Αφηρημένο

Το hotspot ΑΚΤ1

E17K μετάλλαξη στον τομέα πλεκστρίνης ομολογία ΑΚΤ1 συμβαίνει σε περίπου 0,6 έως 2% των ανθρώπινων καρκίνων του πνεύμονα. Πρόσφατα, έχουμε καταδείξει ότι ΑΚΤ1

E17K μετατρέπει αθανατοποιημένα ανθρώπινα βρογχικά κύτταρα. Εδώ με τη χρήση ενός διαγονιδιακών Cre επαγόμενο στέλεχος ποντικού στην άγριου τύπου Rosa 26 (R26) θέση (

R26-ΑΚΤ1

E17K

ποντίκια) που αποδεικνύουν ότι ΑΚΤ1

E17K είναι ένα

καλόπιστων

ογκογονίδιο και παίζει ένα ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα

in vivo

. Στην πραγματικότητα, αναφέρουμε ότι μεταλλαγμένα ΑΚΤ1

E17K προκαλεί βρογχική ή /και βρογχιολιδικού υπερπλαστικών βλαβών στο επιθήλιο ποντικού πνεύμονα, το οποίο η πρόοδος για την ειλικρινή καρκίνωμα σε πολύ χαμηλή συχνότητα, και επιταχύνει το σχηματισμό όγκων που προκαλείται από χημικά καρκινογόνα. Εν κατακλείδι, ΑΚΤ1

E17K προκαλεί υπερπλασία του πνεύμονα ποντικού επιθηλίου

in vivo

και συνεργάζεται με ουρεθάνη για να προκαλέσει την πλήρη κακοήθη φαινότυπο

Παράθεση:. Malanga D, Belmonte S, Colelli F, Scarfo Μ, De Marco C, Ολιβέιρα DM, et al. (2016) ΑΚΤ1

E17K Είναι Ογκογόνες στο ποντίκι του πνεύμονα και συνεργάζεται με καρκινογόνα χημικά στην πρόκληση καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 11 (2): e0147334. doi: 10.1371 /journal.pone.0147334

Επιμέλεια: Francisco X. Real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), Ισπανία

Ελήφθη: 30 Μαρ 2015? Δεκτές: 1 Ιανουαρίου 2016? Δημοσιεύθηκε: 9 Φεβρουαρίου 2016

Copyright: © 2016 Malanga et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:.. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από την Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC 2012-14, IG_12969) και Ministero Istruzione Università e Ricerca (MIUR ΠΡΙΝ, prot 2010W4J4RM_001 ? PONa3_00239? PON01_02782) με GV. HF υποστηρίχθηκε από Västra Götalandsregionen κάτω από το /συμφωνίας ALF LUA και από τις Assar Gabrielssons και Magnus Bergvalls Ιδρύματα

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο σχετίζονται, που συνδέονται με μια παγκόσμια ποσοστό επιβίωσης 5 ετών μικρότερη του 15% [1,2]. Μεταλλακτικές ενεργοποίηση του υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) οδός είναι ο κύριος παθογόνος εκδήλωση στον καπνό προκαλούμενη αδενοκαρκινώματος μη (ADC), ενώ η οδός οδηγείται από v-Ki-Ras2 /Kirsten σάρκωμα αρουραίου ιικού ογκογονιδίου ομόλογο (KRAS) εμπλέκεται σε καπνού με τη μεσολάβηση του πνεύμονα καρκινογένεση [3-6]. Δυστυχώς, η ενεργοποίηση μεταλλάξεων σε EGFR δεν είναι τυπικά παρόν σε καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων του πνεύμονα (SCC), ο δεύτερος πιο κοινός τύπος NSCLC [7], και έτσι στοχευμένη θεραπεία είναι αναποτελεσματική. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ποσοστό 2-4% των P110 α-καταλυτική υπομονάδα της ΡΙ3Κ (PIK3CA) μεταλλάξεις [8-10] και το ποσοστό 1% των μεταλλάξεων ΑΚΤ1 [11,12] στην SCC έχουν προτείνει ότι η στόχευση αυτών των γονιδίων μπορεί να αποδειχθεί μια επιτυχημένη θεραπευτική επιλογή [7,13-15].

Οι κινάσες ΑΚΤ (ΑΚΤ1, ΑΚΤ2, ΑΚΤ3) αντιπροσωπεύουν την κύρια κατάντη τελικό σημείο της φωσφατιδυλοϊνοσιτολικής 3-κινάση (PI3K) μονοπατιού, που ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, του μεταβολισμού και εισβολή. ΑΚΤ1 και ΑΚΤ2 συχνά ενεργοποιούνται σε ανθρώπινο καρκίνο [16-18] μετά την απώλεια του λιπιδίου φωσφατάση ΡΤΕΝ, ενεργοποιώντας μεταλλάξεις ή /και αντιγραφή μεταβολή αριθμού σε EGFR ή του HER2 τυροσίνης υποδοχέων κινάσης, ενεργοποιώντας μεταλλάξεις στο γονίδιο KRAS, σε PIK3CA [19,20]

, [21] ή στην ίδια ΑΚΤ1 [22]. Στον καρκίνο του πνεύμονα μία σωματική μετάλλαξη στο πεδίο πλεκστρίνης ομολογίας (PH) του ΑΚΤ1 που καταλήγει σε γλουταμινικό οξύ σε υποκατάσταση λυσίνη στο υπόλειμμα 17 (E17K) αναφέρθηκε με συνολική συχνότητα 0.6-2% [7,11,12,23-25 ].

ΑΚΤ1

E17K εμφανίζει αυξημένη συγγένεια για PI (4,5) P2, αυξημένη πρόσληψη πλασματική μεμβράνη και συστατική ενεργοποίηση [22,26]. Η ενδογενής ΑΚΤ1

E17K μεταλλαγμένης πρωτεΐνης ανιχνεύθηκε στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα δείχνει ενισχυμένη εντόπιση μεμβράνης [11], που έχει σαν αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του κατάντη σηματοδότησης [11,22].

Ο ρόλος του μεταλλαγμένου ΑΚΤ1

E17K στα επιθηλιακά ογκογένεση παραμένει ασαφής, διότι μελέτες σε κυτταρικές μοντέλα στα κύτταρα του μαστού και του πνεύμονα έχουν παραχθεί αντικρουόμενα αποτελέσματα [27-30]. Επιπλέον, δεν υπάρχει στέλεχος ποντικού ότι τα μοντέλα του ΑΚΤ1

E17K μετάλλαξη έχει δημιουργηθεί μέχρι σήμερα.

Οι σκέψεις μας ώθησε να εξεταστεί ο ρόλος των ΑΚΤ1

E17K στο μετασχηματισμό των επιθηλιακών κυττάρων του πνεύμονα

in vivo

. Στο παρόν, έχουμε αποδείξει ότι ΑΚΤ1

E17K προωθεί την υπερπλασία του πνεύμονα ποντικού και συνεργάζεται με άλλες γενετικές βλάβες για να προκαλέσει την πλήρη κακοήθεια.

Υλικά και Μέθοδοι

Vector Σχεδιασμός και δημιουργία διαγονιδιακών ποντικών

Για να δημιουργήσετε

R26-ΑΚΤ1

E17K

διαγονιδιακά ποντίκια ανθρώπινου ΑΚΤ1 cDNA ενισχύθηκε με PCR από ανθρώπινα μονοπύρηνα κύτταρα του αίματος με PCR χρησιμοποιώντας τους εκκινητές 5′-ATGAGCGACGTGGCTATT- 3 ‘και 5′-TCAGGCCGTGCCGCTGGC-3’. Το προϊόν PCR κλωνοποιήθηκε σε πλασμίδιο μεταφοράς (pBlueScript) χρησιμοποιώντας τυποποιημένες τεχνικές κλωνοποίησης. Μεταλλαγμένα ΑΚΤ1

E17K cDNA παρήχθη με Quick Change τοπο-Direct μεταλλαξογένεση (Stratagene) και υπο-κλωνοποιήθηκε στον φορέα pROSA26 [31-33] για τη λήψη του κατασκευάσματος Pr26-ΑΚΤ1

E17K στόχευσης, το οποίο αποτελούνταν από 5 ‘ και 3 ‘βραχίονες ομολογίας του τόπου Rosa 26, FRT /FRT-πλαισιώνεται ανθεκτικότητα σε νεομυκίνη (Neo) κασέτα και /ΙοχΡ-πλαισιώνεται τριπλό πολυαδενυλίωσης αλληλουχία ΙοχΡ (tPA). Βλέπε σχήμα 1 για λεπτομέρειες.

Α. Σχηματική αναπαράσταση του κατασκευάσματος στόχευσης που χρησιμοποιείται για την υπό όρους knock-in στο

R26

τόπο. Το ανθρώπινο

ΑΚΤ1

E17K

cDNA προηγείται μία ΙοχΡ-πλαισιώνεται μεταγραφική κασέτα διακοπής, ανασυνδυάστηκε εντός του τόπου R26. Cre μεσολάβηση αφαίρεση της κασέτας στοπ συνδέει Rosa 26 εξώνιο 1 του εξωγενούς cDNA που επιτρέπουν την έκφραση του διαγονιδίου. B. Southern blot του EcoRV πέψη γονιδιωματικού DNA που προέρχεται από MESCS επιμολυσμένα με το μόρφωμα στοχεύσεως μεταφέρουν μεταλλαγμένο ΑΚΤ1. Διαδρομή 1: DNA από μη στοχευμένες MESCS, λωρίδα 2 και 3: DNA από DNA από δύο διαφορετικές

R26-ΑΚΤ1

E17K

MESCS στελέχη. Η ενδογενής αλληλόμορφο αντιστοιχεί στη ζώνη 11.5 kb (

WT

)? μεταλλαγμένο αλληλόμορφο αντιστοιχεί στη ζώνη 4,3 kb (

REC

). Γ έκφραση Σχετική mRNA της ανθρώπινης ΑΚΤ1

E17K από την Q-RT-PCR σε στοχευμένα MESCS και στα αντίστοιχα κύτταρα επιμολυσμένα με το Flp (pFlpE-IRES-Puro) ή Cre ανασυνδυάση (Pcre-IRES-Puro). Τα δεδομένα είναι από πανομοιότυπα πειράματα ως η μέση τιμή ± SD. *** P & lt? 0.001. Δ Γονότυπος ανάλυση με PCR στην ουρά-tip DNA γενετικά τροποποιημένα ποντίκια, όπως υποδεικνύεται.

Η

30μg του R26-ΑΚΤ1

πλασμίδιο E17K κατέστη γραμμικό με ένζυμο περιορισμού SfiI (New England, Biolabs) και ηλεκτροδιάτρηση σε βλαστικά κύτταρα ποντικού εμβρυϊκά (MESC). G418-ανθεκτικών MESC κλώνοι απομονώθηκαν και υποβλήθηκαν σε διαλογή για το σωστό στόχευση του τόπου με PCR (εκκινητές F1 και R1, αντίστοιχα: 5′-AGGGAACGCAGGGAGACTGAGGTGACCCTTCTTT-3 ‘, 5’-GATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGC-3) ενίσχυση θραύσματος 3,9 kb. PCR θετικά G418 ανθεκτικοί κλώνοι ακολούθως διαλέγονται με στύπωμα Southern σχολαστικά για διασταύρωση ανασυνδυασμό 5 ‘. Μόλις εντοπιστεί, στοχευμένη MESC κλώνοι επιμολύνθηκαν με Flp εκφράζουν πλασμίδιο (pFlpE-IRES-puro) για την εκτομή της κασέτας Neo. Στη συνέχεια, Neo-διαγράφεται κλώνοι MESC απομονώθηκαν, διαλογή με PCR (εκκινητές F2 και R2, αντίστοιχα: 5’-CGGCCTCGACTCTACGATACCGTCGATCC-3 ‘, 5′-R2 GGATCGAGATCTGATAACTTCGTA-3’) και εγχύθηκε σε Β6 βλαστοκύστες, τα οποία στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε ψευδο -pregnant θηλυκά για να παράγουν χιμαιρικά ζώα στο εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων διευκόλυνση της IRGS (Ariano Irpino, Avellino, Ιταλία). Τα παραγόμενα χίμαιρες αναπαρήχθησαν για να καθορίσει βλαστικής γραμμής μετάδοση του ανθρώπινου αλληλόμορφο. Γονότυποι

R26-ΑΚΤ1

E17K

ποντίκια προσδιορίστηκαν με PCR χρησιμοποιώντας γονιδιωματικό DNA που απομονώθηκε από τις άκρες της ουράς με τους ακόλουθους εκκινητές: 5’ARMF, 5′-AACTGCAGACTTGTGGGATAC-3 ‘ ? 3’ARMR, 5’-ATATTAGTCCACCTCACTCCT-3 ‘? mE17KR5 5’-GCCAACCCTCCTTCACAATA-3 ‘. Η

R26-ΑΚΤ1

E17K

γραμμή ζευγάρωσαν με

TTF1-Cre

γραμμή (ένα δώρο του Δρ Mario De Felice, IRGS, Ariano Irpino, Ιταλία ), για να δημιουργήσει

R26-ΑΚΤ1

E17K

? TTF1-Cre?

Ποντίκια. Η

TTF1

-Cre ποντίκια γονότυπος χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα εναύσματα: FP, 5′-CCTGATGGACATGTTCAGGGACA-3 ‘: RP, 5′-GCCAGATCTCCTGTGCAGCATGT-3’.

R26-ΑΚΤ1

E17K

ποντίκια πίσω σταυρωμένα στο φόντο Β6. Σε όλα τα πειράματα της ίδιας γέννας χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες.

Τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκε από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας «Comitato Etico per la Sperimentazione Animale» (CESA) της IRSG και να συμμορφώνονται με τους κανονισμούς και τις κατευθυντήριες γραμμές της Ιταλίας και της Ευρωπαϊκής Ένωσης. Όλα έγιναν προσπάθειες για την ελαχιστοποίηση της ταλαιπωρίας των ζώων (S1 ΦΘΑΣΕΙ Checklist). Οι ποντικοί στεγάστηκαν σε ένα εξαιρετικά ελεγχόμενο περιβάλλον μικροβιολογική να εγγυηθεί συνθήκες SPF. Αυτά διατηρήθηκαν σε κλωβούς IVC, υπό σταθερές συνθήκες θερμοκρασίας (22 ± 2 ° C), υγρασία (55% ± 10 UR) και σκοτεινό κύκλο 12/12 ωρών φωτός /. Τα ζώα είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε ακτινοβολημένα τυπική δίαιτα και νερό. Τα ποντίκια γονότυπος με PCR του DNA ουράς [34]. Η διαγραφή των ακολουθιών μεταγραφικού στοπ ΙοχΡ-πλαισιώνεται προσδιορίστηκε με PCR χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές:.

TRF, 5′-GGATCGACGGTATCGTAGAGTCGAGGCCG-3 ‘?

L2R 5′-GCCAATGAAGGTGCCATCATTCTTGAGGAGGAAG-3′

η έκφραση της ΑΚΤ1

E17K σε MESCS επιμολυσμένα με Pcre-IRES-puro προσδιορίστηκε με ποσοτική RT-PCR.

κατά Southern

Ένα πρότυπο πρωτόκολλο για κηλίδος Southern ήταν μεταχειρισμένος. Γονιδιωματικό DNA (30 μg) υπέστη πέψη με EcoRV. Ένας ανιχνευτής 500 bp στο 5 ‘πλευρά της θέσης εισαγωγής στοχοθετημένων (από CTTGAAAGTGGAGTAACTAC προς TCAGAAGCTTTGAACTAGAA στον τόπο Rosa 26) σημάνθηκε με DIG-dUTP, χρησιμοποιώντας PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Ελβετία). Αυτός ο ανιχνευτής ταυτοποιεί ένα θραύσμα 11.5 kb σε αυτοφυή τόπο Rosa 26 και ένα θραύσμα 4.3kb στο στοχευόμενο τόπο Rosa 26.

Western Blot και αντισώματα

Σύνολο πρωτεϊνικά εκχυλίσματα ιστού παρασκευάστηκαν με ΝΡ-40 ρυθμιστικό διάλυμα ( 10 mM Tris-HCl ρΗ 7,5, 150 mM NaCl, 1% ΝΡ-40) που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης (SigmaFast, Sigma-Aldrich). Η ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε με πρότυπες μεθόδους [11]. Αντι-φωσφο-ΑΚΤ (Ser473) (# 4058), αντι-ΑΚΤ1 (# 2938), αντι-φωσφο-FoxO1 (Ser256) (# 9461), αντι-FoxO1 (# 2880), αντι-φωσφο-GSK3-α /β (Ser21 /9) (# 9331), αντι-GSK3-α (# 9338), αντι-GSK3-β (# 9332) αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Danver, ΜΑ).

Ποσοτική αντίστροφη μεταγραφής πραγματικού χρόνου PCR (Q-RT-PCR)

Ολικό RNA παρασκευάστηκε όπως περιγράφεται [35]. RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε RNA που εκχυλίζεται από ΤπζοΙ (Invitrogen) και ρετρο-μεταγράφονται με SuperScript II (Invitrogen). Q-RT-PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη δύναμη SYBR Green ΡΟΚ Master Mix στο ΑΒΙ Prism 7900 θερμοκυκλωτή (Applied Biosystems, Foster City, CA). γονιδιακή έκφραση ομαλοποιήθηκε στο περιεχόμενο GAPDH mRNA. Οι σχετικές ποσότητες του mRNA ή DNA υπολογίσθηκαν με τη μέθοδο συγκριτικής κατώφλι κύκλου (CT) [36]. Οι παρακάτω εκκινητές που χρησιμοποιούνται στην Q-RT-PCR

AKT1R26 μπροστά 5′-CACACCACCTGACCAAGATG-3. «?

AKT1R26 αντίστροφη 5′-AATCAAGGGTCCCCAAACTC-3 ‘

Virus μόλυνση ποντικών

Έλεγχος

R26 ένα

ος

R26-ΑΚΤ1

E17K

ποντίκια μολύνθηκαν με 10

6 ή 10

7 pfu της αδενοϊοί που εκφράζουν Cre (Ad-CRE) (Vector Biolabs, Philadelphia, PA). Ποντίκια μεταξύ 6 και 12 εβδομάδων αναισθητοποιήθηκαν με ισοφλουράνη και Ad-Cre χορηγήθηκε ενδορινικά. Οι ποντικοί έλαβαν 120 μΙ Ad-Cre, σε δύο δόσεις των 60 μΙ το καθένα, με ένα διάλειμμα μεταξύ των δύο δόσεων, για να επιτρέψει τα ποντίκια για να ανακτήσει μια κανονική αναπνοή. Οι ποντικοί ελέγχου έλαβαν ίση ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικού άλατος (S1 ΦΘΑΣΕΙ Checklist).

Πειραματική Καρκινογένεση

R26 ή R26-ΑΚΤ1

E17K

νεογνά είτε μολύνθηκαν με Ad-Cre (10

6-10

7 PFU) ή κατεργασμένα μόνο με διαλύτη πριν από τη λήψη ενδο-περιτοναϊκή ένεση με μία μόνο δόση του 1 mg /g σωματικού βάρους ουρεθάνη, μία αιθυλεστέρας του καρβαμικού οξέος που χρησιμοποιείται εκτενώς σε μοντέλα ποντικών της καρκινογένεσης [37], διαλύεται σε στείρο αλατούχο διάλυμα 0,9%. Τα ποντίκια παρακολουθείται σε εβδομαδιαία βάση και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. Αριθ ποντίκι έπρεπε να ευθανασία πριν από τη συγκεκριμένη πειραματική τελικό σημείο (6, 9 και 18 μήνες, αντιστοίχως) για λόγους υγείας. Τα ποντίκια θανατώθηκαν μετά από 6, 9 και 18 μηνών με εξάρθρωση του αυχένα (S1 ΦΘΑΣΕΙ Checklist). Οι πνεύμονες αφαιρέθηκαν και διογκώθηκαν με 10% ουδέτερα ρυθμισμένη φορμαλίνη. Ιστοί πνεύμονα συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν με 10% φορμαλίνη και εμπεδώθηκαν σε παραφίνη με χρήση τυπικών διαδικασιών. Lung τομής πραγματοποιήθηκε για να συμπεριλάβει 1,5 mm του parenchyme πνεύμονα? μετωπική τμήματα συλλέχθηκαν σε 15 επίπεδα με 100 μm απόσταση) της οβελιαίο απόσταση για να καλύψει επαρκώς τις δύο περιφερειακών και κεντρικών περιοχών. Οι τομές τοποθετήθηκαν σε πλακίδια και χρωματίστηκαν με ηωσίνη διαφήμιση αιματοξυλίνη και αξιολογήθηκαν με οπτικό μικροσκόπιο από την κτηνιατρική και την ανθρώπινη παθολόγους παθολόγος (ΕΠ, HF και CM). Για κάθε όγκο ταυτίστηκε η πλάκα με μέγιστη διάμετρος βλάβη και καταγράφεται κάτω από το μικροσκόπιο.

Η ιστολογική ανάλυση και ανοσοϊστοχημεία

ιστοί πνεύμονα συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν με 10% φορμαλίνη και εμπεδώθηκαν σε παραφίνη με χρήση τυπικών διαδικασιών. Τμήματα (5 μm) τοποθετήθηκαν σε πλάκες και χρωματίζονται με αιματοξυλίνη και ηωσίνη να αξιολογηθούν με οπτικό μικροσκόπιο από την κτηνιατρική (ΕΠ και HF) ή ανθρώπου (CM) παθολόγους. Μια συνδυασμένη βαθμολογία των υπερπλαστικών αλλοιώσεων υπολογίστηκε με την προσθήκη ενός βαθμολογίας μετρώντας τον αριθμό των επιθηλιακών στρωμάτων (βαθμολογία Layer) σε ένα ποσοστό μέτρησης βαθμολογίας υπερπλασίας που υπάρχουν στο σύνολο του τμήματος (συνολική βαθμολογία υπερπλασία). Το σκορ στιβάδα ορίζονται ως εξής: βαθμός 1, παρουσία 1-2 στρώμα (στρώματα), το σκορ 2, παρουσία 2-3 στρώσεις, βαθμολογία 3, παρουσία & gt? 4 στρώματα. Η συνολική βαθμολογία υπερπλασία ορίστηκε ως εξής: θα σκοράρει 1, όταν υπερπλασία ήταν παρούσα σε 1-20% του συνόλου των τμημάτων που αναλύθηκαν (3 σειριακές τομές /ποντίκι)? σκοράρει 2, όταν υπερπλασία ήταν λάτρης σε 21-60% του συνόλου των τμημάτων που αναλύθηκαν (3 σειριακές τομές /ποντίκι)? βαθμολογία 3, όταν υπερπλασία βρέθηκε στο 61-100% του συνόλου των τμημάτων που αναλύθηκαν (3 σειριακές τομές /ποντίκι).

ανοσοχρώση με αντι-φωσφο-ΑΚΤ έγινε με πρότυπα πρωτόκολλα χρησιμοποιώντας το Vectastain καθολική Quick Kit και DAB υποστρώματος υπεροξειδάσης Kit (Vector Laboratories, Burlingame) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη με κατεργασία μικροκυμάτων σε αντιγόνο αποκάλυψη διάλυμα (VectorLaboratory, Burlingame, CA) για 10 λεπτά. Αντι-φωσφο-ΑΚΤ (Ser473) (1: 1000, # 4058) αγοράστηκε από την Cell Signaling Technology

Η ανοσοχρώση για Ki67 διεξήχθη με τυποποιημένα πρωτόκολλα χρησιμοποιώντας Bond ™ Polymer Σύνθετη Ανίχνευση (Leica Biosystem, Buffalo Grove. , IL) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κουνέλι αντι-Κί67 (1: 100, PA5-19462) αγοράστηκε από την Fisher Scientific (Thermo Fisher Sientific, Pittsburgh, ΡΑ). Η ανοσοχρώση για ρ21 εκτελέστηκε με πρότυπα πρωτόκολλα χρησιμοποιώντας EnVision ™ Detection Systems Dako, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πολυκλωνικός Ab-5? αντι-p21 /WAF1 αντιορό (1:50) αγοράστηκε από την Oncogene Research Products (Cambridge, ΜΑ). Ki67 και p21 θετικότητα προσδιορίστηκε μετρώντας θετικών πυρήνων σε 10 πεδία σε Χ400 μεγέθυνση

σύλληψης Laser μικροδιατομής (LCM)

μικροανατομίας έγινε με τη χρήση του λέιζερ Microdissector Leica LMD6 & amp.? LMD7 (Leica μικροσυστημάτων, Μιλάνο). 5-μm τομών ιστού όγκου επάνω σε γυάλινες πλάκες εισήχθησαν εντός του Laser Microdissector για ανατομή των όγκων του πνεύμονα. Επιλεγμένες περιοχές συνελήφθησαν με υπέρυθρη παλμούς λέιζερ πάνω CapSure Caps Macro LCM.

Άμεση

Kras

αλληλουχίας

δείγματα μικροτομή λύθηκαν με SB LysePrep Kit (Silicon Biosystem, Μπολόνια) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κλάσματα του διαλύματος λύσης (2,5 μΙ) χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα για την ενίσχυση του DNA με τους ακόλουθους εκκινητές: mKrasF-TCCTAC AGGAAACAAGTA και mKras R-TTATTTATGGCAAATACA. Το πρόγραμμα ενίσχυσης που χρησιμοποιήθηκε ήταν: 95 ° C /5 λεπτά? 35x (95 ° C /30 s, 52 ° C /30 s 72 ° C /30 s) για μετουσίωση, ανόπτηση, και την επέκταση? 72 ° C /7 λεπτά για να τερματίσει την επέκταση, που ακολουθείται από ψύξη στους 15 ° C. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα αγαρόζης 2% και καθαρίστηκαν με το κιτ καθαρισμού QIAquick PCR (Qiagen). Τα καθαρισμένα προϊόντα PCR αναλύθηκαν σε 3500 Genetic Analyzer (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Για όλες τις αναλύσεις, τα δεδομένα ήταν ευθυγραμμισμένες με την συναινετική αλληλουχία που λαμβάνεται από το BLAST της βάσης δεδομένων GenBank.

ανοσοφθορισμού χρώση

αποπαραφινωθείσες τομές ενυδατώνονται σε φθίνουσα διαλύματα κλίση αιθανόλης και ξεπλένονται σε διάλυμα έκπλυσης (TBST, 0,05 mol /L Tris ρυθμιστικό διάλυμα με Tween20). Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη με διάλυμα κιτρικού οξέος ρΗ 6 για 30 λεπτά στους 98 ° C ακολουθούμενη από πλύση σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS? ΡΗ 7,4). Οι τομές επωάστηκαν με αντισώματα έναντι SP-C (κατσίκας πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-SP-C, 1: 200 του διαλύματος,, Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, USA) ή CC-10 (κατσίκας πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-CC-10, 1 : 200 του διαλύματος,, Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, USA) για 60 λεπτά, ακολουθούμενη από επώαση με δευτερογενή Alexa Fluor 488-συζευγμένο IgG αντισωμάτων αντι-κατσίκας (1: 400 αραίωση? Santa Cruz Biotechnology) για 60 λεπτά. Τα κύτταρα αντίθετα με DAPI (2 μg /mL? Santa Cruz Biotechnology), τοποθετημένο χρησιμοποιώντας τοποθέτηση μέσο (DakoEnvision System, Inc, CA, USA) αντι-fade και παρατηρούνται σε μικροσκόπιο φθορισμού (Leica Microsystems)

. η στατιστική ανάλυση

τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες τιμές ± SD της

ν

ανεξάρτητες αναλύσεις ή αναπαράγει, όπως αναφέρεται στο κείμενο. Συνεχείς μεταβλητές αναλύθηκαν με t-test ή ANOVA Student, ενώ κατηγορικές μεταβλητές αναλύθηκαν με χ

2 ή ακριβές εξετάσεις του Fisher. Σημασία ήταν υπολογίζονται Log-rank (Mantel-Cox) δοκιμή (GraphPad Prizm 5 Λογισμικό, San Diego, CA).

Αποτελέσματα

Mutant ΑΚΤ1

E17K προωθεί την υπερπλασία των βρόγχων και βρογχιόλια

Εμείς παράγεται ένα διαγονιδιακό στέλεχος ποντικών (

R26-ΑΚΤ1

E17K

) που εκφράζει την υπό όρους ανθρώπινο μεταλλαγμένο ΑΚΤ1 στον πνεύμονα με τη χρήση ενός συστήματος νοκ-in (Cre υπό όρους

Rosa 26

,

R26

) που φιλοξενεί ακολουθίες της μεταγραφής στάση ΙοχΡ-πλαισιώνεται ανάντη των μεταλλαγμένων cDNA ΑΚΤ1 (Σχήμα 1Α). Ποντικού ΟΚΕ έγιναν στόχος και διαλογή με στύπωμα Southern για να αναγνωριστούν οι κλώνοι που έφεραν το ανασυνδυασμένο αλλήλιο (Σχήμα 1Β) και για Cre-επαγόμενη έκφραση του διαγονιδίου (Σχήμα 1 C). Cre-απόκρισης

R26-ΑΚΤ1

E17K

MESCS στη συνέχεια χρησιμοποιείται για τη δημιουργία χιμαιρικών ποντικών. Βλαστικής γραμμής μετάδοση του χτύπησε στο αλληλόμορφο επιβεβαιώθηκε με PCR (Σχήμα 1D)

Για να εκφράσει την μεταλλαγμένη ΑΚΤ1 στον πνεύμονα επιθήλιο χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικά συστήματα:. Ενδορρινική ενστάλαξη ενός αδενοϊό που φέρει την ανασυνδυάση Cre (Ad-CRE) ή το ζευγάρωμα των

R26-ΑΚΤ1

E17K

ποντίκια με

TTF1-Cre

ποντίκια [38,39]. Η χρήση του

TTF1-Cre

ποντικούς επέτρεψε την έκφραση του διαγονιδίου στο βρογχικό επιθήλιο [39]

[40], ενώ ενστάλαξη του Ad-Cre παρουσιάζει τα πλεονεκτήματα ότι επιτρέπει την σωματικών ενεργοποίηση του διαγονιδίου σε patched περιοχές και όχι την επιλογή εκ των προτέρων τον τύπο κυττάρου στο οποίο εκφράζεται το διαγονίδιο.

στην πρώτη σειρά πειραμάτων, περάσαμε το

R26-ΑΚΤ1

E17K

ποντίκια με

TTF1-Cre

. Σχήμα 2Α δείχνει τη διαγραφή της κασέτας ΙοχΡ στους ιστούς των πνευμόνων του

R26-ΑΚΤ

E17K

? TTF1-Cre

ποντίκια? Το σχήμα 2Β δείχνει πραγματικού χρόνου RT-PCR της έκφρασης του μεταλλαγμένου ΑΚΤ1 στον πνεύμονα και το Σχ 2C δείχνει τα αυξημένα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης ΑΚΤ και /ή υποστρώματα ΑΚΤ (GSK3α /β, FOXO1) σε πνεύμονες από

R26-ΑΚΤ

E17K

? TTF1-Cre

ποντίκια σε σύγκριση με το

R26-TTF1-Cre

αδερφών. Μετρήσαμε έκφραση ΑΚΤ1 με RT-PCR σε πέντε επιπλέον ιστούς (ουρά, μυ, νεφρό, σπλήνα, καρδιά και το ήπαρ) που προέρχονται από R26-AKTE17K? TTF1-Cre και R26-TTF1-Cre γέννας ποντικούς και τα αποτελέσματα φαίνονται στο S1 Σχ. Όπως φαίνεται, δεν έκφραση παρατηρείται σε ιστούς διαφορετικούς από τους πνεύμονες.

A. PCR ανάλυση του πνεύμονα DNA από

R26-ΑΚΤ1

E17K

? TTF1-Cre

και τον έλεγχο των αδερφών. ΔStop ΤΡΑ: σήμα στάσης τερματισμού πλαισιώνεται μεταγραφής LOX-P. B. Σχετική έκφραση του mRNA της ανθρώπινης ΑΚΤ1 από την Q-RT-PCR σε RNA των πνευμόνων από το

R26? TTF1-Cre

,

R26-ΑΚΤ1

E17K

? TTF1-Cre

. Τα δεδομένα παρουσιάζονται από επαναληπτική ανάλυση ως μέση ± SD. Γ Εκπρόσωπος ανοσοαποτύπωση ανάλυση των ρΑΚΤ, συνολικής ΑΚΤ1 και κατάντη πρωτεΐνες σηματοδότησης συνολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από ολόκληρα πνεύμονες

R26? TTF1-Cre

και

R26-ΑΚΤ1

E17K

? TTF1-Cre

ποντίκια, αντίστοιχα. D-E. Εκπρόσωπος H & amp? Ε χρώση των πνευμόνων από το

R26? TTF1-Cre

και

R26-ΑΚΤ1

E17K

? TTF1-Cre

, αντίστοιχα. Μεγέθυνση όπως υποδεικνύεται. F-G. Εκπρόσωπος χρώση ρΑΚΤ των πνευμόνων από το

R26?. Nkx2

1-Cre

και

R26-ΑΚΤ1

E17K

? Nkx2

.

1-Cre

, αντίστοιχα. Μεγέθυνση όπως υποδεικνύεται.

Η

Ποντίκια του 2 (n = 10), 6 (n = 8) και 12 (n = 11) μηνών θυσιάστηκαν ως καταληκτικά σημεία.

TTF1-Cre

ποντίκια δεν παρουσίασαν ενδείξεις της νόσου έως και 12 μηνών (n = 7). Αντίθετα, ιστο-παθολογική ανάλυση αποκάλυψε την παρουσία υπερπλαστικών βλαβών στον πνεύμονα στο σύνολο των 12 μηνών

R26-ΑΚΤ1

E17K

? TTF1-Cre

ποντικούς (Εικ 2Δ και 2Ε). Αυτά τα ποντίκια έδειξαν μέτρια υπερπλασία των βρογχικών και /ή τερματικό βρογχικό επιθήλιο με πολωμένο πυρήνες. Κυψελιδικό επιθήλιο ήταν φυσιολογικό αν και παρατηρήθηκε ατελεκτασία σε ορισμένα ποντίκια. Ανοσοχρώση με αντι-pS473 έδειξαν αυξημένα επίπεδα της ενεργοποίησης ΑΚΤ στα υπερπλασίας πνεύμονες

R26-ΑΚΤ1

E17K

? TTF1-Cre

ποντίκια σε σύγκριση με τον έλεγχο ή

TTF1-Cre

ποντίκια (Σχήμα 2F και 2G).

Εμείς ενεργοποιείται επίσης το μεταλλαγμένο ΑΚΤ1

E17K διαγονιδίου με ενδορινική χορήγηση Ad-Cre (10

6, 10

7 pfu) σε 6-12 εβδομάδες ηλικίας

R26-ΑΚΤ1

E17K

ποντίκια. Μετά από 6, 9 και 18 μήνες (η = 8, 8 και 7, αντίστοιχα) οι ποντικοί θυσιάστηκαν και οι πνεύμονες αναλύθηκαν. Δεν παρατηρήσαμε ανωμαλίες των πνευμόνων σε

R26-ΑΚΤ1

E17K

ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με διαλύτη μόνο (PBS) (n = 7) (Σχήμα 3Α). Αντίθετα, σχεδόν όλοι

R26-ΑΚΤ1

E17K

ποντίκια ανέπτυξαν μέτρια βρογχικού και /ή τερματικό σταθμό βρογχιολιδικού υπερπλασία σε 9 μήνες μετά τη χορήγηση Ad-Cre (Σχήμα 3Β και 3C).

AD. Εκπρόσωπος H & amp? Ε χρώση των πνευμόνων επιθηλίου του

R26-ΑΚΤ1

E17K

ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με διαλύτη μόνο (που δεν έχουν μολυνθεί) ή έχουν μολυνθεί με Ad-Cre (9 και 18 μηνών , αντίστοιχα). Μεγέθυνση όπως υποδεικνύεται.

Η

Για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό των βλαβών ανιχνεύεται σε διαγονιδιακά

R26-ΑΚΤ1

E17K

ποντίκια, αξιολογήσαμε υπερπλασία του πνεύμονα αναλύοντας τον αριθμό των επιθηλιακών στρωμάτων στο βρογχικό επιθήλιο και το ποσοστό της υπερπλασίας σε ολόκληρη την περιοχή των 3 διαδοχικών τομών που προέρχονται από εκπρόσωπο

R26-ΑΚΤ1

E17K

ποντίκια μετά από 6 (n = 3) και 9 (n = 3) μηνών από τη χορήγηση Ad-Cre (κωδικός ποντίκια # 7a- # 12α). Ως μάρτυρες κάναμε χρήση του ίδιου αριθμού των

R26-ΑΚΤ1

E17K

ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με διαλύτη μόνο (το ποντίκι κωδικό # 1α- # 6α), αντίστοιχα. Η ποσοτικοποίηση των επιθηλιακών στρωμάτων και των υπερπλαστικών περιοχών διεξήχθη όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Αντιπροσωπευτικές εικόνες των βαθμολογιών εκχωρηθεί για τον αριθμό των στρωμάτων που φαίνεται στο S2 Σχ.

Υπερπλαστικοί βλάβες ταξινομήθηκαν με βάση τον αριθμό των επιθηλιακών στρωμάτων και το ποσοστό της υπερπλασίας. Αξιολόγηση των επιθηλιακών στρωμάτων, θα σκοράρει 1: 1-2 στρώματα των επιθηλιακών κυττάρων, το σκορ 2: 2-3 στρώσεις των επιθηλιακών κυττάρων, βαθμολογία 3: & gt? 4 στρώματα των επιθηλιακών κυττάρων (η = 6 ποντίκια /ομάδα? 3 σειριακές τομές /ποντικό ). Αξιολόγηση της έκτασης της υπερπλασίας, σκοράρει 1: υπερπλασία σε 1-20% του συνόλου των τμημάτων που αναλύθηκαν? σκοράρει 2: υπερπλασία στο 21-60% του συνόλου των τμημάτων που αναλύθηκαν? βαθμολογία 3: υπερπλασία σε 61-100% του συνόλου των τμημάτων που αναλύθηκαν (η = 6 ποντίκια /ομάδα? 3 σειριακές τομές /ποντικό). Οι βλάβες ταξινομήθηκαν σύμφωνα με μια συνδυασμένη βαθμολογία προκύπτει από το άθροισμα της βαθμολογίας των στρωμάτων και η βαθμολογία του ποσοστού της υπερπλασίας παρατηρήθηκαν (p & lt? 0,05? T-Student).

Η

Ανάμεσα στα ποντίκια ελέγχου βαθμολογίας Layer ήταν 1 για 4 από τις 6 ποντίκια και 2 για 2 από τους 6 ποντικούς. Συνολική βαθμολογία υπερπλασία ήταν 1 για το 5/6 και 2 για 1/6 ποντίκια. Αντίθετα, από το

R26-ΑΚΤ1

E17K

βαθμολογίας ποντίκια στρώμα 1 για 1/6 ποντίκια και 2 για 5/6 ποντίκια και στη συνολική βαθμολογία υπερπλασία ήταν 1 για 2/6 , 2 για 2/6 και 3 για 2/6 ποντικούς. Τέλος, βρήκαμε ότι

R26-ΑΚΤ1

E17K

ποντίκια παρουσίασε μια συνδυασμένη βαθμολογία των υπερπλασία των 3.8 ± 0.4 που ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι στα ποντίκια ελέγχου (2.5 ± 0.3) ( n = 6 /ομάδα? p & lt?. 0.05)

Στη συνέχεια, ερευνήσαμε αν τα υπερπλασικά αλλοιώσεις που παρατηρήθηκαν ήταν πολλαπλασιασμού ή γήρανση που σχετίζονται με immonostaining της Ki67 και p21. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στον Πίνακα 2 και αντιπροσωπευτικές εικόνες χρώση για Κί67 και ρ21 σε πνεύμονες ποντικού φαίνονται στο S3 Σχ. Βρήκαμε ότι ο μέσος αριθμός των Κί67-θετικών πυρήνων σε διαγονιδιακά ποντίκια R26-AKTE17K (11,1 ± 1,2, η = 5) ήταν περισσότερο από 2-φορές αυξημένη σε σύγκριση με τα ποντίκια ελέγχου (4.6 ± 0.49, η = 3). Αντιστρόφως, δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά της χρώσης ρ21. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι υπερπλαστικών αλλοιώσεων που προκαλούνται από ΑΚΤ1

E17K στον πνεύμονα διαγονιδιακών ποντικών είναι αποτέλεσμα της αύξησης του πολλαπλασιασμού των κυττάρων.

Η

Αξίζει να σημειωθεί ότι μετά από 18 μήνες από τη θεραπεία, δύο από τις επτά

R26-ΑΚΤ1

+ /E17K

ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με Ad-Cre αναπτύξει ένα ενιαίο οζίδιο καθένα, που διαγνώστηκε ως βρογχο-κυψελιδικά αδενοκαρκίνωμα με θηλώδη μοτίβο που αποτελείται από καλώδια και φωλιές των επιθηλιακών κυττάρων που περιβάλλονται από αραιά ινοαγγειακού στρώμα (Εικ 3D). Η ανοσοχρώση ανάλυση κατέδειξε υψηλά επίπεδα ρΑΚΤ στο υπερπλαστικών και νεοπλαστικών αλλοιώσεων του

R26-ΑΚΤ1

E17K

ποντίκια μολυσμένα με Ad-Cre σε σύγκριση με τους πνεύμονες από μη μολυσμένα ποντίκια (Σχ 4Α -4C).

ρΑΚΤ ανοσοχρώση των ιστών του πνεύμονα από το

R26-ΑΚΤ1

E17K

ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με διαλύτη μόνο (Α) ή έχουν μολυνθεί με Ad-Cre μετά 9 και 18 μήνες από τη μόλυνση, αντίστοιχα (Β, C).

η

Εν κατακλείδι, φαίνεται ότι το μεταλλαγμένο ΑΚΤ1

E17K αλληλόμορφο προκαλεί μέτρια υπερπλασία των βρόγχων ή /και τερματικά βρογχιόλια ότι, η μακροπρόθεσμη και σε χαμηλή συχνότητα, μπορεί να εξελιχθεί σε εμφανή καρκίνωμα.

Mutant ΑΚΤ1

E17K συνεργάζεται με χημικά καρκινογόνα

στα ανθρώπινα κύτταρα, ΑΚΤ1

E17K προάγει τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση όταν εκφράζεται σε βρογχικά κύτταρα αθανατοποιημένα από την 12 /SV0 υβριδικό ιό αδενο [30]. Για να διερευνηθεί κατά πόσο μεταλλάξεις ΑΚΤ1 είναι σε θέση να συνεργάζονται με άλλους ογκογόνους επιτυχίες και

in vivo

, κάναμε χρήση του καρβαμιδικού αιθυλεστέρα (ουρεθάνη), μια χημική ένωση που υπάρχει στον καπνό που έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς για το μοντέλο πειραματικά πολυσταδιακή καρκινογένεση του πνεύμονα [41].

R26 ή R26-ΑΚΤ1

E17K

αδερφάκια είτε ήταν μολυσμένα με Ad-Cre (10

6-10

7 PFU) ή υφίστανται επεξεργασία με διαλύτη μόνο του πριν να είναι εκτίθενται σε ουρεθάνη (1 mg /g) και αναλύθηκαν μετά από 6 ή 9 μήνες. Πολλαπλότητα και το μέγεθος των όγκων /πνεύμονα βρέθηκαν να είναι σημαντικά υψηλότερη σε

R26-ΑΚΤ1

E17K

ποντίκια μολυσμένα με Ad-Cre. Είναι σχετικά ανθεκτικά στην ουρεθάνη,

R26-ΑΚΤ1

E17K

ποντίκια που δεν είχαν προηγουμένως εκτεθεί σε Ad-Cre αναπτύχθηκε οζίδια σε 1 από 6 ποντικούς στους 6 μήνες και 1 από τους 4 ποντικούς στους 9 μήνες μετά τη χορήγηση ουρεθάνης, αντίστοιχα (Σχήμα 5Α). Αντίθετα, σχεδόν όλα τα

R26-ΑΚΤ1

E17K

ποντίκια που είχαν μολυνθεί με το Ad-Cre πριν χορήγησης ουρεθάνη, παρουσιάζονται οζίδια του πνεύμονα και μετά από 6 (n = 4) και 9 (n = 6) μήνες θεραπείας. Ο μέσος αριθμός των όγκων που αναπτύχθηκαν από μεταλλαγμένα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με ουρεθάνη και μολύνθηκαν με Ad-Cre ήταν 3 /ποντικό στους 6 μήνες και 7 /ποντικό σε 9 μήνες? Αντίθετα, ποντίκια που έλαβαν θεραπεία μόνο με ουρεθάνη αναπτυχθεί & lt? 0,15 όγκου /ποντίκι σε 6 μήνες και 1,6 όγκων /ποντίκι σε 9 μήνες (Σχήμα 5Α). Αξίζει να σημειωθεί ότι το μέγεθος των όγκων που αναπτύχθηκαν από τα μεταλλαγμένα ποντίκια μετά από μόλυνση με Ad-Cre εξαρτιόταν από τη δόση του Ad-Cre χορηγηθούν (Σχήμα 5Β).

A. πολλαπλότητα των όγκων του πνεύμονα σε

R26-ΑΚΤ1

E17K

μολυνθεί με Ad-Cre (6 και 9 μήνες μετά τη θεραπεία, αντίστοιχα). Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει ένα ποντίκι? ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD. ** P & lt? 0,01, * ρ & lt? 0,05. Β Διάμετρος των όγκων του πνεύμονα που παράγεται από ουρεθάνη στο

R26-ΑΚΤ1

E17K

ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με αυξανόμενες δόσεις του Ad-Cre. Ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση διάμετρος του όγκου ± SD. * P & lt? 0,05. Γ, Δ Εκπρόσωπος H & amp? Ε χρώση των βλαβών του πνεύμονα αναπτύσσεται στο

R26-ΑΚΤ1

E17K

ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με διαλύτη ή Ad-Cre, όπως αναφέρεται, 9 μήνες μετά τη χορήγηση ουρεθάνη . Ε, ΣΤ φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ χρώση των βλαβών του πνεύμονα αναπτύσσεται στο

R26-ΑΚΤ1

E17K

ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με διαλύτη ή Ad-Cre, όπως αναφέρεται, 9 μήνες μετά τη χορήγηση ουρεθάνη. Μεγέθυνση όπως υποδεικνύεται.

Η

Οι όγκοι που δημιουργούνται από ουρεθάνη στο

ΑΚΤ1

E17K

φόντο διαγνώστηκαν ως βρογχο-κυψελιδικά αδενωμάτων /αδενοκαρκινώματα που παρουσιάζονται πιο συχνά θηλώδες μοτίβο (Σχήμα 5C και 5D). Μια τελευταία παρατήρηση ήταν ότι, σε αντίθεση με τους όγκους που δημιουργούνται στα ποντίκια ελέγχου που απέδειξαν μικρή ή μέτρια χρώση για ρΑΚΤ, αυτά που δημιουργούνται στο

R26-ΑΚΤ1

E17K

ποντίκια παρουσίασε σημαντική αύξηση σε ρΑΚΤ χρώση (Σχήμα 5Ε και 5F). Τέλος, αναλύσαμε

Kras

κατάσταση σε ποντίκια ουρεθάνη-θεραπεία. DNA εκχυλίστηκε από μικροδιατομή μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη παραφίνης-embedded όγκων των επιλεγμένων ποντικών ουρεθάνης-αγωγή (2 ποντίκια που έλαβαν μόνο ουρεθάνη και 4 ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με ουρεθάνη συν Ad-CRE). Η περιοχή που εκτείνεται κωδικόνιο 61 στο εξόνιο 3 του

Kras

γονίδιο ενισχύθηκε και υποβλήθηκε σε αλληλούχιση Sanger DNA. Η ανάλυση της αλληλουχίας των όγκων έδειξαν την παρουσία ενός A & gt? G μετάβαση στο κωδικόνιο 61 που οδηγεί σε αντικατάσταση Q61 με R. Δείτε S4 Σχ για αντιπροσωπευτικά χρωματογραφήματα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ΑΚΤ1

E17K μπορεί να συνεργάζεται με τους ογκογόνους γεγονότα που προκαλείται από ουρεθάνη σε πνεύμονα ποντικού (δηλαδή

Kras

αύξηση των μεταλλάξεων λειτουργίας), επιταχύνοντας έτσι την εξέλιξη σε έκδηλο όγκους.

το ποντίκι, τα κύτταρα Clara γραμμή βρογχικού επιθηλίου και εκφράζουν κυττάρων-πρωτεΐνης που συνδέεται με Κλάρα 10 (CC10), ενώ κυψελιδικά κύτταρα τύπου ΙΙ (ΑΤ2) κατοικούν στις κυψελίδες και να εκφράσει επιφανειοδραστική πρωτεΐνη C (SPC) [42-44].

Ως εκ τούτου, για τον χαρακτηρισμό των κυττάρων που αποτελούν τις βλάβες των πνευμόνων που προκαλείται από ΑΚΤ1

E17K στο ποντίκι, πραγματοποιήσαμε έμμεσο ανοσοφθορισμό για την SP-C και CC10 σε τμήματα του πνεύμονα FFPE που προέρχονται από

R26-ΑΚΤ1