Αφηρημένο

Πρόσθια Κλίση Πρωτεΐνη (AGR-2) αναφέρεται ότι είναι υπερ-εκφράζεται σε πολλά επιθηλιακά καρκίνους και προωθεί μετάσταση. Ένας μηχανισμός σαφής για παρατηρείται λειτουργία (-ες) του δεν έχει προηγουμένως εντοπιστεί. Βρήκαμε σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης AGR-2 σε ένα οστό μεταστατική κυτταρική γραμμή καρκίνου του προστάτη, PC3, μετά καλλιέργεια σε μυελό των οστών ρυθμισμένο μέσο. Ουσιαστική έκφραση AGR-2 επιβεβαιώθηκε επίσης σε προστάτη δείγματα καρκινικού ιστού σε ασθενείς με βλάβες των οστών. Με την ανάπτυξη σταθερών κλώνων κυττάρων PC3 με διαφορετικά επίπεδα έκφρασης AGR-2, προσδιορίσαμε ότι η κατάργηση της AGR-2 μείωσε σημαντικά την κυτταρική προσκόλληση σε φιμπρονεκτίνη, κολλαγόνο Ι, κολλαγόνο IV, λαμινίνη Ι και ινωδογόνου. Απώλεια κυτταρική συγκόλληση συνδέθηκε με απότομη μείωση στην έκφραση του α4, α5, αν, β3 και β4 ιντεγκρίνες. Η αποτυχία να υποστούν απόπτωση μετά την αποκόλληση είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα των επιθηλιακών μετάστασης του καρκίνου. Οι AGR-2-σιγήσει κύτταρα PC3 έδειξαν μεγαλύτερη αντοχή στην νέκρωσης όγκων απόπτωση παράγοντα που σχετίζονται με απόπτωση που προκαλεί συνδέτη (TRAIL) που προκαλείται

in vitro

. Αυτή η παρατήρηση υποστηρίζεται επίσης από σημαντικά μειωμένη έκφραση της κασπάσης-3 σε AGR-2-σιγήσει κύτταρα PC3, η οποία αποτελεί βασικό τελεστές των δύο εξωγενών και ενδογενών θάνατο σηματοδότηση μονοπατιών. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο καρκίνος του AGR-2 επιρροή του προστάτη μετάσταση από ρύθμιση της κυτταρικής προσκόλλησης και της απόπτωσης

Παράθεση:. Chanda D, Lee JH, Sawant Α, Hensel JA, Isayeva Τ, Reilly SD, et al. (2014) Πρόσθιο Κλίση Πρωτεΐνη-2 είναι ένας ρυθμιστής της κυτταρικής προσκόλλησης στον καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 9 (2): e89940. doi: 10.1371 /journal.pone.0089940

Επιμέλεια: Λουκία R. Languino, Πανεπιστήμιο Τόμας Τζέφερσον, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 22 του Οκτωβρίου του 2013? Αποδεκτές: 25 Γενάρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 27 Φεβρουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Chanda et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η οικονομική υποστήριξη των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας χορηγεί R01 AR560948, R01 CA133737 και Ρ30 AR046031 ευγνωμοσύνη εκτιμηθεί. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Δρ. Raj Singh είναι υπάλληλος της Vivo Biosciences Inc. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, προϊόντα στην ανάπτυξη ή διατίθενται στην αγορά προϊόντα να δηλώσει. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη έχει το υψηλότερο ποσοστό εμφάνισης μεταξύ όλων των καρκίνων στους άνδρες στον ανεπτυγμένο κόσμο και είναι η τρίτη κύρια αιτία θανάτου πίσω του πνεύμονα και του παχέος εντέρου [1]. Παθογένεση του καρκίνου του προστάτη και των προτιμησιακών μετάσταση στα οστά του και άλλα όργανα ρυθμίζονται από γονίδια, τα οποία λειτουργούν συνεργατικά για την προώθηση κάθε βήμα της καρκινογένεσης και της μεταστατικής καταρράκτη [2] – [4]. Αν και οι ξεχωριστές υπογραφές γονίδιο που διέπουν τα στάδια της εξέλιξης του καρκίνου που αναφέρθηκαν στον καρκίνο του μαστού, όπως πληροφορίες σχετικά με τον καρκίνο του προστάτη εξακολουθεί να λείπει [5]. Τον προσδιορισμό του ρόλου των νέων μορίων της διαγνωστικής και θεραπευτικής σημασίας παραμένει στο επίκεντρο της τρέχουσας έρευνας για τον καρκίνο. Με ανάλυση γονιδιακής έκφρασης, παρατηρήσαμε σημαντική αύξηση του AGR-2 στο κυτταρική σειρά καρκίνου προστάτη PC3, κάνει μετάσταση στα οστά, μετά από συντήρηση σε φυσιολογικό μυελό των οστών ρυθμισμένο μέσο. AGR-2 εντοπίστηκε για πρώτη φορά ως XAG-2 στο

Xenopus laevis

, η οποία προκαλεί διαφοροποίηση των αδένα τσιμέντου που βοηθά τα έμβρυα να παραμένουν προσκολλημένα στο υπόστρωμα μέσω της έκκρισης μιας βλεννώδους ουσίας [6]. Το ομόλογο θηλαστικού, AGR-2, είναι μία πρωτεΐνη δισουλφίδιο ισομεράση (PDI), η οποία περιέχει έναν τομέα θειο-redoxin και υπεύθυνη για την εντερική παραγωγή βλέννας [7]. Τα ποντίκια που στερούνται AGR-2 είναι επιρρεπείς στην ανάπτυξη κολίτιδας [7]. AGR-2 επέστησε ιδιαίτερη προσοχή τα τελευταία χρόνια για υποθετικό ρόλο του στην νεοπλασματική εξέλιξη και τη μετάσταση [8] – [15]. AGR-2 έχει βρεθεί ότι υπερεκφράζεται σε διάφορους αδενοκαρκινώματα και έχει συνδεθεί με την κακή επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του μαστού και του προστάτη [16], [17]. Λίγοι πρόσφατες εκθέσεις έχουν ρίξει φως στις ρυθμιστικά στοιχεία της λειτουργίας AGR-2, αλλά ειδικό ρόλο (ες) του στην ογκογένεση και εξέλιξη σε μετάσταση εξακολουθεί να απουσιάζει [18] – [20]. Στον καρκίνο του προστάτη, AGR-2 αναφέρεται ότι ανδρογόνα επαγώγιμη και μόνο υπερ-εκφράζεται κατά τη διάρκεια των πρώτων σταδίων της καρκινογένεσης [13], [21]. Αντίθετα, μια πρόσφατη μελέτη, επίσης, παρατηρείται μειωμένη AGR-2 έκφραση σε όγκους υψηλής ποιότητας, η οποία συνέπεσε με μεταστατική νόσο [13].

Η παρούσα μελέτη χρησιμοποιείται AGR-2 μεθόδου αποσιώπηση του γονιδίου στα οστά μεταστατικό καρκίνο του ανθρώπινου προστάτη κυτταρική σειρά PC3 να κατανοήσουμε τη βιολογική λειτουργία του στη μετάσταση του προστάτη των οστών του καρκίνου. Τα αποτελέσματα έδειξαν απώλεια του AGR-2 σε κύτταρα PC3 είχε σαν αποτέλεσμα σημαντική μείωση στην προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων, η απώλεια της έκφρασης του α4, α5, αν, β3 και β4 ιντεγκρίνες και την ανάπτυξη ανθεκτικότητας απόπτωση, υποδηλώνοντας ρόλο του AGR-2 σε μεταστατικό καταρράκτη προστάτη καρκίνος επηρεάζοντας την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων και τη μετανάστευση.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων και αντιδραστήρια

Ένα οστεολυτικές ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη, PC3, αγοράστηκε από την ATCC (Manassas , VA), και κλωνική παράγωγο των κυττάρων PC3, που εκφράζουν λουσιφεράση πυγολαμπίδας, ήταν μια γενναιόδωρη δωρεά από τον Dr. Kenneth J. Pienta (Πανεπιστήμιο του Michigan, Ann Arbor, Michigan). Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI-1640 (Mediatech Inc. Hendron, VA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Mediatech Inc.) και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Mediatech Inc). Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA) και καθαρίστηκε με χρήση QIAGEN μίνι κιτ (Valencia, CA). ανάλυση cDNA μικροσυστοιχιών εκτελέστηκε από τον καρκίνο Γονιδιωματική Shared Resources στο Winship Αντικαρκινικό Κέντρο του Πανεπιστημίου Emory (Ατλάντα, GA) χρησιμοποιώντας ένα Illumina Beadstation 500 και τα δεδομένα αναλύθηκαν από JAVA Treeview, Spotfire, Gene Cluster 3,0 και ανάλυση μονοπάτι εφευρετικότητα. κιτ σύνθεσης cDNA iScript αγοράστηκε από την Bio-Rad (Hercules, CA). AGR-2 εκκινητές (5′-Forward TTGGGGTGACCAACTCATCT-3 ‘? Αντίστροφα 5′- GGACAAACTGCTCTGCCAAT-3’) για την ανάλυση RT-PCR σχεδιάστηκαν με τη χρήση της (έκδοση 4.0), το λογισμικό Primer 3 και ολιγονουκλεοτίδια αγοράστηκαν από την Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, ΙΑ). Δείγματα cDNA αναλύθηκαν σε Bio-Rad iCycler (Hercules, CA). 3-διαστάσεων (3-D) σφαιρίδια PC3 για την ανάπτυξη του μυελού των οστών ρυθμισμένο μέσο παρήχθησαν μετά την ανάπτυξη των κυττάρων PC3 σε μήτρες hu-Biogel και παρέχονται από Vivo Biosciences (Birmingham, AL). Ένα Vybrant ® ΜΤΤ κιτ δοκιμασίας κυτταρικού πολλαπλασιασμού αγοράστηκε από την Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). εκχύλισμα βασικής μεμβράνης 3-D Culture Matrix ™ αγοράστηκε από Cultrex (3445 – 00501, Gaithersburg, MD). Ένα κιτ δοκιμασίας προσκόλλησης κυττάρου 48-φρεατίων Cytoselect ™ αγοράστηκε από την Cell Biolabs, Inc. (CBA-070, San Diego, CA). Όλα τα κιτ και τα αντιδραστήρια χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Αντισώματα

Ποντίκι και ανθρώπινα μονοκλωνικά αντισώματα, πολυκλωνικά αντισώματα και για AGR-2 αγοράστηκαν από Abcam Ltd (Cambridge, ΜΑ, και χρησιμοποιήθηκε σε μία αραίωση 1:1000 για ανοσοκηλιδώσεις και 1:500 για IHC). Μια ιντεγκρίνης kit δειγματολήπτη αντίσωμα αγοράστηκε από την κυτταρική σηματοδότηση (4749S, Danvers, ΜΑ, και χρησιμοποιήθηκε σε μια αραίωση 1:1000 για ανοσοστυπώματα και 1:500 για IHC). Caspase-3, διασπασμένη κασπάση 3 και β-ακτίνη αντισώματα αγοράστηκαν από Cell Signaling (Danvers, ΜΑ, και χρησιμοποιήθηκε σε μια αραίωση 1:500 για ανοσοστυπώματα). Δευτερογενής ανοσο-ανίχνευση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κατσίκας-αντι-αρουραίου /ποντικού /κουνελιού IgG ABC κιτ αγοράστηκε από Vector Laboratories (Burlingame, CA) και GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). Για ανοσοφθορισμό δευτερεύουσα ανίχνευση, κατσίκα-αντι-αρουραίου /ποντικού /κουνελιού IgG σημασμένο με Alexa-Fluor-594 αγοράστηκε από την Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR, 2 μg /ml).

Ανθρώπινα δείγματα ιστών

Bone μεταστατικού προστατικού καρκινικού ιστού λήφθηκε από αυτοψία στο Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ, σύμφωνα με το εγκεκριμένο θεσμικό συμβούλιο επιθεώρησης πρωτόκολλο (IRB). Φορμαλίνη σταθερό ενσωματωμένα σε παραφίνη τμήματα ιστού που λαμβάνονται από αυτές τις πηγές κόπηκαν στα 6 μm. Όλα τα δείγματα ιστού εξετάστηκαν και χαρακτηρίζεται από την πίνακας-επικυρωμένο ανατομικά παθολόγους.

Απομόνωση Μυελού των Οστών-ρυθμισμένο μέσο

Male C57BL /6 ποντίκια θυσιάστηκαν και οι δύο μηρού και της κνήμης συλλέχθηκαν και μυελού ήταν ξεπλυθεί με αποστειρωμένο απαλλαγμένο από ορό μέσο SIGMA Stemline (St Louis, ΜΟ) χρησιμοποιώντας βελόνα διαμετρήματος 28,5 τοποθετηθεί σε μία σύριγγα του 1 ml σε 50 ml αποστειρωμένο σωλήνα που περιέχει 10 ml μέσου Stemline χωρίς ορό. συσσωματώματα μυελού των οστών απομακρύνθηκαν με επαναλαμβανόμενη διέλευση μέσω μιας βελόνας διαμετρήματος 16,5 τοποθετηθεί σε μια σύριγγα των 10 ml μέχρι ένα ομοιογενές εναιώρημα μεμονωμένων κυττάρων επιτυγχάνεται. Τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν μέσω φυγοκέντρησης στις 1200 rpm, πλύθηκαν τρεις φορές χρησιμοποιώντας μέσο άνευ ορού και τελικά επαναιωρήθηκαν σε 50 ml μέσου Stemline περιέχει 10% ορό και αντιβιοτικά εμβρύου βοοειδών. Τα κύτταρα αραιώνονται περαιτέρω με ορό που περιέχει μέσο Stemline στα 100 ml και διανέμεται σε τέσσερα 150 cm

2 φιάλες κυτταρικής καλλιέργειας (Corning Inc. Corning, ΝΥ) για συντήρηση σε υγρό θάλαμο με 95% O

2 και 5% CO

2 εφοδιασμού. Μετά από δύο ημέρες το μέσο καλλιέργειας συλλέχθηκε και φυγοκεντρήθηκε σε υψηλή ταχύτητα για να απαλλαγούμε από τα κύτταρα και υπολείμματα. Τα υπερκείμενα συγκεντρώνονται και χρησιμοποιούνται άμεσα για την καλλιέργεια του 3-D, χάντρες PC3.

Κατασκευή του ανασυνδυασμένου shRNA Vector και Ανάπτυξης της Ενιαίας κυττάρων που προέρχονται από κλώνους PC3 με AGR-2 Νοκ ντάουν

Είκοσι στόχοι ενός ζεύγους βάσεων επιλέχθηκαν από μοναδικές περιοχές της ακολουθίας κωδικοποίησης AGR-2 χρησιμοποιώντας Tuschl et al., 1999 κατευθυντήριες γραμμές σχεδιασμού siRNA [22]. Μεταξύ των δοκιμασμένων αλληλουχίες shRNA, αυτή που έδειξε μέγιστη αποτελεσματικότητα χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη και αποτελούνταν από νόημα 21-mer (GACAAACACCTTTCTCCTGAT) και κλώνους αντι-νόημα διαχωρίζονται από μια περιοχή 9-bp και περιείχε θέσεις περιορισμού BamHI ή HindIII, αντίστοιχα , για κατευθυντική κλωνοποίηση (Integrated DNA Technologies, Coralville, ΙΑ). Τα ολιγονουκλεοτίδια ανοπτήθηκαν και συνδέθηκαν απευθείας σε ένα pRNAT.U6 /πλασμίδιο έκφρασης /GFP Neo (Genescript, Piscataway, NJ). Μία από τις ακολουθίες 21-mer (CCTTGAGACTTGAAACCAGAA) που απέτυχαν να σιγήσει έκφραση AGR-2 χρησιμοποιήθηκε ως πειραματικό έλεγχο για να ελαχιστοποιηθεί οποιαδήποτε επίδραση εκτός στόχου. PC3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων έως περίπου 90% συρροή σε αντιβιοτικό μέσο ελεύθερο. Τα κύτταρα στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με AGR-2 shRNA πλασμιδίων που εκφράζουν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από 24 ώρες, το μέσο διαμολύνσεως αντικαταστάθηκε με πλήρες μέσο και μετά από άλλα 24 ώρες, GFP θετικά κύτταρα ταξινομήθηκαν ροής και διατηρήθηκαν σε προ-τυποποιημένα 600 μg /ml νεομυκίνη (10131, GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, CA). Μόλις νεομυκίνη ανθεκτικά κύτταρα αναπτύχθηκαν, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και πάλι καλλιεργήθηκαν σε δίσκους καλλιέργειας των 96 φρεατίων σε /συχνότητα 1 κύτταρο καλά, εις διπλούν. AGR-2 κλώνοι νοκ ντάουν PC3 (PC3

AGR-2SH) κυτταρικών κλώνων και ελέγχου (PC3

Control) επιλέχθηκαν μετά από τη δοκιμή για την έκφραση AGR-2 μέσω Western και ανοσοφθορισμό αναλύσεις.

sTRAIL- η απόπτωση που επάγεται Δοκιμασίες

Το ανασυνδυασμένο ανθρώπινο TNF που σχετίζονται με συνδέτη που επάγει απόπτωση (TRAIL) αγοράστηκε από την EMD Millipore Corporation, Temecula, CA. PC3

Έλεγχος και PC3

AGR-2SH κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0, 12.5, 25, 50 και 100 ng /συγκέντρωσης TRAIL ml. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε μετά από 12 ώρες και 72 ώρες με χρώση ιωδιούχου προπιδίου (BD Biosciences) και ΜΤΤ κυτταρικού πολλαπλασιασμού Assay Kit αντίστοιχα. Τα επεξεργασμένα κύτταρα επίσης συλλέχθηκαν μετά 0 ώρες, 1 ώρα, 3 ώρες και 6 ώρες από κύτταρο απόξεσης, σφαιρίδια κυττάρου πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS και υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western για την ανίχνευση της κασπάσης 3 και ενεργό διασπασμένη κασπάση 3 πεπτίδια.

Western Blotting

τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης πρωτεΐνης πριν να είναι ψυγμένου-αποψυγμένου μια φορά στους -80 ° C. Οι πρωτεΐνες μετουσιώθηκαν προσθέτοντας ρυθμιστικό SDS-PAGE που περιείχε β-μερκαπτοαιθανόλη και επώαση στους 95 ° C για 5 λεπτά. Γενωμικό DNA διατέμνεται από εξαιρετικά υπερήχων. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Lowry του (Biorad, Hercules, CA). Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε δύο πηκτή πολυακρυλαμιδίου 10 ή 15% και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Η μεμβράνη επωάστηκε για 1 ώρα, σε 2% σκόνη άπαχου γάλακτος, σε TBST για να εμποδίσει την μη ειδική σύνδεση πρωτογενές αντίσωμα. Η μεμβράνη στη συνέχεια επωάστηκε όλη τη νύκτα με κατάλληλα αραιωμένο πρωτογενή αντισώματα σε ρυθμιστικό TBST. Βήτα-ακτίνη αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Μετά ένα 3 φορές πλένετε σε TBST, η μεμβράνη επωάστηκε σε κατσίκα IgG αντι-ποντικού /κουνελιού συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας (1:5000, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) για 30 λεπτά. Η μεμβράνη πλύθηκε και πάλι σε TBST και αναπτύχθηκε με χρήση αντιδραστηρίου ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (GE Healthcare Bio-Sciences Corp. Piscataway, NJ) και απεικονίζεται σε έναν προγραμματιστή χημειοφωταύγειας Fuji ΣΕΝ-3000.

ανοσοφθορισμού

Τόσο PC3

έλεγχος και PC3

AGR-2SH κύτταρα αναπτύχθηκαν σε καλλιέργεια μέχρι 50% συρροή σε θαλαμωτές πλάκες, πλύθηκε καλά με PBS και μονιμοποιήθηκαν σε παγωμένο 3.7% παραφορμαλδεϋδη σε PBS που περιέχει 0.1% Triton-X-100 , για 20 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα πλύθηκαν επιμελώς και επωάζονται όλη τη νύκτα στους 4 ° C σε μονοκλωνικό αρουραίου ανθρώπινο αντίσωμα AGR-2. Μετά PBS πλύση, τα κύτταρα επωάστηκαν με Alexa-φθορο-594 σημασμένο αντι-αρουραίου IgG (Molecular Probes, Eugene, OR), για 30 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα πλύθηκαν και οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI για αντίθεση. Τα κύτταρα επισημαίνονται φθορισμού είχαν τοποθετηθεί χρησιμοποιώντας Vectashield (Vector Labs, Burlingame, CA) και να προβληθούν σε ένα μικροσκόπιο φθορισμού Leica DMRB.

Ιστομορφομετρία και ανοσοϊστοχημεία

μαλακοί ιστοί σταθεροποιήθηκαν σε 10% ουδέτερη buffered- διάλυμα φορμαλίνης για 48 ώρες πριν από την ενσωμάτωση σε παραφίνη για ιστολογική ανάλυση. ιστοί των οστών ήταν απασβεστωμένες σε 0,5 mol /L EDTA σε Ca

2 + – και Mg

2 + -δωρεάν του Dulbecco PBS (Cellgro) πριν από την ενσωμάτωση σε παραφίνη. Έξι μm διαμήκεις σειριακές τομές κόπηκαν από μηρού και της κνήμης και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) για τον προσδιορισμό των χαρακτηριστικών της ανάπτυξης του όγκου στο οστό. Για ανοσοϊστοχημεία, 6 μΜ τομές παραφίνης αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο και ενυδατώθηκαν μέσω διαβαθμισμένης αλκοόλης. Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη σε κιτρικό ρυθμιστικό, ρΗ 6,0, υπό ατμό για 20 λεπτά. Οι τομές ψύχεται σε θερμοκρασία δωματίου και ενδογενούς υπεροξειδάσης απομακρύνθηκε χρησιμοποιώντας 0,3% Η

2O

2 σε μεθανόλη για 30 λεπτά και αποκλείστηκαν με 3% φυσιολογικό ορό κατσίκας για 30 λεπτά. Τομές ιστού στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Οι τομές πλύθηκαν σε PBST και πάλι επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου (RT) με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με βιοτίνη κατσίκας αντι-κουνελιού /αντι-αρουραίου επί 2 ώρες. Μετά την πλύση, οι τομές επωάστηκαν με στρεπταβιδίνη-συζευγμένη υπεροξειδάση αρμορακίας για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από μια άλλη πλύση με PBST, ανοσοανίχνευση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας DAB-H

2O

2 (Vector Labs, Burlingame, CA) και με αιματοξυλίνη κατά περίπτωση.

Μετανάστευση Αναλύσεις

δοκιμασίες μετανάστευση διεξήχθησαν με μία μέθοδο «κλείσιμο του τραύματος» και με τη χρήση ανιχνεύσεως θαλάμου Boyden. Στον προσδιορισμό κλεισίματος του τραύματος, AGR-2-σιγήσει κύτταρα PC3 και τα κύτταρα PC3 ελέγχου απλώθηκαν σε 10

5 ανά φρεάτιο σε έξι φρεατίων. Μετά την επίτευξη του 90% συρροή, τα κύτταρα στερήθηκαν τη διάρκεια της νύχτας ορού. Φρέσκο ​​μέσο προστέθηκε στα κύτταρα και τραύματα δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας αποστειρωμένη πιπέτα 200 μΙ. Φωτογραφίες του κλεισίματος του τραύματος ελήφθησαν σε 0 ώρες και 22 ώρες για να συγκριθεί η διαφορά στην τιμή κλεισίματος τραύματος μεταξύ του AGR-2-σιγήσει και PC3 ελέγχου κυτταρικές σειρές. Μια δοκιμασία μετανάστευσης θαλάμου Boyden διεξήχθη δια απλώματος 4 × 10

4 PC3

έλεγχος και PC3

AGR-2SH κύτταρα ανά φρεάτιο σε ένα ένθεμα κυτταρικής καλλιέργειας (μέγεθος πόρων 8 μm, τη μορφή 24-πηγαδιών? Becton Dickinson Labware) σε μέσο χωρίς ορό εις τριπλούν. Για να ξεκινήσει η μετανάστευση 10% FBS χρησιμοποιήθηκε ως χημειο-προσελκυστικό στον κατώτερο θάλαμο. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 6 ώρες στους 37 ° C και απομακρύνεται από τον άνω θάλαμο χρησιμοποιώντας ένα μάκτρο βάμβακος. Τα κύτταρα στην κάτω πλευρά του θαλάμου οπτικοποιήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας Image J λογισμικού. Η επίδραση του AGR-2 αποσιώπηση για τη μετανάστευση PC3 κυττάρων παρουσιάστηκε ως σχετικές τιμές σε σύγκριση με τον έλεγχο (100%).

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα αναλύθηκαν από Φοιτητών

t

-δοκιμή. Τιμές που παρέχονται είναι η μέση τιμή ± SEM και οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές εάν ρ & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

AGR-2 έκφραση είναι αυξημένη σε κύτταρα Μεταστατικό καρκίνο του προστάτη στην Παρουσία κλιματισμός Μυελού των Οστών μικροπεριβάλλον

οστών μετάσταση είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της διάδοσης του καρκίνου του προστάτη, το οποίο προσφέρει ένα ιδανικό σκηνικό για να μελετήσει την μετάσταση τέτοιων καρκινικών κυττάρων εντός του μικροπεριβάλλοντος και συγκεκριμένα τα μοριακά σήματα που προωθούν την επιβίωσή τους στη μεταστατική θέση. Για να διαλευκανθεί αν αποκρίσεις σε τέτοια σήματα στο μικροπεριβάλλον μεταβάλλει έκφραση AGR-2 σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη, τα κύτταρα PC3 αναπτύχθηκαν σε 3-διαστάσεων σφαιροειδή και διατηρήθηκε για 3 ημέρες σε μυελό των οστών ρυθμισμένο μέσο. Ολικό RNA απομονώθηκε από αυτά τα κύτταρα και υποβλήθηκαν σε ανάλυση cDNA μικροσυστοιχιών (Εικόνα 1Α), η οποία επιβεβαιώθηκε στη συνέχεια από πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR (Gene Expression Omnibus, GEO προσχώρηση # GSE38714? NCBI σύστημα εντοπισμού # 16589736). AGR-2 ήταν υπερ-εκφράζεται σημαντικά (ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με PC3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε κανονικό μέσο (Σχήμα 1Β), προτείνοντας AGR-2 μπορεί να απαιτούνται για την αρχική προσαρμογή των μεταστατικών κυττάρων όγκου στον νέο μικροπεριβάλλον. έκφραση AGR-2 προσδιορίστηκε επίσης στα οστά μεταστατικού προστατικού δείγματος καρκινικού ιστού. Έντονη έκφραση AGR-2 ανιχνεύθηκε, γεγονός που υποδηλώνει την απαίτηση του AGR-2 για τη δημιουργία των οστών μετάσταση (σχήμα 1Γ).

Α. cDNA χάρτης μικροσυστοιχία θερμότητα που δείχνουν υψηλότερη έκφραση AGR-2 (κόκκινο) σε κύτταρα PC3 αναπτύχθηκαν σε μυελό των οστών ρυθμισμένο μέσο σε σύγκριση με το κανονικό μέσο (πράσινο). δεδομένα B. πραγματικό χρόνο RT-PCR δείχνει μία σημαντική (ρ & lt? 0,05) αύξηση στην έκφραση AGR-2 σε κύτταρα PC3 μετά την ανάπτυξη σε φυσιολογικό μυελό των οστών ρυθμισμένο μέσο (bmcm) σε σύγκριση με όταν αναπτύχθηκαν σε κανονικό μέσο (RM). Γ Ανοσοϊστοχημική ανάλυση δείχνει έντονη ανοσοχρώση AGR-2 στα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του προστάτη κάνει μετάσταση στα οστά (αρχική μεγέθυνση 400χ).

Η

Προσδιορισμός AGR-2 mRNA έκφρασης σε διάφορες γραμμές κυττάρων του καρκίνου του προστάτη

σχετική έκφραση του mRNA AGR-2 προσδιορίστηκε σε μεταστατικό PC3 οστών, κυτταρικές σειρές καρκίνου ανθρώπινου προστάτη LnCap και C4-2B και του εγκεφάλου μεταστατικού Du145 κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη με RT-PCR. Τα αποτελέσματα δείχνουν σημαντικά υψηλότερη έκφραση AGR-2 σε κυτταρικές γραμμές C4-2B PC3, LnCap και συγκρίθηκε με κυτταρική γραμμή Du145, υποδεικνύοντας σημασία της AGR-2 σε προστάτη του οστού του καρκίνου της μετάστασης (Εικόνα 2Α).

A. επίπεδα AGR-2 προσδιορίστηκαν με ανάλυση RT_PCR σε διάφορες κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη. Τα μεταστατικά κύτταρα PC3 των οστών έχουν την υψηλότερη έκφραση του mRNA AGR-2, ενώ εγκεφάλου μεταστατικά κύτταρα Du145 έχουν το λιγότερο ποσό της έκφρασης AGR-2. B. Ανάπτυξη AGR-2 σιγήσει κύτταρα PC3. ανάλυση Western Blot δείχνει σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω της πρωτεΐνης AGR-2 μετά σταθερή εισαγωγή κατασκευάσματος στόχευσης shRNA AGR-2 σε κύτταρα PC3. βήτα-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. ανάλυση Γ ανοσοφθορισμού σύγκριση της έκφρασης AGR-2 σε AGR-2 σιγήσει PC3 κύτταρα σε σχέση με τα κύτταρα PC3 ελέγχου (Αρχική μεγέθυνση 400Χ).

Η

Προσδιορισμός του AGR-2 Εκφραση σε PC3

Έλεγχος και PC3

AGR-2SH κυττάρων Lines

Ποσό AGR-2 γονιδιακή σίγηση σε PC3

Έλεγχος και PC3

AGR-2SH κυττάρων εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western (Σχήμα 2Β) και χρώση ανοσοφθορισμού (Σχήμα 2C ). Πάνω από ενενήντα τοις εκατό κάτω ρύθμιση της έκφρασης AGR-2 επιτεύχθηκε σε PC3

AGR-2SH κυττάρων σε σύγκριση με PC3

κύτταρα ελέγχου.

Altered χαρακτηριστικά ανάπτυξης PC3 κυττάρων μετά AGR-2 γονιδιακή σίγηση

Όταν τα κύτταρα PC3 με διαφορετικά επίπεδα έκφρασης AGR-2 αναλύθηκαν

in vitro

, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στα ποσοστά πολλαπλασιασμού μεταξύ PC3

AGR-2SH και PC3

Έλεγχος κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 3Α). Ωστόσο, σε μονοστρωματικές καλλιέργειες, τα PC3

Τα κύτταρα ελέγχου φαίνεται να είναι παρόμοια με ινοβλάστη και σταθερά συνδεδεμένη με την πλαστική επιφάνεια. Τα κύτταρα χαλαρά συνδεδεμένα μεταξύ τους και μόνο μέσω ψευδοποδίων επεκτάσεις. Η PC3

AGR-2SH κύτταρα από την άλλη πλευρά διατηρείται περισσότερο επιθηλιακά φαινότυπο με στρογγυλεμένες ή κυβοειδή μορφολογία και σχηματίζεται ένα λιθόστρωτο όπως εμφάνιση όταν συρροή. Σε αντίθεση με τα PC3

Τα κύτταρα ελέγχου, PC3

AGR-2SH κύτταρα εμφανίστηκαν να συνδέονται χαλαρά στην πλαστική επιφάνεια (Σχήμα 3Β).

A. Δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων ΜΤΤ που δείχνουν παρόμοια ποσοστά αύξησης των PC3

έλεγχος και PC3

AGR2sh κύτταρα. B. PC3

κύτταρα ελέγχου (ανωτέρω) που εμφανίζει ένα μοιάζουν με ινοβλάστες εμφάνιση με ψευδοπόδια-όπως επέκταση για τις επαφές κυττάρου-κυττάρου. PC3

κύτταρα AGR2sh (παρακάτω) έδειξε μια πιο επιθηλιακών κυττάρων, όπως, στρογγυλεμένες φαινότυπο. Αυτά τα κύτταρα επίσης χαλαρά συνδέονται με τα πιάτα καλλιέργειας σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Το πράσινο φθορισμό στα δεξιά πάνελ δείχνει τόσο PC3

έλεγχος και PC3

AGR2sh κυττάρων εκφράζουν GFP λόγω της παρουσίας της GFP έκφρασης κασέτας στους φορείς που χρησιμοποιούνται για να δημιουργήσουν το AGR-2-σιγήσει PC3 κυτταρικές σειρές ελέγχου και διαχείρισης.

Η

AGR-2 προάγει την κυτταρική πρόσφυση

Όταν

AGR-2SH κύτταρα PC3

Έλεγχος και PC3 συγκρίθηκαν για την ικανότητά τους να συνδέονται σε διάφορα εξωκυττάρια μήτρα (ECM) πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων ινονεκτίνη, κολλαγόνο Ι, κολλαγόνο IV, λαμινίνη και το ινωδογόνο χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας προσκόλλησης κυττάρου, τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική μείωση στην ικανότητα των PC3

AGR-2SH κύτταρα να παραμένουν ενσωματωμένα σε όλα τα συστατικά του ECM που δοκιμάστηκαν. PC3

AGR-2SH προσκόλληση σε φιμπρονεκτίνη μέγιστο μειώθηκε (70%), μεταξύ άλλων πρωτεϊνών ECM, υποδεικνύοντας AGR-2 επιρροές οδού (ες) οι οποίες προάγουν την κυτταρική προσκόλληση (Σχήμα 4Α).

A. ιδιότητες πρόσφυσης των PC3

έλεγχος και PC3

AGR2sh κύτταρα αξιολογήθηκαν μετά από ανάπτυξη σε δίσκους καλλιέργειας επικαλυμμένες με διάφορες πρωτεΐνες ECM. Πρώτον, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε διπλούν επί των επικαλυμμένων υποστρωμάτων και αφέθηκαν να προσκολληθούν. Στη συνέχεια, τα μη δεσμευμένα κύτταρα πλένονται μακριά, και τα προσκολλημένα κύτταρα καθηλώθηκαν και χρωματίστηκαν. Τέλος, η χρωστική εκχυλίστηκε και ποσοτικοποιήθηκε χρωματομετρικά. Σημαντική μείωση στην κυτταρική πρόσφυση στη φιβρονεκτίνη (*** p & lt? 0.001), το κολλαγόνο Ι (** p & lt? 0.01), το κολλαγόνο IV (*** p & lt? 0.001), λαμινίνη (* p & lt? 0,05) και το ινωδογόνο (* p & lt? 0,05) παρατηρήθηκαν σε περίπτωση PC3

κύτταρα AGR2sh σε σύγκριση με PC3

κύτταρα ελέγχου. BSA επικαλυμμένα φρεάτια χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος αντιδραστήριο (ρ & gt? 0,1). Τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ είναι μέσος όρος ± SEM. B. Σημαντικές κάτω ρύθμιση α4, α5, αν, β3 και β4 ιντεγκρινών παρατηρήθηκε σε PC3 κύτταρα

AGR2sh σε σύγκριση με PC3

κύτταρα ελέγχου. Δεν παρατηρήθηκε διαφορά στην β1 ιντεγκρίνης επίπεδα παρατηρήθηκε μεταξύ των δύο τύπων κυττάρων. Βήτα-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Πολλαπλές ζώνες πρωτεΐνης που υπάρχει στα στυπώματα περιλαμβάνουν ιντεγκρίνης πρόδρομες και ώριμες πρωτεΐνες, καθώς και διασπασμένων προϊόντων αναμένεται μοριακή μάζα σύμφωνα με τις πληροφορίες του κατασκευαστή (Cell Signaling Technology, Cat # 4749S).

Η

Απώλεια Integrin Έκφραση σε PC3 κύτταρα που στερούνται AGR-2

Ιντεγκρίνης ετεροδιμερών σε διάφορους συνδυασμούς είναι γνωστό ότι μεσολαβούν την κυτταρική προσκόλληση στην ECM και παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και μετάσταση όγκου [23]. Για να καθοριστεί εάν διαμορφώσεις του AGR-2 επίπεδα κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου και μετάσταση συνδέεται με αλλοιωμένη επίπεδα ιντεγκρίνη και λειτουργία, προσδιορίσαμε την έκφραση ενός πάνελ των ιντεγκρινών (α4, α5, αν, β1, β3, β4, β5 ιντεγκρίνες) σε PC3

AGR-2SH και PC3

κύτταρα ελέγχου με κηλίδωση Western. Σημαντικά μειωμένη έκφραση των α4, α5, αν, β3 και β4 ιντεγκρινών παρατηρήθηκε σε PC3

AGR-2SH κύτταρα. Συγκρίσιμες ποσότητες β1 ιντεγκρίνης επίπεδα παρατηρήθηκαν σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές ενώ δεν ιντεγκρίνη β5 ανιχνεύθηκε σε οποιαδήποτε κυτταρική γραμμή. Αυτά τα δεδομένα προτείνουν έντονα έναν ρόλο για AGR-2 στην ρύθμιση κυτταρικής συγκόλλησης μέσω έκφρασης ιντεγκρίνης. (Εικόνα 4Β).

Μείωση του όγκου κυτταρικής μετανάστευσης στην AGR-2-σιγήσει PC3 κύτταρα

Για να προσδιορίσετε αν πρόσφυση μειώνεται κυττάρων και έκφραση ιντεγκρίνης σε AGR-2-σιγήσει κύτταρα PC3 επηρεάζονται κυττάρων PC3 μετανάστευση, τόσο ένα «κλείσιμο του τραύματος» δοκιμασία, καθώς και μια δοκιμασία μετανάστευσης θαλάμου Boyden διεξήχθη. Τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντικά μειωμένη (ρ & lt? 0,01) μετανάστευση των κυττάρων του όγκου σε AGR-2-σιγήσει κυττάρων PC3 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου PC3. Και οι δύο αυτές δοκιμασίες, επίσης, προτείνοντας την κυτταρική προσκόλληση μέσω έκφρασης ιντεγκρινών είναι ζωτικής σημασίας για τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 5 Α & amp? Β).

Υψηλή AGR-2 που εκφράζει PC3

κύτταρα ελέγχου και χαμηλής AGR-2 που εκφράζει PC3

AGR-2SH κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 6 δίσκο καλλιέργειας καλά έως και 90% συρροή. Μπορούν στερήθηκαν ορού όλη τη νύκτα και αφήνεται να μεταναστεύσουν μετά τη δημιουργία της πληγής χρησιμοποιώντας ένα ρύγχος πιπέτας 200 μl και προσθέτοντας φρέσκο ​​πλήρες μέσο. Οι φωτογραφίες ελήφθησαν σε 0 ώρες και 22 ώρες για τον προσδιορισμό του ρυθμού κλεισίματος τραύματος μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών. Δοκιμασία Β Boyden τμήμα: PC3

κύτταρα ελέγχου και PC3

AGR-2SH κύτταρα απλώθηκαν σε ένθετα κυτταρικής καλλιέργειας σε μέσο ελεύθερο και μετανάστευση κυττάρων στον ορό διεγέρθηκε προσθήκη 10% FBS ως χημειοελκυστικό στον κάτω θάλαμο. Μετά από 6 ώρες επώασης, τα κύτταρα απομακρύνθηκαν από την κορυφή του ενθέτου, χρησιμοποιώντας μια μπατονέτα και τα κύτταρα στην κάτω πλευρά του ενθέτου φωτογραφήθηκαν και μετρήθηκαν. Η επίδραση του AGR-2 αποσιώπηση σχετικά με τη μετανάστευση PC3 κυττάρων παρουσιάζεται εδώ ως σχετικές τιμές σε σύγκριση με τον έλεγχο (100%).

Η

Ανάπτυξη TRAIL Αντίστασης PC3

AGR-2SH κύτταρα

Προηγούμενα πειράματα έδειξαν AGR-2-σιγήσει κύτταρα PC3 έδειξε μειωμένη κυτταρική προσκόλληση, ιντεγκρίνης έκφρασης και της μετανάστευσης. Φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα υφίστανται απόπτωση μετά την αποκόλληση από τη βασική μεμβράνη (anoikis), ενώ η αντίσταση anoikis είναι ένα από τα χαρακτηριστικά των κακοήθων καρκινικών κυττάρων. Για να προσδιορίσετε αν AGR-2 αποσιώπηση συνέβαλε στην ευαισθησία σε anoikis, τόσο PC3

Έλεγχος και PC3

AGR-2SH κύτταρα καλλιεργήθηκαν

in vitro

για 72 ώρες με την παρουσία 0, 12.5, 25, 50 και 100 ng /ml ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης TRAIL ανθρώπινη διαλυτή (ες). Αποτελέσματα του πειράματος αναλύθηκε με δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας πολλαπλασιασμού των κυττάρων MTS μετά από αγωγή TRAIL. Παρά το γεγονός ότι παρατηρήθηκε κυτταρικό θάνατο σε τόσο PC3

κύτταρα ελέγχου και PC3

AGR-2SH κύτταρα, PC3

AGR-2SH κύτταρα επιβίωσαν της πρόκλησης TRAIL σημαντικά καλύτερη από ό, τι τα PC3

κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 6Α) προτείνοντας απώλεια AGR-2 μπορεί να σχετίζεται με την ανάπτυξη ανθεκτικότητας anoikis σε κακοήθη καρκινικά κύτταρα. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά την πρόκληση sTRAIL προσδιορίστηκε επίσης με χρώση των κυττάρων με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ).

AGR-2SH κύτταρα PC3

Έλεγχος και PC3 καλλιεργήθηκαν

in vitro

για 12 ώρες υπό την παρουσία 0 ng /ml και 100 ng /ml συγκέντρωση του sTRAIL ακολουθούμενη από χρώση ΡΙ. Φάση Αντίθετα, φθορισμού και επικαλυπτόμενα εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο Leica DMI 4000B και αναλύονται με το λογισμικό J Image. Αμφότερα τα ζωντανά και νεκρά κύτταρα μετρήθηκαν και μη βιώσιμα κύτταρα (ΡΙ θετικών) εκπροσωπείται ως ποσοστό του συνολικού αριθμού των κυττάρων. Τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντικά υψηλότερες ΡΙ θετικών κυττάρων (ρ & lt? 0,05) σε PC3

κύτταρα ελέγχου σε σύγκριση με PC3

AGR-2SH κύτταρα (Σχήμα 6 Β & amp? C). Η κασπάση-3 βρέθηκε να ενεργοποιείται σε αμφότερες εξωγενή και ενδογενή οδούς κυτταρικού θανάτου και τη διεξαγωγή της φάσης εκτέλεσης της απόπτωσης [24]. Caspase-3 βρέθηκε να είναι σημαντικά χαμηλότερη σε AGR-2-σιγήσει κυττάρων PC3 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου σε ανάλυση Western blot, η οποία υποστηρίζει επίσης την ανάπτυξη του anoikis αντίστασης (Σχήμα 6D). Δεν παρατηρήθηκε διαφορά μεταξύ ελέγχου και AGR-2-σιγήσει κύτταρα PC3 άποψη της κασπάσης-8, ο θάνατος του υποδοχέα-5 και κασπάσης-9 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Κασπάσης-3 δραστηριότητα απαιτεί πρωτεολυτική διάσπαση των ανενεργών κασπάσης-3 σε 19/17 KDa ενεργοποιηθεί διασπασμένης κασπάσης-3 [25]. Για τη σύγκριση γενιά διασπασμένης κασπάσης-3 και οι δύο PC3

Έλεγχος και PC3

AGR-2SH κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 50 ng /συγκέντρωση του sTRAIL ml για χρονικό διάστημα 0 ώρες, 1 ώρα, 3 ώρες και 6 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με διάλυση και κυτταρικό ίζημα πλύθηκε με PBS δύο φορές πριν από την απομόνωση των πρωτεϊνών. Κασπάση-3 και διασπασμένη κασπάση 3 προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western, η οποία έδειξε τα υψηλότερα επίπεδα των δύο πεπτιδίων σε PC3

κύτταρα ελέγχου σε σύγκριση με PC3

AGR-2SH κύτταρα σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο (Εικόνα 6D). . Η ανάλυση του καρκίνου του προστάτη σύνολο δεδομένων γονιδιακής έκφρασης για την πρωτοβάθμια και μεταστατικό καρκίνο του προστάτη (194 περιπτώσεις) που δημοσιεύθηκε από τους Taylor et al, 2010, χρησιμοποιώντας CBIOPORTAL έδειξε μια αναλογία πιθανοτήτων 4,25 (διάστημα εμπιστοσύνης 1,40 έως 12,86? P & lt? 0.02 με την ακριβή δοκιμή του Fisher) μεταξύ AGR -2 και κασπάσης-3 υποδηλώνοντας μια τάση προς συνύπαρξη αυτών των δύο μορίων [26].

Α. PC3

έλεγχος και PC3

AGR2sh κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία

in vitro

με διάφορες συγκεντρώσεις sTRAIL. Η βιωσιμότητα των κυττάρων ελέγχθηκε μετά από 72 ώρες χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας κυτταρικής βιωσιμότητας. Σημαντικά υψηλότερο κυτταρικό θάνατο (p & lt? 0.001) παρατηρήθηκε σε PC3

κύτταρα ελέγχου σε σύγκριση με PC3

AGR2sh κύτταρα. B. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από πρόκληση sTRAIL επίσης προσδιορίστηκε μεταξύ PC3

έλεγχος και PC3

AGR2sh κυττάρων με χρώση ΡΙ και προβολή στο μικροσκόπιο φθορισμού (αρχική μεγέθυνση 200Χ). Γ Πολλαπλές εικόνες ελήφθησαν για κάθε κυτταρική σειρά μετά από αγωγή sTRAIL και χρώση ΡΙ. Τόσο ζωντανά και νεκρά κύτταρα με το χέρι μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό J Εικόνα και γραφικά απεικονίζονται. ανάλυση κηλίδος Δ Western δείχνει κασπάσης-3 και διασπάστηκε κασπάσης-3 επίπεδα χωρίς επαγωγή και TRAIL επαγόμενη από τον έλεγχο και την AGR-2-σιγήσει κύτταρα PC3.

Η

Συζήτηση

Ο καρκίνος του προστάτη κάνει μετάσταση στο οστό και παράγει οστεοβλαστικά /οστεολυτικές βλάβες, οι οποίες προκαλούν έντονο πόνο των οστών, την ευαισθησία σε κάταγμα και συμπίεση του νωτιαίου μυελού [27]. Bone μεταστατικός καρκίνος είναι ανίατη και οδηγεί σε σημαντική νοσηρότητα και θνησιμότητα στους ασθενείς αυτούς. Η προσκόλληση των απολέπιση, κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων εντός των πρωτεϊνών ECM του μυελού των οστών είναι η κύρια βήμα που απαιτείται για τη δημιουργία των οστών μετάσταση [28]. Στη μελέτη μικροσυστοιχίας μας, σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης mRNA AGR-2 μετά από συντήρηση σε μυελό των οστών ρυθμισμένο μέσο προτείνει έναν ρόλο των AGR-2 για τη διευκόλυνση της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων του προστάτη στο μικροπεριβάλλον των οστών.