Αφηρημένο

Σε αυτή τη μελέτη, ένα νέο αποπτωτικών μονοτερπενοειδούς ινδόλη αλκαλοειδές, subditine (1), και τέσσερις γνωστές ενώσεις απομονώθηκαν από το φλοιό του

Nauclea subdita

. Πλήρης

1 Η- και

στοιχεία 13C- NMR της νέας ένωσης αναφέρθηκαν. Οι δομές των απομονωμένων ενώσεων επεξηγηθεί με διάφορες φασματοσκοπικές μεθόδους, όπως 1D- και 2D- NMR, IR, UV και LCMS. Και οι πέντε ενώσεις σαρώθηκαν για κυτταροτοξική δραστηριότητα σε LNCaP και PC-3 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη. Μεταξύ των πέντε ενώσεων, το νέο αλκαλοειδές, subditine (1), έδειξε την πιο ισχυρή δράση αναστολής της κυτταρικής ανάπτυξης και επιλεκτική έναντι LNCaP με IC

50 του 12,24 ± 0,19 μΜ και PC-3 με IC

50 13.97 ± 0.32 μΜ, σε σύγκριση με RWPE ανθρώπινη φυσιολογική κυτταρική σειρά επιθηλιακών κυττάρων (IC

50 = 30,48 ± 0,08 μΜ). Subditine (1) θεραπεία επαγόμενης απόπτωσης σε LNCaP και PC-3, όπως αποδεικνύεται από την αυξημένη διαπερατότητα των κυττάρων, διάσπαση του κυτταροσκελετικών δομών και αυξημένη πυρηνική κατακερματισμό. Επιπλέον, subditine (1) ενισχυμένη ενδοκυτταρική αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) παραγωγή, όπως αντικατοπτρίζεται από την αυξημένη έκφραση της ρεδουκτάσης γλουταθειόνης (GR) να σαρώνουν επιβλαβείς ελεύθερες ρίζες και στις δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη. Υπερβολική ROS μπορεί να οδηγήσει σε διαταραχή του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ), την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c και επακόλουθη κασπάσης 9, 3/7 ενεργοποίηση. Περαιτέρω τεχνική Western blot έδειξε subditine (1) προκάλεσε μειορύθμιση του Bcl-2 και Bcl-XL έκφραση, ενώ p53 ήταν ρυθμιζόμενες σε LNCaP (ρ53-άγριου τύπου), αλλά όχι σε PC-3 (ρ53-ηυΙΙ) . Συνολικά, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι η νέα ένωση subditine (1) ασκεί αντι-πολλαπλασιαστική δράση επί LNCaP και PC-3 ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη κύτταρα μέσω της επαγωγής της απόπτωσης

Παράθεση:. Liew SY, κατάλογο σημαντικών ζητημάτων CY, Paydar Μ, Cheah FK, Leong KH, Wong WF, et al. (2014) Subditine, μια νέα μονοτερπενοειδούς αλκαλοειδές ινδόλης από το φλοιό του

Nauclea subdita

(Korth.) Steud. Επάγει την απόπτωση σε κύτταρα ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 9 (2): e87286. doi: 10.1371 /journal.pone.0087286

Επιμέλεια: Chih-Pin Chuu, Εθνική Έρευνα Υγείας Ινστιτούτα, την Ταϊβάν

Ελήφθη: 16 Αυγούστου του 2013? Αποδεκτές: 20, Δεκεμβρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 14 Φεβρουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Liew et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Πανεπιστήμιο της Malaya Research Grant RP001 /2012? University of Malaya High Impact Research Grant UM.C /625/1 /HIR /Mohe /SC /37 και HIR: E00002-20001? Γαλλικό Εθνικό Κέντρο Επιστημονικής Έρευνας CNRS χορηγήσει 57-02-03-1007? και Μεταπτυχιακό Κονδυλίων Έρευνας του Πανεπιστημίου της Μαλαισίας (PV050 /2012A). Η εργασία αυτή πραγματοποιήθηκε στο πλαίσιο της επίσημης συμφωνίας μεταξύ του CNRS και του Πανεπιστημίου της Μαλαισίας (Μαλαισία). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η οικογένεια Rubiaceae (Madder οικογένεια) είναι μία από τις μεγαλύτερες των αγγειόσπερμων με περισσότερα από 637 γένη και σχεδόν 10.700 είδη [1]. Το γένος

Nauclea

που ανήκει σε αυτή την οικογένεια, αποτελείται από περίπου 35 είδη σε όλο τον κόσμο [2] και στη Μαλαισία, υπάρχουν δύο

Nauclea

είδη?

Ν. officinalis

και

Ν. subdita

[3].

Nauclea subdita

(Korth.) Steud. είναι ένα τροπικό φυτό που φυτρώνει σε πεδινές στα δάση λόφο, σε ελώδεις περιοχές και συχνά μαζί ρέματα και τα ποτάμια [4]. Είναι ένα μικρό ή μεσαίου δέντρο έως 25 m ύψος και 60 εκατοστά περίμετρο [3]. Τα φυτά από αυτό το γένος είναι γνωστό ότι παράγουν ενδιαφέροντα μονοτερπενοειδούς ινδόλη αλκαλοειδή με υψηλή δομική ποικιλία όπως naucline [5], nauclealines B [6] και naufoline [7]. Πολλοί από αυτούς παρουσίασαν σημαντικές βιολογικές δραστηριότητες? αντισπασμωδικό [8], αντι-πολλαπλασιαστικές [9] και αγγειοχαλαρωτικού δραστηριότητες [5].

Ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται ο καρκίνος στους άνδρες στον ανεπτυγμένο κόσμο. Υπολογίζεται ότι 238.590 νέες περιπτώσεις θα διαγνωστούν και 29.720 θάνατοι θα προκύψουν από καρκίνο του προστάτη στις Ηνωμένες Πολιτείες το 2013 (Καρκίνου Γεγονότα και αριθμοί 2013, American Cancer Society, 2013). Αν και οι μηχανισμοί που οδηγούν τον καρκίνο του προστάτη δεν έχουν πλήρως κατανοηθεί, την ηλικία, τη φυλή και το οικογενειακό ιστορικό των ασθενών με καρκίνο του προστάτη έχουν δειχθεί ότι είναι οι πιθανοί παράγοντες που συνδέονται στενά με αυτό το θανατηφόρο ασθένεια [10].

συνεχής προσπάθεια μας για την αναζήτηση νέων και βιοενεργών χημικών συστατικών από τη χλωρίδα Μαλαισία [11] – [15], μια νέα κυτταροτοξική και αποπτωτικών μονοτερπενοειδούς ινδόλη αλκαλοειδές, subditine (1), έχει απομονωθεί από το φλοιό του

Nauclea subdita

μαζί με τα τέσσερα γνωστά αλκαλοειδή? angustoline (2) [11], [16], [17], angustidine (3) [18], [19], angustine (4) [20], [21], nauclefine (5) [22], [23 ] (Φιγούρα 1). Στην παρούσα εργασία, αναφέρουμε την απομόνωση και χαρακτηρισμό του subditine (1), η κυτταροτοξική δραστηριότητα των αλκαλοειδών 1-5, καθώς και την αποπτωτικό μηχανισμό του 1 έναντι ανθρώπινου προστάτη καρκινικών κυττάρων LNCaP και PC-3.

η δομή της νέας ένωσης, subditine (1) έχουν αποσαφηνιστεί χρησιμοποιώντας διάφορες φασματοσκοπικές μέθοδος η οποία ήταν 1D-NMR (

1

13C, DEPT), 2D-NMR (HSQC, HMBC, NOESY), UV, IR και LCMS ενώ η δομή των άλλων τεσσάρων γνωστών ενώσεων επιβεβαιώθηκαν μέσω της σύγκρισης των δεδομένων NMR με τις τιμές της βιβλιογραφίας.

η

Υλικά και Μέθοδοι

Γενικές Διαδικασίες

η 1D – και 2D-NMR καταγράφηκαν εντός δευτεριωμένου χλωροφορμίου (ΟϋΟ

3) (Merck, βαθμός δευτεριώσεως min 99,8%.) χρησιμοποιώντας JEOL LA 400 MHz FT NMR και φασματόμετρο JEOL ECA 400 MHz FT NMR. Τα φάσματα μάζας λήφθηκαν σε ένα Shimadzu LCMS-IT-TOF. Τα υπεριώδη φάσματα απορρόφησης αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας Shimadzu UV-250 υπεριώδους-ορατού φασματόμετρου. Διαλύτης που χρησιμοποιήθηκε ήταν μεθανόλη (CH

3OH). IR φάσματα ελήφθησαν σε Perkin Elmer Spectrum 400 FTIR φασματόμετρο με CHCl

3 ως διαλύτη. Όλοι οι διαλύτες, εκτός από εκείνες που χρησιμοποιούνται για την εκχύλιση χύδην είναι AR βαθμού. Silica gel 60 (Merck, 0.040-0.063 mm) χρησιμοποιήθηκε για χρωματογραφία στήλης (CC). πυριτική πηκτή αλουμινίου υποστηρίζεται 60 F

254 πλάκες 20 × 20 cm χρησιμοποιήθηκαν για χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC) (Merck, Germany). Παρασκευαστική χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (PTLC) σίλικα ζελ 60 F πλάκες

254 ποτήρι 20 × 20 cm (Merck, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκαν για το διαχωρισμό των ενώσεων που δεν μπορούν να διαχωριστούν με συμβατικές στήλη. TLC κηλίδες οπτικοποιήθηκαν υπό υπεριώδες φως (254 και 365 nm) που ακολουθείται από ψεκασμό με αντιδραστήριο Dragendorff για αλκαλοειδές ανίχνευση. Ένα θετικό αποτέλεσμα υποδείχθηκε από τον σχηματισμό πορτοκαλί κηλίδες.

Φυτικό υλικό

Ο φλοιός του

Nauclea subdita

συλλέχθηκε σε Hutan Simpan Bukit Kinta, Chemor, Perak, Μαλαισία από το φυτοχημικές ομάδα του Τμήματος Χημείας, Σχολή Θετικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο της Μαλαισίας. Τα δείγματα κουπόνι (KL 5254) από αυτά τα φυτά έχουν κατατεθεί στο Herbarium του Τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Malaya, Κουάλα Λουμπούρ, Μαλαισία. συλλογή φυτών έχουν εγκριθεί από τον προϊστάμενο της Jabatan Perhutanan Negeri Perak (Perak μέλος Δασαρχείο). Οι μελέτες πεδίου δεν περιλαμβάνει απειλούμενα ή προστατευόμενα είδη.

Εξαγωγή και Απομόνωση

Αποξηραμένα, γειωμένη φλοιό του φυτού (1,7 kg) για πρώτη φορά σε αφαίρεση του λίπους με εξάνιο (17 λίτρα) για 3 ημέρες στους θερμοκρασία δωματίου. Το εκχύλισμα εξανίου διηθείται και ξηραίνεται σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, οι ξηροί φυτικών υλικών υγράνθηκαν με διάλυμα αμμωνίας και διαποτίζεται για 2 ώρες. Είχαν επανεκχυλίζεται με CH

2Cl

2 (17 λίτρα) δύο φορές για μια περίοδο 3 ημέρας. Το υπερκείμενο που ελήφθη συμπυκνώθηκε με τη χρήση περιστροφικού εξατμιστήρα υπό ελαττωμένη πίεση σε έναν όγκο 500 mL και εξετάστηκαν για αλκαλοειδές το περιεχόμενό του (χρησιμοποιώντας TLC και επιβεβαιώθηκε με ψεκασμό με αντιδραστήριο Dragendorff του). Το εκχύλισμα συμπυκνώθηκε τελικά για να δώσει ακατέργαστο εκχύλισμα διχλωρομεθανίου (5,0 g). Το ακατέργαστο εκχύλισμα υποβλήθηκε σε CC υπεράνω silica gel 60 χρησιμοποιώντας CH

2Cl

2 και MeOH διαλύτη (100:0, 99:1, 98:2, 97:3, 96:4, 95:5, 94 :6, 90:10, 83:17, 75:25 και) και τελικά με 100% MeOH χρησιμοποιήθηκε ως μέσο έκλουσης. Με τη σύγκριση TLC πρότυπα των κλασμάτων αυτών, δεκαπέντε κλάσματα λαμβάνεται τελικά.

Καθαρισμός της Ενωσης

Περαιτέρω καθαρισμός του κλάσματος 5 από ΡΤΙΧ έδωσε αλκαλοειδές 1 (10.6 mg, MeOH-CH

2Cl

2? 98:2: κορεσμένο με NH

4OH). Αμφότερες οι γνωστές ενώσεις του 3 (5.5 mg, MeOH-CH

2Cl

2? 98:2: κορεσμένο με NH

4OH) και 5 (6,2 mg, MeOH-CH

2Cl

2 ? 98:2: κορεσμένο με NH

4OH) ελήφθησαν μετά από καθαρισμό με PTLC από κλάσμα επτά ενώ οι ενώσεις 2 (7,5 mg, MeOH-CH

2Cl

2? 95:5: κορεσμένο με NH

4OH) και 4 (12,5 mg, MeOH-CH

2Cl

2? 98:2: κορεσμένο με NH

4OH) ελήφθησαν από κλάσμα δώδεκα και έξι αντίστοιχα

Alkaloid. 1

κιτρινωπό άμορφο στερεό? UV (MeOH) λ

max (log ε): 393, 377, 210 nm? IR (ΟΗΟ

3) ν

max: 3430, 1640 εκατοστά

-1? για

1 Η- και

13C-NMR φασματοσκοπικά δεδομένα, βλέπε πίνακα 1? LCMS -IT-TOF σε

m /z

330.1018 [Μ + Η]

+ για C

20Η

15N

3Ο

2 (Υπολ. Για C

20Η

15N

3Ο

2:330.1237).

Η

Cell Culture

ανθρώπινο προστάτη φυσιολογική κυτταρική σειρά (καρκινικό κύτταρο RWPE-1) και του ανθρώπινου προστάτη γραμμές? LNCaP και PC-3, αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Virginia, USA). LNCaP και PC-3 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο Roswell Park Memorial Institute (RPMI) συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS, Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ), 1% πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη. κύτταρα RWPE-1 διατηρήθηκαν σε κερατινοκυττάρων ορού Ελεύθερη Medium (Κ-SFM, ATCC) συμπληρωμένο με εκχύλισμα βόειας υπόφυσης (ΒΡΕ) και ανθρώπινο ανασυνδυασμένο επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF). Μέντιουμ συμπληρώθηκαν με 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (Sigma.), 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 mg /ml στρεπτομυκίνη (Flowlab, Sydney, Αυστραλία). Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στον αέρα στους 37 ° C επωαστήρα.

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Προσδιορισμός

Η αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα αξιολογήθηκε εκτελώντας προσδιορισμούς ΜΤΤ όπως περιγράφηκε προηγουμένως με ελάσσονες τροποποιήσεις [24]. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν 24 ώρες πριν από την επεξεργασία σε πλάκα 96 φρεατίων σε 5 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο προκειμένου να ληφθεί το 70% έως 80% συρρέουσες καλλιέργειες. Οι ενώσεις διαλύθηκαν σε DMSO (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) που ακολουθείται από μια σειριακή αραίωση 2 × 10 βαθμούς κυμαίνονταν από 0,825 μΜ έως 100 μΜ. Η πλάκα 96 φρεατίων επωάστηκε για 24 ώρες στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2. Στο τέλος της επώασης, 50 μΙ διαλύματος ΜΤΤ (2 mg /ml? Sigma) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Η πλάκα στη συνέχεια επωάστηκε για 4 ώρες. Όλα μέσο απομακρύνθηκε και το πορφυρό φορμαζάνη κρύσταλλος που σχηματίζεται στον πυθμένα των φρεατίων διαλύθηκαν με 200 μΙ DMSO για 20 λεπτά. Η απορρόφηση στα 570 nm διαβάστηκε σε αναγνώστη φασματοφωτομετρικής πλάκας (Hidex). Η αναλογία των κυττάρων που επιβιώνουν υπολογίστηκε ως:.

καμπύλες δόσης-απόκρισης κατασκευάστηκαν για να ληφθεί η IC

50 αξίες. Τα πειραματικά δεδομένα που προέρχονται από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Ο δείκτης επιλεκτικότητας ελήφθη με μέση τιμή IC

50 RWPE-1 /σημαίνει IC

50 LNCaP ή PC-3.

Cellomics Δοκιμασία Multiparameter

Η κυτταροτοξικότητα 3 σετ (Thermo Scientific ) χρησιμοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Εν συντομία, 24 ώρες μετά την subditine (1) κατεργασία, βαφή ΜΜΡ και της βαφής διαπερατότητας των κυττάρων προστέθηκαν σε ζωντανά κύτταρα και επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν, κατέστησαν διαπερατά, δεσμεύτηκαν με 1χ ρυθμιστικό διάλυμα μπλοκαρίσματος πριν ανίχνευση με πρωτογενή κυτοχρώματος c και δευτερεύοντα DyLight 649 αντισώματα IgG αντι-ποντικού κατσίκας συζευγμένο για 1 ώρα η κάθε μία. Hoechst 33342 προστέθηκε στο διάλυμα χρώσης. Οι πλάκες στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ArrayScan διαλογή υψηλής περιεκτικότητας (HCS) (Cellomics, ΡΑ, USA). Δεδομένα συνελήφθησαν, εξάγονται και αναλύονται με ArrayScan ΙΙ Δεδομένων και Data Viewer έκδοση 3.0.

ROS Δοκιμασία

Η παραγωγή των ενδοκυττάριων ROS ανιχνεύθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Το αντιδραστήριο βαφής DHE μετατρέπεται σε φθορίζουσα αιθίδιο και παρεμβάλλεται στην DNA σε ενδοκυτταρική απόκριση ROS. Εν συντομία, 10 mM DHE διάλυμα (σε μεθανόλη) απόθεμα αραιώθηκε 500 φορές σε HBSS χωρίς ορό ή άλλα πρόσθετα για να αποδώσει ένα διάλυμα εργασίας 20 μΜ. Μετά από έκθεση σε subditine (1), τα κύτταρα στο 96 φρεατίων μαύρη πλάκα πλύθηκε δύο φορές με HBSS και μετά επωάστηκαν σε 100 μι διάλυμα της διυδροεργοταμίνης που εργάζονται στους 37 ° C για 30 λεπτά. Φθορισμού DCF σε κάθε κύτταρο συνελήφθη, εξάγεται και αναλύονται με ArrayScan ΙΙ Δεδομένων και Data Viewer έκδοση 3.0 (Cellomics).

Gene Expression Profiling

κύτταρα LNCaP και PC-3 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με subditine (1) (12.5 μΜ) για 18 ώρες. RNA εκχυλίστηκε από PC-3 ή LNCaP κύτταρα χρησιμοποιώντας RNeasy μίνι κιτ συν (Qiagen). 1 μg του RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας το πρώτο σετ σκέλος RT2 (Α.Ε. Biosciences, Qiagen) .cDNA αναμίχθηκε με RT2 Real Time ™ SYBR Green /φλουορεσκεΐνη ΡΟΚ master-mix και φορτώνονται σε κάθε 96 πηγαδάκια του στρες Ανθρωπίνων οξειδωτικό και Αντιοξειδωτικές συστοιχία Defense qPCR σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (SA Biosciences, Qiagen). Εν συντομία, ένα συνολικό όγκο 25 μΙ μίγματος PCR, η οποία περιελάμβανε 12,5 μΙ κύριου μίγματος, 11,5 μΐ διπλά αποσταγμένου νερού και 1 μΙ cDNA φορτώθηκε σε κάθε μία από τις 96wells. qPCR έγιναν χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου της μηχανής (Applied Biosystems) StepOne PLUS. PCR ενίσχυση διεξήχθη στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 sec και 60 ° C για 1 λεπτό. Η έκφραση του mRNA για κάθε γονίδιο ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέση έκφραση των γονιδίων πέντε housekeeping:

β-ακτίνης (ACTB), β-2-μικροσφαιρίνη (β2Μ), φωσφοριβοσυλτρανσφεράση της υποξανθίνης-1 (HPRT1), ριβοσωμική πρωτεΐνη L13a ( RPL13A) και αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH). Η μέθοδος ΔΔCt χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων. Φορές αλλαγές υπολογίστηκαν για κάθε γονίδιο ως η διαφορά στην έκφραση γονιδίων μεταξύ subditine (1) ή μη επεξεργασμένο έλεγχο χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης δεδομένων qPCR συστοιχίας RT Profiler.

Σε πραγματικό χρόνο Ανάλυση qPCR

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα PC-3 ή LNCaP χρησιμοποιώντας το RNeasy μίνι κιτ συν (Qiagen). RNA (1 μ§) μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας κιτ σύνθεσης cDNA iScript (Biorad). QPCR διεξήχθη επί του πραγματικού χρόνου PCR μηχάνημα StepOne PLUS (Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Εκκινητές εμπορικά συντέθηκαν από το Ολοκληρωμένο DNA Technologies (IDT). τιμές mRNA στόχο ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας β-ακτίνης mRNA και δεδομένα εκφράστηκαν σε σχέση με κανονικοποιημένες τιμές των αντίστοιχων ελέγχων. Τα δείγματα αναλύθηκαν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα εις τριπλούν. Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν παρατίθενται πιο κάτω,

GR Προώθηση αστάρι, AACATCCCAACTGTGGTCTTCAGC

GR Αντίστροφη αστάρι, TTGGTAACTGCGTGATACATCGGG

β-ακτίνης Forward αστάρι, GATGACCCAGATCATGTTTGAGACC

β-ακτίνης αντίστροφο εκκινητή, AGTCCATCACGATGCCAGTGGT

βιο-φωσφορισμού Δοκιμασίες της κασπάσης-3/7 -8 και -9

Μια χρονο-εξαρτώμενη μελέτη της κασπάσης-3/7 -8, -9 και δραστηριότητες ήταν πραγματοποιείται εις τριπλούν χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας κασπάσης-Glo 3/7, 8 και 9 (Promega Corp., Madison, WI, USA) σε λευκό 96 φρεατίων μικροπλάκα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Ένα σύνολο 10,000 κυττάρων ανά φρεάτιο σπάρθηκε και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 12,25 μΜ subditine (1) για 6, 12, 18, 24, και 30 ώρες. Στη συνέχεια, 100 μι του αντιδραστηρίου κασπάσης-Glo προστέθηκαν, επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά και μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Tecan άπειρο 200 Pro (Tecan, Μάνερντορφ, την Ελβετία) αναγνώστη μικροπλακός.

Western Blotting

για να προσδιοριστεί η έκφραση της πρωτεΐνης, 1

×

10

6 κύτταρα /mL ήταν seeded και αντιμετωπίζονται με subditine (1) ή πακλιταξέλη για 24 ώρες. εκχυλίσματα ολόκληρου κυττάρου παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Εν συντομία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, λύθηκαν και διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα 10% SDS-πολυακρυλαμιδίου. Μετά την ηλεκτροφόρηση, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Millipore), αποκλείστηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε PBS-T (0,05% Tween 20) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με πρωτογενές αντι-Bcl-2, Bcl-xL ή ρ53 αντισώματα ακολουθούμενη από horseradish υπεροξειδάση (HRP) δευτερογενές αντίσωμα αντι-κουνελιού (Cell Signaling Technology Inc, CA, USA). Μεμβράνες απογυμνώθηκαν και ξαναϊχνηθετούνται με το ποντίκι αντι

β

ακτίνης αντισώματος ως έλεγχος φόρτωσης (Santa Cruz Biotechnology Inc.). σύμπλοκα πρωτεΐνης-αντισώματος ανιχνεύθηκαν με Amersham ECL προνομιακή Western αντιδραστηρίου κηλίδωσης ανίχνευσης (GE Healthcare, ΗΠΑ).

Στατιστική Ανάλυση

Όλες οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± Τ.Α. Στατιστικές αναλύσεις εκτιμήθηκαν με t-test του Student. Οι τιμές πιθανότητας * ρ * p * p & lt? 0,05)

Η

Σύνδεσης μεταξύ του προστάτη κίνδυνο καρκίνου και οξειδωτικό στρες έχει καλά αναγνωρισμένα.. Υπάρχουν σημαντικές ενδείξεις που υποδηλώνει το οξειδωτικό στρες συμβάλλει στην αιτιολογία και παθογένεση του καρκίνου του προστάτη. Δεδομένου ότι τα μιτοχόνδρια είναι μια σημαντική πηγή των ROS, αλλαγμένη μιτοχονδριακή βιοενεργητική ίσως αποτελούν τη βάση της ανάπτυξης του καρκίνου του προστάτη. Επιπλέον, τα υψηλά επίπεδα των ROS έχουν ανιχνευθεί σε πολλές ανθρώπινες κυτταρικές σειρές όπως επίσης και σε διαφορετικούς ανθρώπινους ιστούς. Μερικοί υποστηρίζουν ενδείξεις υποδηλώνουν ότι η αυξημένη παραγωγή ROS μπορεί να είναι αποτέλεσμα της ογκογόνου μετασχηματισμού. Εγγενής οξειδωτικό στρες μπορεί να επηρεάσει διάφορες λειτουργίες σε καρκινικά κύτταρα ή ιστό όγκου, όπως τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την προώθηση των μεταλλάξεων και γενετική αστάθεια, μεταβολές στην κυτταρική ευαισθησία σε αντικαρκινικούς παράγοντες, εισβολή και μετάσταση. Στόχευση παραγωγή ROS και όχι ROS εξουδετέρωσης μπορεί να προσφέρει ένα νέο μηχανισμό για την καταπολέμηση του καρκίνου του προστάτη και ίσως και άλλες κακοήθειες.

Subditine (1) έκφραση του γονιδίου της αναγωγάσης που προκαλείται γλουταθειόνης.

Όπως δείξαμε ότι subditine (1 ) έχει δείξει ότι θα μπορούσε να επάγει ROS στα κύτταρα, αποφασίσαμε να χρησιμοποιήσουμε την ανθρώπινη οξειδωτικό στρες και αντιοξειδωτική άμυνα σε πραγματικό χρόνο Profiler qPCR διάταξης για την ποσοτικοποίηση αλλαγών γονιδιακή έκφραση σε PC-3 ή των κυττάρων LNCaP σε επεξεργασία με subditine (1). Αυτό qPCR-συστοιχίας περιέχει 84 γονίδια που εμπλέκονται στην κυτταρική απόκριση στρες και τον έλεγχο οξειδοαναγωγής και περιλαμβάνει όλα τα έξι μέλη της αντιοξειδωτικής peroxiredoxin οικογένειας (PRDX).

Το οξειδωτικό στρες και αντιοξειδωτικά που σχετίζονται με τα γονίδια εκφράζονται διαφορικά σε PC-3 ή LNCaP κύτταρα σε απόκριση προς subditine (1). Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε ότι αναγωγάσης γλουταθειόνης (GR) ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα (

P

& lt? 0,05) σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη σε σχέση με κύτταρα μάρτυρες (Σχήμα 6Α).. Η φορές η αλλαγή είναι πιο δραστική σε LNCaP (& gt? 100 φορές) σε σύγκριση με το PC-3 (& gt? 20 φορές) κύτταρα. Μεταγενέστερες ανεξάρτητη ανάλυση qPCR έδειξε επίσης ότι αυτό το γονίδιο είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε subditine (1) κύτταρα κατεργασμένα, σε συνέπεια με qPCR αποτελέσματα array μας (Εικ. 6Β).

LNCaP και PC-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με subditine (1) (12.5 μΜ) για 18 ώρες. (Α) Ανθρώπινη οξειδωτικό στρες και αντιοξειδωτική άμυνα qPCR συστοιχία χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση γονιδίων σημαντικά πάνω ή προς τα κάτω ρυθμισμένα σε subditine (1) κατεργασμένους LNCaP ή PC-3 κύτταρα. Gene αναλύσεις προφίλ διεξήχθησαν τρεις φορές ανεξάρτητα πειράματα. (Βέλος δεικνύει τοποθεσία του GR στα διαγράμματα διασποράς) (Β) Μεταγραφική μεταβολές του GR αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR. Τα επίπεδα του mRNA GR ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας γονίδιο housekeeping β-ακτίνης και εκφράζονται ως φορές μεταβολής σε σύγκριση με μη κατεργασμένο έλεγχο.

Η

GR είναι ένα σημαντικό ένζυμο που εμπλέκεται στην παγίδευσης του δραστικού ειδών οξυγόνου. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η αυξημένη παραγωγή ROS από subditine (1) θα μπορούσε να τονώσει GR

de novo

σύνθεσης. GR είναι γνωστό για τις αντι-οξειδωτικές του λειτουργία και χρησιμοποιείται συνήθως ως δείκτης για το οξειδωτικό στρες. Προς τα πάνω ρύθμιση GR θα μπορούσε να είναι ένας από τον μηχανισμό κυτταρικής αντι-οξειδωτικό άμυνα σε απόκριση προς την αύξηση της ROS. Ωστόσο, περιττή παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου θα μπορούσε να συντρίψει το αντιοξειδωτικό σύστημα, το οποίο πυροδοτεί μια σειρά γεγονότων που οδηγεί σε βλάβη των λιπιδίων-πρωτεΐνης, αποσύμπλεξη του οξειδωτική φωσφορυλίωση και τελικά οδηγεί σε απόπτωση.

Subditine (1) αυξημένη μεμβράνη διαπερατότητα, μειωμένη δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ) και αυξημένη απελευθέρωση του κυτοχρώματος c.

Για να πάρετε μια καλύτερη εικόνα για το μηχανισμό της subditine (1) επαγόμενη κυτταροτοξικότητα, οι αλλαγές στη διαπερατότητα της μεμβράνης, δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ) και κυτόχρωμα c εντοπισμό μετά subditine (1) θεραπείες μετρήθηκαν. Όπως ήταν αναμενόμενο, subditine (1) κατεργασμένους LNCaP και PC-3 κύτταρα κατέδειξαν υψηλότερη διαπερατότητα της μεμβράνης σε σύγκριση με τον έλεγχο, καθώς τα περισσότερα επεξεργασμένα κύτταρα υφίστανται απόπτωση λόγω κυτταροτοξική δραστικότητα της ένωσης (Σχήμα 7Α και 7Β). Επιπλέον, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι subditine (1) θεραπεία προκάλεσε απώλεια της ΜΜΡ, υποδηλώνοντας μια ευλογοφανή μηχανισμό κυτταρικού θανάτου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α, ΜΜΡ βαφή βάφονται έντονα στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων ελέγχου σε σύγκριση με subditine (1) κύτταρα κατεργασμένα. LNCaP και PC-3 κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με subditine (1) για 24 ώρες έδειξε εξαρτώμενη από τη δόση μείωση της ΜΜΡ ένταση φθορισμού (Σχήμα 7Β), η οποία αντανακλούσε την κατάρρευση της ΜΜΡ. Από την άλλη πλευρά, subditine (1) κατεργάζεται-LNCaP και PC-3 έδειξαν αυξημένη φθορίζουσα χρώση στο κυτταρόπλασμα σε σύγκριση με τον έλεγχο, δείχνοντας την απελευθέρωση κυτοχρώματος c (Σχήμα 7Α και 7Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι subditine (1) προκάλεσε την απώλεια των ΜΜΡ και την επακόλουθη μετατόπιση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια στο κυτταρόπλασμα σε LNCaP και PC-3 κύτταρα.

κύτταρα LNCaP και PC-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με subditine (1 ) για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με χρωστική ουσία διαπερατότητα της μεμβράνης, ΜΜΡ, κυτόχρωμα c και Hoechst όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. (Α) χρωματισμένα κύτταρα έγιναν ορατά χρησιμοποιώντας HSC arrayscan σύστημα για να ελέγξει την πυρηνική μορφολογία, διαπερατότητα της μεμβράνης, ΜΜΡ ακεραιότητα, κυτόχρωμα απελευθέρωση γ? Μπλε (πυρηνικά), Green (Membrane διαπερατότητα), Κόκκινο (ΜΜΡ), Κυανό (κυτόχρωμα απελευθέρωση γ). (Β) Μπαρ γράφημα που δείχνει τις μέσες εντάσεις φθορισμού της διαπερατότητας της μεμβράνης, ΜΜΡ και κυτόχρωμα c (μέση τιμή ± SD? * Ρ & lt? 0,05)

Η

Subditine (1) ενεργοποιημένη κασπάση 9 και 3/7..

Η απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια ενεργοποιεί μεταγενέστερα μόρια κασπάσης και να οδηγήσει σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Για να εξεταστεί αυτό, οι βιοφωταυγείς εντάσεις της κασπάσης-3/7 -8, -9 δραστηριότητες του subditine (1) κατεργασμένους LNCaP και PC-3 κύτταρα σε 6, 12, 18, 24, ή 30 ωρών μετρήθηκαν χρονικά σημεία . Όπως φαίνεται στο Σχήμα 8, σημαντική αύξηση της κασπάσης-3/7 -9 δραστηριότητες ανιχνεύθηκαν σε αμφότερα LNCaP και PC-3 κύτταρα μετά από 12 και 24 ώρες subditine (1) έκθεση. Η υψηλότερη δραστηριότητα για κασπάσης-9 σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές παρατηρήθηκε μετά από 24 ώρες θεραπείας με subditine (1). Από την άλλη πλευρά, κασπάσης-3/7 Δράση έφθασε σε μία κορυφή μετά από 18 ώρες επεξεργασίας και μειώνεται σταδιακά σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία (24 και 30 ώρες). Ούτε LNCaP ούτε PC-3 κύτταρα παρουσίασαν καμία επαγωγή της κασπάσης-8 δραστηριότητα κατά τη διάρκεια 30 ωρών subditine (1) θεραπεία.