Αφηρημένο

Polygonatum odoratum

λεκτίνη (POL), απομονωθεί από την παραδοσιακή κινεζική ιατρική βοτάνων

(Mill.)

Druce, επέστησε την προσοχή αυξάνεται λόγω της ευρείας βιολογικές δραστηριότητες της. Στην παρούσα μελέτη, τα αποτελέσματα κατά του όγκου, συμπεριλαμβανομένων απόπτωση και τις ιδιότητες autophagy επαγωγής του POL, προσδιορίστηκαν από μια σειρά μεθόδων κυτταρικής βιολογίας όπως ΜΤΤ, κυτταρική μορφολογία παρατήρηση, κυτταρομετρία ροής, ανοσοκηλίδωση. Εδώ, βρήκαμε ότι POL θα μπορούσε ταυτόχρονα να επάγουν απόπτωση και αυτοφαγία σε ανθρώπινα μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα καρκίνου του Α549. POL ξεκίνησε την απόπτωση μέσω της αναστολής της Akt-NF-κΒ οδού, ενώ POL πυροδότησε αυτοφαγία

μέσω

καταστολή μονοπατιού Akt-mTOR, γεγονός που υποδηλώνει το διακόπτη ρόλο μοριακή της Akt στη ρύθμιση μεταξύ POL-επαγόμενη απόπτωση και αυτοφαγία. Επιπλέον, ROS ενεπλάκη στην POL-επαγόμενη αναστολή της έκφρασης Akt, και ως εκ τούτου θα μπορούσε να μεσολαβήσει τόσο απόπτωση και αυτοφαγία σε κύτταρα Α549. Επιπλέον, POL εμφανίζεται καμία σημαντική κυτταροτοξικότητα προς τα φυσιολογικά ανθρώπινα εμβρυϊκά πνευμονικά κύτταρα ινοβλαστών HELF. Λόγω των δραστηριοτήτων κατά των όγκων, POL θα μπορούσε να γίνει ένα ισχυρό φάρμακο κατά του καρκίνου στο μέλλον της θεραπείας, το οποίο θα μπορούσε να ανοίξει το δρόμο για την εξερεύνηση GNA σχετίζονται με λεκτίνες σε αποτελεσματικά φάρμακα στη θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Li C, Chen J, Lu Β, Shi Ζ, Wang Η, Zhang Β, et al. (2014) Μοριακή Switch ρόλος της Akt στο

Polygonatum odoratum

λεκτίνη απόπτωση και Autophagy στην Ανθρώπινη μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα Α549 κύτταρα. PLoS ONE 9 (7): e101526. doi: 10.1371 /journal.pone.0101526

Επιμέλεια: Jin Ερ Cheng, H. Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15, Ιανουαρίου, 2014? Αποδεκτές: 8 Ιουνίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 3 Ιουλίου, 2014

Copyright: © 2014 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81373311, Αρ 31300674, Αρ 30970643, Αρ 81173093 και Νο J1103518), το Ειδικό Πρόγραμμα για την Επιστήμη Νεολαίας και Τεχνολογίας Καινοτόμες Ερευνητική Ομάδα της επαρχίας Σιτσουάν, Κίνα (Νο 2011JTD0026). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή οι

οι λεκτίνες που χαρακτηρίζονται ως πρωτεΐνες σύνδεσης υδατάνθρακα που υπάρχουν ευρέως σε ζώα, φυτά και μικροοργανισμούς, και θα μπορούσαν να δεσμεύουν υδατάνθρακες, συγκολλά κύτταρα ή κατακρήμνιση πολυσακχαριτών και γλυκοσυζεύγματα [1]. Η ταχεία πρόοδος έχει επιτευχθεί σε απομόνωση και τον χαρακτηρισμό των φυτικών λεκτινών, και πρόσφατα η κατάταξη των λεκτινών έχει emended από τις 7 οικογένειες σε 12 οικογένειες [2] – [4].

Αξίζει να σημειωθεί ότι, ο καρκίνος σχετίζεται με την προγραμματισμένη κυτταρικού θανάτου (PCD), η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της ομοιόστασης, την κυτταρική διαφοροποίηση, τον έλεγχο της ανάπτυξης, των κυττάρων της άμυνας και κ.λπ., από κοινού σφραγίζοντας το απόλυτο μοίρα των καρκινικών κυττάρων [5]. Σε γενικές γραμμές, υπάρχουν δύο κύριοι τύποι της ΣΑΠ, αναφερόμενος στην απόπτωση και αυτοφαγία. Αυτοφαγία είναι μια εξελικτικά συντηρημένη κυτταρικός μηχανισμός για την εκκαθάριση των κατεστραμμένων ή περιττή μακρο-συγκροτήματα και οργανίδια σε ευκαρυωτικά κύτταρα, που οδηγεί είτε σε προ-επιβίωσης ή προ-θανάτου επιπτώσεις [6]. Η απόπτωση, η οποία μπορεί να ρυθμίζεται από πολυάριθμες πορείες μοριακής σηματοδότησης, απευθύνεται κυρίως για την αυτοκτονία του όγκου. Αυτοφαγία και την απόπτωση φέρουν διακριτά μορφολογικά χαρακτηριστικά και φυσιολογική διαδικασία, ωστόσο, εξακολουθούν να υπάρχουν περίπλοκες αλληλεπιδράσεις μεταξύ τους [7].

Polygonatum odoratum

(Mill.) Druce, ένας τυπικός εκπρόσωπος της Liliaceae οικογένεια, είναι μια σημαντική παραδοσιακή κινέζικη ιατρική λόγω ευρεία ποικιλίες της βιολογικώς δραστικών ενώσεων.

Polygonatum odoratum

λεκτίνη (POL), απομονωμένη από

Polygonatum odoratum

(Mill.) Druce, είναι μαννόζη-ειδικής δέσμευσης

Galanthus nivalis

συγκολλητίνη (GNA)-σχετικών οικογένεια λεκτίνη, και ασκεί τις δράσεις αξιοσημείωτη παρεμπόδιση της ανάπτυξης κατά των κυττάρων Α375 [8]. Προηγούμενη έκθεση έδειξε ότι POL επάγεται L929 κυτταρική απόπτωση μέσω τόσο του θανάτου-υποδοχέα και μιτοχονδριακή οδούς, καθώς και ενισχυμένο ΤΝΡα επαγόμενη L929 κυτταρικής απόπτωσης [9]. Ωστόσο, αν η POL θα μπορούσε ταυτόχρονα να προκαλέσει απόπτωση και αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα είναι ακόμη στα σπάργανα. Και μέχρι σήμερα, μόνο

Polygonatum cyrtonema

λεκτίνη (PCL) ταυτόχρονα μπορεί να προκαλέσει τόσο απόπτωση και αυτοφαγία στα ανθρώπινα κύτταρα μελανώματος Α375 [10] και L929 κύτταρα [11]. Ως εκ τούτου, η απόπτωση και η αυτοφαγία-επαγωγικές επιδράσεις της POL πρέπει να διερευνηθεί.

Υλικά και Μέθοδοι

Μοριακή μοντελοποίηση

Τρισδιάστατη δομή της ΠΟΛ κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας SWISS -MODEL εξυπηρετητή (https://swissmodel.expasy.org/) με τη δομή της PCL (ΠΠ ID: 3A0E). ως πρότυπο [12], [13]

Κυτταρική καλλιέργεια

Lung κυτταρικές γραμμές αδενοκαρκινώματος Α549 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA), ενώ τα φυσιολογικά ανθρώπινα εμβρυϊκά HELF κυτταρικές σειρές ινοβλαστών πνεύμονος αγοράστηκαν από την τράπεζα κυττάρων (κινεζική Ακαδημία Επιστημών, Σαγκάη, Κίνα). Ανθρώπινη μη-μικρών κυττάρων Α549 καρκίνου του πνεύμονα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Gibco), που περιέχει 10% FBS, 100 mg /mL στρεπτομυκίνη (Invitrogen), 100 U /mL πενικιλλίνη (Invitrogen), και διατηρήθηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2 σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα. Και τα ανθρώπινα εμβρυϊκά πνευμονικά κύτταρα ινοβλαστών HELF, που χρησιμοποιείται ως αντίστοιχη ομάδα ελέγχου, καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco ελάχιστο βασικό μέσο (Gibco) που περιέχει τα ίδια υλικά.

Αντιδραστήρια

POL καθαρίστηκε και συντηρείται από το εργαστήριο μας [8]. Ο ορός εμβρύου μόσχου (FBS), 3- (4,5-dimetrylthiazol-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ), 3,3-διαμινοβενζιδίνη τετραϋδροχλωρική (DAB), monodansylcadaverine (MDC), αναστολέα αυτοφαγία 3- μεθυλαδενίνη (3-ΜΑ), πορτοκαλί της ακριδίνης (AO), ροδαμίνη-123 και Ζ-VAD-fmk αγοράστηκαν από τη Sigma Chemical (St. Louis, ΜΟ, USA). κυτόχρωμα

γ

κοκτέιλ αντισωμάτων αποπτωτικά WB (ab110415) λήφθηκε για MitoSciences (Eugene, Όρεγκον, ΗΠΑ). Μικρά παρεμβαλλόμενα RNA (siRNA που) κατά της ανθρώπινης Beclin1 (# 6222), LC3 (# 6212) και τον έλεγχο siRNA (# 6568) αγοράστηκαν από Cell Signaling Technologies, USA

Μετά αντισώματα αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotech.: pro-caspase3 (# sc-7148), προ-caspase9 (# sc-56073), Βαχ (# sc-493), προσφορά (# sc-6538), Bcl-2 (# sc-492), Bcl-X

L (# sc-8392), PARP (# sc-7150), NF-κΒ (# sc-109), φωσφο-NF-κΒ (Ser536) (# sc-136548) και β-ακτίνη (# SC- 47778). Εκτός αυτού, τα αντισώματα, συμπεριλαμβανομένων φωσφο-Beclin1 (Ser234) (ab183335), mTOR (ab2732) και φωσφο-mTOR (Ser2448) (ab109268) ήταν από Abcam. Αντισώματα για LC3 (mAb # 12741), Akt (PAN) (mAb # 4685), Phospho-Akt (Thr308) (mAb # 2965), Phospho-Ακί (Ser473) (mAb # 4060), Phospho-p70S6K (Thr389) ( mAb # 9234) και Phospho-4EBP1 (Thr37 /46) (mAb # 2855) αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technologies, USA. Οι πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αντι-κουνελιού IgG ή αντι-ποντικού συζευγμένο με υπεροξειδάση (HRP) και 3,3-διαμινοβενζιδίνη τετραϋδροχλωρική (DAB) ως υπόστρωμα HRP.

συστατικά ενεργοποιημένη Akt (Myr-Akt, Addgene πλασμίδιο 9008 ), NF-κΒ (Τ7-ΚεΙΑ, Addgene πλασμίδιο 23251), mTOR (Flag-mTOR, Addgene πλασμίδιο 26603), άδειο φορέα (pcDNA3, Addgene plasmid10792) αγοράστηκαν από Addgene.

δοκιμασία αναστολής της ανάπτυξης

Α549 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για προκαθορισμένο χρόνο, και οι κυτταροτοξικές επιδράσεις των διαφόρων συγκέντρωση του POL διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [14]. Απορρόφηση στα 570 nm μετρήθηκε με ένα φασματοφωτόμετρο (Μοντέλο 3550 Microplate Reader, Bio-Rad).

Η βιωσιμότητα των κυττάρων (%) = (OD

570nm (φάρμακο) /OD

570 nm (έλεγχος )) χ 100%.

μαννόζης αναστολή δοκιμασία

ΜΤΤ δοκιμασία προσδιορίστηκε όπως αναφέρθηκε παραπάνω εκτός του ότι οι λεκτίνες προεπωάστηκαν στους 37 ° C για 30 λεπτά με διαφορετικούς τύπους μαννόζες, όπως μαννόζη α (1,3), μαννόζη α (1,6) και μαννόζη α (1,3:1,6), η οποία μπορεί να αναστείλει πλήρως την δραστικότητα συγκόλλησης των ερυθρών αιμοσφαιρίων σε διαφορετικές συγκεντρώσεις του POL.

δοκιμασίας απόπτωση

Α549 και HELF κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PBS και 23 μg /mL POL για 12 ώρες, 24 ώρες, 36 ώρες και 48 ώρες. μορφολογία των κυττάρων φωτογραφήθηκε με μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (Leica, Wetzlar, Γερμανία) καθώς και μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus, Tokyo, Japan) με Hoechst χρώση 33342. Στη συνέχεια, το σύνολο των 6 × 10

5 Α549 κύτταρα /φρεάτιο απλώθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και επωάστηκαν για 24 ώρες, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με PBS ή 23 μg /mL POL για άλλες 12 ώρες, 24 ώρες, 36 ώρες ή 48 h επώαση. Τα συλλεγμένα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Με στόχο την περαιτέρω ταξινόμηση πρώιμη και όψιμη απόπτωση σε κύτταρα Α549 POL-θεραπεία, δοκιμασία διπλή χρώση αννεξίνης V-FITC /ΡΙ διεξήχθη με κιτ ισοθειοκυανικό αννεξίνης V-φλουορεσκεΐνη (FITC) ανίχνευση της απόπτωσης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (BD Pharmingen, San Diego , CA, USA).

Autophagy δοκιμασία

Μετά από επώαση με 23 μg /mL POL για προκαθορισμένο χρόνο, Α549 και κύτταρα HELF καλλιεργήθηκαν με 0,05 mM MDC στους 37 ° C για 60 λεπτά. Η ένταση φθορισμού των κυττάρων αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Επιπλέον, τα κύτταρα Α549 επωάζονται με PBS ή 23 μg /mL POL για χρονικό διάστημα που υποδεικνύεται βάφτηκαν με πορτοκαλί της ακριδίνης (10 ng /mL) για 15 λεπτά και υποβλήθηκε σε κυτταρομετρία ροής. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με αντίστοιχα Beclin1 siRNA, LC3 siRNA και τον έλεγχο siRNA στα 33 ηΜ χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα επιμολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για μεταγενέστερα πειράματα 24 ώρες αργότερα.

Caspase δοκιμασία

Η απόπτωση εκτιμήθηκε με μέτρηση της δραστικότητας της κασπάσης-3 με τη χρήση του κιτ δραστικότητα κασπάσης-3 (Beyotime Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας , Haimen, Κίνα) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Ανίχνευση πιθανών δυνητικών

μιτοχονδριακής μεμβράνης μιτοχονδριακής μεμβράνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη φθορίζουσα χρωστική ροδαμίνη-123 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Η ένταση φθορισμού των κυττάρων Α549 παρενέβαινε με 23 μg /mL POL για 12 ώρες, 24 ώρες, 36 ώρες και 48 ώρες αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής.

Προσδιορισμός των ενδοκυττάριων ROS

Μετά την κατεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις POL για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα, τα κύτταρα Α549 επωάστηκαν με 10 μΜ 2 ‘, 7’-διχλωρο διοξεικό (DCFH-DA) για 60 λεπτά στους 37 ° C. Η ένταση φθορισμού των κυττάρων Α549 μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής με ένα μήκος κύματος διέγερσης 480 nm και μήκος κύματος εκπομπής 525 nm. Η ενδοκυτταρική περιεκτικότητα GSH και ενζυμική δραστηριότητα GPX μετρήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Οι επιμολύνσεις

Α549 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 60-mm με RPMI 1640 που περιείχε 10% FBS και 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη έφθασε σε πυκνότητα 1 × 10

6 κύτταρα /δίσκο. Στη συνέχεια, τα κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε συνεχώς PRMI 1640 χωρίς 10% FBS και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη για άλλες 2 ώρες. Για να σχηματιστεί σύμπλοκο πλασμιδίου-Lipofectamine LTX, πλασμίδια αναμίχθηκαν με 25X αραιωτικό Λιποφεκταμίνη LTX, και επωάστηκαν για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, επιμολύνσεις αντίστοιχα διεξήχθησαν σε μέσο OptiMEM μειωμένο ορό (Invitrogen) που περιέχει 1 mg /mL DNA, 0.1% συν αντιδραστήριο και 0,3% Lipofectamine LTX αντιδραστηρίου επιμόλυνσης, και προστέθηκε το μέσο με το πλασμίδιο σε δίσκους 60-mm για ένα άλλο 48 ώρες καλλιέργειας του Α549 κύτταρα. Τέλος, η αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης ανιχνεύθηκαν με ανάλυση Western Blot.

Western blot ανάλυση

κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 23 μg /mL POL για προκαθορισμένο χρόνο, και στη συνέχεια τα δύο προσκολλημένα καθώς και επιπλέοντα κύτταρα συλλέχθηκαν. Η ανάλυση στυπώματος Western των προϊόντων λύσης κυττάρου διεξήχθη όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [16], [17].

Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων

Όλα τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα . Στατιστικές συγκρίσεις έγιναν με αμφίδρομη ANOVA και μονόδρομη ANOVA με post hoc Bonferroni δοκιμή. Μια σ value≤0.05 θεωρήθηκε ως σημαντική.

Αποτελέσματα

οικογένειας Μοριακή μοντελοποίηση της ΠΟΛ

Οι λεκτίνες από GNA σχετίζονται φέρουν διαφορετικό σύνταγμα αλληλουχία αμινοξέων, αλλά όλοι εκτίθενται παρόμοια τρισδιάστατη δομή. GNA σχετίζονται με την οικογένεια λεκτίνες φέρουν αυστηρή δράση δέσμευσης μαννόζης, και συντηρημένο μοτίβο αμινοξέων »QXDXNXVXY» παίζει σημαντικό ρόλο στη μαννόζη αναγνώριση. POL διέθετε τρία συντηρημένα υποτομείς «QXDXNXVXY», και ως εκ τούτου, POL ήταν αυστηρός λεκτίνη δέσμευσης μαννόζης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, η τρισδιάστατη δομή του POL κτίστηκε, και το μονομερές του POL εμφάνισε μια δομή β-βαρελιού που περιλαμβάνει τρία υποτομείς (I, II, III), κάθε υποτομέα αποτελείται από τρία ή τέσσερα σκέλη του αντιπαράλληλο φύλλου β αλληλεπιδρούν με Ω βρόχου.

(Α) Μοριακή δομή του μονομερούς ΠΟΛ. (Β) καρκίνωμα του παχέος εντέρου Caco-2 κύτταρα, τραχήλου καρκινώματος κύτταρα HeLa, μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα καρκίνου του Α549, ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα HepG

2 και 7721 κυττάρων, καρκινώματος του μαστού MCF-7 κύτταρα, κύτταρα μελανώματος Α375 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις του POL για 24 ώρες, και το IC

50 τιμές προσδιορίστηκαν ποσοτικά με προσδιορισμό ΜΤΤ (μέσος όρος ± SEM,

n

= 3). (Γ) Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετική συγκέντρωση του POL, και στη συνέχεια η κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ στον υποδεικνυόμενο χρόνο (μέση ± SEM,

n

= 3). (D) Διάφορα συγκέντρωση POL προεπωάσθηκε στους 37 ° C για 30 λεπτά με μαννόζη (1-3), μαννόζη (1-6) και μαννόζη (1-3? 1-6), και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με Α549 κύτταρα για 24 h. Η ανασταλτική αναλογία κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ (μέσος όρος ± SEM,

n

= 3).

Η

Τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα του POL επί κυττάρων Α549

Η ανασταλτική ανάπτυξης επιδράσεις του POL αξιολογήθηκαν με δοκιμασία ΜΤΤ σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένου του καρκινώματος του παχέος εντέρου Caco-2 κυττάρων, καρκίνωμα τραχήλου HeLa κύτταρα, μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα καρκίνου του Α549, ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα HepG

2 και 7721 κυττάρων, καρκινώματος μαστού MCF- 7 κύτταρα, κύτταρα μελανώματος Α375, και το IC

50 τιμές ήταν 47 μg /ml, 30 μg /ml, 23 μg /mL, 42 μg /mL, 38 μg /mL, 50 μg /mL και 26 μg /mL , αντίστοιχα (Εικ. 1Β). Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι η POL ήταν περισσότερο ευαίσθητη σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα καρκίνου του Α549, και, ως εκ τούτου, τα κύτταρα Α549 επιλέχθηκαν για περαιτέρω διερεύνηση.

επάγεται POL θάνατος κυττάρου Α549 σε μια δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο, και 0 μg /ml έως 100 μg /mL POL εξασκείται ισχυρή ανασταλτική δράση επί της ανάπτυξης των κυττάρων Α549 (Σχ. 1 C). Μετά από 24 ώρες επώαση με 23 μg /mL POL, η ανασταλτική ποσοστό έφθασε σχεδόν στο 50%.

Η συσχέτιση μεταξύ ζάχαρης δέσμευσης και αντι-πολλαπλασιαστική δράση του POL

Η δοκιμασία αναστολής μαννόζη για να προσδιορισθεί η σχέση μεταξύ της δραστικότητας ζάχαρη δέσμευσης του POL και αντι-πολλαπλασιαστική ιδιοκτησία της. Διαφορετικές συγκέντρωση POL προ-επωάστηκαν με μαννόζη α (1,3), μαννόζη α (1,6) και μαννόζη α (1,3:1,6) για 30 λεπτά, αντίστοιχα. Λόγω της δραστικότητας δέσμευσης μαννόζης του POL, και οι τρεις τύποι μαννόζες ανέστειλε πλήρως την δραστηριότητα συγκόλλησης των ερυθρών αιμοσφαιρίων του POL. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1D, η ανάπτυξη ανασταλτικές επιδράσεις των διαφόρων συγκέντρωση ΠΟΛ χάθηκαν στο αντίστοιχο επίπεδο με τον χάνουν δραστηριότητας δέσμευσης μαννόζης, δείχνοντας ότι μπορεί να υπάρχει μια στενή σχέση μεταξύ της δραστηριότητας συγκόλλησης των ερυθρών αιμοσφαιρίων και αντι-πολλαπλασιαστική ιδιότητα της ΠΟΛ.

POL επάγει απόπτωση σε κύτταρα Α549

Marked αποπτωτικά μορφολογικές αλλαγές όπως διόγκωση της μεμβράνης, η μείωση του όγκου των κυττάρων και τη στρογγυλοποίηση, παρατηρήθηκαν σε /mL κύτταρα Α549 POL-αγωγή 23 μg με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης (Σχ. 2Α). Εκτός αυτού, σημαντική κατάτμηση του DNA σε πυρήνες παρατηρήθηκε σε κύτταρα Α549 POL-επαγόμενη, ενώ η αγωγή με PBS ομάδα ελέγχου έδειξε φυσιολογική, στρογγυλά και ομοιογενώς χρωματίστηκαν πυρήνες (Εικ. 2Β). Ωστόσο, 23 μg /mL POL δεν οδήγησε σε εμφανή αποπτωτική μορφολογία σε μη καρκινικά κύτταρα HELF μετά από 24 ώρες ή 48 ώρες θεραπείας (Εικ. 2C και Σχ. 2D). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι POL ενδέχεται να προκαλέσουν επιλεκτικά κύτταρα Α549 απόπτωση αλλά δεν θα μπορούσε να προκαλέσει την απόπτωση των κανονικών κυττάρων HELF. Επιπλέον, όπως φαίνεται στο Σχ. 2Ε, 23 μg /mL POL αισθητά οδήγησε στην ενίσχυση του Υπο-G

1 φάγου αναλογία των κυττάρων Α549 σε χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο (β: 27,34 ± 4,1%, C: 39,27 ± 5,8%), υποδεικνύοντας ότι POL επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα Α549. Επιπλέον, αννεξίνη V-FITC και διπλή χρώση ΡΙ διεξήχθη για να κατατάξει μεταξύ των ζωντανών κυττάρων (αννεξίνη V- /ΡΙ-), πρώιμων αποπτωτικών (αννεξίνη V + /ΡΙ-), αργά αποπτωτικών (αννεξίνη V + /ΡΙ +) και νεκρωτικές κυττάρων (αννεξίνη V – /ΡΙ +). Όπως φαίνεται στο Σχ. 2F, μετά /mL θεραπεία POL 23 μg, το ποσοστό των ζωντανών κυττάρων μειώθηκαν σταδιακά (α: 98,25 ± 1,3%, Β: 74.63 ± 4.7%, C: 55,71 ± 3,9%), ενώ η αναλογία της πρώιμης (β: 15,34 ± 2,6%, C: 23,75 ± 2,8%) και αργά (β: 13,94 ± 3,6%, c:. 22.14 ± 4.5%) αποπτωτικά κύτταρα ενισχύθηκαν με την αύξηση του χρόνου

(Α) κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με PBS (24 h) ή 23 μg /mL POL για προκαθορισμένο χρόνο, και οι μορφολογικές ποικιλίες ανιχνεύθηκαν υπό μικροσκοπία αντίθεσης φάσης και (Β) μικροσκοπία φθορισμού (200 Χ). (Γ) Μετά από αγωγή με κύτταρα HELF με PBS (24 h) ή 23 μg /mL POL για προκαθορισμένο χρόνο, τα μορφολογικά ποικιλίες ανιχνεύθηκαν υπό μικροσκοπία αντίθεσης φάσης και (D) μικροσκοπία φθορισμού (200 Χ). (Ε) Οι διαφορετικές φάσεις ποσοστό των κυττάρων Α549 παρενέβαινε με 23 μg /mL POL για 24 ώρες ή 48 ώρες μετρήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Η ομάδα ελέγχου υποβλήθηκε σε επεξεργασία με PBS για 24 ώρες. (F) Α549 κύτταρα εκτέθηκαν σε 23 μg /mL POL για 24 ώρες ή 48 ώρες, οι αναλογίες της πρόωρης απόπτωσης και αργά απόπτωση μετρήθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό διπλή χρώση αννεξίνης V-FITC /ΡΙ. ομάδα ελέγχου υποβλήθηκε σε επεξεργασία με PBS για 24 ώρες.

Η

ΠΟΛ προκαλεί αυτοφαγία στα κύτταρα Α549

Για την ανίχνευση του σχηματισμού αυτοφαγικά κενοτόπια, MDC έντασης φθορισμού των 23 μg /mL POL κατεργασμένα Α549 και κύτταρα HELF για 24 ώρες ή 48 ώρες αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, αυτοφαγικά κενοτόπια σχηματίστηκαν σε κύτταρα Α549 που χαρακτηρίστηκε από την αυξημένη MDC ένταση φθορισμού, υποδεικνύοντας την παρουσία αυτοφαγικά κυτταρικού θανάτου. Ωστόσο, στο Σχ. 3Β, MDC έντασης φθορισμού των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με HELF POL δεν αυξήθηκε ούτε μετά από 24 ώρες, ούτε 48 ώρες, γεγονός που υποδηλώνει αυτοφαγικά κενοτόπια δεν σχηματίστηκαν σε POL-επαγόμενα κύτταρα HELF. Θα μπορούσαμε να περιλαμβάνουν ότι η POL θα μπορούσαν να προκαλέσουν επιλεκτικά αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα Α549 αλλά όχι σε κύτταρα HELF. Με την περαιτέρω χρησιμοποιώντας χρώση πορτοκαλί ακριδίνης, το σχηματισμό των όξινων φυσαλιδώδους οργανίδια (ΑνΟ) σε κύτταρα Α549 POL-ενεργοποιείται καταδείχθηκε (Σχ. 3C). Από Beclin1 αναβάθμιση και μετατροπή των LC3I να LC3II ήταν τα χαρακτηριστικά της αυτοφαγία, εντοπίστηκαν οι εκφράσεις του Beclin1 και LC3 σε κύτταρα Α549 POL-επαγόμενη. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3D, POL επήγαγε την εξαρτώμενη από το χρόνο αύξηση της Beclin 1 επίπεδο και συσσώρευση της LC3-ΙΙ σε κύτταρα Α549. Στη συνέχεια, οι εκφράσεις του Beclin1 και LC3 ήταν γκρέμισε με τη χρήση ειδικών siRNAs (Εικ. 3Ε). Η επιμόλυνση με Beclin1 ή LC3 siRNA μειωμένη POL-επαγόμενη αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης (Εικ. 3F). Όλα αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι POL επάγεται autophagy σε κύτταρα Α549.

Α549 κύτταρα (Α) και τα κύτταρα HELF (Β) υπέστησαν αγωγή με PBS (24 h) ή 23 μg /mL POL για προκαθορισμένο χρόνο, και το MDC ένταση φθορισμού αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. (Γ) Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με PBS (24 h) ή 23 μg /mL POL για προκαθορισμένο χρόνο, και ο πορτοκαλί ακριδίνης ένταση φθορισμού μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. (D) Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 23 μg /mL POL για προκαθορισμένο χρόνο, που ακολουθείται από ανάλυση κηλίδος Western για την ανίχνευση του φωσφορυλιωμένου-Beclin1 και LC3 επίπεδα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης ίση. (Ε) κύτταρα Α549 επιμολύνονται με Beclin1, LC3 ή ελέγχουν siRNA για 24 ώρες, το Beclin1 και τα επίπεδα LC3 εξετάστηκαν με ανάλυση κηλίδος Western. (F) κύτταρα Α549 επιμολύνονται με Beclin1, LC3 ή ελέγχουν siRNA για 24 ώρες που ακολουθείται από διέγερση με ή χωρίς 23 μg POL /ml για 24 ώρες, ο λόγος αναστολής της κυτταρικής ανάπτυξης μετρήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ (μέσος όρος ± SEM,

n

= 3).

Η

POL Προκαλεί κασπάσης-εξαρτώμενη απόπτωση σε κύτταρα Α549

Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α, μετά αυτοφαγικά αναστολέας θεραπεία 3-ΜΑ, 23 μg /mL POL σημαντικά ενισχυμένη δραστικότητα κασπάσης-3 σε έναν χρονο-εξαρτώμενο τρόπο, υποδεικνύοντας POL-επαγόμενη απόπτωση λαμβάνει χώρα μέσω της ενεργοποίησης του κοινού αποπτωτικών εκτελεστών όπως κασπάση-3. Επιπλέον, αναλύσεις κηλίδος Western μετά αναστάλθηκε autophagy έδειξαν ότι μετά από αγωγή με 23 μg /mL POL για προκαθορισμένο χρόνο, κασπάσης-3 και -9 διασπάστηκαν, αφού procaspase-3 και -9 μειώθηκαν ενώ διασπασμένης κασπάσης-3 και -9 ήταν αυξημένη (Σχ. 4Β α). Επίσης, αυξητική ρύθμιση των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bax και Bid, καθώς και προς τα κάτω ρύθμιση των αντι-αποπτωτικών Bcl-2 και Bcl-X

L πρωτεΐνες παρατηρήθηκαν μετά την αγωγή POL. Εκτός αυτού, 23 μg /mL POL οδήγησαν σε διάσπαση της PARP από μια ζώνη 116 kDa σε ένα θραύσμα 89 kDa με την αύξηση του χρόνου (Σχ. 4Β β), και κυτόχρωμα

γ

απελευθερώθηκε από μιτοχόνδρια σε κυτταρόπλασμα μετά τη θεραπεία POL (Εικ. 4Β γ). Όπως φαίνεται στο Σχ. 4C και το Σχ. 4D, όταν autophagy καταστάλθηκε από 3-ΜΑ, POL μείωσε την ροδαμίνη 123 ένταση φθορισμού σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, η διάσπαση της κασπάσης-3 και -9 μπορούσαν να διασωθούν με την παρουσία 10 μΜ Ζ-VAD-fmk σε κύτταρα Α549 POL-επαγώμενη (Σχ. 4Ε). Και, Sub-G

1 ανάλυση κυττάρων αναλογία και διπλή χρώση αννεξίνης V /PI επίσης αποδειχθεί ότι ο αναστολέας κασπάσης z-VAD-fmk θα μπορούσε να προστατεύσει τα κύτταρα Α549 από αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο (Σχ. 4F και Σχ. 4G). Όλα αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν σαφώς ότι POL απόπτωση που επάγεται μέσω της μιτοχονδριακής μεσολάβηση οδού στα κύτταρα Α549.

(Α) Επιπτώσεις των 23 μg /mL ΠΟΛ για κασπάσης-3 ενεργοποίησης με την αύξηση του χρόνου (μέσος όρος ± SEM,

n

= 3) (* p & lt? 0,05

vs

0 h ομάδα).. (Β) 23 μg /mL POL επαγόμενη διάσπαση της κασπάσης-3, κασπάσης-9 (α). POL οδήγησε σε διάσπαση της PARP, αυξητική ρύθμιση των προ-αποπτωτικών Βαχ και Bid, καθώς επίσης και ρύθμιση προς τα κάτω των αντι-αποπτωτικών Bcl-2 και Bcl-X

L με τον χρόνο καλλιέργειας (β). Κυτταρολύματα κλασματώθηκαν για να απομονωθούν κυτταροπλασματική και αργού μιτοχόνδρια, και η παρουσία του κυτοχρώματος

γ

σε κυτοσολικά και μιτοχονδριακή κλάσματα αξιολογήθηκε με ανάλυση WB χρησιμοποιώντας το κοκτέιλ αντισωμάτων ApoTrack. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος κυτοσόλιο ίση φόρτωση, ενώ prohibitin χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης μιτοχόνδρια (γ). (Γ) Η επίδραση του 23 μg /mL POL σχετικά με την ακεραιότητα των μιτοχονδριακών μεμβρανών μετρήθηκε με χρώση ροδαμίνη 123, και η ένταση φθορισμού αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. (Δ) Οι ποικιλίες των μιτοχονδριακών μεμβρανών πιθανών περαιτέρω παρουσιάζεται ως διάγραμμα bar (μέση τιμή ± SEM,

n

= 3) (** p & lt? 0.001

vs

ομάδα ελέγχου, ns:. Δεν σημαντική

vs

. ομάδα ελέγχου). (Ε) Ανάλυση Western blot της προ-κασπάσης 3, διασπασμένη κασπάση 3, προ-caspase9 και διασπάται επίπεδα caspase9 σε κύτταρα Α549 σε επεξεργασία με 23 μg /mL μόνη ή σε συνδυασμό με 10 μΜ αναστολέα κασπάσης z-VAD-fmk για 24 ώρες. (F) Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 23 μg /mL POL μόνο του ή σε συνδυασμό με 10 μΜ κασπάσης αναστολέα z-VAD-fmk για 24 ώρες και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ), τον ποσοτικό προσδιορισμό των στοιχείων χρώσης ΡΙ παρουσιάζονται ως ποσοστά των κυττάρων σε SubG

1 φάση. (Ζ) Η επίδραση της κασπάσης σε 23 μg /mL POL-επαγόμενη SubG

1 αναλογία φάση εκπροσωπήθηκαν ως ιστόγραμμα (μέση τιμή ± SEM,

n

= 3) (## ρ & lt? 0.001

vs

ΠΟΛ ομάδα, ns:.. χωρίς σημαντική

vs POL ομάδα

)

Η

Η αναστολή της αυτοφαγία μειώνει εν μέρει POL-επαγόμενη απόπτωση

Όπως. φαίνεται στο Σχ. 5Α, μετά αυτοφαγία κατεστάλη, POL-επαγόμενο κυτταρικό παρεμπόδιση της ανάπτυξης μειώθηκε σημαντικά. Αναστολή της autophagy με 3MA ή knockdown του Beclin1 δια προκατεργασίας με Beclin1 siRNA (Σχ. 5Β) μειώθηκε η αναλογία του MDC θετικών κυττάρων (Εικ. 5C α), υποδεικνύοντας ότι autophagy καταστάλθηκε από 3MA και Beclin1 siRNA. Εκτός αυτού, καταθλιπτική του POL-επαγόμενης autophagy ανέστειλε POL-επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα Α549, τα οποία χαρακτηρίστηκε από μείωση της υπο-G

1 περιεχόμενο DNA φάγων (Σχ. 5C β), καθώς και νωρίς και αργά αποπτωτικών τμήμα (Εικ . 5C γ). Συνέπεια, η καταστολή της αυτοφαγία είτε 3MA ή Beclin1 siRNA οδήγησε επίσης σε μείωση της διάσπασης PARP και την έκφραση LC3-II σε κύτταρα Α549 αντιμετωπίζονται ΠΟΛ (Εικ. 5D και Σχ. 5Ε). Όλα αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αναστολή της autophagy μειώνει μερικώς POL-επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα Α549.

(Α) κύτταρα Α549 προκατεργάστηκαν με 2 mM 3MA 1 ώρα πριν από τη χορήγηση του 23 μg /ml POL για προκαθορισμένο χρόνο , και η ανασταλτική αναλογία κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ. Η ομάδα ελέγχου υποβλήθηκε σε επεξεργασία με PBS. (Μέση τιμή ± SEM,

n

= 3) (* p & lt? 0,05, ** p & lt? 0.001

vs

ομάδα ελέγχου, ns:.. Καμία σημαντική

vs

Ελέγχου ομάδα, # p & lt? 0,05, ## ρ & lt?. 0,001

vs

ομάδα POL). (Β) κύτταρα Α549 επιμολύνονται με έλεγχο siRNA και ειδικών Beclin1 siRNA για 24 ώρες, το επίπεδο Beclin1 εξετάστηκε με ανάλυση στυπώματος Western. (Γ) Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με 2 mM 3MA ή επιμολυσμένα με ειδικές Beclin1 siRNA πριν από τη χορήγηση του 23 μg /ml POL για 24 ώρες, και η ένταση φθορισμού MDC (α), SubG

1 αναλογία φάγων κυττάρων (β ) και στις αρχές του, καθώς και τα τέλη απόπτωση (c) αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Η ομάδα ελέγχου υποβλήθηκε σε επεξεργασία με PBS για 24 ώρες. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως διάγραμμα μπαρ. (Μέση τιμή ± SEM,

n

= 3) (* p & lt? 0,05, ** p & lt? 0.001

vs

ομάδα ελέγχου, ns:. Καμία σημαντική

vs

Ελέγχου. ομάδα, # p & lt? 0,05, ## ρ & lt?. 0,001

vs

ΠΟΛ ομάδα). (D) διασπασμένη PARP και LC3-ΙΙ εκφράσεις σε κύτταρα Α549 σε επεξεργασία με 23 μg /ml POL για 24 ώρες απουσία ή παρουσία 3MA (2 mM) μετρήθηκαν. Τα αντιπροσωπευτικά στοιχεία έδειξαν. (Ε) κύτταρα Α549 προτίμηση επιμολύνθηκαν με έλεγχο siRNA ή ειδικές Beclin1 siRNA για τη θεραπεία 24 ώρες πριν από τις 23 μg /ml POL για άλλες 24 ώρες και η διάσπαση της PARP όπως επίσης και την έκφραση του LC3II μετρήθηκαν.

Η

POL πυροδοτεί απόπτωση μέσω καταστολής μονοπατιού Akt-NF-κΒ και εκκινεί autophagy

μέσω

αναστολή μονοπατιού Akt-mTOR

κηλίδος Western αναλύσεις έδειξαν ότι η θεραπεία των κυττάρων Α549 με 23 μg /mL POL για υποδεικνύεται ώρα οδήγησε σε μειωμένη έκφραση του φωσφορυλιωμένου-NF-κΒ (ρ65) (Ser536), φωσφορυλιωμένου-Ακί (Ser473), φωσφορυλιωμένου-Akt (Thr308), φωσφορυλιωμένη-mTOR (Ser2448), φωσφορυλιωμένη-70S6K (Thr389) και φωσφορυλιωμένου-4E -BP1 (Thr37 /46) (Σχ. 6Α). Και οι μεταγενέστεροι υποστρώματα της mTORC1, p70S6K (70 kDa ριβοσωμική S6 κινάσης) και 4Ε-BP1, επίσης αποτελεσματικά αποφωσφορυλιώθηκαν με επεξεργασία POL σε κύτταρα Α549 (Σχ. 6Α). Για να επιβεβαιωθεί το μονοπάτι σηματοδότησης σε κύτταρα Α549 POL-αγωγή, χρησιμοποιήσαμε γενετική προσέγγιση για αντίστοιχα υπερεκφράζουν Akt, NF-κΒ και mTOR (Εικ. 6Β) σε POL-αγωγή Α549 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Β, υπήρχε έντονη ενεργοποίηση της Akt, NF-κΒ και mTOR σε επιμολυσμένα κύτταρα Α549 σε σχέση με αυτά φορέα-επιμολυσμένα, επιβεβαιώνοντας την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης. Η επιμόλυνση του Myr-Akt σε κύτταρα Α549 (υπερ-έκφραση του Akt) αντιστρέφεται POL-επαγόμενη μείωση του φωσφορυλιωμένου-NF-κΒ (ρ65) (Ser536) και φωσφορυλιωμένου-mTOR (Ser2448) (Εικ. 6Β). Ωστόσο, η επιμόλυνση του Τ7-ΚεΙΑ (υπερ-έκφραση του NF-κΒ) ή Flag-mTOR (υπερ-έκφραση του mTOR) δεν οδήγησε σε οποιαδήποτε αντίστροφη των πρωτεϊνών (Σχ. 6Β), υποδεικνύοντας ότι Akt θα μπορούσε να είναι η προς τα πάνω του NF-κΒ και mTOR σε κύτταρα Α549 POL-αγωγή.

(Α) Μετά από αγωγή με 23 μg POL /ml για προκαθορισμένο χρόνο, τα επίπεδα φωσφορυλιωμένου Akt-, Akt, φωσφορυλιωμένη-NF-κΒ (ρ65) , NF-κΒ (ρ65), φωσφορυλιωμένου-mTOR, mTOR, φωσφορυλιωμένη-p70S6K και φωσφορυλιωμένο-4E-BP1 ανιχνεύθηκαν. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης ίση. (Β) κύτταρα Α549 επιμολύνονται με κενό φορέα, Myr-Akt (ενεργοποιημένη), Τ7-ΚεΙΑ (ενεργοποιημένη) και Flag-mTOR (ενεργοποιημένη), και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 23 μg /mL POL για 0 ​​h ή 24 h. Τα επίπεδα φωσφορυλιωμένου Akt-, Akt, φωσφορυλιωμένη-NF-κΒ (ρ65), ΝΡ-κΒ (ρ65), φωσφορυλιωμένη-mTOR και mTOR μετρήθηκαν. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης ίση. (Γ) συνεχής ενεργοποίηση του Akt, NF-κΒ και mTOR PRIO προς /mL θεραπεία POL 23 μg για 24 ώρες, οι ποικιλίες μορφολογικές ανιχνεύθηκαν υπό μικροσκοπία αντίθεσης φάσης. Η ομάδα ελέγχου υποβλήθηκε σε επεξεργασία με PBS για 24 ώρες. (Δ) Μετά από συνεχή ενεργοποίηση του Akt, NF-κΒ και mTOR, 23 μg /mL POL υποβλήθηκε σε επεξεργασία με κύτταρα Α549 για 24 ώρες, το SubG

1 αναλογία φάγων (α), νωρίς καθώς και αναλογία αργά απόπτωση (β ), MDC ένταση φθορισμού (γ), και η ένταση φθορισμού AVO (δ) αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Η ομάδα ελέγχου υποβλήθηκε σε επεξεργασία με PBS για 24 ώρες. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως διάγραμμα μπαρ. (Μέση τιμή ± SEM,

n

= 3). (* P & lt? 0,05, ** p & lt? 0.001

vs

ομάδα ελέγχου, ns:. Καμία σημαντική

vs ΠΟΛ ομάδα

, # p & lt? 0,05, ## ρ & lt? 0.001

. εναντίον

POL ομάδα).

Η

Για να επαληθεύσετε περαιτέρω κατά πόσον αυτές οι πρωτεΐνες συμμετείχε στην POL-επαγόμενη απόπτωση ή αυτοφαγία, την ανίχνευση μορφολογία και κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας εφαρμόστηκαν. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6C, υπερ-έκφραση του Akt αντιστραφεί POL-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο, ενώ η υπερ-έκφραση του NF-κΒ και mTOR διατηρούνται ακόμα μερικώς POL-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο. Αναφέρεται ότι Akt μπορεί να είναι υπεύθυνος για POL που προκαλείται τόσο απόπτωση και αυτοφαγία στα κύτταρα Α549. Επιπλέον, Akt υπερέκφραση ως αποτέλεσμα τη μείωση του SubG

1 μερίδα (Εικ. 6D α), πρώιμων αποπτωτικών (αννεξίνης V + /ΡΙ-) και αργά αποπτωτικά (αννεξίνης V + /ΡΙ +) κύτταρα (Σχ. 6D β), MDC ένταση φθορισμού (Εικ. 6D γ) καθώς και όξινα φυσαλιδώδους οργανίδια (ΑνΟ) σχηματισμός (Εικ. 6D δ). Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι η υπερ-έκφραση του Akt μπορούσε να αντιστρέψει POL-επαγόμενη απόπτωση και αυτοφαγία ταυτόχρονα, υποδεικνύοντας Akt πρωτεΐνη μπορεί να περιλαμβάνει τόσο POL-επαγόμενη απόπτωση και αυτοφαγία. Ωστόσο, η υπερβολική έκφραση του ΝΡ-κΒ σαν αποτέλεσμα μόνο καταστολή των αποπτωτικών χαρακτηριστικών, συμπεριλαμβανομένων μειωθεί σημαντικά τμήματα των SubG

1 (Σχ. 6D α), καθώς και πρώιμη και την όψιμη αποπτωτικών κυττάρων (Σχ. 6D β). Ενώ, η υπερ-έκφραση του mTOR αντιστραφεί μόνο POL-επαγόμενη αυτοφαγία, όπως χαρακτηρίζεται από μειωμένη ένταση φθορισμού του MDC (Εικ. 6D γ) και ΑΟ (Εικ. 6D δ). Στο σύνολό τους, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι η προκαλούμενη ΠΟΛ απόπτωση μέσω καταστολή Akt-NF-κΒ οδού, ενώ ξεκίνησε αυτοφαγία

μέσω

αναστολή της Akt-mTOR μονοπάτι. Akt οδηγεί το διακόπτη μεταξύ αυτοφαγία και την απόπτωση σε κύτταρα Α549 POL-θεραπεία.

POL-επαγόμενη μοριακός διακόπτης ο ρόλος της Akt είναι ROS-εξαρτώμενη

επίπεδα ROS ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ROS-ανίχνευση φθορίζουσα χρωστική DCFH -DA. Αποδεικνύεται ότι η συσσώρευση ROS ενισχύθηκε σε POL-επαγόμενη Α549 κυττάρων σε ένα δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 7Α). Επιπλέον, η επώαση των κυττάρων Α549 με 23 μg /mL POL οδήγησε στη μείωση της περιεκτικότητας σε GSH και ενζυμική δραστηριότητα GPX σε χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο, υποδεικνύοντας ότι POL κατήργησε το σύστημα αντιοξειδωτικό GSH και τελικά οδήγησε σε μαζική συσσώρευση ROS στα κύτταρα Α549 (Σχ . 7Β). Και, αυτή η 23 μg /mL POL-προκαλούμενη αύξηση του ROS θα μπορούσε να ανασταλεί με προκατεργασία με τον καθαριστή ROS, NAC (Εικ. 7C).