Αφηρημένο

Ιστορικό

εκκριτική πρωτεΐνη όξινο και πλούσια σε κυστεΐνη (SPARC) είναι μια γλυκοπρωτεΐνη η οποία λειτουργεί για να αναστέλλουν την αγγειογένεση, πολλαπλασιασμό, και εισβολή σε διαφορετικούς τύπους καρκίνου. Η ικανότητα του να διαμορφώνει SPARC νεοαγγείωση πιστεύεται ότι προκαλείται εν μέρει από την ικανότητά του να ρυθμίζει την έκφραση του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) και μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (ΜΜΡ). Σε αυτή τη μελέτη, με στόχο να προσδιοριστεί η επίδραση της έκφρασης SPARC στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα στον πολλαπλασιασμό και την αγγειογένεση

in vitro

και

in vivo

.

Μέθοδος

Αξιολογήσαμε έκφραση του SPARC σε επτά ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Τότε ιδρύσαμε μια σταθερά επιμολυσμένα SPARC υπερεκφράζεται κυτταρική σειρά (BGC-SP) και μια σταθερά επιμολυσμένα SPARC κυτταρική σειρά knock-down (HGC-sh). Η επίδραση της SPARC υπερέκφραση και SPARC σίγηση μελετήθηκε εξετάζοντας τριχοειδή σχηματισμό HUVECs

in vitro

και της πτυχής του δέρματος μοντέλο θάλαμο ραχιαίο

in vivo

. Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου και κηλίδωση Western διεξήχθησαν για να ανιχνεύσει αν οι εκφράσεις του VEGF και ΜΜΡ-7 διαμορφώνεται με έκφραση SPARC. Για να προσδιοριστεί περαιτέρω το αποτέλεσμα της έκφρασης SPARC την αγγειογένεση

in vivo

, ιδρύθηκαν μοντέλα ξενομοσχεύματος και μικροαγγειακή πυκνότητα (MVD) των διαφορετικών κλώνων ανιχνεύθηκαν με ανοσοϊστοχημεία.

Αποτελέσματα

η ενδογενής SPARC υπερέκφραση ανέστειλε την έκφραση του VEGF και ΜΜΡ-7, καθώς και η αγγειογένεση που επάγεται από τα κύτταρα BGC-SP. Αντίστοιχα, SPARC σίγηση αύξησε την έκφραση του VEGF και ΜΜΡ-7, καθώς και η αγγειογένεση που επάγεται από HGC-sh κύτταρα. Αυξημένα αγγειογένεση που επάγεται από SPARC φίμωση σε HGC-sh κύτταρα μειώθηκε όταν VEGF εξουδετερώθηκε από αντισώματα, και ΜΜΡ-7 χτυπήθηκε κάτω

in vitro

Συμπέρασμα

SPARC

. καταστέλλει την αγγειογένεση του καρκίνου του στομάχου από τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης του VEGF και MMP-7

Παράθεση:. Zhang JL, Chen GW, Liu YC, Wang PY, Wang Χ, Wan YL, et al. (2012) εκκρινόμενη πρωτεΐνη Όξινα και πλούσια σε κυστεΐνη (SPARC) Καταστέλλει αγγειογένεση με Down-ρύθμιση της έκφρασης του VEGF και ΜΜΡ-7 σε γαστρικό καρκίνο. PLoS ONE 7 (9): e44618. doi: 10.1371 /journal.pone.0044618

Επιμέλεια: Rajesh Mohanraj, Πανεπιστήμιο ΗΑΕ, Ηνωμένα Αραβικά Εμιράτα

Ελήφθη: 9 Ιούνη του 2012? Αποδεκτές: 6, Αύγ του 2012? Δημοσιεύθηκε: 5 του Σεπτεμβρίου του 2012

Copyright: © Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 30901417 /H1617). https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Μεταξύ των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με γαστρικό καρκίνο κατέχει τη δεύτερη θέση παγκοσμίως, μετά τον καρκίνο του πνεύμονα? σχεδόν τα δύο τρίτα των περιπτώσεων συμβαίνουν σε αναπτυσσόμενες χώρες, μεταξύ των οποίων 42% από την Κίνα [1]. Η αγγειογένεση είναι μια κρίσιμη διαδικασία στην γαστρικό καρκίνο? Ως εκ τούτου, οι ρυθμιστικές και σηματοδότηση μορίων που διαμορφώνουν την αγγειογένεση να γίνει το επίκεντρο της παρούσας έρευνας. Η αγγειογένεση δεν είναι μια ενεργός διαδικασία από μόνη της? ελέγχεται από ορισμένους αγγειογόνους παράγοντες και ορισμένες αναστολείς της αγγειογένεσης.

εκκρινόμενη πρωτεΐνη όξινο και πλούσια σε κυστεΐνη (SPARC), επίσης γνωστή ως Οστεονεκτίνη ή BM-40, είναι ένα πολύπλευρο εκκρινόμενη γλυκοπρωτεΐνη που εκφράζεται από πολλούς διαφορετικούς τύπους κυττάρων και συνδέεται με το σχηματισμό των οστών, ίνωση και την επισκευή ιστών.

Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι SPARC ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση, την εισβολή και την αγγειογένεση σε διαφορετικούς τύπους καρκινικών κυττάρων, ωστόσο, ο ρόλος των SPARC σε ογκογένεση είναι περίπλοκη και φαίνεται να είναι κυτταρικό τύπο, λόγω ποικίλες λειτουργίες του σε ένα δεδομένο μικρο-περιβάλλον [2]. SPARC λειτουργεί ως καταστολέας όγκων σε καρκίνους του μαστού, νευροβλάστωμα, παγκρεατικό, ωοθήκης και του πνεύμονα [3]. Ο καρκίνος των ωοθηκών σε SPARC-μηδενικούς ποντικούς αυξήθηκε σημαντικά μεγαλύτερο από ότι στα ζώα άγριου τύπου με επαυξημένης επίπεδα του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) και μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (MMPs) [4]. Καταστέλλοντας την αγγείωση του όγκου μέσω της καταστολής της έκφρασης και της έκκρισης του VEGF, SPARC ανέστειλε γλοίωμα ανάπτυξης [5]. SPARC δεσμεύεται με VEGF, αναστέλλοντας έτσι τη φωσφορυλίωση VEGFR, που ενεργοποιείται από μιτογόνο κινασών πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) και ενεργοποίηση της σύνθεσης του DNA που επάγεται με VEGF [6]. Ωστόσο, ο ρόλος της SPARC στην αγγειογένεση είναι επίσης κυτταρικό τύπο, η οποία μεταβάλλει τα γεγονότα μεταγωγής σήματος σε απόκριση στη μοναδική κυτταρική περιβαλλόντων [7].

VEGF διεγείρει την αγγειογένεση, και είναι η πιο σημαντική πρωτεΐνη σήμα που παράγεται από τα κύτταρα [8]. ΜΜΡ παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του όγκου, όχι μόνο στην αποικοδόμηση της εξωκυτταρικής μήτρας αλλά επίσης στη ρύθμιση της αγγειογένεσης. ΜΜΡ-7, το οποίο είναι το μικρότερο μοριακό βάρος όλων των μελών της οικογένειας των ΜΜΡ, έχει αποδειχθεί ότι επιταχύνει τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων ομφάλιων φλεβικών ενδοθηλιακών κυττάρων (HUVEC) με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο

in vitro

[9].

Η πρωταρχική λειτουργία της SPARC στην αγγειογένεση των κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου παραμένει ασαφής. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, υποθέσαμε ότι SPARC μπορούσε ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό και την αγγειογένεση ρυθμίζοντας VEGF και ΜΜΡ-7 εκφράσεις σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα. Για να δοκιμαστούν αυτές οι υποθέσεις, εξετάσαμε την έκφραση του SPARC σε επτά κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Στη συνέχεια, για να αξιολογηθεί το αποτέλεσμα της διαταραγμένης SPARC στη γαστρική καρκινικά κύτταρα, έχουμε δημιουργήσει ένα κλώνο BGC-SP που υπερεκφράζεται SPARC και ένα κλώνο HGC-sh στην οποία η ενδογενής SPARC χτυπήθηκε κάτω.

Αποτελέσματα

Η έκφραση της SPARC σε κύτταρα που καλλιεργήθηκαν γαστρικός καρκίνος

Εμείς αξιολογούνται έκφραση SPARC σε διάφορες ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Κηλίδωση Western έδειξε ότι η SPARC ήταν undectable σε κυτταρικές σειρές AGS, ΜΚΝ45, NCI-Ν87 και BGC-823, ωστόσο SGC-7901 κυτταρική γραμμή που εκφράζεται χαμηλό επίπεδο SPARC και HGC-27, MGC-803 κυτταρικές σειρές εξέφρασαν υψηλό επίπεδο SPARC ( Σχήμα 1Α).

(Α) έκφραση της πρωτεΐνης SPARC σε 7 τύπους κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου. (Β) πρωτεΐνη SPARC (άνω πάνελ) και mRNA (κάτω πίνακας) έκφραση σε γονικά κύτταρα (BGC-Ρ και HGC-P), κενό φορέα επιμολυσμένοι κλώνοι (BGC-EV και HGC-EV), SPARC cDNA που εκφράζουν κλώνος (BGC -δΡ) και SPARC shRNA εκφράζουν κλώνος (HGC-sh). GAPDH χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. (Γ) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. κύτταρα και επιμολυσμένοι κλώνοι (500 κύτταρα) BGC-Ρ και HGC-P καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και επωάστηκαν για 8 ημέρες και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με τη μέθοδο ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσο (± sd) του προσδιορισμών εις τετραπλούν από έξι ξεχωριστά πειράματα.

Η

Η υπερέκφραση και αναστολή της ενδογενούς SPARC σε γαστρικός καρκίνος Κυτταρικές Γραμμές

κηλίδωση Western έδειξε ότι το 43 kDa ζώνη που αντιστοιχεί στην πρωτεΐνη SPARC ήταν σημαντικά αυξημένη σε BGC-SP (κύτταρα BGC εκφράζουν SPARC cDNA) κυττάρων σε σύγκριση με γονικά κύτταρα (BGC-Ρ) και ελέγχου επιμολυσμένα με τον κενό φορέα (BGC-EV) (Ρ & lt? 0,05)? η SPARC ανεστάλη κατά σχεδόν τα δύο τρίτα των HGC-sh (κύτταρα HGC εκφράζουν SPARC-shRNA) σε σύγκριση με τα κύτταρα HGC-P και HGC-EV (P & lt? 0.05, Σχήμα 1Β). RT-PCR έδειξε ότι η έκφραση SPARC mRNA σε κύτταρα BGC-SP ήταν αυξημένη σε σύγκριση με BGC-Ρ και τα κύτταρα BGC-EV (Ρ & lt? 0,05)? η έκφραση SPARC mRNA σε HGC-sh μειώθηκαν κατά σχεδόν 80% σε σύγκριση με HGC-P και τα κύτταρα HGC-EV (P & lt? 0.05, Σχήμα 1Β).

SPARC υπερέκφραση μειώνει τον πολλαπλασιασμό του γαστρικού καρκίνου κυτταρικών γραμμών

Για να καθοριστεί εάν η έκφραση μεταβάλλεται SPARC επηρεάζεται ο πολλαπλασιασμός των κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου, η ανάπτυξη των επιμολυσμένων κυττάρων συγκρίθηκαν με εκείνα των γονικών και κενά στοιχεία ελέγχου φορέα. Τα δεδομένα έδειξαν ότι η ανάπτυξη των κυττάρων BGC-SP αναστάλθηκε σε σύγκριση με BGC-P και BGC-EV κύτταρα μετά από 8 ημέρες καλλιέργειας (Ρ & lt? 0,05)? η ανάπτυξη των HGC-sh κυττάρων αυξήθηκε ελαφρά σε σύγκριση με HGC-Ρ και τα κύτταρα HGC-EV (Ρ & lt? 0,05, Σχήμα 1 C).

SPARC υπερέκφραση σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου Μειώνει αγγειογένεση

in vitro

και

in vivo

η

για να κατανοήσουν την επίδραση των αλλαγμένη έκφραση SPARC στην αγγειογένεση σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου, HUVECs επωάζονται σε ρυθμισμένα μέσα. Το υπερκείμενο BGC-SP επαγόμενη HUVECs να διαφοροποιηθούν σε τριχοειδείς δομές σαν μέσα σε 36 h (2564,5 ± 553,1 μm, Ρ & lt? 0,05) σε μικρότερο βαθμό από ό, τι το υπερκείμενο από κύτταρα BGC-EV (5002,4 ± 665,7 μm) και τα κύτταρα BGC-P (5417,3 ± 784,25 μm, Σχήμα 2Α). Το υπερκείμενο HGC-sh επαγόμενη HUVECs να διαφοροποιηθούν σε τριχοειδείς δομές σαν μέσα σε 36 h (7024,9 ± 923,1 μm, Ρ & lt? 0,05) σε ένα ισχυρότερο βαθμό από το υπερκείμενο από κύτταρα HGC-EV (4456,2 ± 554,2 μm) και τα κύτταρα HGC-P (4023,4 ± 665,2 μm, Σχήμα 2Α). Η ποσοτικοποίηση του μέσου μήκους σωλήνα έδειξαν ότι το μήκος του σωλήνα του HUVECs σε ρυθμισμένα μέσα από BGC-SP μειώθηκε κατά περίπου 52,7% σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου? μήκος του σωλήνα του HUVECs σε ρυθμισμένα μέσα από HGC-sh κλώνων αυξήθηκε 74,6% σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 2Α)

(Α)

In vitro

αγγειογένεσης:. HUVECs σπάρθηκαν σε Matrigel -επικαλυμμένα πλάκες 96 φρεατίων επωάστηκαν με υπερκείμενο συλλέγεται από BGC-Ρ και HGC-Ρ κύτταρα ή επιμολυσμένων κλώνων. Τα κύτταρα αφέθηκαν σε καλλιέργεια για 36 ώρες επί Matrigel σε μέσο υπό όρους. Οι επιδράσεις της ρυθμισμένα μέσα στο τριχοειδές σχηματίζεται από HUVECs αναλύθηκαν, και μετρήθηκε το τριχοειδές μήκος. δεδομένα μήκους τριχοειδούς εμφανίζονται είναι μέσα (± Τ.Α.) του τετραπλούν προσδιορισμών από τρία ξεχωριστά πειράματα. * P & lt? 0,05, σημαντική διαφορά από τα κύτταρα ελέγχου. (Β)

In vivo

αγγειογένεση: BGC-P, BGC-EV, BGC-SP, HGC-P, HGC -EV, ή HGC-sh (1 × 10

6) εμφυτεύθηκαν σε διάχυση θάλαμοι και χειρουργικά τοποθετείται κάτω από το ραχιαίο δέρμα αθυμικών γυμνών ποντικών. PV, προϋπάρχουσα αγγείωση? ΤΝ, προκαλούμενη από όγκο αγγείωση. Νεοσυσταθείσα σκάφη ποσοτικά και εκπροσωπήθηκαν ως ανά πεδίο. Οι στήλες είναι μέσα (± Τ.Α.) Του τετραπλούν πεδία από τρία ξεχωριστά πειράματα. * P & lt?. 0.05, σημαντική διαφορά από τα κύτταρα ελέγχου

Η

Το μοντέλο παράθυρο ραχιαίο έδειξε ότι τα κύτταρα BGC-SP παρουσίασαν μείωση 40,4% σε μικροαγγεία προκαλούμενη από όγκο, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (P & lt? 0,05) . HGC-sh κύτταρα στον θάλαμο ραχιαίο δέρμα φορές είχε ως αποτέλεσμα μια αύξηση 73,2% σε μικροαγγεία προκαλούμενη από όγκο, με ένα μεγαλύτερο αριθμό μικροσκοπικών κηλίδων αιμορραγίας σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Ρ & lt? 0.05 Σχήμα 2Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν σαφώς ότι SPARC υπερέκφραση σε καρκίνο του στομάχου ανέστειλε την αγγειογένεση

in vitro

και

in vivo

.

Η ΜΑΡΚ σηματοδότηση Pathway και έκφραση του VEGF και MMP-7 αναστέλλονται με SPARC υπερέκφραση

για να προσδιοριστεί η επίδραση της υπερέκφρασης SPARC για ΜΜΡ-7 και VEGF, ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR και κηλίδωση Western δοκιμασίες διεξήχθησαν. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ΜΜΡ-7 και η έκφραση του VEGF ρυθμίζεται αρνητικά από την έκφραση SPARC. Σε κύτταρα BGC-SP, τα επίπεδα της ΜΜΡ-7 mRNA, ΜΜΡ-7 πρωτεΐνης, VEGF mRNA, και η πρωτεΐνη VEGF ανεστάλησαν κατά 87,2%, 68,9%, 48,4%, και 58,6%, αντίστοιχα, σε σύγκριση με άδειο φορέα επιμολυσμένα κύτταρα. Σε HGC-sh κύτταρα, το επίπεδο του mRNA ΜΜΡ-7 αυξήθηκαν 11,6 φορές, το επίπεδο της πρωτεΐνης ΜΜΡ-7 αυξήθηκε 8,1 φορές, το επίπεδο VEGF mRNA αυξήθηκε 8,8-φορές, και το επίπεδο πρωτεΐνης VEGF αυξήθηκε 3,2 φορές σε σύγκριση με τις κενές διάνυσμα κύτταρα (Σχήμα 3Α, Β). Για να προσδιορίσετε αν το σηματοδοτικό μονοπάτι ΜΑΡΚ ρυθμιζόταν από SPARC, SAPK /JNK, ERK1 /2 και ρ-38 επίπεδα αξιολογήθηκαν από western αποτύπωση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα επίπεδα του p-ERK1 /2 ήταν σημαντικά μειωμένη σε κύτταρα BGC-SP και αυξημένα σε HGC-sh κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου τους (Σχήμα 3C).

χρησιμοποιήθηκαν (Α) Κυτταρολύματα να εκτελέσει κηλίδωση Western ανάλυση για τον VEGF και ΜΜΡ-7 έκφραση. GAPDH χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. Οι εκφράσεις του VEGF και MMP-7 μειώθηκαν στο επίπεδο της πρωτεΐνης στα κύτταρα BGC-SP. Οι εκφράσεις του VEGF και ΜΜΡ-7 αυξήθηκαν σε επίπεδο πρωτεΐνης σε κύτταρα HGC-sh. Οι στήλες είναι μέσα (± Τ.Α.) Των πειραμάτων εις τριπλούν? * P & lt? 0,05, σημαντική διαφορά από τα κύτταρα ελέγχου. (Β) σε πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε για την αξιολόγηση του VEGF και ΜΜΡ-7 επίπεδα μεταγραφής mRNA. GAPDH χρησίμευσε ως βαθμονόμηση φόρτωσης. Οι στήλες είναι μέσα (± Τ.Α.) Των πειραμάτων εις τριπλούν? * P & lt? 0,05, σημαντική διαφορά από τα κύτταρα ελέγχου. (Γ) Τα κυτταρολύματα χρησιμοποιήθηκαν για την εκτέλεση κηλίδωση Western ανάλυση για μόρια σε μονοπάτι σηματοδότησης ΜΑΡΚ. Η ενεργοποίηση των ERK1 /2 παρεμποδίστηκε σε κύτταρα BGC-SP σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, ωστόσο, ERK1 /2 ενεργοποιήθηκε σε HGC-sh κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου.

Η

Νοκ-κάτω της SPARC Έκφρασης σε HGC-27 κύτταρα προάγει την αγγειογένεση μέσω Up-ρυθμιζόμενες VEGF και ΜΜΡ-7 έκφραση

για να επιβεβαιωθεί ότι τα προ-αγγειογενετική επιδράσεις που παρατηρήθηκαν με μειωμένη έκφραση SPARC οφείλονται στην αυξημένη έκφραση ΜΜΡ-7 και VEGF και όχι σε επίπεδα της ίδιας της SPARC, HUVECs επωάζονται σε ρυθμισμένα μέσα συλλέχθηκαν από κύτταρα HGC-sh με εξωγενή προστίθεται ανασυνδυασμένη ανθρώπινη SPARC (rhSPARC, 0,3 μg /ml). Τα δεδομένα μας έδειξαν ότι η προσθήκη εξωγενούς SPARC δεν αναστέλλει τριχοειδείς δομές τύπου του HUVECs σε σύγκριση με HGC-sh (Σχήμα 4), σε αντίθεση με το αντι-αγγειογενετική απόκριση που παρατηρείται με ενδογενή έκφραση της SPARC σε BGC823 κύτταρα (Σχήμα 2).

(Α) εμπλουτισμένο μέσο από HGC-P, HGC-EV, HGC-sh με ή χωρίς rhSPARC (0,3 μg /ml) και HGC-sh + ΜΜΡ7-sh κύτταρα συμπυκνώθηκαν κάτω από τις ίδιες συνθήκες. β-καζεΐνη ζυμογραφία διεξήχθη για ΜΜΡ-7 δραστηριότητα. Ανάλυση Western blotting πραγματοποιήθηκε για ΜΜΡ-7, SPARC και τα επίπεδα πρωτεΐνης VEGF σε ρυθμισμένα μέσα. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και τα προϊόντα λύσης ανιχνεύθηκαν με αντίσωμα GAPDH για τη βαθμονόμηση συνολικό ποσό των αντίστοιχων πρωτεϊνών. Οι στήλες είναι μέσα (± Τ.Α.) Των πειραμάτων εις τριπλούν. (Β)

In vitro

αγγειογένεσης: Προκειμένου να επιβεβαιωθεί ότι SPARC έκφραση μεσολάβηση αντι-αγγειογενετική επιδράσεις οφείλονται στην αλλαγμένη έκφραση ΜΜΡ-7 και VEGF και όχι με την έκφραση του ίδιου του SPARC, συγκομίζονται υπερκείμενο από HGC-sh κύτταρα προστέθηκε σε 0,3 μg /ml rhSPARC. Τα υπερκείμενα και από τις δύο HGC-sh και HGC-sh + ΜΜΡ7-sh κυττάρων με αντίσωμα εξουδετέρωσης σε VEGF χρησιμοποιήθηκαν επίσης σε δοκιμασία συν-καλλιέργειας (αντι-VEGF = εξουδετερωτικό αντίσωμα σε VEGF). HUVECs σπάρθηκαν σε επικαλυμμένα με Matrigel πλάκες 96 φρεατίων επωάστηκαν με ρυθμισμένα μέσα. Οι επιδράσεις των ρυθμισμένων μέσων για τα προ-σχηματισμένα από σωλήνες HUVECs αναλύθηκαν, και μετρήθηκε το μήκος του σωλήνα. δεδομένα μήκους σωλήνα που δείχνεται είναι οι μέσες (± Τ.Α.) του τετραπλούν προσδιορισμών από τρία ξεχωριστά πειράματα. * Ρ & lt? 0,05, σημαντική διαφορά από HGC-Ρ κύτταρα, ** Ρ & lt?. 0.05, σημαντική διαφορά από HGC-sh κύτταρα

Η

Για να χαρακτηριστεί περαιτέρω ο ρόλος του VEGF και ΜΜΡ-7 σε SPARC- μεσολάβηση διαμόρφωση αγγειογένεσης, ΜΜΡ-7-shRNA και 1 μg /ml εξουδετέρωσης VEGF αντίσωμα (Chemicon, Temacula, CA, USA) χρησιμοποιήθηκαν για HGC-sh κλώνους να ανταγωνίζονται τις λειτουργίες της ΜΜΡ-7 και VEGF.

Εξετάσαμε την ικανότητα των ΜΜΡ-7 έκφραση σε κύτταρα HGC-sh να ρυθμίζουν την αγγειογένεση

in vitro από

σταθερώς επιμόλυνση ΜΜΡ-7-shRNA σε HGC-sh κύτταρα. Το Σχήμα 4Α δείχνει ότι η έκφραση του ΜΜΡ-7 σε HGC-sh + ΜΜΡ7-sh κυττάρων κάτω-ρυθμίζονται από σταθερώς εκφράζουν ΜΜΡ-7-SH-RNA σε επίπεδο συγκρίσιμο με εκείνο του HGC-Ρ και τα κύτταρα HGC-EV. Για να διευκρινιστεί ο ρόλος του ΜΜΡ-7 σε knock-down SPARC μεσολάβηση προώθηση των καρκινικών κυττάρων που προκαλείται από την αγγειογένεση, εκτελέσαμε ανάλυση σχηματισμός τριχοειδών με ρυθμισμένα μέσα από HGC-sh κύτταρα και HGC-sh + ΜΜΡ7-sh κύτταρα. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4Β, τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι μειώθηκε ΜΜΡ-7 έκφραση σε HGC-sh + ΜΜΡ7-sh κύτταρα οδήγησε σε μια σημαντική μείωση του σχηματισμού των τριχοειδών με HUVECs

in vitro

(HGC-sh + ΜΜΡ7-sh

vs

HGC-sh, P & lt?. 0.05)

Για τον προσδιορισμό της λειτουργίας της αυξημένης έκφρασης του VEGF που προκαλείται από SPARC αποσιώπηση, VEGF στο ρυθμισμένο μέσο της HGC-sh και HGC-sh + ΜΜΡ7-sh κύτταρα εξουδετερώθηκε με αντίσωμα VEGF (1 μg /ml). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τριχοειδής σχηματισμός HUVECs ήταν σημαντικά μειωμένη στο υπερκείμενο HGC-sh που περιέχουν το VEGF αντίσωμα εξουδετέρωσης σε σύγκριση με υπερκείμενο από κύτταρα HGC-sh μόνο (HGC-sh + αντι-VEGF

vs

HGC-SH, P & lt? 0.05 Εικόνα 4Β). σχηματισμός τριχοειδών του HUVECs ήταν σχεδόν ανέστειλε πλήρως όταν καλλιεργούνται σε ρυθμισμένα μέσα από HGC-sh + ΜΜΡ7-sh κύτταρα συν προστίθεται αντίσωμα VEGF εξουδετέρωσης (

vs

HGC-SH, Ρ & lt? 0.05 Σχήμα 4Β).

απαλλαγμένο ορού μέσων που συλλέγονται από HGC-P, HGC-EV, HGC-sh με ή χωρίς rhSPARC (0,3 μg /ml) και HGC-sh + ΜΜΡ7-sh κύτταρα συμπυκνώθηκαν με σωλήνα υπερδιήθησης (Millipore, Bedford, μΑ , USA) υπό τις ίδιες συνθήκες. Κηλίδωση Western έδειξε ότι η συγκέντρωση του SPARC σε HGC-sh κυττάρων με 0,3 μg /ml rhSPARC inmedium ήταν ίση με εκείνη του HGC-P υπερκείμενο (Σχήμα 4Α).

Η υπερέκφραση του SPARC σε καρκινικά κύτταρα γαστρικού Αναστέλλει το ογκογόνο σε γυμνά ποντίκια

Για να εκτιμηθεί η θεραπευτική αποτελεσματικότητα της έκφρασης SPARC, BGC-P, BGC-EV, κύτταρα BGC-SP ή HGC-P, HGC-EV, HGC-sh κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο μέγεθος μεταξύ BGC-P (n = 6? μέσος όγκος όγκου = 2004 ± 63 χιλιοστών

3), BGC-EV (n = 6? μέσος όγκος όγκου = 1856 ± 69 χιλιοστών

3 ) ξενομοσχεύματα. Μια σημαντική μείωση (39,1%) σε μέσο όγκο του όγκου βρέθηκε σε ζώα εμφυτεύονται με ξενομοσχεύματα BGC-SP (n = 6? Μέσος όγκος του όγκου = 1130 ± 55 mm

3), σε σύγκριση με τα ζώα εμφυτεύονται με BGC-EV ξενομοσχεύματα ( Ρ & lt? 0,05, Σχήμα 5). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο μέγεθος μεταξύ HGC-P (n = 6? μέσος όγκος όγκου = 1605 ± 63 χιλιοστών

3), HGC-EV (n = 6? μέσος όγκος όγκου = 1708 ± 82 χιλιοστών

3 ) ξενομοσχεύματα. Μία σημαντική αύξηση (50,3%) σε μέσο όγκο του όγκου βρέθηκε σε ζώα εμφυτεύονται με HGC-sh ξενομοσχεύματα (η = 6? Μέσος όγκος του όγκου = 2412 ± 75 mm

3), σε σύγκριση με τα ζώα εμφυτεύονται με HGC-EV ξενομοσχεύματα ( Ρ & lt?. 0.05, Εικόνα 5)

(Α) εγκλεισμένα σε παραφίνη τμήματα ξενομοσχευμένων όγκων χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοϊστοχημική ανάλυση του SPARC, ΜΜΡ-7, VEGF, και CD-31. (Β) Οι τομές χρωματίστηκαν με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα κατά του ανθρώπινου SPARC, VEGF, ΜΜΡ-7. πυκνότητες Sum υπολογίστηκαν και αναλύθηκαν με ΙΡΡ 6.0. Οι στήλες είναι μέσα (± Τ.Α.) Του τετραπλούν προσδιορισμών από έξι ποντικούς σε κάθε ομάδα. * P & lt? 0,05, σημαντική διαφορά από τα κύτταρα ελέγχου. (Γ) MVD σε ιστούς όγκων ποσοτικοποιήθηκε μετρώντας CD31-θετικών περιοχών σε κάθε μικροσκοπική οπτικό πεδίο. Οι στήλες είναι μέσα (± Τ.Α.) Του τετραπλούν προσδιορισμών από έξι ποντικούς σε κάθε ομάδα. * P & lt? 0,05, σημαντική διαφορά από τα κύτταρα ελέγχου. Ο όγκος του όγκου υπολογίσθηκε (όγκος = πλάτος

2 × μήκος × 0,52). Ο όγκος των όγκων κατά τη 50η ημέρα υποδεικνύεται από τις μέσες τιμές (± SD) των έξι ποντίκια σε κάθε ομάδα, * P & lt?. 0.05, σημαντική διαφορά από τα κύτταρα ελέγχου

Η

Για την εκτίμηση SPARC, VEGF , ΜΜΡ-7 εκφράσεις

in vivo

, ξενομοσχεύματος τομές χρωματίστηκαν με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα κατά του ανθρώπινου SPARC, VEGF ή ΜΜΡ-7. Το σχήμα 5Α δείχνει ότι οι όγκοι BGC-SP εκφράζουν περισσότερο SPARC από BGC-P, BGC-EV όγκους, ενώ ταυτόχρονα VEGF, οι ΜΜΡ-7 εκφράσεις μειώθηκε (Ρ & lt? 0,05, Σχήμα 5Α). Τμήματα από HGC-sh όγκοι εκφράζουν λιγότερο από SPARC HGC-P, όγκοι HGC-EV ενώ ταυτόχρονα VEGF, οι ΜΜΡ-7 εκφράσεις αυξήθηκε (Ρ & lt? 0,05, Σχήμα 5Α). CD31 χρησιμοποιείται κυρίως για να αποδειχθεί η παρουσία των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων σε τομές ιστολογική ιστού, η οποία μπορεί να βοηθήσει στην αξιολόγηση του βαθμού της αγγειογένεσης του όγκου. Για να εκτιμηθεί κατά πόσον αλλοιωμένη έκφραση SPARC μεσολάβηση της πυκνότητας μικροαγγείων (MVD), αναλύσαμε την αγγειογένεση σε ξενομοσχεύματα από ιστολογική ανάλυση των CD-31. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην MVD μεταξύ BGC-Ρ (12.5 ± 2.3 μικροαγγείων /0,145 χιλιοστά

2), BGC-EV (11.5 ± 3.4 μικροαγγείων /0,145 χιλιοστά

2) ξενομοσχευμάτων. MVD μειώθηκε 54,8% σε BGC-SP (5,2 ± 2,1 μικροαγγείων ανά /mm

2) όγκους σε σύγκριση με BGC-EV όγκους (Ρ & lt? 0,05, Σχήμα 5). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην MVD μεταξύ HGC-Ρ (6.4 ± 2.1 μικροαγγείων /0,145 χιλιοστά

2), HGC-EV (6.9 ± 1.8 μικροαγγείων /0,145 χιλιοστά

2) ξενομοσχευμάτων. MVD ήταν αυξημένα 51,7% σε HGC-sh (10.5 ± 1.5 μικροαγγείων /0,145 χιλιοστά

2) όγκους σε σύγκριση με HGC-EV όγκους (P & lt? 0.05, Σχήμα 5)

Συζήτηση

SPARC είναι ένας ιστός-ειδική πρωτεΐνη που επηρεάζει πολλαπλές κυτταρικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων πολλαπλασιασμού, εισβολή, και αγγειογένεση μεταβλητά σε διαφορετικούς τύπους ιστών. Για παράδειγμα, προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι SPARC προώθησε την εισβολή, ενώ ταυτόχρονα την αναστολή της ανάπτυξης των όγκων [5], [10]. Σε μυελοβλάστωμα, η υπερέκφραση του SPARC μπορούν να αναστείλουν την αγγειογένεση σε όγκο μειώνοντας την έκφραση και έκκριση του VEGF και ΜΜΡ-9 [11]. Στο μελάνωμα, ωστόσο, η έκφραση της SPARC συσχετίστηκε θετικά με την αγγειογένεση [12]. Η λειτουργία του SPARC στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα παραμένει ασαφής.

Για να ερευνηθεί ο ρόλος της SPARC σε γαστρικό καρκίνο, ελέγξαμε πρώτα την έκφραση της SPARC σε επτά κυτταρικές σειρές γαστρικού καρκίνου. Οι περισσότερες κυτταρικές σειρές δεν εκφράζουν, είτε εκφράζεται μόνο χαμηλό επίπεδο SPARC. Για τον προσδιορισμό του ρόλου της SPARC στην ανάπτυξη και αγγειογένεση του γαστρικού καρκίνου, ιδρύσαμε τον κλώνο BGC-SP που σταθερώς επιμολυσμένα με φορέα SPARC cDNA, και τον κλώνο HGC-sh που σταθερώς επιμολυσμένα με φορέα shRNA στόχευσης SPARC mRNA. έκφραση SPARC αυξήθηκε σημαντικά σε BGC-SP κλώνος και μειώθηκε σε HGC-sh κλώνο σε σύγκριση με τους αντίστοιχους κλώνους ελέγχου τους, όπως προσδιορίζεται με κηλίδωση Western και RT-PCR αναλύσεις. ρυθμού πολλαπλασιασμού των κυττάρων ήταν χαμηλότερο σε BGC-SP κλώνος, και ήταν υψηλότερη σε HGC-sh κλώνο σε σχέση με τις αντίστοιχες κλώνους ελέγχου τους με τη μέθοδο ΜΤΤ. Βρήκαμε επίσης ότι η υπερέκφραση του SPARC ανέστειλε κυττάρων που προκαλείται από τριχοειδή σχηματισμό όγκων των HUVECs

in vitro

και την αγγειογένεση σε δοκιμασία παράθυρο ραχιαίο

in vivo

. Από την άλλη πλευρά, προς τα κάτω ρύθμιση SPARC από παρεμβολή mRNA προωθείται σχηματισμός τριχοειδών

in vitro και την αγγειογένεση

in vivo

.

Τα αιμοφόρα αγγεία είναι απαραίτητα για την παροχή θρεπτικών συστατικών στους ιστούς . Ως εκ τούτου, νεοαγγείωση είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη του στερεού όγκου. Προηγούμενες μελέτες έχουν αποδείξει ότι SPARC παίζει ένα ρόλο στην αγγειογένεση [7]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η υπερέκφραση του SPARC ανέστειλε την αγγειογένεση

in vitro

και

in vivo

σε συνδυασμό με τη μείωση της ΜΜΡ-7, VEGF και φωσφορυλιωμένη ERK1 /2, ενώ ρύθμιση προς τα κάτω της SPARC προωθούνται αγγειογένεση

in vitro

και

in vivo

σε συνδυασμό με την αύξηση του MMP-7, VEGF και φωσφορυλιωμένη ERK1 /2.

εφαρμοστούν περαιτέρω μελέτες για να διερευνηθεί ο ρόλος της VEGF και ΜΜΡ-7 σε SPARC μεσολάβηση διαμόρφωση αγγειογένεσης. Όταν ανασυνδυασμένη ανθρώπινη πρωτεΐνη SPARC προστέθηκε στο ρυθμισμένο μέσο από HGC-sh κλώνος για την αποκατάσταση της συγκέντρωσης SPARC, αυτό ρυθμισμένο μέσο δεν άλλαξε την τριχοειδή σχηματισμό HUVECs με

in vitro δοκιμασία

σε σύγκριση με την τριχοειδή σχηματισμό HUVECs επωάζονται σε το μέσο όρο χωρίς εξωγενή rhSPARC. Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε ΜΜΡ-7-shRNA να μειορυθμίζουν ΜΜΡ-7 έκφραση σε HGC-sh κλώνο, και /ή αντι-VEGF αντίσωμα να εξουδετερώνει VEGF σε ρυθμισμένο μέσο από HGC-sh κλώνο. σχηματισμός τριχοειδών του HUVECs αναστάλθηκε σημαντικά όταν επωάζονται στο ρυθμισμένο μέσο με χαμηλότερο ΜΜΡ-7 ή /και μπλοκάρει VEGF. Αυτά τα πειράματα υποδηλώνουν ότι SPARC κάτω ρύθμιση μόνο είναι ανεπαρκής για την επαγωγή της νεοαγγείωσης, και άλλοι παράγοντες πρέπει να συμμετέχουν σε αυτή τη διαδικασία.

VEGF διαδραματίζει βασικό ρόλο στην αγγειογένεση, και είναι απαραίτητη για την επιβίωση των ενδοθηλιακών κυττάρων [8]. Σε γλοίωμα, SPARC ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου με μεταβολή μικρο-περιβάλλον του και την καταστολή της αγγειογένεσης μέσω της αναστολής της έκφρασης και έκκρισης του VEGF [5]. Μπορεί να υπάρχει μια αρνητική σχέση μεταξύ SPARC και εκφράσεις VEGF, δηλαδή, το πιο SPARC, το λιγότερο VEGF ή

αντίστροφα

[13], [14].

MMP-7 είναι σε θέση να ταπεινωτική βασικής μεμβράνης ή του συνδετικού ιστού γύρω από τα αγγεία. Διεγείρει επίσης τη σύνθεση του DNA σε καλλιεργημένα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα, και επάγει την αγγειογένεση στη θέση όπου τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου εμφυτεύθηκαν σε ένα μοντέλο ποντικού [15]. VEGF και άλλοι αγγειογόνοι παράγοντες λειτουργούν κυρίως μέσω ΜΑΡΚ σηματοδότησης οδών, οι οποίες πιστεύεται ότι είναι σημαντικές οδούς μεταγωγής που εμπλέκονται στις διαδικασίες νεοαγγείωση σε όγκους [8]. πρόσφατη μελέτη μας έδειξε ότι η ΜΜΡ-7 έκφραση διαμορφώνεται μέσω της ενεργοποίησης της ΜΑΡΚ σηματοδότησης οδών [16]. Αρκετές μελέτες έδειξαν επίσης ότι SPARC διαμορφωμένα αρνητικά την ενεργοποίηση των ΜΑΡΚ [17]. Κατά συνέπεια, η έκφραση SPARC μπορεί να μεταβάλλει την ισορροπία αγγειογενετική σε όγκους από τα κάτω ρύθμιση μιας σειράς νεοαγγείωσης παράγοντες προαγωγής.

Για να διερευνηθεί η λειτουργία της SPARC στη ρύθμιση της γαστρικής ανάπτυξης καρκίνου του

in vivo

, BGC-SP και κυτταρικών κλώνων HGC-sh συγκρίθηκαν με κλώνους ελέγχου τους ως προς την ικανότητά τους να σχηματίζουν όγκους σε ένα υποδόριο μοντέλο. SPARC υπερέκφραση μείωσε σημαντικά το μέγεθος του όγκου ξενομοσχευθέντος με μειωμένη MVD, ρύθμιση προς τα κάτω της SPARC με παρεμβολή RNA προώθησε την ανάπτυξη των ξενομοσχευμένων όγκων με αυξημένη MVD. Ως εκ τούτου, σε γαστρικό ξενομοσχεύματα καρκίνου, η έκφραση SPARC συσχετίζεται αρνητικά με την αγγειογένεση. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι SPARC συνέβαλαν στη ρύθμιση του σχηματισμού όγκου, αν και ο ρόλος του φαινόταν να είναι κυτταρικό τύπο. Σε ηπατοκυτταρικό καρκίνο ξενομοσχεύματα κυτταρική γραμμή, SPARC υπερέκφραση καθυστερήσει σημαντικά τον σχηματισμό όγκου, μείωσε το μέγεθος του όγκου, και μειωμένη MVD σε σύγκριση με ξενομοσχεύματα ελέγχου [18]. Σε κόλον καρκινικούς ιστούς, η έκφραση SPARC σχετίστηκε αρνητικά με την έκφραση του VEGF και MVD [19]. Σε κύτταρα μυελοβλάστωμα, SPARC υπερέκφραση ανέστειλε αγγειογένεση που οδηγεί στη μείωση της ανάπτυξης του όγκου [11]. Σε ανθρώπινα μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα, SPARC ανέστειλε τη σύνθεση του DNA

in vitro

[6]. Σε ξενομοσχεύματα νευροβλάστωμα, SPARC πεπτίδια ανέστειλαν την αγγειογένεση και την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

[20]. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν SPARC ως αναστολέας της αγγειογένεσης του όγκου

in vivo

.

SPARC εκφράζει σε φυσιολογικά γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα, γαστρικά καρκινικά κύτταρα, και στρωματικά κύτταρα που περιβάλλουν γαστρικού καρκίνου σε ένα χαμηλότερο επίπεδο [21 ]. Μια μελέτη ανοσοϊστοχημείας έδειξαν ότι SPARC εκφράζεται κυρίως σε στρωματικά κύτταρα που περιβάλλουν τον όγκο [22]. Αυτές οι διαφορές δεν μπορούν να εξηγηθούν πλήρως. έκφραση SPARC μπορεί να εξαρτάται από ιστολογικό τύπο του όγκου, ή

αντίστροφα

. Πρόσφατη μελέτη ανοσοϊστοχημείας διαπίστωσε ότι η έκφραση SPARC σχετίστηκε αρνητικά με την έκφραση του VEGF και MVD στο γαστρικό καρκινικούς ιστούς και η έκφραση SPARC μειώθηκε σε γαστρικό καρκίνο με υψηλότερο βαθμό κακοήθειας [23].

Συνοπτικά, η αναστολή της ανάπτυξης του γαστρικού καρκίνου με SPARC φαίνεται να προκαλείται μέσω επιδράσεις καταστολής της για ΜΜΡ-7 και VEGF εκφράσεις, οι οποίες μπορούν με τη σειρά αναστέλλουν διείσδυση μικροαγγείων σε όγκους. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η ρύθμιση προς τα κάτω της SPARC μπορεί να συνδέσει με την πρόοδο του καρκίνου του στομάχου, και η εξερεύνηση με στόχο τη ρύθμιση της έκφρασης SPARC μπορεί να γίνει μια ουσιαστική προσέγγιση για τη βελτίωση της γαστρικής τη θεραπεία του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα και Αντιδραστήρια

Τα αντισώματα έναντι SPARC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), (ρ) SAPK /JNK, (ρ) ERK1 /2, (ρ) ρ-38, ΜΜΡ-7 (τεχνολογία κυτταρική σηματοδότηση, Danvers, ΜΑ, USA), VEGF, και CD31 (Abcam, Cambridge, MA, USA) χρησιμοποιήθηκαν για την κηλίδωση Western και ανοσοϊστοχημεία. Η rhSPARC παρασχέθηκε από R &? D (Minneapolis, ΜΝ, USA). Η αντίστροφη μεταγραφή kit-PCR που παρέχεται από την Promega (Madison, WI, USA). ΜΜΡ-7-shRNA (KH00809P, SuperArray Bioscience Corp. Frederick, MD, USA) χρησιμοποιήθηκε για την προς τα κάτω ρύθμιση της ΜΜΡ-7 στους κυτταρικούς κλώνους. β-καζεΐνη (C-6905, Sigma-Aldrich Corporation, Natick, ΜΑ, USA) χρησιμοποιήθηκε σε β-καζεΐνη ζυμογραφία. Όλα τα άλλα αντιδραστήρια ήταν αναλυτικού βαθμού ή καλύτερα.

Cell Culture

Ανθρώπινο γαστρικό γραμμές AGS καρκινικών κυττάρων, ΜΚΝ-45, NCI-Ν87, BGC823, MGC803, HGC27, SGC7901 ελήφθησαν από το Cancer Institute της κινεζικής Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών. Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 μέσο συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). BGC-EV (επιμολυσμένα με άδειο φορέα), BGC-SP (υπερεκφράζουν SPARC cDNA), HGC-EV (που εκφράζει κενό φορέα) και HGC-sh (που εκφράζει SPARC shRNA) αναπτύχθηκαν σε πλήρες RPMI 1640 με G418 (50 μg /ml) . Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε καλλιέργειες μονοστοιβάδας στους 37 ° C σε υγροποιημένο αέρα με 5% CO

2.

Καθιέρωση BGC-SP, HGC-sh κλώνοι και HGC-SH-ΜΜΡ7-sh Κλώνοι

Περίπου 150.000 κύτταρα BGC-823 επιστρώθηκαν ανά φρεάτιο σε μια έξι-φρεατίων σε RPMI 1640 με 10% FBS και αφέθηκαν να προσκολληθούν για μία νύχτα. Ισομοριακές ποσότητες pcDNA3.1 με πλήρους μήκους διανύσματος SPARC cDNA ή τον κενό φορέα (Invitrogen, San Diego, CA, USA) επωάστηκαν με το αντιδραστήριο Lipofectamine-2000 Επιμόλυνσης (Invitrogen, San Diego, CA, USA). Επικυρώθηκε SureSilencing ανθρώπινη SPARC shRNA και κενός φορέας ελέγχου ελήφθησαν από SuperArray Bioscience Corp. (Frederick, MD, USA). HGC-27 κύτταρα επιμολύνθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Εν συντομία, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν σε ένα σταθερό τρόπο χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη. Τα επιμολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν με G418 (100 μg /ml για BGC-SP και HGC-sh κλώνοι) για 14 ημέρες πριν από την απομόνωση των μεμονωμένων κλώνων. HGC-SH-ΜΜΡ7-sh παραλλαγές καθορίστηκαν όπως περιγράφεται ανωτέρω, ο κλώνος κυττάρων HGC-sh επιμολύνθηκαν με ΜΜΡ-7-shRNA (KH00809P, SuperArray Bioscience Corp. Frederick, MD, USA) χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη. Στη συνέχεια, τα επιμολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν με πουρομυκίνη (1 μg /ml) για 10 ημέρες.

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Προσδιορισμός

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με μια 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2- υλ) -2,5-διφαινυλτετραζόλιο βρωμίδιο (ΜΤΤ) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Εν συντομία, 500 κύτταρα καλλιεργήθηκαν ανά φρεάτιο σε πλάκες 96-φρεατίων και επωάστηκαν για 8 ημέρες, και στη συνέχεια, ΜΤΤ (R &? D, Minneapolis, ΜΝ, USA) προστέθηκε στα κύτταρα. Οι τιμές απορρόφησης στα 550 nm μετρήθηκαν με έναν αναγνώστη μικροπλάκας. Τα αποτελέσματα φαίνονται ως μέση απορρόφηση στα 550 nm και τα μέσα (± sd) του προσδιορισμών εις τετραπλούν από έξι ξεχωριστά πειράματα.

Western Blotting Ανάλυση

Σύνολο κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με western αποτύπωση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Εν συντομία, τα αντισώματα να SPARC, ΜΜΡ-7, και VEGF (1:1000 αραίωση) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση SPARC, ΜΜΡ-7, και VEGF, αντίστοιχα, ενώ τα αντισώματα για (Α-) SAPK /JNK, (ρ-) ERK1 /2 και (ρ) p-38 (1:800 αραίωση) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης ΜΑΡΚ. P & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.