αποτελέσματα

Cx26, αλλά όχι Cx32 ή 43, αναστέλλουν μετασχηματισμένα ανάπτυξη των κυττάρων HeLa

κύτταρα HeLa είναι ένα ευρέως μελετηθεί καρκίνο του τραχήλου κυτταρική γραμμή, τα οποία στερούνται ενδογενών μεσοκυττάριου, αλλά επιτρέπει ισχυρή έκφραση, κατάλληλη διακίνηση και επεξεργασία των εξωγενώς εξέφρασε συνδετίνες. Αξιοποιήσαμε αυτό το σύστημα για να χαρακτηρίσει τις ιδιότητες ανάπτυξης κοννεξίνης από την προετοιμασία συγκεντρωμένων κλώνων των κυττάρων HeLa που εκφράζουν Cx43 (HeLa43), Cx32 (HeLa32), και Cx26 (HeLa26). Κάθε ένα από τα προϊόντα επιμόλυνσης εκφράζουν HeLa συνδετίνες σε παρόμοια επίπεδα, και σύμφωνα με την προβλεπόμενη MW σε κηλίδες Western (Σχήμα S1). Σχηματίζουν χαρακτηριστική πλάκες μεσοκυττάριου στη διεπιφάνεια κυττάρου-κυττάρου (Σχήμα 1Α), και δείχνουν παρόμοια ποσοστά μεταφοράς του προ-φορτωμένο χρωστική καλσεΐνη να περιβάλλει μη επισημασμένα κύτταρα, με ~ 95% των φορτωμένων κυττάρων να συνδέεται με τουλάχιστον ένα γείτονα, και 73-83% των πρώτων γειτόνων τάξης λαμβάνουν χρωστικής (Πίνακας 1).

(Α) χρώση ανοσοφθορισμού, χρησιμοποιώντας το κατάλληλο αντίσωμα αντι-Οχ, δείχνει χαρακτηριστική έκφραση του συνδετίνες σε πλάκες μεταξύ των κυττάρων. HeLaPar παρουσιάζουν αρνητικό αποτέλεσμα με όλα τα τρία αντισώματα αντι-Οχ (τα αποτελέσματα αντι-Cx26 αντίσωμα παρουσιάζεται εδώ) (ράβδοι κλίμακας, 10 μm).

(Β) Ανάπτυξη HeLaPar (τετράγωνα) με τα κέντρα HeLa επιμολυσμένα με κλώνους Cx26 (κύκλοι), Cx32 (ανεστραμμένο τρίγωνο) ή Cx43 (όρθια τρίγωνο), υποβλήθηκε σε 3 ημέρες από ασιτία ορού (ημέρες 0-3) που ακολουθείται από 3 ημέρες σε 1% ορό (ημέρες 3-6), αποκαλύπτει επιλεκτική καταστολή της ανάπτυξης με Cx26. Αντιπροσωπευτικά δεδομένα από ένα από τρία πειράματα φαίνεται, με τα σημεία που αντιπροσωπεύουν την μέση τιμή ± SEM των τριπλών επιμεταλλώσεις.

(C) Τοπολογία διάγραμμα του Cx26, με εξωκυτταρική επιφάνεια στην κορυφή, απεικονίζει τη θέση των δύο μεταλλάξεων σημείου που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μελέτη που διαταράσσουν τις διαφορετικές πτυχές της λειτουργίας του καναλιού (R75Y και T135A).

(D) Χρώση ανοσοφθορισμού με ένα αντίσωμα αντι-Cx26 δείχνει ότι και οι δύο πλάκες μεταλλαγμένου συνδετίνες μορφή στην επιφάνεια του κυττάρου, με R75Y έχοντας ελαφρώς μικρότερη, λιγότερο συχνή πλάκες, και T135A έχουν μεγαλύτερες και συχνότερες πλάκες από W.T. Cx26 (πίνακας Α) (μπαρ κλίμακα, 10μm).

λειτουργία (Ε) Hemichannel δοκιμάστηκε με πρόσληψη χρωστικής LY σε μια δοκιμασία βαφής πτώση (Scout et al., 2002). Το αριστερό πλαίσιο δείχνει την εικόνα αντίθεσης φάσης (αστερίσκοι υποδεικνύουν κύτταρα ανάληψη της βαφής) και ο δεξιός πίνακας δείχνει την εικόνα φθορισμού (μπαρ κλίμακα, 20μm). Σημειώστε ότι μερικές βαφές-θετικά κύτταρα φαίνεται να έχουν λάβει χρωστικής μέσω μεσοκυττάρια μεταφορά από το αρχικό κύτταρο που ανέλαβε βαφής στις καλλιέργειες HeLa26.

(F) Σύγκριση της ανάπτυξης σε χαμηλό ορό (βλ πίνακα Β) μεταλλαγμένα Cx26 κύτταρα που εκφράζουν (Cx26T135A – διαμάντια, Cx26R75Y – τρίγωνα) με εκείνα που εκφράζουν κ.β. HeLa26 (κύκλοι) και HeLaPar κύτταρα (τετράγωνα) αποδεικνύει ότι τα λειτουργικά μεσοκυττάρια κανάλια της W.T. Cx26 απαιτούνται για την καταστολή της ανάπτυξης. Αντιπροσωπευτικά δεδομένα από ένα από τρία πειράματα φαίνεται, με τα σημεία που αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM των τριπλών επιστρώσεις.

Η Gap Junction

Hemichannel

HeLa κυττάρων Τύπος

% Σε συνδυασμό

ένα

% πρώτης τάξης

β Σύζευξη

% κύτταρα Πλήρωση με Εξωκυττάρια Dye

γ

Parental000Cx 4395 ± 1,3273 ± 10.43NTCx 3296 ± 2,0180 ± 9.53NTCx 2693 ± 0,6783 ± 8,283 ± 1.7Cx26 R75Y006 ± 1.2Cx 26T135A000Table 1. Λειτουργική Ανάλυση της Gap Κόμβων και hemichannels.

α το ποσοστό των προεγκατεστημένα τα κύτταρα περνούν βαφής με τουλάχιστον ένα κύτταρο δέκτη.

b το ποσοστό των κυττάρων πρώτης τάξης (δηλαδή εκείνων που αμέσως δίπλα στο κύτταρο δότη) που λαμβάνουν χρωστικής μετά από 6 ώρες από επιμετάλλωσης.

C το ποσοστό των κυττάρων που δείχνουν την πρόσληψη χρωστικής του Lucifer Yellow (LY) (βλέπε Σχήμα 1 Ε). Τα αποτελέσματα δεν περιλαμβάνουν κύτταρα λαμβάνουν LY δευτερευόντως μέσω σύζευξης (δηλαδή Cx26) .nt: Δεν έχει δοκιμαστεί CSV Λήψη CSV

Η επίδραση της έκφρασης συνδετίνης στις μετατραπεί χαρακτηριστικά της ανάπτυξης των κυττάρων HeLa εκτιμήθηκε υπό χαμηλά (1%) συνθήκες ορό και πολυ (μεθακρυλικό 2-υδροξυαιθύλιο) (polyHEMA) επικαλυμμένα ελάσματα που δεν υποστηρίζουν προσκόλληση κυττάρου-υποστρώματος [31]. Παρά τα παρόμοια επίπεδα ζεύξης σε όλα τα προϊόντα μετεμβολιασμού συνδετίνη, διαπιστώσαμε ότι μόνο HeLa26 παρουσίασαν καθυστέρηση της ανάπτυξης, σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες (Mesnil et al., 1995). HeLa26 δείχνουν 3-φορές μεγαλύτεροι χρόνοι διπλασιασμού σε συνθήκες χαμηλού ορού (Εικόνα 1Β), και ≥2 φορές βραδύτερη ανάπτυξη ανεξάρτητη αγκύρωση (σχ S2) σε σύγκριση με γονικά κύτταρα HeLa (HeLa Par) ή άλλους μορφομετατροπείς συνδετίνη, όπως καταδεικνύεται σε τρία ανεξάρτητα HeLa26 κλώνους. Όλα τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ ελήφθησαν από δεξαμενές κλώνων αναμειγνύονται σε ίσες αναλογίες για κάθε πείραμα.

ενδοκυτταρική επικοινωνία με Cx26 είναι απαραίτητη για την καταστολή της ανάπτυξης

Η συγκεκριμένη λειτουργία του Cx26 υπεύθυνος για την καταστολή της ανάπτυξης εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας σημειακές μεταλλάξεις Cx26 που αποκόπτεται λειτουργία του καναλιού. Η μετάλλαξη Cx26T135A στην κυτταροπλασματική τέλος της τρίτης διαμεμβρανικής περιοχής (Σχήμα 1 C) εμποδίζει το άνοιγμα του είτε καναλιών χασμοσυνδέσμου ή ημικανάλια [32]. Η μετάλλαξη Cx26R75Y στον πρώτο εξωκυτταρικό βρόχο (Σχήμα 1C) αποτρέπει το σχηματισμό καναλιών στενών τμημάτων του μεσοκυττάριου, αλλά αφήνει hemichannel λειτουργούν σε μεγάλο βαθμό αμετάβλητη [33]. Gap διασταύρωση και ιδιότητες hemichannel όλων Cx26 κατασκευασμάτων, καθώς επίσης και Cx43 και 32, επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας Lucifer Yellow μεταφορά μεταξύ των κυττάρων, ή την πρόσληψη από το μέσο ακόλουθη μηχανική διέγερση (Σχήμα 1Ε), αντίστοιχα (που συνοψίζονται in). Και οι δύο μεταλλάξεις Cx26 σχηματίζουν πλάκες στα κύτταρα HeLa (Σχήμα 1D), τεκμηριώνοντας ότι αυτές οι μεταλλάξεις εξακολουθούν να υποστηρίζουν τη συναρμολόγηση δομών διασταύρωση χάσματος [32]. Πλάκες φάνηκε να είναι πιο πολυάριθμες στην περίπτωση της HeLa26T135A, και μικρότερη στην περίπτωση του HeLa26R75Y (πρβλ Σχήματα 1Α και D), σε συμφωνία με προηγούμενες ενδείξεις ότι Cx26R75Y μπορεί να μειώσει τη σταθερότητα και το μέγεθος των πλακών μεσοκυττάριου [34].

Σε αντίθεση με άγριου-τύπου (W.T.) Cx26, κανένα από τα μεταλλάγματα Cx26 προκάλεσε καταστολή της ανάπτυξης των κυττάρων HeLa, είτε σε χαμηλό ορό (Σχήμα 1 F), ή υπό συνθήκες ανεξάρτητη από προσκόλληση (Εικόνα S2). Έτσι, ενδοκυτταρική επικοινωνία είναι απαραίτητη για την καθυστέρηση της ανάπτυξης από Cx26. Ενώ η λειτουργία του hemichannel HeLa26R75Y μείωσαν πυκνότητα κορεσμού, γεγονός που υποδηλώνει μια μερική ρόλο για ημικανάλια του βαθμού συσκευασίας των κυττάρων, το αποτέλεσμα ήταν μια μέτρια 20%, σε σύγκριση με W.T. Cx26, η οποία μείωσε την πυκνότητα κορεσμού κατά 60%. Αν και ενδοκυτταρική σύζευξη που ήταν σαφώς απαραίτητο για τη μεσολάβηση κοννεξίνης αναστροφή των μετασχηματισμένων χαρακτηριστικά ανάπτυξης, σύζευξη μέσω άλλων συνδετίνες (Cx43 και Cx32) ήταν αναποτελεσματική, υποδεικνύοντας έναν μοναδικό ρόλο για τα κανάλια Cx26.

Τα αποτελέσματα της ανάπτυξης των κόμβων χάσμα Cx26 διαμεσολαβείται από μπλοκ αναστρέψιμη κυτταρικού κύκλου

Ως ένα πρώτο βήμα για τον προσδιορισμό του μηχανισμού με τον οποίο Cx26 σύζευξη διασταύρωση κενό καταστέλλει μετατραπεί ανάπτυξη των κυττάρων HeLa, ρωτήσαμε αν αυτό ήταν συνέπεια αυξημένο κυτταρικό θάνατο, ή μειωμένη κυτταρική διαίρεση. HeLa26 κύτταρα δεν έδειξαν αύξηση στην χρώση TUNEL ή δραστικότητα κασπάσης-3 (δεν φαίνεται), υποδεικνύοντας ότι Cx26 δεν αύξησε την απόπτωση σε κύτταρα HeLa (Πίνακας S1). Υπήρξε κάποια αύξηση στο αννεξίνης V και την επισήμανση των κυττάρων Hoechst HeLa26, αλλά αυτά τα κύτταρα δεν έδειξαν μορφολογικά χαρακτηριστικά χαρακτηριστικό του κυτταρικού θανάτου με απόπτωση, νέκρωση ή αυτοφαγία. Αντ ‘αυτού, έδειξε τα χαρακτηριστικά συμφωνούν με κύτταρα τα οποία μπορεί να έχουν κλειδωθεί κυτοκίνηση (βλέπε παρακάτω), οι οποίες συνήθως παρουσιάζουν μεγαλύτερη διαπερατότητα της μεμβράνης. FACS ανάλυση των HeLa Par και Cx26 επιμολύνσεις μετά από ελευθέρωση% ορό 1 από θυμιδίνης /νοκοδαζόλη μπλοκ (G2 σύλληψη), αποκάλυψαν μια παρατεταμένη έξοδο από τη μίτωση στα κύτταρα HeLa26, με εμφανείς καθυστερήσεις σε όλες τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου. (Εικόνα 2Α). HeLa43, HeLa32, και οι δύο μεταλλαγμένα Cx26 HeLa μορφομετατροπείς κατανομές δείχνουν κυτταρικό κύκλο παρόμοια με HeLa Par (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Παρόμοιες μελέτες που συνέκριναν την ανάπτυξη μετά την απελευθέρωση από μπλοκ G1 που προκαλείται από διπλό μπλοκ θυμιδίνης απέδωσε παρόμοια αποτελέσματα, με την έξοδο από G1 /S καθυστέρηση κυρίως στα κύτταρα HeLa26 σε σύγκριση με HeLa43, HeLa32, και τα μεταλλαγμένα προϊόντα επιμόλυνσης Cx26 HeLa (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) Η κατανομή κυτταρικού κύκλου του HeLaPar (πάνω πίνακα) και HeLa26 (κάτω πίνακας) αναλύθηκε με FACS [διαχωρισμού κυττάρων σε G1 (ανοιχτό γκρι μπάρες), S (σκούρο γκρι μπάρες) και G2-M (μαύρο bars) φάσεις] στους αναγραφόμενους χρόνους μετά την προσθήκη του ορού 1% μετά ασιτία ορού. HeLa26 κύτταρα εμφανίζουν μια πιο αργή εξέλιξη διαμέσου του κυτταρικού κύκλου (π.χ. χρόνος να επιστρέψει στην G2: & gt? 24 ώρες σε σύγκριση με 16 ώρες για το HeLaPar), καθώς και μια αξιοσημείωτη απώλεια του συγχρονισμού. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

(Β) χρώση του πυρήνα με DAPI (αριστερή στήλη) αποκαλύπτει μια πολύ υψηλότερη συχνότητα multilobed πυρήνων σε κύτταρα που εκφράζουν Cx26 (10-14% – πάνελ III, V και VII) από HeLaPar κυττάρων (2 – 5% – πίνακας Ι). Συν-χρώση των ίδιων κυττάρων για γάμμα-τουμπουλίνης (δεξιά στήλη) δείχνει κεντροσωμάτια σε κύτταρα HeLaPar (πίνακας II) είτε ένα (αδρανή κύτταρα) ή δύο (διαιρούμενα κύτταρα). Σε αντίθεση, τα κύτταρα HeLa26 (πίνακες IV, VI και VIII) μοιράζονται συχνά μια ενιαία κεντροσωμάτων μεταξύ πολλαπλών πυρήνων (βέλη), ή να έχουν ένα σύμπλεγμα πολλαπλών κεντριόλα (βέλος) (μπαρ κλίμακα, 10μm).

(C ) το ποσοστό των πολλαπλών λοβών κύτταρα προσδιορίστηκε σε διαφορετικές ημέρες μετά την προσθήκη 1% ορό, είναι σταθερά υψηλότερη σε HeLa26 (γεμάτες ράβδοι) από HeLaPar (ανοικτές μπάρες), με τη μέγιστη διαφορά σε 1 ημέρα. Τα δεδομένα είναι μέση τιμή ± SEM. * Υποδηλώνει σημασία στην τιμή p & lt? 0,05. ** Δηλώνει σημασία σ τιμές & lt? 0.005.

Η

Hoechst ή DAPI χρώση με 1% ορό αποκάλυψε μια σημαντική συσσώρευση των πολυμορφικών πυρήνες, ή πολυ-πυρηνικών κυττάρων σε HeLa26 (≥10% 24 ώρες μετά την προσθήκη του ορού) σε σύγκριση με αυτή που παρατηρήθηκε σε HeLa Par ( & lt? 4%) (Σχήμα 2Β). Αυτά τα κύτταρα είναι σημαντικά μεγαλύτερες και πιο πεπλατυσμένο από αυτούς με μόνο πυρήνες, και εμφανίζονται συνεπή με την αποτυχία να ολοκληρωθεί με επιτυχία Μ φάση και /ή κυτταροκίνηση. Αυτές οι πυρηνικές ανωμαλίες που σχετίζονται είτε με μονό (βέλη στο Σχήμα 2Β, IV και VI), ή πολλαπλές (κεφαλή βέλους στο Σχήμα 2Β viii) κεντροσωμάτια εντός ενός κυττάρου, από κοινού από πολλούς πυρήνες, ή πυρηνική λοβούς. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με τις συνήθεις δύο κεντροσωμάτια συνδέονται με διαιρούμενα κύτταρα HeLa Par (ανοιχτό βέλος εις το Σχήμα 2Β ii), και υποδηλώνει ότι τα κύτταρα HeLa26 έχουν προβλήματα με τη ρύθμιση της κεντροσώματος επικαλύψεων. Άθικτα τα πυρηνικά μεμβράνες, η έλλειψη συμπυκνωμένη χρωματίνη, και η απουσία επισήμανση TUNEL σε HeLa26 (Πίνακας S1), δείχνουν ότι τα κύτταρα δεν εισέρχονται απόπτωση, αλλά τελικά έξοδο από τη μίτωση. Σε συμφωνία με αυτό, ενώ τα πολυ-λοβούς ή πολυ-εμπύρηνα κύτταρα είναι πάντα πιο άφθονα σε HeLa26 καλλιέργειες, δεν συσσωρεύεται με τον καιρό (Σχήμα 2C).

σύζευξη μεσοκυττάριου Cx26 επηρεάζει τα επίπεδα και τη δραστηριότητα αρκετών μιτογόνου μόρια

Σύμφωνα με τις παρατηρούμενες επιδράσεις της Cx26 στον κυτταρικό κύκλο των κυττάρων HeLa, η κατάσταση ενεργοποίησης των πολλών μιτογόνος ρυθμιστικές βρέθηκε να αυξάνεται χρόνια στην HeLa26 σε σύγκριση με τα κύτταρα HeLa Par και άλλες επιμολύνσεις Cx (Cx26R75Y φαίνεται σηματοδότησης ως παράδειγμα) κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης σε 1% ορό (Σχήμα 3 και Σχήμα S3). Συγκεκριμένα, τα επίπεδα της CDK αναστολέων, ρ21 και ρ27, οι οποίες ρυθμίζουν άμεσα G1 (ρ21 και ρ27) και G2 (ρ27) εξέλιξη, ήταν 1,5 έως 2 φορές υψηλότερες σε κύτταρα HeLa26 κατά την διάρκεια στέρησης ορού (0 χρονικό σημείο), και παρέμειναν υψηλότερα για 48 ή 24 ώρες μετά την προσθήκη του ορού 1%, αντίστοιχα.

(AG) τα επίπεδα πρωτεΐνης σε HeLaPar (ανοικτές μπάρες), HeLa26 (κλειστές ράβδοι) και HeLa26R75Y (καρό ράβδοι) προσδιορίστηκαν ποσοτικά από ψηφιοποιημένες εικόνες των κηλίδων Western (Εικόνα 2, συμπληρωματικά στοιχεία) αμέσως μετά ασιτία ορού (ημέρες 0), και καθημερινά μετά την προσθήκη του ορού 1%. Επίπεδα για κάθε πρωτεΐνη κανονικοποιήθηκαν με εκείνη των κυττάρων HeLaPar την ημέρα 0. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης. Επίπεδα των αναστολέων cdk, p21 (Α) και ρ27 (Β), και ο λόγος της φωσφορυλιωμένης (ενεργοποιημένης) προς τα συνολικά επίπεδα των μελών της οικογένειας ΜΑΡΚ και τις ρυθμιστικές τους, ΜΕΚ (C), ΕΚΚ (D), JNK (Ε) p38MAPK (F) και η καταλυτική υπομονάδα του ΡΚΑ (G) το καθένα σε υψηλότερες HeLa26. Αυτή η αύξηση, εμφανής κατά τη διάρκεια ασιτία ορού, συνεχίστηκε από 1 – 3 Ημέρες, ανάλογα με την πρωτεΐνη.

(Η) επίπεδα cAMP εκτιμήθηκαν με ELISA σε HeLaPar (open bar), HeLa26 (κλειστό bar) και HeLa26T135A (bar καρό). Σε αντίθεση με δραστηριότητα ΡΚΑ, τα επίπεδα cAMP δεν δείχνουν συνεπής αυξήσεις HeLa26 σε σύγκριση με τους άλλους τύπους κυττάρων. κύτταρα HeLa26R75Y δείχνουν τα επίπεδα cAMP παρόμοια με HeLa26T135A. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SEM από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν τις περιπτώσεις όπου η δραστηριότητα στο HeLa26 είναι σημαντικά υψηλότερη (* = p & lt? 0,05? ** = Ρ & lt? 0.005) τόσο από HeLaPar και HeLa26R75Y ή κύτταρα T135A

Η

Πολλά μέλη της μιτογόνου ενεργοποιηθεί. πρωτεϊνικής κινάσης (ΜΑΡΚ) οικογένεια, που είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν τα επίπεδα ρ21 και ρ27 (Erk 1/2, ρ38 και ΙΝΚ) (Σχήμα 3 CE), έδειξε επίμονος αυξήσεις (2- έως 3-πλάσια) σε HeLa26. Δύο κινάσες περαιτέρω ανοδικά, ΜΕΚ και η πρωτεΐνη κινάση Α (ΡΚΑ) καταλυτική υπομονάδα άλφα (Σχήμα 3 F και G), έδειξαν ακόμα μεγαλύτερη παρατεταμένη αυξήσεις στη δραστηριότητα στο HeLa26 (3- έως 5-φορές για πάνω από 72 ώρες μετά προσθήκη ορού). Οι αυξήσεις αυτές δεν παρατηρήθηκαν σε όλες τις μιτογόνο οδών όπως δεν παρατηρήθηκαν αλλαγές στην Akt ή p70 S6 κινάση.

Αν και παρατεταμένη ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ συσχετίζεται με μειωμένη κυτταρική διαίρεση [35,36], η οξεία ενεργοποίηση τους είναι συνήθως προ-μιτογόνο. Σε συμφωνία με αυτό, κατά τις πρώτες 2 ώρες μετά 1% διέγερση ορού, τα κύτταρα HeLa Par έδειξε μια παροδική ενεργοποίηση του Erk και JNK και μια μείωση της ρ38, που ακολουθείται από επανάληψη της βασική κατάσταση. Σε αντίθεση, HeLa26 δεν δείχνουν αυτές τις παροδικές αλλαγές στη δραστηριότητα (Σχήμα S4), αλλά μόνο μια βραδύτερη έναρξη εκκίνησης ενεργοποίηση ~ 2 ώρες μετά την προσθήκη του ορού.

Η ενεργοποίηση της PKA είναι τόσο αναγκαία και επαρκής για την καταστολή της ανάπτυξης με Cx26

Η λειτουργική συμβολή της ανύψωσης από αυτές τις κινάσες προς καταστολή της ανάπτυξης Cx26 εκτιμήθηκε με siRNA knockdown μελέτες Erk, JNK και την άλφα καταλυτική υπομονάδα ΡΚΑ. siRNAs προστέθηκε κατά την αρχική ασιτία ορού, 24 ώρες πριν από την προσθήκη 1% ορό, προκάλεσε μία 5-πλάσια μείωση της JNK και ένα 2-φορές μείωση της ERK και ΡΚΑ (Σχήμα 4Α). Υψηλότερα επίπεδα siRNA δεν χρησιμοποιήθηκαν για να αποφευχθούν τοξικές επιδράσεις στα κύτταρα, καθώς κάθε ένα από αυτά τα μονοπάτια σηματοδότησης απαιτείται επίσης για βασικοκυτταρικό κυτταρική διαίρεση.

(Α) Κυτταρολύματα HeLa26 (αριστερό πάνελ), υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τυχαία αλληλουχία siRNA (έλεγχος), ή siRNAs ειδικά για τα κινάσες που αναφέρονται, παρασκευάστηκαν 24 ώρες μετά την προσθήκη του ορού και ανιχνεύθηκαν με αντισώματα έναντι ολικής πρωτεΐνης όπως υποδεικνύεται στα αριστερά κάθε κηλίδα. Επίπεδα όλων των κινασών μειώθηκαν, με JNK μειώσεις είναι πιο δραματικές. Τα προϊόντα λύσης των κυττάρων HeLaPar (δεξί πάνελ) επιμολυσμένα με ένα CA-ΡΚΑ (ιδιοσυστατικά ενεργό) κατασκεύασμα έδειξαν πολύ υψηλότερη έκφραση του ΡΚΑ από μη επιμολυσμένα ελέγχους. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

(Β) Ανάπτυξη των διαφόρων siRNA κατεργασμένων κυττάρων HeLa26 (ανοικτές μπάρες), ή κύτταρα HeLaPar με και χωρίς ουσιαστικά δραστική έκφραση ΡΚΑ (κλειστές ράβδοι) συγκρίνονται ως αναλογία του κυττάρου αριθμός 24 ώρες μετά, και κατά το χρόνο της, προσθήκη ορού. Ο ρόλος των συστατική ενεργοποίηση του καθενός από τα μιτογόνου κινάσες σε αναστολή της ανάπτυξης του HeLa26 είναι εμφανής στην αντιστροφή του Cx26 που προκαλείται καταστολή της ανάπτυξης από τις αντίστοιχες siRNAs τους. Αυτό είναι πιο δραματική στην περίπτωση της PKA, όπου η ανάπτυξη επιστρέφει στα ίδια επίπεδα με τα κύτταρα HeLaPar. καταστολή της ανάπτυξης των κυττάρων HeLaPar, στον ίδιο βαθμό όπως φαίνεται στο HeLa26, με έκφραση CA-ΡΚΑ υποδεικνύει ότι ΡΚΑ μπορεί μόνη της να μεσολαβήσει αυτό το αποτέλεσμα. Οι σημαντικές διαφορές στην ανάπτυξη σημειώνονται με αστερίσκο (p & lt? 0,05).

Η

Κατά τη διάρκεια των πρώτων 24 ωρών σε 1% ορό, τα κύτταρα HeLa Par διπλασιάστηκε σε αριθμό, ενώ τα κύτταρα HeLa26 δεν έδειξε σημαντική αύξηση (Εικόνα 4Β ), σύμφωνα με την καθυστέρηση στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου που παρατηρείται στην ανάλυση FACS στο Σχήμα 2Α. Η θεραπεία με siRNA τυχαίας αλληλουχίας δεν είχε καμία επίδραση σε αυτό το πρότυπο ανάπτυξης. Erk και JNK siRNAs μεμονωμένα ή από κοινού, προκάλεσε μερική απώλεια της αναστολής της ανάπτυξης σε κύτταρα HeLa26, αλλά siRNA να ΡΚΑ προκάλεσε μια πλήρη αναστροφή με το πρότυπο ανάπτυξης των κυττάρων HeLa Par. Περαιτέρω, η υπερ-έκφραση της καταλυτικής υπομονάδας άλφα ΡΚΑ σε κύτταρα HeLa (Εικόνα 4Α, δεξιό πλαίσιο) κατέστειλε την ανάπτυξη τους με την ίδια ταχύτητα με εκείνη των κυττάρων HeLa26 (Σχήμα 4Β). Έτσι, ενώ η ενεργοποίηση των άλλων κατάντη κινασών συμβάλλει στη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης HeLa, ενεργοποίηση ΡΚΑ φαίνεται να είναι ο κυρίαρχος παράγοντας που επηρεάζει, όντας τόσο αναγκαία όσο και επαρκή για τις επιπτώσεις της Cx26 στην ανάπτυξη HeLa σε χαμηλό ορό.

Η ενεργοποίηση της PKA από Cx26 σύζευξη μεσοκυττάριου προκαλείται από την αναδιανομή του cAMP, όχι από την ανύψωση της στάθμης της

Ο πρωταρχικός ρόλος της PKA αποδείχθηκε παραπάνω εμπλέκει έντονα cAMP ως ρυθμιστικό σήμα πιθανή ανάπτυξη. Ωστόσο, οι συγκρίσεις των παγκόσμιων επιπέδων cAMP σε HeLa26, HeLa Par και πολιτισμούς HeLa26R75Y (Σχήμα 3Η) δεν αποκάλυψε συνεπείς διαφορές μεταξύ των κυτταρικών γραμμών πάνω από τρεις ημέρες ανάπτυξης σε 1% ορό. Ωστόσο, cAMP έχει αποδειχθεί ότι είναι διαπερατό διαμέσου Cx26 καναλιών στενών τμημάτων του μεσοκυττάριου μεταξύ των κυττάρων HeLa [37,38]. Επειδή τα λειτουργικά μεσοκυττάρια κανάλια απαιτούνται για την ενεργοποίηση ΡΚΑ και καταστολή της ανάπτυξης, αυτό μας οδήγησε να διερευνήσει εάν ένας διάχυση της cAMP από τα κύτταρα με υψηλές συγκεντρώσεις σε κύτταρα με χαμηλότερες συγκεντρώσεις θα μπορούσε να οδηγήσει σε ένα μεγαλύτερο κλάσμα των κυττάρων με ενεργοποιημένα ΡΚΑ, χωρίς καμία απαίτηση για πρόσθετες παραγωγή cAMP.

για να απεικονίσει άμεσα τα επίπεδα cAMP χωρικά, ένας δημοσιογράφος FRET απασχολούν EPAC ως πεδίο ανίχνευσης cAMP ανάμεσα ΚΑΠ και φθοροφόρων YFP εισήχθη μέσα στα κύτταρα με επιμόλυνση. Λεύκανση του YFP (ο δέκτης) fluorphore είχε ως αποτέλεσμα μια αύξηση της ΚΑΠ (δότης) φθορισμού (23%) (Σχήμα 5Α) που δεν παρατηρήθηκε όταν ΚΑΠ και YFP εκφράστηκαν μόνο (2%) ή μαζί, αλλά σε διαφορετικά μόρια ( ~ 4%). Αύξηση της cAMP από 8-Br cAMP (αγωνιστής cAMP), φορσκολίνη (αδενυλ ενεργοποιητή κυκλάσης) και 3-ισοβουτυλ-1-μεθυλξανθίνη (αναστολέας φωσφοδιεστεράσης) προκάλεσε απώλεια της FRET σε & lt? 10%, προφανώς λόγω επέκταση του μορίου EPAC επί cAMP πρόσδεσης (τα δεδομένα συνοψίζονται στο Σχήμα 5Β). FRET αναγνώσεις από μεμονωμένα κύτταρα σε μη συγχρονισμένη HeLa Par και HeLa26 πολιτισμών απεικονίστηκαν σε ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο συσχετίστηκαν με το περιεχόμενο του DNA και πυρηνική μορφολογία. Τα επίπεδα cAMP σε κύτταρα HeLa Par αυξημένη ~ 2 φορές από μεσόφαση προς τη μίτωση. Αυτή η διαφορά ήταν σχεδόν εντελώς χαθεί σε κύτταρα HeLa26, λόγω των αυξημένων επιπέδων μεσόφαση και μειωμένα επίπεδα σε μιτωτικά κύτταρα (Σχήμα 5C). Παρακολούθηση των επιπέδων cAMP σε όλη την κανονική του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα παρ HeLa συγχρονίζονται με διπλό μπλοκ θυμιδίνης, επιβεβαίωσε ότι τα επίπεδα cAMP παραμένουν χαμηλά κατά τη διάρκεια της G1 και S, αυξάνεται στην G2, αιχμής σε μετάφαση, και στη συνέχεια να μειωθεί κατά το τελευταίο μέρος της μίτωσης (Σχήμα 5D) . Αυτοί οι «κορυφές και κοιλάδες» της cAMP φαίνεται να εξαλειφθούν στα κύτταρα HeLa26 λόγω της διάχυσης του cAMP από τις σχετικά λίγα κύτταρα Μ φάση, στην πλειονότητα των G1 κύτταρα φάσης /S. Η προκύπτουσα αύξηση του cAMP στα κύτταρα φάση G1 /S επάγει την ενεργοποίηση του ΡΚΑ, το οποίο είναι ανασταλτικό αύξησης σε αυτό το στάδιο του κυτταρικού κύκλου [39]. Αυτό εξηγεί τα αποτελέσματα στο Σχήμα 4Β, όπου knock-down της PKA (ιδιαίτερα κατά τη διάρκεια της G1 /S φάσης) μπορεί να εξαλείψει τις επιδράσεις καταστολής ανάπτυξης Cx26 του Cx26, ενώ η ενεργοποίησή του μπορεί να το μιμηθεί.

(α) εκπροσώπηση του αποδέκτη φωτολευκάνσεως FRET, παρουσιάζοντας αύξηση σε δότη (ΚΑΠ) φθορισμού μετά από πλήρη δέκτη (YFP) φωτολεύκανση.

(Β) FRET απόδοση είναι ελάχιστη όταν ΚΑΠ και YFP εκφράζονται ξεχωριστά ή μαζί, αλλά δεν συνδέονται με ένα κοινός μεταφορέας. FRET αποδοτικότητα του διπλά επισημασμένου EPAC κατασκευάσει αυξάνεται κατά σχεδόν 10 φορές, αλλά πέφτει σε μόλις 3-4 φορές πάνω από το υπόβαθρο όταν τα επίπεδα cAMP αυξημένη.

(C) FRET μετρήσεις 1 ημέρα μετά την προσθήκη ορού από μεμονωμένα κύτταρα είτε μεσόφαση ή μίτωση δείχνουν ότι οι αλλαγές στα επίπεδα cAMP με τον κυτταρικό κύκλο παρατηρείται σε κύτταρα HeLa εξαλείφεται κατά την έκφραση του Cx26.

(D) FRET ανάλυση ενός πληθυσμού κυττάρων HeLaPar συγχρονισμένη σε G1, δείχνει την ταλαντωτική πρότυπο του cAMP με τον κυτταρικό κύκλο, με τα επίπεδα που παραμένουν χαμηλά σε όλη μεσόφαση, και κορυφώθηκε κατά τη διάρκεια του τμήματος μετάφαση της μίτωσης.

bar Κλίμακα αντιπροσωπεύουν ~ 40 μΜ. Ένα ελάχιστο των 25 κυττάρων κατά μέσο όρο για κάθε κυτταρικό τύπο και το στάδιο του κυτταρικού κύκλου για FRET.

(Ε) Ανοσοκυτοχημεία των ενεργών φωσφο-PKA (καταλυτική υπομονάδα άλφα) 1 ημέρα μετά την 1% προσθήκη ορού (επάνω σειρά) αποκαλύπτει ένα ετερογενές πρότυπο χρώσης σε κύτταρα HeLaPar και κύτταρα που εκφράζουν Cx43 ή το κανάλι μεσοκυττάριου ανεπάρκεια Cx26R75Y μεταλλαγμένο. Αντίθετα, τα επίπεδα π-PKA στην HeLa26 είναι υψηλότερα και πιο ομοιόμορφη σε όλα τα κύτταρα. Σκοράροντας χωριστά κελιά για καθαρό σήμα και το DNA περιεχόμενο ρ-PKA όπως εκτιμάται με χρώση DAPI αποκαλύπτει μια συσχέτιση (κάτω γραφικές παραστάσεις), με τα επίπεδα π-PKA είναι χαμηλή σε G1 /S (χαμηλότερη περιεκτικότητα σε DNA) και υψηλή περιεκτικότητα σε G2 /M (υψηλότερη DNA περιεχόμενο). Αυτή η διαφορά μειώνεται δραματικά σε HeLa26 καλλιέργειες.

Η

Για να επιβεβαιώσει εάν αυτή η ανακατανομή της cAMP ήταν σύμφωνη με τη συνολική αύξηση της φωσφορυλίωσης PKA στην ενεργοποίηση ιστοσελίδα Thr197 [40] είχαμε παρατηρείται (Σχήμα 3G), εξετάσαμε επίσης τα χωρικά πρότυπα των p- χρώση PKA σε HeLa Par, 26, 43 και πολιτισμούς 26R75Y (Σχήμα 5Ε). Η χρώση των μεμονωμένων κυττάρων ήταν εξαιρετικά ετερογενής σε όλες τις καλλιέργειες που δείχνουν ραγδαία αύξηση σε χαμηλό ορό (HeLa Par, Cx43 και Cx26R75Y). Συν-χρώση με ϋΑΡΙ αποκάλυψε μια σαφής συσχέτιση μεταξύ της έντασης της επισήμανσης Ρ-ΡΚΑ κάθε κυττάρου με περιεχόμενο DNA του (Σχήμα 5Ε – οικόπεδα κάτω από κάθε ανοσοφθορισμού εικόνας), με τα υψηλότερα επίπεδα του Ρ-ΡΚΑ μετά την αντιγραφή του DNA είναι συνεπές με την παρατηρηθείσα αιχμή στα επίπεδα cAMP σε φάση Μ φαίνεται στο Σχήμα 5Β. HeLa26 κύτταρα παρουσίασε μια εξαίρεση σε αυτό το μοτίβο από το γεγονός ότι η χρώση των κυττάρων ήταν πιο ομοιόμορφη. Δεν αποτελεί έκπληξη, η συσχέτιση της έντασης P-ΡΚΑ με περιεχόμενο DNA επίσης μειώνεται δραματικά, συνεπείς με τις ελάχιστες διαφορές που βλέπουμε στα επίπεδα cAMP μεταξύ Μ φάση και κύτταρα φάσης S σε αυτές τις καλλιέργειες (Σχήμα 5C). Αυτά τα αποτελέσματα είναι μόνο εξηγείται εύκολα από ανακατανομή των cAMP μέσω καναλιών Cx26, από κύτταρα με υψηλότερες συγκεντρώσεις (φάση Μ), σε κύτταρα με χαμηλότερες συγκεντρώσεις (G1 /S φάση). Αυτό προφανώς οδηγεί σε ένα πολύ υψηλότερο κλάσμα των κυττάρων φθάσει σε επίπεδα cAMP επαρκής για να επάγει φωσφορυλίωση του ΡΚΑ, οδηγώντας σε ενεργοποίηση της και μια συνολική αυξορρύθμιση της δραστηριότητας ΡΚΑ στην καλλιέργεια χωρίς πραγματική αύξηση στα συνολικά επίπεδα cAMP.

Cx43 και τα κανάλια Cx32 ήταν αναποτελεσματικά στην καταστολή της ανάπτυξης, όπως αυτά τα κανάλια κοντά κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου

Επειδή HeLa43 και HeLa32 κύτταρα δείχνουν ισχυρή μεσοκυττάρια σύζευξης, και δεδομένου προηγούμενες ενδείξεις που cAMP μπορούν να περάσουν μέσα από τα δύο κανάλια Cx43 και Cx26 σε αυτές κύτταρα [37], επιδιώξαμε να προσδιορίσετε το λόγο Cx43 και 32 ήταν αναποτελεσματικά στην καταστολή της ανάπτυξης. Επειδή τα επίπεδα της cAMP αυξάνουν μόνο κατά τη φάση Μ, όπου έχει αναφερθεί ότι η σύζευξη μεσοκυττάριου μπορεί να μειώσει, εξετάσαμε αν οι τρεις αυτοί συνδετίνες ρυθμίζονται διαφορικά κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Τα κύτταρα συγχρονίστηκαν σε φάση S με διπλό μπλοκ θυμιδίνης σε κανονική (10%) στον ορό. Σε αντίθεση με την συμπεριφορά σε χαμηλό ορό (Σχήμα 1), όλες οι κυτταρικές σειρές HeLa αυξήθηκε με παρόμοιους ρυθμούς σε φυσιολογικό ορό. Ο βαθμός συγχρονισμού, καθώς επίσης και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου μετά την απελευθέρωση από μπλοκ, βρέθηκε να είναι η ίδια και για τις τρεις μορφομετατροπείς συνδετίνης υπό κανονικές συνθήκες ορού. .